Summary
Drosophila هو نموذج تجريبي يستخدم على نطاق واسع ومناسب لفحص الأدوية مع التطبيقات المحتملة لعلاج السرطان. هنا، ونحن نصف استخدام الأنماط الظاهرية لون العين المتنوعة Drosophila كوسيلة لفحص مركبات الجزيئات الصغيرة التي تعزز تشكيل الهيتروكروماتين.
Abstract
Drosophila هو كائن نموذجي ممتاز يمكن استخدامه لفحص المركبات التي قد تكون مفيدة لعلاج السرطان. الطريقة الموصوفة هنا هي فعالة من حيث التكلفة في طريقة الجسم الحي لتحديد المركبات المعززة للتغاير باستخدام Drosophila. سلالة DX1 في Drosophila ، وجود نمط ظاهري لون العين المتنوعة التي تعكس مدى تكوين الهيتروكروماتين ، وبالتالي توفير أداة لشاشة المخدرات تعزيز التغاير. في طريقة الفحص هذه ، يتم قياس تنوع العين على أساس مساحة سطح التصبغ الأحمر الذي يشغل أجزاء من العين ويتم تسجيله على مقياس من 1 إلى 5. طريقة الفحص واضحة وحساسة وتسمح باختبار المركبات في الجسم الحي. فحص المخدرات باستخدام هذه الطريقة يوفر وسيلة سريعة وغير مكلفة لتحديد الأدوية المعززة للتغاير التي يمكن أن يكون لها آثار مفيدة في علاجات السرطان. تحديد المركبات التي تعزز تشكيل الهيتروكروماتين يمكن أن يؤدي أيضا إلى اكتشاف آليات اللاجينية لتطوير السرطان.
Introduction
هيتروكروماتين هو شكل مكثف من الحمض النووي الذي يلعب دورا مركزيا في التعبير الجيني، في تنظيم الفصل الكروموسوم أثناء انقسام الخلايا، وفي الحماية من عدم استقرار الجينوم1. وقد اعتبر Heterochromatin أن يكون منظم قمع الجينات وحماية سلامة الكروموسوم خلال الانقسام الخلية2،3. ويرتبط مع دي- وثلاثي ميثيلمن الهيستون H3 ليسين 9 (H3K9me) خلال التزام النسب4،,5. وعلاوة على ذلك، يعتبر أيضا تجنيد البروتين اتيروكروماتين 1 (HP1) البروتينات اللونية لتكون مرتبطة مع التغايرية وقمع اللاجينية للتعبير الجيني6. هذه البروتينات هي المكونات الأساسية وعلامات تشكيل الهيتيروكروماتين.
منذ عدم الاستقرار الجينومي تمكن الخلايا من الحصول على التعديلات الوراثية التي تعزز التسرطن، الهيتيروكروماتين أصبحت أكثر المعترف بها في تطور السرطان، ويمكن أن تكون مستهدفة لعلاج السرطان7،,8. حاليا، لا توجد أدوية راسخة في مساعدة تكوين الهيتروكروماتين. هنا، نقدم طريقة بسيطة وسريعة ولكنها فعالة لفحص مركبات الجزيئات الصغيرة التي تعزز تكوين الهيتروكروماتين. يتم الفحص عن طريق علاج Drosophila مع مكتبة من الأدوية ذات الجزيئات الصغيرة. هذه الطريقة تستفيد من النمط الظاهري لون العين المتنوعة في سلالةDROSophila DX1التي تتأثر مستويات الهيتيروكروماتين. يحتوي ذباب DX1 على صفيف ة مترادفة من سبعة جينات من نوع P [lac-w] ، والتي لها التعبير / الاكتئاب المتنوع اعتمادًا على تغاير اللون ، وبالتالي ، فإن مدى التنوع في لون العين يعكس مستوى التغاير. على وجه التحديد، يمكن الكشف عن زيادة التغاير كروماتين من قبل ارتفاع نسبة لون العين المتنوعة (العين البيضاء). على العكس من ذلك ، سيتم الكشف عن انخفاض الهيتروكروماتين من قبل ارتفاع نسبة التعبير P [lac-w] transgene (العين الحمراء)9،10،11،12.
ولذلك، فإننا نستفيد من هذا النظام ترانسجين Drosophila التي تنتج نمط الظاهري لون العين المتنوعة منذ التعبير يرتبط مباشرة إلى كمية من الهيتروكروماتين الحالي. عند اكتشاف المركبات التي يشتبه في تعزيز تشكيل الهيتروكروماتين، قد نؤكد هذا الشك باستخدام أساليب أخرى مثل لطخة الغربية. ويمكن تطوير هذه المواد تعزيز التغاير للتجارب السريرية في المرضى في المستقبل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1- إعداد مكتبة المخدرات
- تحديد وإعداد مكتبة المخدرات ليتم فحصها باستخدام المذيبات المناسبة بالتركيز المطلوب (على سبيل المثال، 10 mM في DMSO).
ملاحظة: مثال محدد لمكتبة الأدوية هو مجموعة الأورام الثالثة من برنامج العلاجات التنموية للمعهد الوطني للسرطان (NCI). يتم توفير المركبات في هذه المجموعة كـ 20 ميكرولتر في 10 mM في 100٪ DMSO في اثنين من لوحات 96-جيدا PP U-bottom وتخزينها في -20 درجة مئوية. يمكن العثور على خرائط NCI Plate والبيانات الكيميائية الأساسية لكل دواء في المواقع التالية:
NCI لوحة رقم 4740
NCI لوحة رقم 4741
2- شاشة للعقاقير التي تروج للتغاير باستخدام دروسوفيلا
-
دروسوفيلا استراتيجية التربية(الشكل 1A)
- اليوم الأول: عبر ثلاثة ث1118/Y; DX1/CyO الذباب الذكور وثلاثة أو أكثر من العذراء ث1118 ذباب الإناث في 25 ملم × 95 ملم قارورة الغذاء مع 9 مل من وسائل الإعلام الغذائية دروسوفيلا القياسية (وصفة بلومينغتون). إعداد ثلاث قوارير تكرار لكل دواء وعنصر تحكم واحد للشاشة.
ملاحظة: تم توفير الذباب DX1 بلطف من قبل جيمس بيرشلر (جامعة ميسوري)9،13. - اليوم الثاني واليوم الثالث: اسمح للذباب بوضع البيض لمدة يومين في درجة حرارة الغرفة (22 درجة مئوية).
- اليوم الرابع: استخدم دفعة قصيرة منغاز ثاني أكسيد الكربون لتنويم الذباب الأم والتخلص من الذباب الأم في "مشرحة الذباب" (زجاجة تحتوي على 70٪ كحول).
- اليوم الأول: عبر ثلاثة ث1118/Y; DX1/CyO الذباب الذكور وثلاثة أو أكثر من العذراء ث1118 ذباب الإناث في 25 ملم × 95 ملم قارورة الغذاء مع 9 مل من وسائل الإعلام الغذائية دروسوفيلا القياسية (وصفة بلومينغتون). إعداد ثلاث قوارير تكرار لكل دواء وعنصر تحكم واحد للشاشة.
- تغذية المخدرات إلى دروسوفيلا للفحص.
- تمييع كل مركب دواء من المخزون الأصلي (20 ميكرولتر في 10 مل في 100٪ DMSO في 96-well PP U-bottom plates) إلى تركيز نهائي 10 ميكرومتر مع 33٪ DMSO في الماء. استخدام 33٪ DMSO في الماء دون أي دواء كتحكم.
ملاحظة: بعض الأدوية سيئة الذوبان في الماء وتم إذابة في DMSO. 100٪ DMSO سامة للذباب. 33% مقبول. - اليوم 4: ماصة 60 ميكرولتر من محلول المخدرات 10 ميكرومتر أو السيطرة على الجزء العلوي من الغذاء يطير. عند هذه النقطة ، تأكد من أن الذباب الأم قد أزيلت وهناك بيض الذباب والزحف يرقات أول instar على الطعام.
- اليوم 6: تكرار pipetting 60 ميكرولتر من نفس محلول المخدرات 10 ميكرومتر إلى قارورة الطعام.
ملاحظة: بما أن الأدوية أضيفت إلى طعام الذبابة، فإن الطعام السطحي العلوي يحتوي على تركيز 10 ميكرومتر تقريبًا ولا يمكن اختراق الطعام السفلي بالكامل. كل الذباب وضع البيض على رأس الطعام وأكل الطعام السطحي العلوي.
- تمييع كل مركب دواء من المخزون الأصلي (20 ميكرولتر في 10 مل في 100٪ DMSO في 96-well PP U-bottom plates) إلى تركيز نهائي 10 ميكرومتر مع 33٪ DMSO في الماء. استخدام 33٪ DMSO في الماء دون أي دواء كتحكم.
- مراقبة وتسجيل التغيرات لون العين.
- بعد يومين من ظهور ذباب F1 (في اليوم 14 تقريبًا) ، افحص الذباب. استخدم دفعة قصيرة من ثاني أكسيد الكربون2 لتنويم ذباب F1 وإزالة الذباب من قنينته على وسادة تشريح مسامية مع CO2 يحتسي من تحت ورقة التصفية.
- تفقد الذباب على هذه الوسادة تحت مجهر تشريح. فحص الذبابة بأكملها وتحديد جميع ث1118/ Y؛ DX1/+ heterozygous الذكور من قبل افتقارهم إلى CyO المهيمنة الجناح المجعد النمط الظاهري.
- تسجيل لون العين لكل من ث1118/ Y; DX1/+ ذباب ذكر يروزيغوس على مقياس من 1 إلى 5(الشكل 1B). تم تصنيف النسبة المئوية للون العين الأبيض على النحو التالي:
1. <5% العين الحمراء المتناثرة المساحة الإجمالية للسطح
2. 6٪ - 25٪ بقع حمراء العين المساحة الإجمالية للسطح
3. 26٪ - 50٪ بقع حمراء العين المساحة الإجمالية للسطح
4. 51٪ - 75٪ بقع حمراء العين المساحة الإجمالية للسطح
5. > 75٪ بقع حمراء العين المساحة الإجمالية للسطح
ملاحظة: بدلاً من ذلك، التجانس رؤساء ذبابة في الميثانول 100% واستخدام مطياف لقياس تصبغ العين في OD 450 نانومتر. حدد الذكور فقط لأن PEV هو أكثر pronouced في الذكور DX1. يسجل أكثر من 10 ذكور في كل قارورة. - حساب متوسط مؤشر اللون لجميع الذكور من كل قارورة سجل. تنفيذ ثلاثية لكل مركب(الشكل 1C).
ملاحظة: نظرًا لأن لون العين يختلف باختلاف العمر، فهذه خطوة حساسة للوقت. يجب حساب لون العين في نفس العمر – 2 أيام من العمر. عادة > 10 الذباب ينبغي أن يسجل في كل قارورة. - للتأكد من أن المركبات في الواقع تعزيز تشكيل الهيتيروكروماتين، واستخدام تقنية مختلفة مثل النشاف الغربية للتحقق من صحة(الشكل 1G).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وقد استخدم هذا البروتوكول بنجاح لفحص المركبات التي تعزز تشكيل الهيتيروكروماتين في Drosophila، وهو فعال ومنخفض التكلفة في نظام الجسم الحي لتطوير المخدرات(الشكل 1). فحصنا مكتبة المخدرات جزيء صغير، الأورام المجموعة الثالثة، والتي تتكون من 97 ادارة الاغذية والعقاقير أذن أدوية الأورام، وذلك باستخدام سلالة DX1 من ددروسوفيلا melanogaster (الشكل 1B). تم تمثيل نتائج دواء مهم في رسم بياني شريطي(الشكل 1C, D). وفقا لفحص الفحص، الميثوتريكسات (4-أمينوبتروثيلغلوتاميك حمض)، الذي يتم ترميز كما E7 في المكتبة، تسبب في معظم variegation في سلالة DX1، مما يشير إلى أن الميثوتريكسات يمكن أن يكون الدواء الأكثر واعدة هيتيروكروماتين لتعزيز للسرطان في المستقبل تستهدف العلاج(الشكل 1E، F). لمزيد من التأكيد على أن هذا هو في الواقع اختبار المركبات تعزيز تكوين الهيتروكروماتين, بيانات لطخة الغربية يظهر أن تكوين الهيتيروكروماتين المرتبطة بالبروتين H3K9me3 هو upregulated(الشكل 1G),مزيد من التحقق من أن الميثوتريكسات يمكن أن يكون الدواء الأكثر واعدة تعزيز التغاير.
الشكل 1: مثال على فحص المخدرات في دروسوفيلا. (أ)منهجية شاشة دروسوفيلا. لمحة عامة عن مخطط لفحص المركبات المعززة للتغاير الكروماتين باستخدام نموذج Drosophila. ثلاثة ث1118/ Y; يتم عبور ذكور DX1/CyO وثلاثة عذراء w1118 في درجة حرارة الغرفة. ثم، إزالة الذباب الكبار في اليوم الرابع وإضافة 60 ميكرولتر من المخدرات 10 ميكرومتر حل في 33٪ DMSO حل إلى الجزء العلوي من الغذاء يطير في اليوم الرابع واليوم السادس، على التوالي. تم استخدام 33٪ من محلول DMSO كتحكم. لوحظت نسبة لون العين (الأبيض إلى الأحمر) من جيل الذكور F1. (ب)العين تحليل النمط الظاهري لون ودرجة. صور تمثيلية من لون العين تظهر النمط الظاهري المتنوع. تم تصنيف النسبة المئوية لتباين لون العين على النحو التالي: 1، 1-5٪ بقع حمراء في المساحة الإجمالية للسطح. 2، 6-25٪ بقع حمراء في المساحة الإجمالية للسطح؛ 3، 26-50٪ بقع حمراء في المساحة الإجمالية للسطح؛ 4، 51-75٪ بقع حمراء في إجمالي مساحة السطح؛ و 5، > 75٪ بقع حمراء في إجمالي مساحة السطح. (مقياس شريط = 200 ميكرون) (ج)تم تقييم كل دواء كقيم متوسطة من ثلاث تجارب مستقلة ± s.d. (الانحراف المعياري). شريط أحمر يظهر عنصر التحكم. (د)نتائج المقياس الذي يتم تنفيذه في المخدرات E7 والسيطرة. اعتبرت الاختلافات بين E7 ومجموعات التحكم كبيرة إذا كانت قيم P <0.05 (*) بواسطة اختبار T-Test.(E)التركيب الجزيئي لمجمع كيميائي يطلق عليه E7 المستخدم في مكتبة الأدوية المثال. (واو)صور تمثيلية لعيون الذبابة في E7 ومجموعة علاج التحكم. (مقياس شريط، 200 ميكرومتر) (G)تم إجراء اللطخة الغربية مع الأجسام المضادة المحددة لH3K9me3, H3، أو α-Tubulin باستخداماليرقات الثالثة اليرقية الكلية للبروتين دون أو مع العلاج بالميثوتريكسات في التركيزات المشار لها. وقد تم تعديل هذا الرقم من لويولا وآخرون14. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الهيتروكروماتين هو شكل مكثف من الحمض النووي الذي يلعب دورا مركزيا في تنظيم التعبير الجيني. هو أصبح بدرجة متزايدة أكثر يميّز في سرطان ويمكن كنت بمثابة هدف محتملة للسرطان علاج15,,16,,17,,18. وتستخدم عادة مركبات الجزيئات الصغيرة في تطوير المخدرات بسبب مزايا في التصنيع والحفظ والتمثيل الغذائي في الهيئات البشرية. لتحديد مركبات الجزيئات الصغيرة المعززة للتغاير ، تم تصميم طريقة فعالة وتقديمها باستخدام سلالة DX1Drosophila ، والتي ثبت أنها تؤثر على لون عين الذباب بطريقة تعتمد على التغاير(الشكل 1).
بروتوكول الفحص لدينا هو بسيط وغير مكلف وسهل المتابعة في نظام الجسم الحي لتطوير الدواء. ومع ذلك، فإن أحد القيود على استراتيجية الفحص هو تحديد تركيز فعال للمخدرات. تضع ذبابة الفاكهة الأنثوية بيضها على سطح طعام الذبابة شبه الصلبة. للعلاج من المخدرات ، ونحن pipet محلول المخدرات على سطح الطعام ، والتي من المفترض أن تحتوي على تركيز محدد سلفا. ومع ذلك ، نظرًا لأن الأدوية المختلفة يمكن أن يكون لها كفاءات مختلفة في الانتشار إلى الجزء السفلي من الطعام ، لا يضمن تركيز الدواء أن يكون ثابتًا تحت السطح أو نحو قاع الطعام. بتركيز 10 ميكرومتر، نادراً ما لوحظ تَفتك في اليرقات المعالجة بأي من الأدوية في المكتبة التي فحصناها. ومع ذلك ، تسببت معظم الأدوية في فتك شديد لليرقات بتركيز 100 ميكرومتر ، مما يشير إلى أن تركيز الدواء يمكن اعتباره أيضًا عاملًا مهمًا للشاشة.
هنا، نلاحظ أن تكرار ترادفي مثل تلك المستخدمة هنا يمكن أن تؤدي PEV من قبل آلية تختلف في بعض النواحي عن تلك التي ينظر إليها في الهيتيروكروماتين pericentric. الدواء الذي يؤثر على PEV أثناء تطور الجنين واليرقات (الاختبار الموصوف هنا) سيحدد فقط الأدوية التي تؤثر على الحفاظ على التغاير اللون في الخلايا الجسدية ولن يحدد الأدوية التي تؤثر على التكوين الأولي للتغاير ، الذي يحدث على الأرجح خلال blastoderm (دورات نووية 10-14). ومع ذلك، يمكن أن يكون هذا فحص مفيد لشاشة بدء سريعة.
هذا البروتوكول موثوق به وفعال من حيث التكلفة بسبب حساسية هذه المجموعة المتحولة(DX1)لتشكيل الهيتروكروماتين ، والتي تنعكس من خلال كمية التصبغ الأحمر الموجودة في العين. بالإضافة إلى ذلك ، فإن العمر القصير لدروسوفيلا يجعل هذا البروتوكول أكثر كفاءة من الكائنات الحية النموذجية الأخرى مثل حمار وحشي أو خلايا بشرية. في حين أن هناك من المرجح أن يكون نظام الجينات مراسل موجودة في حمار وحشي التي هي مجرد حساسة لمستويات الهيتروكروماتين, عمرهم أطول بكثير من Drosophila وسوف يستغرق وقتا أطول للحصول على النتائج. بالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام الخلايا البشرية لن يكون ممكناً لأن هذا البروتوكول يركز بشكل خاص على استخدام التغيرات في نوتسيبيك من التنظيم اللاجيني لتحديد مستويات الهيتروكروماتين. وهكذا، يوفر هذا البروتوكول كفاءة في طريقة الجسم الحي لتحديد أي جزيء المخدرات الصغيرة يمكن أن تكون بمثابة مرشح لقمع الأورام في علاجات السرطان. في حين أن طريقة فحص المخدرات Drosophila هو نهج بطيء لتحديد المركبات بالمقارنة مع بعض طرق الفحص في المختبر ، فهي حساسة نسبيًا وتسمح لنا باختبار المركبات في الجسم الحي. وبالاقتران مع طريقة فحص الخلايا، وهي غير مكلفة نسبياً وسهلة الأداء وإنتاجية عالية، يمكن أيضاً استخدام طريقة فحص دروسوفيلا لتأكيد الضربات كطريقة تكميلية.
باختصار ، مع الاهتمام بتحديد المركبات لمزيد من البحث واستهداف الهيتروكروماتين لعلاج السرطان ، على الرغم من أن الآلية التي يحدث فيها ذلك لم يتم فهمها بالكامل بعد ، تم إجراء شاشة بسيطة من أجل تحديد المخدرات التيتروكروماتين المعززة للهيتيروكروماتين. اكتشاف تركيز منخفض يمكن أن يعزز الدواء تكوين الهيتيروكروماتين يمكن أن تقدم علاجات أكثر فريدة من نوعها التي قد تؤدي إلى آثار جانبية أقل مقارنة بعلاجات العلاج الكيميائي الحديثة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
Acknowledgments
نشكر J. Birchler, E. باخ ومركز بلومينغتون دروسوفيلا للمخزون لسلالات Drosophila المختلفة; المعهد الوطني للسرطان (NCI) برنامج العلاجات التنموية لمكتبة الأدوية الصغيرة الجزيئات الصغيرة الأورام؛ طلاب جامعة كاليفورنيا في لوس أنج بما في ذلك إيمي تشانغ، Taesik أنت، جيسيكا سينغ بانغا، راشيل ميزا، وأليكس شافيز. تم دعم الأبحاث الواردة في هذا المنشور من خلال منحة بحثية من جمعية الصدر الأمريكية إلى J.L. والتمويل من المعاهد القومية للصحة: R01GM131044 إلى W.X.L.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila | DX1 strain | DX1 flies were kindly provided by James Birchler (University of Missouri) | |
| Drosophila food media | UCSD fly kitchen | ||
| Methotrexate | NCI drug library | ||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Ethyl alcohol | Sigma | E7023-500ML |
References
- Morgan, M. A., Shilatifard, A.
- Saksouk, N., Simboeck, E., Dejardin, J. Constitutive heterochromatin formation and transcription in mammals. Epigenetics Chromatin. 8, 3 (2015).
- Allshire, R. C., Madhani, H. D. Ten principles of heterochromatin formation and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 229-244 (2018).
- Jenuwein, T., Allis, C. D.
- Grewal, S. I., Moazed, D. Heterochromatin and epigenetic control of gene expression. Science. 301 (5634), 798-802 (2003).
- Heard, E. Delving into the diversity of facultative heterochromatin: the epigenetics of the inactive X chromosome. Current Opinion in Genetics & Development. 15 (5), 482-489 (2005).
- Ci, X., et al. Heterochromatin Protein 1alpha Mediates Development and Aggressiveness of Neuroendocrine Prostate Cancer. Cancer Research. 78 (10), 2691-2704 (2018).
- Zhu, Q., et al. Heterochromatin-Encoded Satellite RNAs Induce Breast Cancer. Molecular Cell. 70 (5), 842-853 (2018).
- Dorer, D. R., Henikoff, S. Expansions of transgene repeats cause heterochromatin formation and gene silencing in Drosophila. Cell. 77 (7), 993-1002 (1994).
- Fanti, L., Dorer, D. R., Berloco, M., Henikoff, S., Pimpinelli, S.
- Shi, S., et al. JAK signaling globally counteracts heterochromatic gene silencing. Nature Genetics. 38 (9), 1071-1076 (2006).
- Shi, S., et al. Drosophila STAT is required for directly maintaining HP1 localization and heterochromatin stability. Nature Cell Biology. 10 (4), 489-496 (2008).
- Ronsseray, S., Boivin, A., Anxolabehere, D. P-Element repression in Drosophila melanogaster by variegating clusters of P-lacZ-white transgenes. Genetics. 159 (4), 1631-1642 (2001).
- Loyola, A. C., et al. Identification of methotrexate as a heterochromatin-promoting drug. Scientific Reports. 9 (1), 11673 (2019).
- Dialynas, G. K., Vitalini, M. W., Wallrath, L. L. Linking Heterochromatin Protein 1 (HP1) to cancer progression. Mutation Research. 647 (1-2), 13-20 (2008).
- Janssen, A., Colmenares, S. U., Karpen, G. H.
- Zhu, Q., et al. BRCA1 tumour suppression occurs via heterochromatin-mediated silencing. Nature. 477 (7363), 179-184 (2011).
- Hu, X., et al. Unphosphorylated STAT5A stabilizes heterochromatin and suppresses tumor growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10213-10218 (2013).
