Summary
Les principaux ganglions pelviens contiennent des neurones parasympathiques et sympathiques qui innervent les organes pelviens. Ici, nous décrivons une méthode de dissection et fournissons des schémas pour l’identification de ces ganglions et de leurs nerfs associés. Ces méthodes peuvent être appliquées à la manipulation expérimentale de ces ganglions in vivo ou de l’ablation post-mortem pour une étude plus approfondie.
Abstract
Les principaux ganglions pelviens bilatéraux (MPG; synonyme, ganglion pelvien) sont la principale source de neurones sympathiques et parasympathiques postganglioniques innervant les organes pelviens des rongeurs; la structure fonctionnellement équivalente chez l’homme est le plexus hypogatricien inférieur. Les principaux ganglions pelviens fournissent également la route par laquelle les axones sensoriels lombaires et sacrés atteignent les organes pelviens. Ces ganglions complexes et mixtes peuvent s’avérer difficiles à identifier et à disséquer pour une étude expérimentale plus poussée des mécanismes autonomes normaux ou pour établir des modèles précliniques de maladie, de blessure ou de douleur viscérale. Ici, nous décrivons un protocole pour accéder et visualiser ces ganglions et leurs voies nerveuses associées. Nous fournissons ce protocole avec des schémas pour les rats mâles et femelles, car la taille de ganglion et les points de repère pour l’identification diffèrent entre les sexes. Le protocole décrit l’ablation du ganglion pour des études in vitro, mais cette méthode peut être intégrée dans un protocole de récupération chirurgicale pour les interventions expérimentales (p. ex. écrasement de nerf, résection nerveuse) ou pour cartographier les circuits neuronaux (p. ex., par microinjection des traceurs neuronaux). Nous démontrons également les structures primaires du ganglion et de ses nerfs associés immédiatement après la dissection et suivant la coloration immunohistochimique.
Introduction
Le rat est l’une des espèces les mieux caractérisées utilisées dans l’étude de la physiologie et de l’anatomie des organes pelviens. Bien qu’il existe d’excellentes ressources pour les descriptions de ces organes1,2, ils ne fournissent généralement pas d’informations sur les structures neuronales connexes ou le font à une résolution insuffisante pour guider une étude expérimentale. Comme détaillé plus loin ci-dessous, l’organisation des ganglions autonomes qui régulent la fonction pelvienne d’organe est tout à fait différente du reste du système nerveux autonome, ce qui rend difficile d’inférer avec précision les dispositifs d’innervation pelvienne de l’information neuroanatomique disponible pour d’autres ganglions autonomes. Cette carence en ressources pour guider les chercheurs entrant dans ce domaine peut avoir ralenti la recherche sur la régulation neuronale des organes pelviens. Ici, nous décrivons des protocoles pour accéder à cette région du système nerveux pour d’autres études in vitro ou une intervention expérimentale.
Les grands ganglions pelviens bilatéraux (MPG; synonymes: ganglions pelviens; ganglions paracévacgiques [femelles]; Le ganglion [féminin] de Frankenhuser est la principale source de neurones sympathiques et parasympathiques postganglioniques innervant les organes pelviens des rongeurs ; le plexus hypogatricien inférieur comprend la structure neuronale équivalente chez l’homme3,4,5,6. Les projections sensorielles des ganglions lombaires et sacrés de racine dorsale voyagent également par l’intermédiaire du MPG pour atteindre les organes pelviens. Par conséquent, la compréhension des circuits neuronaux et de la biologie du MPG est essentielle pour des études précliniques sur une myriade de conditions cliniques relatives au développement et à la fonction adulte des organes pelviens. Plusieurs excellentes descriptions de rongeur MPG ont été publiés7,8,mais notre expérience est que, en général, ces descriptions ne fournissent pas toujours des conseils suffisants pour pratiquement informer une dissection expérimentale ou la manipulation de ces structures lors de la récupération de l’animal est nécessaire. En outre, la majorité des études MPG se concentrent sur les rats mâles. Chez les rats femelles, le MPG est plus petit9 et ont des repères anatomiques distincts, et nécessitent donc un guide distinctement adapté à la visualisation et la dissection.
Les voies sympathiques et parasympathiques se distinguent par leur anatomie, en particulier l’emplacement de leurs neurones preganglionic, avec des voies sympathiques ayant des neurones preganglionic dans la moelle épinière thoraco-lumbar et les neurones préganglioniques parasympathiques situés dans le tronc cérébral (projections de nerf crânien) et la moelle épinière sacrée. Dans la plupart des autres régions du système autonome, leurs neurones ganglionaux cibles sont situés dans des ganglions sympathiques ou parasympathiques distincts. Cependant, le MPG est peu commun en étant mixte sympathique-parasympathetic ganglions, et donc à une échelle macroscopique sont des sites de convergence des axones préganglioniques des régions thoraciques-lombaires et la colonne vertébrale sacrée. Nous avons donc inclus dans nos protocoles l’emplacement et la description de ces voies nerveuses primaires qui relient chaque région spinale au MPG, facilitant l’analyse expérimentale ou la manipulation séparée de ces composants neuronaux. Nous notons également pour les lecteurs comparant spécifiquement ces ganglions entre les espèces, que chez les rongeurs les neurones préganglioniques de la colonne vertébrale qui sont «fonctionnellement sacral», par exemple, sont actifs et nécessaires pendant la micturition, la défécation et l’érection pénienne, sont situés aux niveaux de la colonne vertébrale L6-S1 plutôt que exclusivement dans les segments sacrés10; de même L6 et S1 dorsal root ganglia fournir l’entrée sensorielle «sacrale» majeure aux organes pelviens. Chez les rongeurs, l’apport sensoriel et préganglionique des circuits neuronaux plus rostrals est concentré dans les niveaux rachidiens L1 et L210.
Ici, nous décrivons un protocole pour accéder au MPG et leurs voies nerveuses associées chez les rats mâles et femelles, et nous l’appuyons avec des schémas pour illustrer des repères spécifiques. Ce protocole guide l’accès chirurgical à ces structures dans un contexte expérimental d’enlèvement du tissu pour des études in vitro, par exemple, l’isolement des neurones MPG pour la caractérisation moléculaire ou la culture primaire. Il peut également être adapté à l’ablation de MPG après perfusion intracardique avec fixatif, bien que ce soit une dissection plus difficile parce que le tissu neural devient plus difficile à visualiser lorsque les tissus adjacents sont dépourvus de sang. Ce protocole peut également être intégré dans un cadre chirurgical pour l’intervention expérimentale de ces voies nerveuses (p. ex., résection nerveuse, microinjection de traceurs neuronaux). Ces types de dissections sont de plus en plus importants pour le domaine croissant de la médecine bioélectronique, où de nouvelles cibles et approches pour la neuromodulation pour traiter les conditions cliniques des viscères pelviens sont en cours dedéveloppement 11. Nous présentons le protocole complet d’abord pour les rats mâles, puis une réplique du protocole adapté spécifiquement pour les rats femelles.
Protocol
Toutes les procédures doivent être menées en fonction des exigences institutionnelles et des organismes de financement pour l’expérimentation animale. L’utilisation d’animaux pour cette dissection et le protocole d’euthanasie ont été approuvés par le Comité d’éthique animale de l’Université de Melbourne (Protocole numéro 1814639).
REMARQUE : Les dissections illustrées ici ont été exécutées sur des rats adultes (10 semaines) mâles et femelles De Sprague-Dawley (Biomedical Sciences Animal Facility, Université de Melbourne), pesant 280 g (femelle) et 350 g (mâle). Avant ces dissections, les rats ont été euthanasiés dans une chambre de CO2 pendant 4-5 min. Immédiatement après la mort, MPG ont été disséqués. Si disséquer le tissu d’un animal qui a subi une perfusion transcardiale avec fixatif, prenez des précautions pour protéger l’opérateur contre l’exposition au fixatif, c’est-à-dire effectuer la dissection dans l’armoire à fumée ou l’armoire à courant descendant et porter un équipement de protection individuelle approprié. Un protocole de perfusion transcardiale a été publié en détail12.
1. Ganglion pelvien majeur et nerfs adjacents : accès et résection chez un rat mâle
REMARQUE : La figure 1 montre des repères anatomiques pour la visualisation de MPG dans un rat mâle.
- Accès à la cavité abdominale et au bassin
- Placer le rat en position de supine et accéder à l’abdomen et au bassin par une incision ventrale de la ligne médiane, en prenant soin d’éviter la contamination du champ chirurgical avec de la fourrure.
- Déplacez doucement les organes abdominaux d’un côté à l’aide de forceps ou d’applicateurs à pointe de coton. Notez l’emplacement des lobes ventrals de la prostate et de la vessie urinaire.
- Déplacez la vésicule séminale vers le côté contralatéral.
- Couper les vaferens pour fournir un meilleur accès à la zone sur-le-ganglion.
REMARQUE : À partir de ce point de dissection, le tissu ne doit pas sécher ; garder le tissu humide avec saline physiologique (pour dissection de tissus frais) ou fixatif (pour l’animal fixé par perfusion). Garder le tissu humide avec salin non seulement bénéficie la structure tissulaire, mais rend également la dissection plus facile que les nerfs secs sont plus fragiles et se déchirent plus facilement lors de la manipulation. - Identifier le lobe dorsolatéral de la prostate, sur la surface dorsale de ce qui est l’emplacement du ganglion; cela ne sera pas encore visible.
- Pour visualiser le ganglion, effacer soigneusement les tissus à proximité et en surlysant le ganglion. Si nécessaire, utilisez un rétracteur pour garder le champ de dissection dégagé.
- Retirez un agrégat à proximité de tissu adipeux et ouvrez le fascia latéral du bassin.
- Dissection du MPG et de ses nerfs associés
- Identifier les endroits suivants qui fournissent des repères pour les prochaines étapes de la dissection : le lobe dorsolateral de la prostate (le ganglion est situé à la surface de ce lobe, légèrement plus caunal que la jonction entre vésicule séminale et prostate) et les vésicules séminales (où elles convergent à la ligne médiane indique l’emplacement du ganglion sur l’axe rostrocaudal de l’animal).
- Comme requis à partir de ce point, enlever soigneusement tout tissu qui empêche la vue complète des structures neuronales, en évitant les dommages à la capsule mince de la prostate ou des vaisseaux majeurs.
- Identifiez le nerf pelvien en visualisant les repères et les caractéristiques suivants.
- Trouvez la veine iliaque interne et sa branche fine se projetant vers le MPG et la vessie. Cette branche vasculaire est parallèle et est parfois ancrée dans le nerf pelvien, puis traverse le ganglion.
- Placez doucement les forceps inclinés à pointe fine sous le nerf pelvien et faites glisser les forceps le long pour le libérer des tissus environnants.
REMARQUE: Il peut également être possible d’isoler le nerf pelvien du petit vaisseau fonctionnant parallèlement à lui, mais pour la plupart des types d’expériences ce n’est pas essentiel. Confirmez que la structure est le nerf pelvien en passant sous un grossissement élevé pour déterminer que le nerf contient plusieurs fascicles vaguement agrégés, qui sont facilement distingués sous le microscope disséquant et sont caractéristiques de la pelvienne nerf, comme aucun des autres nerfs majeurs associés au ganglion montrent cette fasciculation claire.
- Identifiez le nerf caverneux en visualisant les repères et les caractéristiques suivants.
- Après avoir suivi le nerf pelvien à sa jonction avec le ganglion, suivez le nerf caverneux pendant qu’il voyage à travers la prostate, puis caudally vers les corps caverneux du pénis.
- Si le grossissement du microscope le permet, notez qu’il y a un petit groupe de nerfs délicats émergeant du ganglion entre les nerfs pelviens et caverneux ; ce sont les nerfs rectal qui se déplacent à l’intestin inférieur.
- Identifiez le nerf hypogatricrique en visualisant les repères et les caractéristiques suivants.
- Identifiez où le nerf hypogatricrique rejoint le ganglion à son bord crânien, après avoir voyagé à côté de l’uretère.
- Confirmez que le nerf hypogatricien est beaucoup plus mince que les nerfs pelviens ou caverneux et qu’il n’est pas accompagné de gros vaisseaux.
- Identifiez le MPG en visualisant les caractéristiques suivantes.
- Visualisez les bords ventral, dorsal et crâniens du ganglion, formant une forme triangulaire.
- Confirmer l’emplacement de chaque nerf majeur: les nerfs pelviens émergeant du bord dorsal du ganglion, le nerf caverneux dans le coin le plus caunal du ganglion, le nerf hypogatricien de son bord crânien, et les nerfs accessoires émergeant du ganglion bord ventral.
- Identifiez les nerfs accessoires en visualisant les repères et les caractéristiques suivants.
- Après avoir dégagé le tissu pour permettre la visualisation du bord ventral du ganglion, identifiez un groupe de nerfs qui se projettent vers les voies urinaires et reproductrices.
- Si le grossissement de microscope le permet, identifiez un groupe caulique de nerfs qui entrent entre les lobes de prostate et un groupe rostral entre la vésicule séminale et la vessie.
- Enlèvement du MPG avec ses nerfs associés
- Glissez doucement les forceps entre le ganglion et la prostate sous-jacente, en prenant soin de ne pas perforer la fine capsule de la prostate. Perturber les connexions entre le ganglion et la prostate.
- Effacer toutes les connexions finales avec les tissus environnants pour les longueurs des nerfs nécessaires à l’expérience, puis couper chaque nerf.
- À l’aide de forceps fins, déplacez le ganglion avec ses nerfs à la solution appropriée pour l’expérience et confirmez que chacun des nerfs principaux sont intacts.
2. Ganglion pelvien majeur et nerfs adjacents : accès et résection chez un rat femelle
REMARQUE : La figure 2 montre des repères anatomiques pour la visualisation de MPG chez un rat femelle.
- Accès à la cavité abdominale et au bassin
- Placer le rat en position de supine et accéder à l’abdomen et au bassin par une incision ventrale de la ligne médiane, en prenant soin d’éviter la contamination du champ chirurgical avec de la fourrure.
REMARQUE : À partir de ce point de dissection, le tissu ne doit pas sécher ; garder le tissu humide avec saline physiologique (pour dissection de tissus frais) ou fixatif (pour l’animal fixé par perfusion). - Déplacez doucement les organes abdominaux d’un côté à l’aide de forceps ou d’applicateurs à pointe de coton. Notez l’emplacement de la corne utérine, de la vessie urinaire et du rectum.
- Couper les vaisseaux ovariens et utérins et rétracter la corne utérine.
- Entrez dans l’espace péritonéal et dégagez doucement un agrégat de tissu adipeux situé près du col de l’utérus utérin.
- Placer le rat en position de supine et accéder à l’abdomen et au bassin par une incision ventrale de la ligne médiane, en prenant soin d’éviter la contamination du champ chirurgical avec de la fourrure.
- Dissection du MPG et de ses nerfs associés
- Identifier la paroi latérale du col de l’utérus utérin, juste caudal à sa jonction avec les cornes utérines; cette région est le principal point de repère pour définir l’emplacement du MPG sur l’axe rostrocaudal de l’animal.
- Comme requis à partir de ce point, enlevez soigneusement tout tissu qui empêche la vue complète des structures neuronales, évitant ainsi des dommages aux principaux vaisseaux.
- Identifiez le nerf pelvien en visualisant les repères et les caractéristiques suivants.
- Trouvez la veine iliaque interne et sa branche fine se projetant vers le MPG et la vessie. Cette branche est parallèle et est parfois ancrée dans le nerf pelvien, puis traverse le ganglion.
- Confirmez que la structure est le nerf pelvien en passant sous un grossissement élevé pour déterminer que le nerf contient plusieurs fascicles vaguement agrégés, qui sont facilement distingués sous le microscope disséquant et sont caractéristiques de la pelvienne nerf, comme aucun des autres nerfs majeurs associés au ganglion montrent cette fasciculation claire.
- Identifiez le nerf hypogatricrique en visualisant les repères et les caractéristiques suivants.
- Identifiez où le nerf hypogatricrique rejoint le ganglion à son bord crânien, après avoir voyagé à côté de l’uretère.
- Confirmez que le nerf hypogatricien est beaucoup plus mince que les nerfs pelviens ou caverneux et qu’il n’est pas accompagné de gros vaisseaux.
- Identifiez le nerf caverneux en visualisant les repères et les caractéristiques suivants.
- Après avoir suivi le nerf pelvien à sa jonction avec le ganglion, suivez le nerf caverneux pendant qu’il se déplace caudally le long de la paroi latérale du col de l’utérus vers le vagin.
- Si le grossissement du microscope le permet, notez qu’il y a un petit groupe de nerfs délicats émergeant du ganglion entre les nerfs pelviens et caverneux ; ce sont les nerfs rectal qui se déplacent à l’intestin inférieur.
- Identifiez les nerfs accessoires en visualisant les repères et les caractéristiques suivants.
REMARQUE : Les nerfs accessoires sont difficiles à voir mais projettent de l’aspect médial du MPG. Après avoir dégagé le tissu pour permettre la visualisation du bord ventral du ganglion, identifier un groupe de nerfs très délicats qui se projettent vers les voies urinaires et reproductrices. - Identifiez le MPG en visualisant les caractéristiques suivantes.
- Visualisez les bords ventral, dorsal et crâniens du ganglion, qui forment une forme triangulaire.
- Confirmer l’emplacement de chaque nerf majeur: les nerfs pelviens émergeant du bord dorsal du ganglion, le nerf caverneux dans le coin le plus caunal du ganglion, le nerf hypogatricien de son bord crânien, et les nerfs accessoires émergeant du ganglion bord ventral.
- Enlèvement du MPG avec ses nerfs associés
- Placez doucement les forceps inclinés à pointe fine sous le nerf pelvien et faites glisser les forceps le long pour le libérer du col de l’utérus sous-jacent et des tissus environnants.
REMARQUE: Il peut également être possible d’isoler le nerf pelvien du petit vaisseau fonctionnant parallèlement à lui, mais pour la plupart des types d’expériences ce n’est pas essentiel. Si vous démontrez la dissection, placez une suture sous le nerf pelvien, pour faciliter sa visualisation. - Répétez le processus pour le nerf caverneux, puis le nerf hypogatricrique, et enfin les nerfs accessoires.
- Glissez doucement des forceps entre le ganglion et le col de l’utérus sous-jacent. Perturber toute connexion entre le ganglion et le col de l’utérus.
- Effacer toutes les connexions finales avec les tissus environnants pour les longueurs des nerfs nécessaires à l’expérience, puis couper chaque nerf.
- À l’aide de forceps fins, déplacez le ganglion avec ses nerfs à la solution appropriée pour l’expérience et confirmez que chacun des nerfs principaux sont intacts.
- Placez doucement les forceps inclinés à pointe fine sous le nerf pelvien et faites glisser les forceps le long pour le libérer du col de l’utérus sous-jacent et des tissus environnants.
3. Confirmation des composants ganglionnaires (facultatif)
- Après l’ablation du ganglion, plongez ganglion dans un fixatif histologique conventionnel (par exemple, 4% de formaline tamponnée) pour un minimum de 1 h, laver fixatif avec 0,1 M tampon de phosphate et tissu de processus pour la cryosection et l’immunohistochimie de fluorescence, comme précédemment décrit13.
REMARQUE : De nombreux anticorps de haute qualité qui reconnaissent spécifiquement ces trois marqueurs neuronaux sont disponibles dans le commerce. Voir tableau des matériaux pour les réactifs utilisés pour l’étiquetage indiqué dans la figure 3. - Alternativement, traiter les ganglions intacts (wholemounts) pour l’immunohistochimie en utilisant une méthode similaire à ci-dessus, mais en augmentant les temps d’incubation pour les anticorps à 4 jours (anticorps primaires) et 2 jours (anticorps secondaires).
- Pour démontrer une population importante d’axones sensoriels, utilisez des anticorps contre le peptide lié au gène de la calcitonine (CGRP).
REMARQUE : La dilution recommandée de l’anticorps utilisé dans cette étude est de 1:5,000. - Pour démontrer les neurones sympathiques norarénergiques, utilisez des anticorps contre l’hydroxylase de tyrosine (TH).
REMARQUE : La dilution recommandée de l’anticorps utilisé dans cette étude est de 1:5,000. - Pour démontrer une population importante de neurones cholinergiques, utilisez des anticorps contre la synthase d’oxyde nitrique neuronal (NOS).
REMARQUE : La dilution recommandée de l’anticorps utilisé dans cette étude est de 1:500.
Representative Results
Une dissection réussie permettra non seulement d’enlever le corps complet du MPG intact, mais aussi de conserver le premier segment de chacun des nerfs majeurs encore attachés. Ces nerfs sont des indicateurs précieux de l’orientation ganglionnaire in vivo et fournissent donc des informations essentielles pour de nombreux types d’études anatomiques (p. ex., cartographier les modèles d’expression ou les changements cellulaires après une perturbation expérimentale). Bien que la préservation des nerfs associés puisse être moins importante pour certains types d’expériences (p. ex., dissociation ganglionnaire pour la culture des neurones isolés), la présence de nerfs fournit également un moyen de traiter le ganglion sans toucher (et potentiellement endommager) les corps cellulaires neuronaux.
Une dissection infructueuse aura un ganglion incomplet ou endommagé, ou lorsque les nerfs primaires ne sont plus attachés. Il est également possible que les ganglions ou les nerfs soient endommagés sans le savoir pendant la dissection, soit parce que les dommages physiques sont trop subtils pour être détectés sous le microscope disséqué, soit parce que les dommages ne deviennent apparents que lors de certains types d’essais. Par exemple, si le tissu ganglionnaire devient sec pendant la dissection, le tissu peut sembler normal pendant la manipulation ultérieure, mais montrera des niveaux élevés de fluorescence non spécifique à la surface.
Des exemples de MPG disséqué sont montrés dans la figure 3, qui fournit des exemples de l’ensemble du MPG visualisé comme un ganglion complet d’épaisseur entière(figure 3A) et un MPG qui a été cryosectionné pour effectuer l’immunofluorescence pour démontrer les neurones norarénergiques et cholinergiques(figure 3B,C).
Figure 1 : Repères anatomiques pour la visualisation de MPG dans un rat mâle. 1 vésicule séminale; 2, vessie urinaire; 3, glande coagulante ; 4 et 5, nerfs accessoires; 6, prostate (lobe ventral); 7, nerf caverneux; 8, vas deferens; 9, urètre; 10, muscle bulbocavernosus; 11, muscle ischiocavernosus; 12, nerfs rectal; 13, ravisseur caudae externus; 14, ganglion pelvien majeur; 15, nerf pelvien; 16, ravisseur caudae internus; 17, nerf hypogatricien ; 18, veine iliaque interne; 19, brevis de caudae de flécheur ; 20, flexeur caudae longus; 21, uretère; 22, psoas major; 23, aorte abdominale; 24, cava vena inférieure. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Repères anatomiques pour la visualisation de MPG dans un rat femelle. 1, le côlon distal; 2, vessie urinaire; 3, corps utérin; 4, nerf hypogatricien ; 5, nerfs accessoires; 6, ganglion pelvien majeur; 7, nerf caverneux; 8, vagin; 9, urètre; 10, rectum; 11, ravisseur caudae externus; 12, nerfs rectal; 13, brevis de caudae de flécheur ; 14, nerf pelvien; 15, veine iliaque interne; 16, ravisseur caudae internus; 17, flexeur caudae longus; 18, artère iliaque externe; 19, uretère; 20, psoas major; 21, corne utérine; 22, aorte abdominale. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : MPG immunohistochimiquement étiqueté des rats mâles adultes. Toutes les préparations ont été visualisées avec un microscope à fluorescence à large champ conventionnel équipé d’un appareil photo monochrome, puis numériquement colorisé. (A) Wholemount (épaisseur complète), MPG fixe avec les nerfs associés, immunohistochemically étiqueté pour les nerfs sensoriels qui expriment le peptide lié au gène de la calcitonine (CGRP); 1, nerf pelvien (montrant les fascicles multiples); 2, nerf caverneux; 3, nerf hypogatricien ; 4, nerfs accessoires; 5, nerfs rectal; 6, ganglion pelvien majeur (MPG). (B,C) Cryosections (14 m) de MPG fixe, étiqueté immunohistochimiquement pour démontrer la nature mixte norarénergique-cholinergique du ganglion; (B) neurones noradrénergiques démontrés par l’anticorps pour l’hydroxylase de tyrosine et (C) une population importante des neurones cholinergiques par anticorps pour la synthase d’oxyde nitrique neuronal. La barre d’étalonnage représente (A) 1 000 m, (B,C) 200 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus large de ce chiffre.
Discussion
Le contrôle neuronal des organes pelviens est médié par des voies complexes, y compris les composants sensoriels somatiques, parasympathiques, sympathiques et viscérals14,15,16,17. La plupart de ces voies proviennent ou passent par le MPG. Les protocoles de dissection décrits ici fournissent une introduction à l’anatomie de MPG, aux nerfs associés connexes et aux repères anatomiques macroscopiques à proximité ; ces derniers sont illustrés par des schémas anatomiques. D’autres approches de la dissection MPG peuvent également être couronnées de succès, mais nous trouvons celui décrit ici pour être robuste et approprié pour un chercheur nouveau dans ce domaine du système nerveux.
Les aspects les plus critiques du protocole sont l’identification correcte de chaque nerf majeur et l’ablation complète du tissu MPG. Avec une visualisation et une manipulation minutieuses des tissus, les tissus MPG peuvent être enlevés pour des études in vitro anatomiques, moléculaires et électrophysiologiques18,19,20,21,22. Le protocole peut également être adapté pour la manipulation expérimentale in vivo23,24,25, notant que dans ce cas, un grand soin doit être pris pour minimiser le contact avec les nerfs primaires associés au ganglion ou pour endommager la vascularisation à proximité. Si l’expérience nécessite une dénervation sélective par interruption d’un ou plusieurs nerfs, il est recommandé de ligate le nerf coupé pour empêcher la réinnervation et la confusion des analyses. Ce protocole de dissection pourrait également être utilisé pour la souris, où il ya aussi un MPG avec la fonction comparable26,27,28.
Pour les études neuroanatomiques, la meilleure conservation des antigènes et de la structure tissulaire est obtenue en disséquant le MPG d’un animal anesthésié qui a été perfusé transcardially avec le fixatif histologique approprié à l’expérience29; cependant, l’identification du ganglion et des structures nerveuses sont plus difficiles après ce processus, car la coloration de tissu est perdue. Il est recommandé de devenir compétent dans l’identification et la dissection du ganglion d’animaux non perfusés avant de tenter cette dissection après la perfusion. De même, il est recommandé de devenir d’abord compétent dans la dissection chez les mâles parce que pour les animaux d’âge et de taille du corps équivalents, le MPG et ses nerfs associés sont beaucoup plus petits chez les femelles.
Pour valider que le tissu enlevé est en effet le MPG, le chercheur est d’abord conseillé de vérifier l’emplacement et les caractéristiques de chaque nerf primaire. Beaucoup de dissecteurs trouvent le nerf pelvien et le nerf caverneux le plus facile à identifier in situ ; les nerfs hypogatriques et accessoires sont plus délicats et plus difficiles à distinguer du tissu environnant. Si ces nerfs ne sont plus disponibles en raison de problèmes pendant la dissection, ou s’il y a une incertitude concernant leur structure, il est recommandé que les dissections initiales de MPG soient caractérisées avec l’histologie conventionnelle (pour confirmer la présence des corps de cellules neuronales8) et deuxièmement avec l’immunohistochimie (pour identifier que les neurones cholinergiques et noradériques sont présents30,31) (figure 3). Pour valider l’identification correcte des nerfs principaux, les nerfs caverneux sont facilement identifiés par leur forte densité de corps de cellules neuronales dans leur partie initiale près du MPG ; la plupart de ces neurones expriment des marqueurs de neurones cholinergiques et nitrégiques32,33. Les nerfs pelviens, hypogatricien et accessoire ont très peu de corps cellulaires neuronaux34.
Il y a plusieurs pièges communs dans l’exécution de cette dissection. Si les dissecteurs novices ont du mal à trouver l’un des nerfs majeurs ou le MPG, ils sont encouragés à revenir aux étapes qui décrivent les points de repère clés. Il est très fréquent de se concentrer sur la recherche des microstructures que l’on perd la trace du contexte macroscopique. Le plus souvent, les dissecteurs novices se déplacent trop rostral dans leur site de dissection ou restent trop «superficiels», c’est-à-dire trop près de l’ouverture ventrale de l’abdomen, plutôt que d’examiner des structures plus profondes (c.-à-d., plus dorsales). Un problème commun pendant la dissection est dommages à la vascularisation pendant la dissection. Si le saignement commence, maintenez doucement un applicateur à pointe de coton sur la source jusqu’à ce que le saignement cesse, puis rincer la zone généreusement avec saline avant de recommer la dissection. Il est possible que le MPG ne sera pas utilisable pour les expériences si contaminé avec trop de sang ou si la dissection est retardée trop longtemps en attendant que les saignements s’arrêtent. Une autre erreur commune de dissection est des dommages à la capsule de la prostate qui altère considérablement la visualisation et l’enlèvement de MPG. Cette capsule est une structure très délicate qui est facilement perforée tout en enlevant la graisse de la paroi latérale de la prostate, même si vous n’utilisez qu’un applicateur à pointe de coton. Enfin, les nerfs principaux associés au MPG sont facilement endommagés pendant le processus d’identification de chacun d’eux, puis lors de l’enlèvement du MPG. Les disséquents sont encouragés à développer une routine par laquelle chaque nerf est isolé à son tour, dans un ordre particulier, de sorte qu’il y ait moins de possibilités de confusion pendant les dernières étapes de l’enlèvement des ganglions.
Cette dissection n’a pas cherché à retracer chacun des composants des nerfs accessoires à des organes spécifiques, ou à identifier chacune des nombreuses microganglia qui se trouvent à divers points entre les ganglions pelviens et les organes pelviens8. Ceux-ci sont assez difficiles à visualiser in vivo sans utiliser des taches spécifiques; cependant, ils peuvent être enlevés en suivant chacun des tracts nerveux vers les organes, et en utilisant des taches neurales spécifiques post hoc pour déterminer l’emplacement du ganglion. Ces microganglias, même si ne comprennent qu’une petite fraction de la population neuronale par rapport au MPG, peuvent fournir des types spécifiques d’entrée aux organes auxquels ils sont les plus étroitement situés. Nous notons ici une limitation dans le domaine que ni ces microganglia ni beaucoup de petites voies nerveuses sortant du MPG pour se rendre aux organes pelviens encore ont largement accepté des noms. En outre, une étude tout aussi détaillée de la microganglia n’a pas encore été menée chez les rats femelles.
En résumé, le protocole et les schémas fournis ici fournissent aux chercheurs des outils pour étudier les structures primaires fournissant l’approvisionnement en nerf autonome aux organes pelviens, ainsi que les principaux conduits périphériques des nerfs sensoriels de la racine dorsale lumbosacral ganglions qui voyagent via le MPG aux organes pelviens.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les recherches rapportées dans cette publication ont été appuyées par le Bureau du directeur, National Institutes of Health, Stimulating Peripheral Activity to Relieve Conditions (SPARC) Program, Award Number OT2OD023872. Le contenu est uniquement la responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles des National Institutes of Health. La bourse du Dr Bertrand au laboratoire du Dr Keast a été financée par : Le CHU de Nîmes, la faculté de médecine de Montpellier-Nîmes, L’Association Française de Chirurgie (AFC), la Société Interdisciplinaire francophone d’UroDynamique et de Pelvipérinéologie (SIFUD-PP) et le Programme Populaire (Actions Marie Curie) du Septième Programme-cadre de l’Union européenne (FP7/2007-2013) dans le cadre de l’accord de subvention du REA No PCOFUND-GA-2013-609102, par le biais du programme PRESTIGE coordonné par le Campus France.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-calcitonin gene-related peptide; RRID AB_259091 | Merck | C8198 | |
| Anti-nitric oxide synthase, RRID AB_2533937 | Invitrogen | 61-7000 | |
| Anti-rabbit IgG, Cy3 tag, RRID AB_2307443 | Jackson | 711-165-152 | |
| Anti-tyrosine hydroxylase, RRID AB_390204 | Millipore | AB152 | |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ40, SC | |
| Dumont AA epoxy coated forceps | Fine Science Tools | 11210-10 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Dumont #5/45 curved forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| LED light source | Schott | KL 1600 | |
| Micro-Adson forceps | Fine Science Tools | 11019-12 | |
| Student Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14054-13 |
References
- Greene, E. C. Anatomy of the Rat. , American Philosophical Society. Philadelphia, PA. (1935).
- Krinke, G. J. The Laboratory Rat. , Elsevier. Amsterdam, Netherlands. (2000).
- Keast, J. R. Pelvic ganglia. Autonomic Ganglia. McLachlan, E. M. , Harwood Academic. Luxembourg. 445-480 (1995).
- Keast, J. R. Unusual autonomic ganglia: connections, chemistry, and plasticity of pelvic ganglia. International Review of Cytology. 193, 1-69 (1999).
- Alsaid, B., et al. Coexistence of adrenergic and cholinergic nerves in the inferior hypogastric plexus: anatomical and immunohistochemical study with 3D reconstruction in human male fetus. Journal of Anatomy. 214 (5), 645-654 (2009).
- Keast, J. R., Smith-Anttila, C. J., Osborne, P. B. Developing a functional urinary bladder: a neuronal context. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 53 (2015).
- Purinton, P. T., Fletcher, T. F., Bradley, W. E. Gross and light microscopic features of the pelvic plexus in the rat. Anatomical Record. 175 (4), 697-705 (1973).
- Arellano, J., Xelhuantzi, N., Mirto, N., Hernández, M. E., Cruz, Y. Neural interrelationships of autonomic ganglia from the pelvic region of male rats. Autonomic Neuroscience. 217, 26-34 (2019).
- Greenwood, D., Coggeshall, R. E., Hulsebosch, C. E. Sexual dimorphism in the numbers of neurons in the pelvic ganglia of adult rats. Brain Research. 340 (1), 160-162 (1985).
- Nadelhaft, I., Booth, A. M. The location and morphology of preganglionic neurons and the distribution of visceral afferents from the rat pelvic nerve: a horseradish peroxidase study. Journal of Comparative Neurology. 226 (2), 238-245 (1984).
- Kessler, T. M., Birder, L. A., Gomery, P.
- Keast, J. R., Osborne, P. B. Intracardiac perfusion with fixative for anatomical studies [keast-001-stage02]. , https://www.protocols.io/view/intracardiac-perfusion-with-fixative-for-anatomica-w3ffgjn (2019).
- Keast, J. R., Osborne, P. B. Immunohistochemical analysis of ganglion neurons innervating the lower urinary tract [keast-001-stage03]. , https://www.protocols.io/view/immunohistochemical-analysis-of-ganglion-neurons-i-w3efgje (2019).
- Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C.
- Keast, J. R., Booth, A., de Groat, W. C. Distribution of neurons in the major pelvic ganglion of the rat which supply the bladder, colon or penis. Cell and Tissue Research. 256 (1), 105-112 (1989).
- Dail, W. G., Minorsky, N.
- Dail, W. G. The pelvic plexus: innervation of pelvic and extrapelvic visceral tissues. Microscopy Research and Technique. 35 (2), 95-106 (1996).
- Purves-Tyson, T. D., Arshi, M. S., Handelsman, D. J., Cheng, Y., Keast, J. R. Androgen and estrogen receptor-mediated mechanisms of testosterone action in male rat pelvic autonomic ganglia. Neuroscience. 148 (1), 92-104 (2007).
- Nangle, M. R., Keast, J. R. Semaphorin 3A inhibits growth of adult sympathetic and parasympathetic neurones via distinct cyclic nucleotide signalling pathways. British Journal of Pharmacology. 162 (5), 1083-1095 (2011).
- Tan, H., Mawe, G. M., Vizzard, M. A. Electrical properties of neurons in the intact rat major pelvic ganglion. Autonomic Neuroscience. 134 (1-2), 26-37 (2007).
- Park, K. S., et al. An alpha3beta4 subunit combination acts as a major functional nicotinic acetylcholine receptor in male rat pelvic ganglion neurons. Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 452 (6), 775-783 (2006).
- Park, K. S., et al. Modulation of N-type Ca2+ currents by A1-adenosine receptor activation in male rat pelvic ganglion neurons. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 299 (2), 501-508 (2001).
- Payne, S. C., Belleville, P. J., Keast, J. R. Regeneration of sensory but not motor axons following visceral nerve injury. Experimental Neurology. 266, 127-142 (2015).
- Nangle, M. R., Proietto, J., Keast, J. R. Impaired cavernous reinnervation after penile nerve injury in rats with features of the metabolic syndrome. Journal of Sexual Medicine. 6 (11), 3032-3044 (2009).
- Kepper, M. E., Keast, J. R. Specific targeting of ganglion cell sprouts provides an additional mechanism for restoring peripheral motor circuits in pelvic ganglia after spinal nerve damage. Journal of Neuroscience. 18 (19), 7987-7995 (1998).
- Yan, H., Keast, J. R. Neurturin regulates postnatal differentiation of parasympathetic pelvic ganglion neurons, initial axonal projections, and maintenance of terminal fields in male urogenital organs. Journal of Comparative Neurology. 507 (2), 1169-1183 (2008).
- Ritter, K. E., Wang, Z., Vezina, C. M., Bjorling, D. E., Southard-Smith, E. M. Serotonin receptor 5-HT3A affects development of bladder innervation and urinary bladder function. Frontiers in Neuroscience. 11, 690 (2017).
- Tompkins, J. D., Girard, B. M., Vizzard, M. A., Parsons, R. L. VIP and PACAP effects on mouse major pelvic ganglia neurons. Journal of Molecular Neuroscience. 42 (3), 390-396 (2010).
- Forrest, S. L., Payne, S. C., Keast, J. R., Osborne, P. B. Peripheral injury of pelvic visceral sensory nerves alters GFRα (GDNF family receptor alpha) localization in sensory and autonomic pathways of the sacral spinal cord. Frontiers in Neuroanatomy. 9, 43 (2015).
- Keast, J. R., Luckensmeyer, G. B., Schemann, M. All pelvic neurons in male rats contain immunoreactivity for the synthetic enzymes of either noradrenaline or acetylcholine. Neuroscience Letters. 196 (3), 209-212 (1995).
- Keast, J. R., de Groat, W. C. Immunohistochemical characterization of pelvic neurons which project to the bladder, colon, or penis in rats. Journal of Comparative Neurology. 288 (3), 387-400 (1989).
- Dail, W. G., Moll, M. A., Weber, K. Localization of vasoactive intestinal polypeptide in penile erectile tissue and in the major pelvic ganglion of the rat. Neuroscience. 10 (4), 1379-1386 (1983).
- Keast, J. R. A possible neural source of nitric oxide in the rat penis. Neuroscience Letters. 143 (1-2), 69-73 (1992).
- Kepper, M. E., Keast, J. R. Transmitter profile and spinal inputs of pelvic ganglion cells projecting with preganglionic axons along the hypogastric and pelvic nerves of the male rat. Neuroscience Letters. 280 (2), 123-126 (2000).
