Summary
Os principais gânglios pélvicos contêm neurônios parassimpáticos e simpáticos que inervam os órgãos pélvicos. Aqui descrevemos um método de dissecção e fornecemos esquemas para identificação desses gânglios e seus nervos associados. Esses métodos podem ser aplicados à manipulação experimental desses gânglios in vivo ou à remoção pós-morte para estudos posteriores.
Abstract
Os gânglios pélvicos principais bilaterais (MPG; sinônimo, gânglios pélvicos) são a principal fonte de neurônios pós-ganglionários e parassimpáticos que inervam órgãos pélvicos de roedores; a estrutura funcionalmente equivalente em humanos é o plexo hipogástrico inferior. Os principais gânglios pélvicos também fornecem a rota pela qual os axônios sensoriais lombar e sacral atingem os órgãos pélvicos. Esses gânglios complexos e mistos podem ser desafiadores para identificar e dissecar para um estudo experimental mais aprofundado de mecanismos autônomos normais ou para estabelecer modelos pré-clínicos de doença, lesão ou dor visceral. Aqui descrevemos um protocolo para acessar e visualizar esses gânglios e seus tratos nervosos associados. Fornecemos este protocolo com esquemas para ratos machos e fêmeas, pois o tamanho do gânglio e os marcos para identificação diferem entre os sexos. O protocolo descreve a remoção do gânglio para estudos in vitro, mas este método pode ser integrado em um protocolo de recuperação cirúrgica para intervenções experimentais (por exemplo, esmagamento nervoso, ressecção nervosa) ou para mapeamento de circuitos neuronais (por exemplo, por microinjeção de rastreadores neurais). Também demonstramos as estruturas primárias do gânglio e seus nervos associados imediatamente após a dissecção e após a coloração imunohistoquímica.
Introduction
O rato é uma das espécies mais bem caracterizadas utilizadas no estudo da fisiologia e anatomia do órgão pélvico. Embora existam excelentes recursos para descrições desses órgãos1,2, eles geralmente não fornecem informações sobre as estruturas neurais relacionadas ou o fazem em resolução insuficiente para orientar um estudo experimental. Como detalhado mais adiante, a organização dos gânglios autônomos que regulam a função do órgão pélvico é bastante diferente do resto do sistema nervoso autônomo, dificultando a inferação precisa das características de inervação pélvica a partir de informações neuroanatômicas disponíveis para outros gânglios autônomos. Essa deficiência de recursos para orientar pesquisadores que entram nessa área pode ter retardado a pesquisa sobre regulação neural de órgãos pélvicos. Aqui descrevemos protocolos de acesso a esta região do sistema nervoso para estudos in vitro ou intervenção experimental.
Os gânglios pélvicos principais bilaterais (MPG; sinônimos: gânglios pélvicos; gânglios paracervicais [fêmeas]; O gânglio de Frankenhäuser [fêmea]) é a principal fonte de neurônios simpáticos e parassimpáticos pós-ganglionários e parassimpáticos que inserem órgãos pélvicos de roedores; o plexo hipogástrico inferior compreende a estrutura neuronal equivalente em humanos3,4,5,6. Projeções sensoriais de gânglios radiculares lombares e sacral também viajam através do MPG para alcançar os órgãos pélvicos. Portanto, compreender os circuitos neurais e a biologia do MPG é fundamental para estudos pré-clínicos sobre uma miríade de condições clínicas relacionadas ao desenvolvimento e função adulta dos órgãos pélvicos. Várias excelentes descrições de roedores MPG foram publicadas7,8, mas nossa experiência é que, em geral, essas descrições nem sempre fornecem orientação suficiente para praticamente informar uma dissecção experimental ou manipulação dessas estruturas quando a recuperação do animal é necessária. Além disso, a maioria dos estudos de MPG se concentra em ratos machos. Em ratos fêmeas, o MPG é menor9 e tem marcos anatômicos distintos, e, portanto, requerem um guia distintamente adaptado para visualização e dissecção.
Caminhos simpáticos e parassimpáticos são distinguidos por sua anatomia, especificamente a localização de seus neurônios pré-ganglionários, com caminhos simpáticos com neurônios pré-ganglionários na medula espinhal toraco-lombar e os neurônios pré-ganglionários parassimpáticos localizados no tronco cerebral (projeções do nervo cranial) e medula espinhal sacral. Na maioria das outras regiões do sistema autônomo, seus neurônios gângsteres alvo estão localizados em gânglios simpáticos ou parassimpáticos. No entanto, o MPG é incomum em ser gânglios simpáticos-parassimpáticos e, portanto, em escala macroscópica são locais de convergência de axônios pré-ganglionic de ambas as regiões espinhais toraco-lombar e sacral. Por isso, incluímos em nossos protocolos a localização e a descrição desses tratos nervosos primários que conectam cada região espinhal com o MPG, facilitando a análise experimental ou manipulação separada desses componentes neurais. Notamos também para os leitores que comparam especificamente esses gânglios entre espécies, que em roedores os neurônios pré-ganglionários espinhais que são "funcionalmente sacral", por exemplo, são ativos e necessários durante a micturição, defecação e ereção peniana, estão localizados nos níveis espinhais L6-S1 em vez de exclusivamente nos segmentos sacral10; da mesma forma, os gânglios radiculares dorsais L6 e S1 fornecem a entrada sensorial 'sacral' principal aos órgãos pélvicos. Em roedores, a entrada sensorial e pré-ganglionária de circuitos neurais mais rostrais está concentrada nos níveis de coluna L1 e L210.
Aqui descrevemos um protocolo para acessar o MPG e seus tratos nervosos associados em ratos machos e fêmeas, e apoiamos isso com esquemas para ilustrar marcos específicos. Este protocolo orienta o acesso cirúrgico a essas estruturas em um contexto experimental de remoção do tecido para estudos in vitro, por exemplo, isolando neurônios MPG para caracterização molecular ou cultura primária. Também pode ser adaptado à remoção de MPG após perfusão intracardíaca com fixação, embora esta seja uma dissecção mais difícil porque o tecido neural se torna mais difícil de visualizar quando os tecidos adjacentes são desprovidos de sangue. Este protocolo também pode ser integrado em um cenário cirúrgico para intervenção experimental dessas vias nervosas (por exemplo, ressecção nervosa, microinjeção de rastreadores neurais). Esses tipos de dissecções são cada vez mais importantes para o campo crescente da medicina bioeletrônica, onde novas metas e abordagens de neuromodulação para o tratamento das condições clínicas das vísceras pélvicas estão sendo desenvolvidas11. Apresentamos o protocolo completo primeiro para ratos machos, depois uma réplica do protocolo adaptado especificamente para ratos fêmeas.
Protocol
Todos os procedimentos devem ser realizados de acordo com os requisitos institucionais e do órgão de financiamento para experimentação animal. O uso de animais para esta dissecação e o protocolo para eutanásia foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Universidade de Melbourne (Protocolo número 1814639).
NOTA: As dissecções aqui ilustradas foram realizadas em ratos adultos (~10 semanas) masculinos e femininos Sprague-Dawley (Biomedical Sciences Animal Facility, Universidade de Melbourne), pesando 280 g (feminino) e 350 g (masculino). Antes dessas dissecções, os ratos foram eutanizados em uma câmara de CO2 por 4-5 min. Imediatamente após a morte, mpg foram dissecados. Se dissecar tecido de um animal que tenha sofrido perfusão transcardíaca com fixação, tome precauções para proteger o operador da exposição a fixação, ou seja, realize dissecção em armário de fumaça ou armário de rascunho e use equipamento de proteção pessoal adequado. Um protocolo para perfusão transcardíaca foi publicado em detalhes12.
1. Gânglio pélvico maior e nervos adjacentes: acesso e ressecção em um rato macho
NOTA: A Figura 1 mostra marcos anatômicos para visualização de MPG em um rato macho.
- Acesso à cavidade abdominal e pélvis
- Coloque o rato em posição supina e acesse o abdômen e a pelve através de uma incisão de linha média ventral, tomando cuidado para evitar a contaminação do campo cirúrgico com peles.
- Mova suavemente os órgãos abdominais para um lado usando fórceps ou aplicadores com ponta de algodão. Observe a localização dos lóbulos ventral da próstata e da bexiga urinária.
- Mova a vesícula seminal para o lado contralateral.
- Corte os vasos deferem para fornecer melhor acesso à área sobreposta ao gânglio.
NOTA: A partir deste ponto da dissecção, o tecido não deve secar; manter o tecido úmido com soro fisiológico (para dissecção de tecido fresco) ou fixador (para animais fixos por perfusão). Manter o tecido úmido com soro insona não só beneficia a estrutura tecidual, mas também facilita a dissecção, pois os nervos secos são mais frágeis e rasgam mais facilmente durante o manuseio. - Identificar o lobo dorsolateral da próstata, na superfície dorsal da qual está a localização do gânglio; isso ainda não será visível.
- Para visualizar o gânglio, limpe cuidadosamente os tecidos próximos e sobrepostos ao gânglio. Se necessário, use um retrátil para manter o campo de dissecção limpo.
- Remova um agregado próximo de tecido adiposo e abra a fáscia lateral da pelve.
- Dissecção do MPG e seus nervos associados
- Identifique os seguintes locais que fornecem pontos de referência para os próximos passos da dissecção: o lobo dorsolateral da próstata (o gânglio está localizado na superfície deste lóbulo, um pouco mais caudal do que a junção entre a vesícula seminal e próstata) e as vesículas seminais (onde convergem na linha média indica a localização do gânglio no eixo rostrocaudal do animal).
- Conforme exigido a partir deste ponto, remova cuidadosamente qualquer tecido que impeça a visão completa das estruturas neurais, evitando danos à fina cápsula da próstata ou vasos principais.
- Identifique o nervo pélvico visualizando os seguintes marcos e características.
- Encontre a veia ilíaca interna e seu ramo fino projetando-se em direção ao MPG e à bexiga. Este ramo vascular corre paralelamente e às vezes é incorporado dentro do nervo pélvico, em seguida, atravessa o gânglio.
- Coloque suavemente os fórceps angulares de ponta fina o nervo pélvico e deslize os fórceps para libertá-lo do tecido circundante.
NOTA: Também pode ser possível isolar o nervo pélvico do pequeno vaso que corre paralelo a ele, mas para a maioria dos tipos de experimentos isso não é essencial. Confirme que a estrutura é o nervo pélvico, visualizando alta ampliação para determinar que o nervo contém vários fascicles agregados, que são facilmente distinguidos o microscópio dissecando e são característicos do pélvico nervo, como nenhum dos outros nervos principais associados com o gânglio mostram esta fasciculação clara.
- Identifique o nervo cavernoso visualizando os seguintes marcos e características.
- Depois de seguir o nervo pélvico até sua junção com o gânglio, siga o nervo cavernoso enquanto ele viaja pela próstata e, em seguida, caudally em direção aos corpos cavernosos do pênis.
- Se a ampliação do microscópio permitir, note-se que há um pequeno grupo de nervos delicados emergindo do gânglio entre os nervos pélvico e cavernoso; estes são os nervos retais que viajam para o intestino inferior.
- Identifique o nervo hipogástrico visualizando os seguintes marcos e características.
- Identifique onde o nervo hipogástrico se junta ao gânglio em sua borda craniana, depois de viajar ao lado do ureter.
- Confirme que o nervo hipogástrico é muito mais fino que os nervos pélvicos ou cavernosos e não é acompanhado por vasos grandes.
- Identifique o MPG visualizando os seguintes recursos.
- Visualize as bordas ventral, dorsal e craniana do gânglio, formando uma forma triangular.
- Confirme a localização de cada nervo principal: os nervos pélvicos emergindo da borda dorsal do gânglio, o nervo cavernoso no canto mais caudal do gânglio, o nervo hipogástrico de sua borda craniana, e os nervos acessórios emergindo do gânglio borda ventral.
- Identifique os nervos do acessório visualizando os seguintes marcos e características.
- Após limpar tecido para permitir a visualização da borda ventral do gânglio, identifique um conjunto de nervos que se projetam em direção aos tratos urinário e reprodutivo.
- Se a ampliação do microscópio permitir, identifique um grupo caudal de nervos que entram entre os lóbulos da próstata e um grupo rostral entre a vesícula seminal e a bexiga.
- Remoção do MPG com seus nervos associados
- Deslize suavemente os fórceps entre o gânglio e a glândula de próstata subjacente, tomando cuidado para não perfurar a fina cápsula da próstata. Interrompa qualquer conexão entre o gânglio e a próstata.
- Limpe qualquer conexão final com tecidos circundantes para os comprimentos dos nervos necessários para o experimento, em seguida, corte cada nervo.
- Usando fórceps finos, mova o gânglio com seus nervos para a solução apropriada para o experimento e confirme que cada um dos nervos principais está intacto.
2. Gânglio pélvico maior e nervos adjacentes: acesso e ressecção em um rato fêmea
NOTA: A Figura 2 mostra marcos anatômicos para visualização de MPG em um rato fêmea.
- Acesso à cavidade abdominal e pélvis
- Coloque o rato em posição supina e acesse o abdômen e a pelve através de uma incisão de linha média ventral, tomando cuidado para evitar a contaminação do campo cirúrgico com peles.
NOTA: A partir deste ponto da dissecção, o tecido não deve secar; manter o tecido úmido com soro fisiológico (para dissecção de tecido fresco) ou fixador (para animais fixos por perfusão). - Mova suavemente os órgãos abdominais para um lado usando fórceps ou aplicadores com ponta de algodão. Observe a localização do chifre uterino, bexiga urinária e reto.
- Corte os vasos ovariano e uterino e retraia o chifre uterino.
- Insira o espaço peritoneal e limpe suavemente um agregado de tecido adiposo localizado perto do colo uterino.
- Coloque o rato em posição supina e acesse o abdômen e a pelve através de uma incisão de linha média ventral, tomando cuidado para evitar a contaminação do campo cirúrgico com peles.
- Dissecção do MPG e seus nervos associados
- Identificar a parede lateral do colo uterino, apenas caudal à sua junção com os chifres uterinos; esta região é o principal marco para a definição da localização do MPG no eixo rostrocaudal do animal.
- Conforme exigido a partir deste ponto, remova cuidadosamente qualquer tecido que impeça a visão completa das estruturas neurais, evitando danos aos principais vasos.
- Identifique o nervo pélvico visualizando os seguintes marcos e características.
- Encontre a veia ilíaca interna e seu ramo fino projetando-se em direção ao MPG e à bexiga. Este ramo corre paralelamente e às vezes é incorporado dentro do nervo pélvico, em seguida, atravessa o gânglio.
- Confirme que a estrutura é o nervo pélvico, visualizando alta ampliação para determinar que o nervo contém vários fascicles agregados, que são facilmente distinguidos o microscópio dissecando e são característicos do pélvico nervo, como nenhum dos outros nervos principais associados com o gânglio mostram esta fasciculação clara.
- Identifique o nervo hipogástrico visualizando os seguintes marcos e características.
- Identifique onde o nervo hipogástrico se junta ao gânglio em sua borda craniana, depois de viajar ao lado do ureter.
- Confirme que o nervo hipogástrico é muito mais fino que os nervos pélvicos ou cavernosos e não é acompanhado por vasos grandes.
- Identifique o nervo cavernoso visualizando os seguintes marcos e características.
- Depois de seguir o nervo pélvico até sua junção com o gânglio, siga o nervo cavernoso enquanto ele viaja caudally ao longo da parede lateral do colo uterino em direção à vagina.
- Se a ampliação do microscópio permitir, note-se que há um pequeno grupo de nervos delicados emergindo do gânglio entre os nervos pélvico e cavernoso; estes são os nervos retais que viajam para o intestino inferior.
- Identifique os nervos do acessório visualizando os seguintes marcos e características.
NOTA: Os nervos acessórios são difíceis de ver, mas projetam a partir do aspecto medial do MPG. Após limpar tecido para permitir a visualização da borda ventral do gânglio, identifique um aglomerado de nervos muito delicados que se projetam em direção aos tratos urinário e reprodutivo. - Identifique o MPG visualizando os seguintes recursos.
- Visualize as bordas ventral, dorsal e craniana do gânglio, que formam uma forma triangular.
- Confirme a localização de cada nervo principal: os nervos pélvicos emergindo da borda dorsal do gânglio, o nervo cavernoso no canto mais caudal do gânglio, o nervo hipogástrico de sua borda craniana, e os nervos acessórios emergindo do gânglio borda ventral.
- Remoção do MPG com seus nervos associados
- Coloque suavemente os fórceps angulares de ponta fina o nervo pélvico e deslize os fórceps para libertá-lo do colo uterino subjacente e tecido circundante.
NOTA: Também pode ser possível isolar o nervo pélvico do pequeno vaso que corre paralelo a ele, mas para a maioria dos tipos de experimentos isso não é essencial. Se demonstrar a dissecção, coloque uma sutura o nervo pélvico, para facilitar sua visualização. - Repita o processo para o nervo cavernoso, depois o nervo hipogástrico, e finalmente os nervos acessórios.
- Deslize suavemente os fórceps entre o gânglio e o colo uterino subjacente. Interrompa qualquer conexão entre o gânglio e o colo do útero.
- Limpe qualquer conexão final com tecidos circundantes para os comprimentos dos nervos necessários para o experimento, em seguida, corte cada nervo.
- Usando fórceps finos, mova o gânglio com seus nervos para a solução apropriada para o experimento e confirme que cada um dos nervos principais está intacto.
- Coloque suavemente os fórceps angulares de ponta fina o nervo pélvico e deslize os fórceps para libertá-lo do colo uterino subjacente e tecido circundante.
3. Confirmação de componentes de gânglio (opcional)
- Após a remoção do gânglio, mergulhe o gânglio em um fixador histológico convencional (por exemplo, 4% de formalina tamponada) por um mínimo de 1h, lave fixação com tampão fosfato de 0,1 M e tecido de processo para criosecção e imunohistoquímica fluorescência, como descrito anteriormente13.
NOTA: Muitos anticorpos de alta qualidade que reconhecem especificamente esses três marcadores neurais estão disponíveis comercialmente. Consulte Tabela de Materiais para os reagentes utilizados para a rotulagem indicada na Figura 3. - Alternativamente, processe gânglios intactos (conjuntos) para imunohistoquímica usando um método semelhante ao anterior, mas aumentando os tempos de incubação para os anticorpos para 4 dias (anticorpo primário) e 2 dias (anticorpo secundário).
- Para demonstrar uma grande população de axôns sensoriais, use anticorpos contra peptídeos relacionados com o gene calcitonina (CGRP).
NOTA: A diluição recomendada do anticorpo utilizado neste estudo é de 1:5.000. - Para demonstrar neurônios simpáticos noradrenergic, use anticorpos contra a tyrosine hydroxylase (TH).
NOTA: A diluição recomendada do anticorpo utilizado neste estudo é de 1:5.000. - Para demonstrar uma grande população de neurônios colinérgicos, use anticorpos contra a sintese de óxido nítrico neuronal (NOS).
NOTA: A diluição recomendada do anticorpo utilizado neste estudo é de 1:500.
Representative Results
Uma dissecção bem sucedida não só removerá o corpo completo do MPG intacto, mas também manterá o primeiro segmento de cada um dos nervos principais ainda ligados. Esses nervos são indicadores valiosos de orientação de gânglios in vivo e, portanto, fornecem informações essenciais para muitos tipos de estudos anatômicos (por exemplo, padrões de expressão de mapeamento ou mudanças celulares após uma perturbação experimental). Embora preservar os nervos associados possa ser de menor importância para alguns tipos de experimentos (por exemplo, dissociação de gânglios para a cultura de neurônios isolados), a presença de nervos também fornece uma maneira de lidar com o gânglio sem tocar (e potencialmente danificando) os corpos das células neuronais.
Uma dissecção mal sucedida terá um gânglio incompleto ou danificado, ou onde os nervos primários não estão mais ligados. Também é possível que gânglios ou nervos sejam danificados inconscientemente durante a dissecção, seja porque o dano físico é muito sutil para ser detectado o microscópio dissecando ou porque o dano só se torna aparente durante certos tipos de ensaios. Por exemplo, se o tecido gânglio ficar seco durante a dissecção, o tecido pode parecer normal durante o manuseio posterior, mas mostrará altos níveis de fluorescência não específica na superfície.
Exemplos de MPG dissecado são mostrados na Figura 3, que fornece exemplos de todo o MPG visualizado como um gânglio completo de espessura inteira(Figura 3A) e um MPG que foi crioseccionado para a realização de imunofluorescência para demonstrar neurônios noradrenergic os neurônios noradrenergic(Figura 3B,C).
Figura 1: Marcos anatômicos para visualização de MPG em um rato macho. 1, vesícula seminal; 2, bexiga urinária; 3, glândula coagulante; 4 e 5, nervos acessórios; 6, próstata (lobo ventral); 7, nervo cavernoso; 8, vas deferens; 9, uretra; 10, músculo bulbocavernoso; 11, músculo isquiocavernoso; 12, nervos retais; 13, seqüestrador caudae externus; 14, gânglio pélvico maior; 15, nervo pélvico; 16, seqüestrador caudae internus; 17, nervo hipogástrico; 18, veia ilíaca interna; 19, flexor caudae brevis; 20, flexor caudae longus; 21, ureter; 22, psoas major; 23, aorta abdominal; 24, veia cava inferior. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Marcos anatômicos para visualização de MPG em um rato fêmea. 1, cólon distal; 2, bexiga urinária; 3, corpo uterino; 4, nervo hipogástrico; 5, nervos acessórios; 6, gânglio pélvico maior; 7, nervo cavernoso; 8, vagina; 9, uretra; 10, reto; 11, seqüestrador caudae externus; 12, nervos retais; 13, flexor caudae brevis; 14, nervo pélvico; 15, veia ilíaca interna; 16, seqüestrador caudae internus; 17, flexor caudae longus; 18, artéria ilíaca externa; 19, ureter; 20, psoas maior; 21, chifre uterino; 22, aorta abdominal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imunohistoquimicamente rotulado MPG de ratos machos adultos. Todas as preparações foram visualizadas com um microscópio convencional de fluorescência widefield equipado com uma câmera monocromática, então digitalmente colorido. ( A) Wholemount (espessura completa), MPG fixo com nervos associados, imunohistoquimicamente rotulado para os nervos sensoriais que expressam peptídeo relacionado ao gene calcitonina (CGRP); 1, nervo pélvico (mostrando as múltiplas fascicles); 2, nervo cavernoso; 3, nervo hipogástrico; 4, nervos acessórios; 5, nervos retais; 6, gânglio pélvico maior (MPG). (B,C) Crioseses (14 μm) de MPG fixo, identificados imunohistoquimicamente para demonstrar a natureza noradrenergic-cholinergic mista do gânglio; (B) neurônios noradrenergic demonstrados por anticorpos para a tyrosine hydroxylase e (C) uma grande população de neurônios colinérgicos por anticorpos para sintase de óxido nítrico neuronal. A barra de calibração representa (A) 1.000 μm,(B,C) 200 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
O controle neural dos órgãos pélvicos é mediado por vias complexas, incluindo componentes sensoriais somáticos, parassimpáticos, simpáticos e viscerais14,15,16,17. A maioria dessas vias se originam ou passam pelo MPG. Os protocolos de dissecção aqui descritos fornecem uma introdução à anatomia do MPG, aos nervos associados relacionados e aos marcos anatômicos macroscópicos próximos; estes últimos são ilustrados por esquemas anatômicos. Outras abordagens para a dissecção de MPG também podem ser bem sucedidas, mas achamos que a descrita aqui é robusta e adequada para um pesquisador novo nesta área do sistema nervoso.
Os aspectos mais críticos do protocolo são a identificação correta de cada nervo principal e a remoção completa do tecido MPG. Com a visualização e manuseio cuidadosos dos tecidos, os tecidos MPG podem ser removidos para estudos anatômicos, moleculares e eletrofisiológicos in vitro18,19,20,21,22. O protocolo também pode ser adaptado para manipulação experimental in vivo23,24,25, observando que, neste caso, deve-se tomar muito cuidado para minimizar o contato com os nervos primários associados ao gânglio ou danificar a vasculatura próxima. Se o experimento requer denervação seletiva por interrupção de um ou mais nervos, recomenda-se ligar o nervo decepado para evitar a reinervação e a confusão das análises. Este protocolo de dissecção também pode ser utilizado para o mouse, onde há também um MPG com função comparável26,27,28.
Para estudos neuroanatômicos, a melhor preservação de antígenos e estrutura tecidual é obtida pela dissecção do MPG de um animal anestesiado que tenha sido perfundido transcardiicamente com fixação histológica adequada ao experimento29; no entanto, a identificação do gânglio e das estruturas nervosas são mais difíceis após esse processo, pois a coloração tecidual é perdida. Recomenda-se tornar-se proficiente na identificação e dissecção do gânglio de animais não perfusados antes de tentar esta dissecção após a perfusão. Da mesma forma, recomenda-se tornar-se primeiro proficiente na dissecção em machos, pois para animais com idade equivalente e tamanho corporal, o MPG e seus nervos associados são muito menores em fêmeas.
Para validar que o tecido removido é de fato o MPG, o pesquisador é primeiro aconselhado a verificar a localização e características de cada nervo primário. Muitos dessetorianos acham o nervo pélvico e o nervo cavernoso os mais fáceis de identificar in situ; os nervos hipogástrico e acessório são mais delicados e mais difíceis de distinguir do tecido circundante. Se esses nervos não estiverem mais disponíveis por causa de problemas durante a dissecção, ou se houver incerteza quanto à sua estrutura, recomenda-se que as dissecções iniciais de MPG sejam caracterizadas com histologia convencional (para confirmar a presença de corpos de célulasneuronais 8) e, em segundo lugar, com imunohistoquímica (para identificar que tanto os neurônios colinérgicos quanto os noradrenergic estão presentes30,31)(Figura 3). Para validar a identificação correta dos nervos principais, os nervos cavernosos são facilmente identificados pela alta densidade de corpos de células neuronais em sua parte inicial próxima ao MPG; a maioria desses neurônios expressa marcadores de neurônios colinérgicos e nitrergicos32,33. Os nervos pélvico, hipogástrico e acessório têm muito poucos corpos de células neuronais34.
Há várias armadilhas comuns na realização desta dissecação. Se os dessetores novatos têm problemas para encontrar qualquer um dos principais nervos ou o MPG, eles são encorajados a retornar às etapas que descrevem os principais marcos. É muito comum ficar tão focado em encontrar as microestruturas que se perde o controle do contexto macroscópico. Mais comumente, os dessetores novatos ou se movem muito longe em seu local de dissecção ou permanecem muito 'superficiais'-i.e., muito perto da abertura ventral do abdômen, em vez de examinar estruturas mais profundas (ou seja, mais dorsais). Um problema comum durante a dissecção é o dano à vasculatura durante a dissecção. Se começar a sangrar, segure suavemente um aplicador com ponta de algodão sobre a fonte até que o sangramento pare, em seguida, lave a área liberalmente com soro antes de reiniciar a dissecção. É possível que o MPG não seja utilizável para experimentos se contaminado com muito sangue ou se a dissecção for adiada por muito tempo enquanto espera que o sangramento pare. Outro erro de dissecção comum é o dano à cápsula da próstata que prejudica significativamente a visualização e remoção de MPG. Esta cápsula é uma estrutura muito delicada que é facilmente perfurada enquanto remove a gordura da parede lateral da próstata, mesmo usando apenas um aplicador de ponta de algodão. Por fim, os principais nervos associados ao MPG são facilmente danificados durante o processo de identificação de cada um e, em seguida, durante a remoção do MPG. Os dessetorianos são encorajados a desenvolver uma rotina pela qual cada nervo é isolado por sua vez, em uma ordem particular, de modo que há menos oportunidade de confusão durante as etapas finais da remoção de gânglios.
Esta dissecção não procurou traçar cada um dos componentes dos nervos acessórios para órgãos específicos, ou identificar cada um dos muitos microgânglios que se encontram em vários pontos entre os gânglios pélvicos e os órgãos pélvicos8. Estes são bastante difíceis de visualizar in vivo sem o uso de manchas específicas; no entanto, eles podem ser removidos seguindo cada um dos tratos nervosos em direção aos órgãos, e utilizando manchas neurais específicas pós hoc para determinar a localização do gânglio. Esses microgânglios, embora compõem apenas uma pequena fração da população neuronal em comparação com o MPG, podem fornecer tipos específicos de entrada aos órgãos aos quais estão mais próximos. Notamos aqui uma limitação no campo que nem esses microgânglios nem muitos dos pequenos setores nervosos que saem do MPG para viajar para órgãos pélvicos ainda têm nomes amplamente aceitos. Além disso, um estudo igualmente detalhado de microgânglios ainda não foi realizado em ratos fêmeas.
Em resumo, o protocolo e os esquemas fornecidos aqui fornecem aos pesquisadores ferramentas para estudar as estruturas primárias que fornecem o fornecimento de nervos autônomos aos órgãos pélvicos, bem como os principais conduítes periféricos dos nervos sensoriais da raiz dorsal lumbosacral gânglios que viajam através do MPG para órgãos pélvicos.
Disclosures
Os autores não têm nada para revelar.
Acknowledgments
A pesquisa relatada nesta publicação contou com o apoio do Escritório do Diretor, Institutos Nacionais de Saúde, Programa Estimulador da Atividade Periférica para Aliviar as Condições (SPARC), Prêmio Número OT2OD023872. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde. A bolsa do Dr. Bertrand no laboratório do Dr. Keast foi financiada pelo Hospital Universitário de Nîmes, a faculdade de medicina de Montpellier-Nîmes, A Associação Française de Chirurgie (AFC), A Société Interdisciplinarire Francophone d 'UroDynamique et de Pelvipérinéologie (SIFUD-PP) e o Programa de Pessoas (Ações de Marie Curie) do Sétimo Programa-Quadro da União Europeia (FP7/2007-2013) o acordo de subvenção da REA No PCOFUND-GA-2013-609102, através do programa PRESTIGE coordenado pelo Campus França.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-calcitonin gene-related peptide; RRID AB_259091 | Merck | C8198 | |
| Anti-nitric oxide synthase, RRID AB_2533937 | Invitrogen | 61-7000 | |
| Anti-rabbit IgG, Cy3 tag, RRID AB_2307443 | Jackson | 711-165-152 | |
| Anti-tyrosine hydroxylase, RRID AB_390204 | Millipore | AB152 | |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ40, SC | |
| Dumont AA epoxy coated forceps | Fine Science Tools | 11210-10 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Dumont #5/45 curved forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| LED light source | Schott | KL 1600 | |
| Micro-Adson forceps | Fine Science Tools | 11019-12 | |
| Student Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14054-13 |
References
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