Summary
De store bækken ganglier indeholder parasympatiske og sympatiske neuroner, der innervate bækkenorganer. Her beskriver vi en dissektion metode og give skemaer til identifikation af disse ganglier og deres tilhørende nerver. Disse metoder kan anvendes på eksperimentel manipulation af disse ganglier in vivo eller fjernelse post mortem til yderligere undersøgelse.
Abstract
Den bilaterale store bækken ganglier (MPG; synonym, bækken ganglier) er den primære kilde til postganglionic sympatiske og parasympatiske neuroner innervating bækkenorganer gnavere; den funktionelt tilsvarende struktur hos mennesker er ringere hypogastrisk plexus. De store bækken ganglier også give den rute, som lumbal og sakrale sensoriske axoner nå bækken organer. Disse komplekse, blandede ganglier kan vise sig udfordrende at identificere og dissekere for yderligere eksperimentel undersøgelse af normale autonome mekanismer eller til at etablere prækliniske modeller af sygdom, skade eller visceral smerte. Her beskriver vi en protokol for at få adgang til og visualisere disse ganglier og deres tilknyttede nerveskrifter. Vi leverer denne protokol med skemaer for både mandlige og kvindelige rotter, som ganglion størrelse og vartegn for identifikation varierer mellem kønnene. Protokollen beskriver fjernelse af ganglion for in vitro-undersøgelser, men denne metode kan integreres i en kirurgisk genoprettelsesprotokol for eksperimentelle indgreb (f.eks. nerveknusning, nerveresektion) eller til kortlægning af neuronalkredsløb (f.eks. ved mikroinjektion af neurale sporstoffer). Vi demonstrerer også ganglionens primære strukturer og de tilknyttede nerver umiddelbart efter dissektion og efter immunhistokemisk farvning.
Introduction
Rotten er en af de bedst karakteriserede arter, der anvendes i studiet af bækken orgel fysiologi og anatomi. Mens fremragende ressourcer findes for beskrivelser af disse organer1,2, de generelt ikke giver oplysninger om de relaterede neurale strukturer eller gøre det ved utilstrækkelig opløsning til at guide en eksperimentel undersøgelse. Som beskrevet nedenfor, organiseringen af den autonome ganglier, der regulerer bækken organfunktion er helt anderledes end resten af det autonome nervesystem, hvilket gør det vanskeligt præcist at udlede bækken innervation funktioner fra neuroanatomiske oplysninger til rådighed for andre autonome ganglier. Denne mangel i ressourcer til at guide forskere ind i dette område kan have bremset forskning i neurale regulering af bækkenorganer. Her beskriver vi protokoller for at få adgang til denne region af nervesystemet for yderligere in vitro undersøgelser eller eksperimentel intervention.
Den bilaterale større bækkenganglitage (MPG; synonymer: bækkenganglier, parahalseret ganglier [kvinde]; Frankenhäuser's ganglion [kvindelige]) er den primære kilde til postganglionic sympatiske og parasympatiske neuroner innervating bækkenorganer gnavere; den ringere hypogastriske plexus omfatter den tilsvarende neuronale struktur hos mennesker3,4,5,6. Sensoriske fremskrivninger fra lænde- og sakrale dorsale rodganglier rejser også via MPG for at nå bækkenorganerne. Derfor, forståelse af neurale kredsløb og biologi mpg er afgørende for prækliniske undersøgelser på et utal af kliniske tilstande i forbindelse med udvikling og voksne funktion af bækkenorganer. Flere fremragende beskrivelser af gnaver MPG er blevet offentliggjort7,8, men vores erfaring er, at generelt disse beskrivelser ikke altid giver tilstrækkelig vejledning til praktisk informere en eksperimentel dissektion eller manipulation af disse strukturer, når inddrivelse af dyret er påkrævet. Desuden er de fleste mpg undersøgelser fokus på mandlige rotter. Hos kvindelige rotter er MPG mindre9 og har forskellige anatomiske vartegn, og kræver derfor en udpræget skræddersyet guide til visualisering og dissektion.
Sympatiske og parasympatiske veje er kendetegnet ved deres anatomi, specielt placeringen af deres præganglioniske neuroner, med sympatiske veje, der har præganglioniske neuroner i thoraco-lænde rygmarv og den parasympatiske præganglioniske neuroner placeret i hjernestammen (kranienerver fremskrivninger) og sakrale rygmarv. I de fleste andre regioner i det autonome system, deres mål ganglion neuroner er placeret i forskellige sympatiske eller parasympatiske ganglier. Men MPG er usædvanligt i at være blandet sympatisk-parasympatisk ganglier, og derfor på en makroskopisk skala er steder af konvergens fra præganglioniske axoner af både thoraco-lumbal og sakrale spinal regioner. Vi har derfor inkluderet i vores protokoller placeringen og beskrivelsen af disse primære nerveskrifter, der forbinder hver spinal region med MPG, lette eksperimentel analyse eller separat manipulation af disse neurale komponenter. Vi bemærker også for læsere specifikt at sammenligne disse ganglier på tværs af arter, at i gnavere spinal præganglionic neuroner, der er 'funktionelt sakrale', fx er aktive og kræves under micturition, afføring og penis erektion, er placeret på spinal niveauer L6-S1 snarere end udelukkende i sakrale segmenter10; ligeledes L6 og S1 dorsale rod gangli er give de store 'sakrale' sensoriske input til bækkenorganer. Hos gnavere, sensoriske og præganglioniske input fra mere rostral neurale kredsløb er koncentreret i spinal niveau L1 og L210.
Her beskriver vi en protokol for at få adgang til MPG og deres tilknyttede nerveskrifter hos mandlige og kvindelige rotter, og støtte dette med skemaer til at illustrere specifikke vartegn. Denne protokol guider kirurgisk adgang til disse strukturer i en eksperimentel sammenhæng med at fjerne vævet til in vitro-studier, f.eks. Det kan også tilpasses til MPG fjernelse efter intracardiac perfusion med fiksativ, selv om dette er en vanskeligere dissektion, fordi det neurale væv bliver vanskeligere at visualisere, når de tilstødende væv er blottet for blod. Denne protokol kan også integreres i en kirurgisk indstilling for eksperimentel indgriben af disse nerveveje (f.eks nerve resektion, mikroinjektion af neurale sporstoffer). Disse typer af dissektioner får stadig større betydning for det voksende område af bioelektronisk medicin, hvor nye mål og tilgange til neuromodulation til behandling af kliniske tilstande af bækken indvolde er under udvikling11. Vi præsenterer den komplette protokol først for hanrotter, derefter en kopi af protokollen skræddersyet specielt til kvindelige rotter.
Protocol
Alle procedurer skal gennemføres i overensstemmelse med de institutionelle og finansielle organers krav til dyreforsøg. Anvendelsen af dyr til denne dissektion og protokollen for aktiv dødshjælp er blevet godkendt af Animal Ethics Committee ved University of Melbourne (protokol nummer 1814639).
BEMÆRK: De dissektioner illustreret her blev udført på voksne (~ 10 uger) mandlige og kvindelige Sprague-Dawley rotter (Biomedical Sciences Animal Facility, University of Melbourne), vejer 280 g (kvinde) og 350 g (mand). Før disse dissektioner blev rotterne aflivet i et CO2-kammer i 4-5 min. Umiddelbart efter døden blev MPG dissekeret. Hvis der er tale om dissekering af væv fra et dyr, der har gennemgået transkardieperfusion med fiksativ, skal der træffes forholdsregler for at beskytte operatøren mod at blive udsat for fiksativ, dvs. En protokol for transkardieperfusion er blevet offentliggjort i detaljer12.
1. Major bækken ganglion og tilstødende nerver: adgang og resektion i en mandlig rotte
BEMÆRK: Figur 1 viser anatomiske landemærker til MPG-visualisering i en hanrotte.
- Adgang til bughulen og bækkenet
- Placer rotten i en supinposition og få adgang til maven og bækkenet gennem en ventral midterlinjen snit, passe på at undgå forurening af det kirurgiske felt med pels.
- Flyt forsigtigt abdominale organer til den ene side ved hjælp af pincet eller bomuld-tippet applikatorer. Bemærk placeringen af ventrale lapper i prostata og urinblæren.
- Flyt den skelsættende vesikel til den kontralaterale side.
- Skær vas deferens at give bedre adgang til området overliggende ganglion.
BEMÆRK: Fra dette punkt af dissektion, må vævet ikke tørre ud; holde vævet fugtigt med fysiologisk saltvand (til frisk vævdissektion) eller fiksativ (for perfusion-fast dyr). Holde vævet fugtigt med saltvand ikke kun fordele væv struktur, men også gør dissektion lettere som tørre nerver er mere skrøbelige og rive lettere under håndtering. - Identificer den dorsolaterale lap af prostata, på rygoverfladen, som er placeringen af ganglion; dette vil endnu ikke være synligt.
- At visualisere ganglion, omhyggeligt rydde væk væv nær og overliggende ganglion. Brug om nødvendigt en retractor til at holde dissektionsfeltet klart.
- Fjern en nærliggende aggregat af fedtvæv og åbne den laterale fascia af bækkenet.
- Dissektion af MPG og dens tilknyttede nerver
- Identificer følgende steder, der giver landemærker til de næste trin i dissektion: den dorsolaterale lap af prostata (ganglion er placeret på overfladen af denne lap, lidt mere caudal end krydset mellem sædding vesikel og prostata) og de skelsættende vesikler (hvor de konvergerer ved midterlinjen angiver ganglion placering på dyrets rostrocaudal akse).
- Som krævet fra dette punkt, forsigtigt fjerne væv, der hindrer fuldstændig visning af de neurale strukturer, undgå skader på den tynde kapsel af prostata eller større fartøjer.
- Identificer bækkennerven ved at visualisere følgende landemærker og funktioner.
- Find den interne iliaca vene og dens fine gren projicere mod MPG og blæren. Denne vaskulære gren løber parallelt med og er undertiden indlejret i bækkennerven, derefter krydser ganglion.
- Placer forsigtigt fint tippede vinklede pincet under bækkennerven og skub pincetlangs for at befri den fra omgivende væv.
BEMÆRK: Det kan også være muligt at isolere bækkennerven fra det lille fartøj, der løber parallelt med det, men for de fleste typer af eksperimenter er dette ikke afgørende. Bekræft, at strukturen er bækkennerven ved at se under høj forstørrelse for at fastslå, at nerven indeholder flere løst aggregerede fascicles, som let kan skelnes under dissekering mikroskop og er karakteristiske for bækken nerve, som ingen af de andre store nerver forbundet med ganglion viser denne klare fasciculation.
- Identificer den hule nerve ved at visualisere følgende landemærker og funktioner.
- Efter at have fulgt bækkennerven til krydset med ganglion, følg den hule nerve, da den bevæger sig over prostata og derefter caudally mod hule organer penis.
- Hvis mikroskop forstørrelse tillader det, bemærk, at der er en lille gruppe af sarte nerver på vej ud af ganglion mellem bækken og hule nerver; disse er rektal nerver, der rejser til den nedre tarm.
- Identificer hypogastrisk nerve ved at visualisere følgende landemærker og funktioner.
- Identificer, hvor hypogastrisk nerve slutter ganglion på sin kraniekant, efter at have rejst sammen med ureter.
- Bekræft, at hypogastrisk nerve er meget tyndere end enten bækken eller hule nerver og er ikke ledsaget af store fartøjer.
- Identificer mpg ved at visualisere følgende funktioner.
- Visualiser ventrale, ryg- og kraniekanter af ganglionen, der danner en trekantet form.
- Bekræft placeringen af hver større nerve: bækkennerverne på vej ud af ganglionens rygkant, den hule nerve på det mest caudal hjørne af ganglion, hypogastrisknerve fra sin kraniekant, og tilbehøret nerver på vej ud af ganglion's udluftningskant.
- Identificer tilbehørsnerverne ved at visualisere følgende landemærker og funktioner.
- Efter clearing væv for at muliggøre visualisering af ventrale kant af ganglion, identificere en klynge af nerver, der projektet mod urin og reproduktive skrifter.
- Hvis mikroskop forstørrelse tillader det, identificere en caudal gruppe af nerver, der kommer ind mellem prostata lapper og en rostral gruppe mellem den skelsættende vesikel og blæren.
- Fjernelse af MPG med de tilhørende nerver
- Forsigtigt glide pincet mellem ganglion og den underliggende prostata, være omhyggelig med ikke at punktere den tynde kapsel af prostata. Forstyrre eventuelle forbindelser mellem ganglion og prostata.
- Ryd eventuelle endelige forbindelser med omgivende væv for længder af nerver, der kræves for forsøget, derefter skære hver nerve.
- Brug fine pincet, flytte ganglion med sine nerver til den relevante løsning for forsøget og bekræfte, at hver af de vigtigste nerver er intakt.
2. Major bækken ganglion og tilstødende nerver: adgang og resektion i en kvindelig rotte
BEMÆRK: Figur 2 viser anatomiske landemærker til MPG-visualisering hos en kvindelig rotte.
- Adgang til bughulen og bækkenet
- Placer rotten i en supinposition og få adgang til maven og bækkenet gennem en ventral midterlinjen snit, passe på at undgå forurening af det kirurgiske felt med pels.
BEMÆRK: Fra dette punkt af dissektion, må vævet ikke tørre ud; holde vævet fugtigt med fysiologisk saltvand (til frisk vævdissektion) eller fiksativ (for perfusion-fast dyr). - Flyt forsigtigt abdominale organer til den ene side ved hjælp af pincet eller bomuld-tippet applikatorer. Bemærk placeringen af livmoderhorn, urinblære og endetarm.
- Skær æggestokkene og livmoderen fartøjer og trække livmoderen horn.
- Indtast peritoneal rummet og forsigtigt rydde væk en samlet af fedtvæv placeret nær livmoderhalsen.
- Placer rotten i en supinposition og få adgang til maven og bækkenet gennem en ventral midterlinjen snit, passe på at undgå forurening af det kirurgiske felt med pels.
- Dissektion af MPG og dens tilknyttede nerver
- Identificer den laterale væg af livmoderhalsen, bare caudal til sit kryds med livmoderhorn; denne region er det primære vartegn for at definere MPG-placeringen på dyrets rostrocaudalakse.
- Som krævet fra dette punkt, forsigtigt fjerne væv, der hindrer fuldstændig visning af de neurale strukturer, undgå skader på større fartøjer.
- Identificer bækkennerven ved at visualisere følgende landemærker og funktioner.
- Find den interne iliaca vene og dens fine gren projicere mod MPG og blæren. Denne gren løber parallelt med og er undertiden indlejret i bækkennerven, så krydser ganglion.
- Bekræft, at strukturen er bækkennerven ved at se under høj forstørrelse for at fastslå, at nerven indeholder flere løst aggregerede fascicles, som let kan skelnes under dissekering mikroskop og er karakteristiske for bækken nerve, som ingen af de andre store nerver forbundet med ganglion viser denne klare fasciculation.
- Identificer hypogastrisk nerve ved at visualisere følgende landemærker og funktioner.
- Identificer, hvor hypogastrisk nerve slutter ganglion på sin kraniekant, efter at have rejst sammen med ureter.
- Bekræft, at hypogastrisk nerve er meget tyndere end enten bækken eller hule nerver og er ikke ledsaget af store fartøjer.
- Identificer den hule nerve ved at visualisere følgende landemærker og funktioner.
- Efter at have fulgt bækkennerven til sit kryds med ganglion, følg den hule nerve, da den rejser caudally langs den laterale væg af livmoderhalsen mod skeden.
- Hvis mikroskop forstørrelse tillader det, bemærk, at der er en lille gruppe af sarte nerver på vej ud af ganglion mellem bækken og hule nerver; disse er rektal nerver, der rejser til den nedre tarm.
- Identificer tilbehørsnerverne ved at visualisere følgende landemærker og funktioner.
BEMÆRK: Tilbehøret nerver er vanskelige at se, men projektet fra den mediale aspekt af MPG. Efter clearing væv for at muliggøre visualisering af ventrale kant af ganglion, identificere en klynge af meget sarte nerver, der projektet mod urin og reproduktive skrifter. - Identificer mpg ved at visualisere følgende funktioner.
- Visualiser ventrale, ryg, og kraniekanter af ganglion, som danner en trekantet form.
- Bekræft placeringen af hver større nerve: bækkennerverne på vej ud af ganglionens rygkant, den hule nerve på det mest caudal hjørne af ganglion, hypogastrisknerve fra sin kraniekant, og tilbehøret nerver på vej ud af ganglion's udluftningskant.
- Fjernelse af MPG med de tilhørende nerver
- Placer forsigtigt fint tippede pincet under bækkennerven og skub pincetlangs for at frigøre den fra den underliggende livmoderhalsen og det omgivende væv.
BEMÆRK: Det kan også være muligt at isolere bækkennerven fra det lille fartøj, der løber parallelt med det, men for de fleste typer af eksperimenter er dette ikke afgørende. Hvis demonstrere dissektion, placere en sutur under bækkennerven, for at lette dens visualisering. - Gentag processen for hule nerve, så hypogastrisk nerve, og endelig tilbehøret nerver.
- Skub forsigtigt pincet mellem ganglion og den underliggende livmoder livmoderhalsen. Forstyrre eventuelle forbindelser mellem ganglion og livmoderhalsen.
- Ryd eventuelle endelige forbindelser med omgivende væv for længder af nerver, der kræves for forsøget, derefter skære hver nerve.
- Brug fine pincet, flytte ganglion med sine nerver til den relevante løsning for forsøget og bekræfte, at hver af de vigtigste nerver er intakt.
- Placer forsigtigt fint tippede pincet under bækkennerven og skub pincetlangs for at frigøre den fra den underliggende livmoderhalsen og det omgivende væv.
3. Bekræftelse af ganglion komponenter (valgfrit)
- Efter fjernelse af ganglion, nedsænke ganglion i en konventionel histologisk fiksativ (f.eks 4% buffered formalin) i mindst 1 time, vaske sativ med 0,1 M fosfat buffer og procesvæv til kryosektion og fluorescens immunhistokemi, som tidligere beskrevet13.
BEMÆRK: Mange antistoffer af høj kvalitet, der specifikt genkender disse tre neurale markører, er kommercielt tilgængelige. Se Materialetabel for de reagenser, der anvendes til mærkningen i figur 3. - Alternativt kan procesganglier intakt (hele mounts) for immunhistokemi ved hjælp af en lignende metode som ovenfor, men øge inkubationstiden for antistofferne til 4 dage (primært antistof) og 2 dage (sekundært antistof).
- For at påvise en større population af sensoriske axoner skal der anvendes antistoffer mod calcitonin-genrelateret peptid (CGRP).
BEMÆRK: Den anbefalede fortynding af det antistof, der anvendes i dette studie, er 1:5.000. - For at demonstrere noradrenerge sympatiske neuroner, bruge antistoffer mod tyrosin hydroxylase (TH).
BEMÆRK: Den anbefalede fortynding af det antistof, der anvendes i dette studie, er 1:5.000. - For at påvise en stor population af kolinerge neuroner, bruge antistoffer mod neuronal nitrogenoxid syntase (NOS).
BEMÆRK: Den anbefalede fortynding af det antistof, der anvendes i dette studie, er 1:500.
Representative Results
En vellykket dissektion vil ikke kun fjerne hele kroppen af MPG intakt, men også bevare det første segment af hver af de store nerver stadig er knyttet. Disse nerver er værdifulde indikatorer for ganglion orientering in vivo og giver derfor væsentlige oplysninger til mange typer af anatomiske undersøgelser (f.eks kortlægning udtryk mønstre eller cellulære ændringer efter en eksperimentel forstyrrelser). Selv om bevarelse af de tilhørende nerver kan være af mindre betydning for nogle eksperimenttyper (f.eks ganglion dissociation for kultur af isolerede neuroner), tilstedeværelsen af nerver giver også en måde at håndtere ganglion uden at røre (og potentielt skadelige) de neuronale cellelegemer.
En mislykket dissektion vil have en ufuldstændig eller beskadiget ganglion, eller hvor de primære nerver ikke længere er knyttet. Det er også muligt, at ganglier eller nerver er ubevidst beskadiget under dissektion, enten fordi den fysiske skade er for subtil til at opdage under dissekere mikroskop eller fordi skaden kun bliver synlige under visse typer af assays. For eksempel, hvis ganglion væv bliver tør under dissektion, vævet kan forekomme normalt under senere håndtering, men vil vise høje niveauer af ikke-specifik fluorescens på overfladen.
Eksempler på dissekeret MPG er vist i figur 3, som giver eksempler på hele MPG visualiseret som en hel tykkelse komplet ganglion (Figur 3A) og en MPG, der er blevet kryosektioned for at udføre immunfluorescens at påvise noradrenge og kolinerge neuroner (Figur 3B, C).
Figur 1: Anatomiske landemærker til MPG-visualisering i en hanrotte. 1, skelsættende vesikel; 2, urinblære; 3, koagulering kirtel; 4 og 5, tilbehør sognenerver; 6, prostata (ventrallap); 7, hule nerve; 8, vas deferens; 9, urinrøret; 10, bulbocavernosus muskel; 11, ischiocavernosus muskel; 12, rektal nerver; 13, bortfører caudae externus; 14, større bækken ganglion; 15, bækkennerven; 16, bortfører caudae internus; 17, hypogastrisk nerve; 18, intern iliaca vene; 19, flexor caudae brevis; 20, flexor caudae longus; 21, ureter; 22, psoas major; 23, abdominal aorta; 24, ringere vena cava. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Anatomiske landemærker til MPG-visualisering i en kvindelig rotte. 1, distale kolon; 2, urinblære; 3, livmoder krop; 4, hypogastrisk nerve; 5, tilbehør nerver; 6, større bækken ganglion; 7, hule nerve; 8, vagina; 9, urinrøret; 10, endetarm; 11, bortfører caudae externus; 12, rektal nerver; 13, flexor caudae brevis; 14, bækkennerven; 15, intern iliaca vene; 16, bortfører caudae internus; 17, flexor caudae longus; 18, ekstern iliaca arterie; 19, ureter; 20, psoas major; 21, livmoderhorn; 22, abdominal aorta. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Immunhistokemisk mærket MPG fra voksne hanrotter. Alle præparater er blevet visualiseret med en konventionel widefield fluorescens mikroskop udstyret med en monokrom kamera, derefter digitalt farvelagt. (A) Wholemount (komplet tykkelse), fast MPG med tilhørende nerver, immunohistokemisk mærket for de sensoriske nerver, der udtrykker calcitonin gen-relateret peptid (CGRP); 1, bækkennerven (viser flere fascicles); 2, hule nerve; 3, hypogastrisk nerve; 4, tilbehør nerver; 5, rektal nerver; 6, større bækken ganglion (MPG). (B,C) Kryosektioner (14 μm) af fast MPG, immunohistokemisk mærket for at påvise ganglionens blandede noradrenerge-kolinerge karakter (B) noradrenerge neuroner påvist af antistof for tyrosin hydroxylase og (C) en større population af kolinerge neuroner ved antistof for neuronal nitrogenoxid syntase. Kalibreringslinjen repræsenterer (A) 1.000 μm, (B,C) 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Neural kontrol af bækkenorganer er medieret af komplekse veje, herunder somatiske, parasympatiske, sympatiske og visceral sensoriske komponenter14,15,16,17. De fleste af disse veje stammer fra eller passerer gennem MPG. Dissektionsprotokollerne, der er skitseret her, giver en introduktion til MPG-anatomi, de tilknyttede tilknyttede nerver og nærliggende makroskopiske anatomiske landemærker; sidstnævnte illustreres ved anatomiske skemaer. Andre tilgange til MPG dissektion kan også være en succes, men vi finder den ene beskrevet her for at være robust og egnet til en forsker ny på dette område af nervesystemet.
De mest kritiske aspekter af protokollen er korrekt identifikation af hver større nerve og fuldstændig fjernelse af MPG væv. Ved omhyggelig visning og håndtering af væv kan MPG-væv fjernes for anatomiske, molekylære og elektrofysiologiske in vitro-studier18,19,20,21,22. Protokollen kan også tilpasses til in vivo eksperimentel manipulation23,24,25, bemærke, at i dette tilfælde, skal der udvises stor omhu for at minimere kontakt med de primære nerver forbundet med ganglion eller til skader i nærheden vaskulatur. Hvis forsøget kræver selektiv denervation ved afbrydelse af en eller flere nerver, anbefales det at ligeat den afhuggede nerve for at forhindre reinnervation og konfundering af analyser. Denne dissektion protokol kunne også anvendes til musen, hvor der også er en MPG med sammenlignelige funktion26,27,28.
For neuroanatomiske undersøgelser opnås den bedste konservering af antigener og vævsstruktur ved at dissekere MPG fra et bestøvet dyr, der er blevet perfunderet transcardialt med histologisk fiksativ, der er passende for forsøget29; men identifikation af ganglion og nerve strukturer er vanskeligere efter denne proces, som væv farve er tabt. Det anbefales at blive dygtige til at identificere og dissekere ganglion en fra ikke-perfunderede dyr, før du forsøger denne dissektion efter perfusion. Ligeledes anbefales det først at blive dygtige i dissektion hos mænd, fordi for dyr af tilsvarende alder og kropsstørrelse, MPG og dens tilknyttede nerver er meget mindre hos kvinder.
For at validere, at vævet fjernet er faktisk MPG, forskeren rådes først til at kontrollere placeringen og funktionerne i hver primær nerve. Mange dissectors finde bækkennerven og hule nerve den nemmeste at identificere in situ; hypogastriske og tilbehør nerver er mere delikat og vanskeligere at skelne fra det omgivende væv. Hvis disse nerver ikke længere er tilgængelige på grund af problemer under dissektion, eller hvis der er usikkerhed om deres struktur, anbefales det, at de første MPG dissektioner er karakteriseret med konventionel histologi (for at bekræfte tilstedeværelsen af neuronal celle organer8) og for det andet med immunhistokemi (at identificere, at både kolinerge og noradrenerge neuroner er til stede30,31) (Figur 3). For at validere korrekt identifikation af de store nerver, er de hule nerver let identificeret ved deres høje tæthed af neuronale celleorganer i deres oprindelige del tæt på MPG; de fleste af disse neuroner udtrykke markører for kolinerge, nitrerge neuroner32,33. Bækken, hypogastriske og tilbehør nerver har meget få neuronal celle organer34.
Der er flere almindelige faldgruber i udførelsen af denne dissektion. Hvis nybegyndere dissectors har problemer med at finde nogen af de store nerver eller MPG, opfordres de til at vende tilbage til de trin, der beskriver de vigtigste vartegn. Det er meget almindeligt at blive så fokuseret på at finde mikrostrukturerne, at man mister overblikket over den makroskopiske kontekst. Oftest, novice dissectors enten bevæge sig for langt rostral i deres dissektion site eller forblive for 'overfladisk'-dvs for tæt på ventrale åbning af maven, snarere end at undersøge dybere (dvs. mere dorsale) strukturer. Et fælles problem under dissektion er skader på vaskulaturen under dissektion. Hvis blødningen starter, skal du forsigtigt holde en bomuldsspidsapplikator over kilden, indtil blødningen stopper, og derefter skylle området rigeligt med saltvand, før dissektion genoptages. Det er muligt MPG vil ikke være anvendelige til forsøg, hvis forurenet med for meget blod, eller hvis dissektion er forsinket for længe, mens du venter på blødning til at stoppe. En anden fælles dissektion fejl er skader på kapslen af prostata, som i væsentlig grad svækker MPG visualisering og fjernelse. Denne kapsel er en meget delikat struktur, der er let punkteret, mens du fjerner fedt fra den laterale væg af prostata, selv om du kun bruger en bomuld-tippet applikator. Endelig er de vigtigste nerver forbundet med MPG let beskadiget under processen med at identificere hver enkelt og derefter under fjernelse af MPG. De forskellige sektorer opfordres til at udvikle en rutine, hvor hver nerve isoleres på skift, i en bestemt rækkefølge, således at der er mindre mulighed for forvirring i de sidste trin af ganglion fjernelse.
Denne dissektion søgte ikke at spore hver af komponenterne i tilbehøret nerver til specifikke organer, eller at identificere hver af de mange mikroganglier, der ligger på forskellige punkter mellem bækken ganglier og bækkenorganer8. Disse er ganske vanskeligt at visualisere in vivo uden at bruge specifikke pletter; men, de kan fjernes ved at følge hver af de nerveskrifter mod organer, og udnytte specifikke neurale pletter post hoc at bestemme ganglion placering. Disse mikroganglier, selv om de kun omfatter en lille brøkdel af den neuronale population i forhold til MPG, kan give specifikke typer af input til de organer, som de er tættest placeret. Vi bemærker her en begrænsning på området, at hverken disse mikrogangli eller mange af de små nerveskrifter forlader MPG at rejse til bækkenorganer endnu har bredt accepteret navne. Desuden er der endnu ikke udført en tilsvarende detaljeret undersøgelse af mikroganglii en tilsvarende detaljeret undersøgelse af mikrogangliiet hos hunrotter.
Sammenfattende giver protokollen og skemaer her forskerne værktøjer til at studere de primære strukturer, der giver den autonome nerve forsyning til bækkenorganer, samt de store perifere rør af sensoriske nerver fra lumbosacral dorsale rod ganglier, der rejser via MPG til bækkenorganer.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af kontoret for direktøren, National Institutes of Health, stimulerende perifer aktivitet til at lindre betingelser (SPARC) Program, Award Number OT2OD023872. Indholdet er udelukkende ophavsmændenes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra De Nationale Sundhedsinstitutter. Dr. Bertrands stipendium i Dr. Keasts laboratorium blev finansieret af: Universitetshospitalet i Nîmes, det medicinske fakultet i Montpellier-Nîmes, The Association Française de Chirurgie (AFC), Société Interdisciplinaire Francophone d »UroDynamique et de Pelvipérinéologie (SIFUD-PP) og People-programmet (Marie Curie-aktionerne) under Den Europæiske Unions syvende rammeprogram (FP7/2007-2013) under REA-tilskudsaftalen Ingen PCOFUND-GA-2013-609102 gennem PRESTIGE-programmet koordineret af Campus Frankrig.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-calcitonin gene-related peptide; RRID AB_259091 | Merck | C8198 | |
| Anti-nitric oxide synthase, RRID AB_2533937 | Invitrogen | 61-7000 | |
| Anti-rabbit IgG, Cy3 tag, RRID AB_2307443 | Jackson | 711-165-152 | |
| Anti-tyrosine hydroxylase, RRID AB_390204 | Millipore | AB152 | |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ40, SC | |
| Dumont AA epoxy coated forceps | Fine Science Tools | 11210-10 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Dumont #5/45 curved forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| LED light source | Schott | KL 1600 | |
| Micro-Adson forceps | Fine Science Tools | 11019-12 | |
| Student Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14054-13 |
References
- Greene, E. C. Anatomy of the Rat. , American Philosophical Society. Philadelphia, PA. (1935).
- Krinke, G. J. The Laboratory Rat. , Elsevier. Amsterdam, Netherlands. (2000).
- Keast, J. R. Pelvic ganglia. Autonomic Ganglia. McLachlan, E. M. , Harwood Academic. Luxembourg. 445-480 (1995).
- Keast, J. R. Unusual autonomic ganglia: connections, chemistry, and plasticity of pelvic ganglia. International Review of Cytology. 193, 1-69 (1999).
- Alsaid, B., et al. Coexistence of adrenergic and cholinergic nerves in the inferior hypogastric plexus: anatomical and immunohistochemical study with 3D reconstruction in human male fetus. Journal of Anatomy. 214 (5), 645-654 (2009).
- Keast, J. R., Smith-Anttila, C. J., Osborne, P. B. Developing a functional urinary bladder: a neuronal context. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 53 (2015).
- Purinton, P. T., Fletcher, T. F., Bradley, W. E. Gross and light microscopic features of the pelvic plexus in the rat. Anatomical Record. 175 (4), 697-705 (1973).
- Arellano, J., Xelhuantzi, N., Mirto, N., Hernández, M. E., Cruz, Y. Neural interrelationships of autonomic ganglia from the pelvic region of male rats. Autonomic Neuroscience. 217, 26-34 (2019).
- Greenwood, D., Coggeshall, R. E., Hulsebosch, C. E. Sexual dimorphism in the numbers of neurons in the pelvic ganglia of adult rats. Brain Research. 340 (1), 160-162 (1985).
- Nadelhaft, I., Booth, A. M. The location and morphology of preganglionic neurons and the distribution of visceral afferents from the rat pelvic nerve: a horseradish peroxidase study. Journal of Comparative Neurology. 226 (2), 238-245 (1984).
- Kessler, T. M., Birder, L. A., Gomery, P.
- Keast, J. R., Osborne, P. B. Intracardiac perfusion with fixative for anatomical studies [keast-001-stage02]. , https://www.protocols.io/view/intracardiac-perfusion-with-fixative-for-anatomica-w3ffgjn (2019).
- Keast, J. R., Osborne, P. B. Immunohistochemical analysis of ganglion neurons innervating the lower urinary tract [keast-001-stage03]. , https://www.protocols.io/view/immunohistochemical-analysis-of-ganglion-neurons-i-w3efgje (2019).
- Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C.
- Keast, J. R., Booth, A., de Groat, W. C. Distribution of neurons in the major pelvic ganglion of the rat which supply the bladder, colon or penis. Cell and Tissue Research. 256 (1), 105-112 (1989).
- Dail, W. G., Minorsky, N.
- Dail, W. G. The pelvic plexus: innervation of pelvic and extrapelvic visceral tissues. Microscopy Research and Technique. 35 (2), 95-106 (1996).
- Purves-Tyson, T. D., Arshi, M. S., Handelsman, D. J., Cheng, Y., Keast, J. R. Androgen and estrogen receptor-mediated mechanisms of testosterone action in male rat pelvic autonomic ganglia. Neuroscience. 148 (1), 92-104 (2007).
- Nangle, M. R., Keast, J. R. Semaphorin 3A inhibits growth of adult sympathetic and parasympathetic neurones via distinct cyclic nucleotide signalling pathways. British Journal of Pharmacology. 162 (5), 1083-1095 (2011).
- Tan, H., Mawe, G. M., Vizzard, M. A. Electrical properties of neurons in the intact rat major pelvic ganglion. Autonomic Neuroscience. 134 (1-2), 26-37 (2007).
- Park, K. S., et al. An alpha3beta4 subunit combination acts as a major functional nicotinic acetylcholine receptor in male rat pelvic ganglion neurons. Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 452 (6), 775-783 (2006).
- Park, K. S., et al. Modulation of N-type Ca2+ currents by A1-adenosine receptor activation in male rat pelvic ganglion neurons. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 299 (2), 501-508 (2001).
- Payne, S. C., Belleville, P. J., Keast, J. R. Regeneration of sensory but not motor axons following visceral nerve injury. Experimental Neurology. 266, 127-142 (2015).
- Nangle, M. R., Proietto, J., Keast, J. R. Impaired cavernous reinnervation after penile nerve injury in rats with features of the metabolic syndrome. Journal of Sexual Medicine. 6 (11), 3032-3044 (2009).
- Kepper, M. E., Keast, J. R. Specific targeting of ganglion cell sprouts provides an additional mechanism for restoring peripheral motor circuits in pelvic ganglia after spinal nerve damage. Journal of Neuroscience. 18 (19), 7987-7995 (1998).
- Yan, H., Keast, J. R. Neurturin regulates postnatal differentiation of parasympathetic pelvic ganglion neurons, initial axonal projections, and maintenance of terminal fields in male urogenital organs. Journal of Comparative Neurology. 507 (2), 1169-1183 (2008).
- Ritter, K. E., Wang, Z., Vezina, C. M., Bjorling, D. E., Southard-Smith, E. M. Serotonin receptor 5-HT3A affects development of bladder innervation and urinary bladder function. Frontiers in Neuroscience. 11, 690 (2017).
- Tompkins, J. D., Girard, B. M., Vizzard, M. A., Parsons, R. L. VIP and PACAP effects on mouse major pelvic ganglia neurons. Journal of Molecular Neuroscience. 42 (3), 390-396 (2010).
- Forrest, S. L., Payne, S. C., Keast, J. R., Osborne, P. B. Peripheral injury of pelvic visceral sensory nerves alters GFRα (GDNF family receptor alpha) localization in sensory and autonomic pathways of the sacral spinal cord. Frontiers in Neuroanatomy. 9, 43 (2015).
- Keast, J. R., Luckensmeyer, G. B., Schemann, M. All pelvic neurons in male rats contain immunoreactivity for the synthetic enzymes of either noradrenaline or acetylcholine. Neuroscience Letters. 196 (3), 209-212 (1995).
- Keast, J. R., de Groat, W. C. Immunohistochemical characterization of pelvic neurons which project to the bladder, colon, or penis in rats. Journal of Comparative Neurology. 288 (3), 387-400 (1989).
- Dail, W. G., Moll, M. A., Weber, K. Localization of vasoactive intestinal polypeptide in penile erectile tissue and in the major pelvic ganglion of the rat. Neuroscience. 10 (4), 1379-1386 (1983).
- Keast, J. R. A possible neural source of nitric oxide in the rat penis. Neuroscience Letters. 143 (1-2), 69-73 (1992).
- Kepper, M. E., Keast, J. R. Transmitter profile and spinal inputs of pelvic ganglion cells projecting with preganglionic axons along the hypogastric and pelvic nerves of the male rat. Neuroscience Letters. 280 (2), 123-126 (2000).
