Summary
Drosophila est un modèle expérimental largement utilisé adapté aux médicaments de dépistage avec des applications potentielles pour la thérapie contre le cancer. Ici, nous décrivons l’utilisation des phénotypes variés de couleur d’oeil de Drosophila comme méthode pour le criblage des composés de petites molécules qui favorisent la formation d’hétérochromatine.
Abstract
Drosophila est un excellent organisme modèle qui peut être utilisé pour dépister les composés qui pourraient être utiles pour la thérapie contre le cancer. La méthode décrite ici est une méthode in vivo rentable pour identifier les composés heterochromatin-promotion en utilisant Drosophila. La souche DX1 de la Drosophila, ayant un phénotype de couleur œil varié qui reflète les étendues de la formation d’hétérochromatine, fournissant ainsi un outil pour un écran de drogue hétérochromatine-promotion. Dans cette méthode de criblage, la variété des yeux est quantifiée en fonction de la surface de la pigmentation rouge occupant des parties de l’œil et est notée sur une échelle de 1 à 5. La méthode de dépistage est simple et sensible et permet de tester les composés in vivo. Le dépistage des drogues utilisant cette méthode fournit un moyen rapide et peu coûteux pour identifier les médicaments hétérochromatine-promotion qui pourraient avoir des effets bénéfiques dans la thérapeutique de cancer. L’identification des composés qui favorisent la formation de l’hétérochromatine pourrait également mener à la découverte des mécanismes épigénétiques du développement du cancer.
Introduction
L’hétérochromatine est une forme condensée de l’ADN qui joue un rôle central dans l’expression des gènes, dans la régulation de la ségrégation chromosomique pendant la division cellulaire, et dans la protection contre l’instabilité du génome1. L’hétérochromatine a été considérée comme un régulateur de la répression génétique et pour protéger l’intégrité des chromosomes pendant la mitose cellulaire2,3. Il est associé à la di- et tri-méthylation de l’histone H3 lysine 9 (H3K9me) lors de l’engagement de lignée4,5. En outre, le recrutement de protéines hétérochromatines 1 (HP1) protéines de chromodomaine est également considéré comme associé à l’hétérochromatine et la répression épigénétique de l’expression génique6. Ces protéines sont des composants essentiels et des marqueurs de formation d’hétérochromatine.
Puisque l’instabilité génomique permet aux cellules d’acquérir des altérations génétiques qui favorisent la carcinogenèse, l’hétérochromatine est de plus en plus reconnue dans le développement du cancer et peut être ciblée pour le traitement du cancer7,8. À l’heure actuelle, il n’existe aucun médicament bien établi pour aider la formation d’hétérochromatine. Ici, nous présentons une méthode simple et rapide mais efficace pour le criblage des composés à petites molécules qui favorisent la formation d’hétérochromatine. Le dépistage se fait en traitant Drosophila avec une bibliothèque de médicaments à petites molécules. Cette méthode tire parti d’un phénotype de couleur œil panaché dans la souche DX1Drosophila qui est influencée par les niveaux d’hétérochromatine. Les mouches DX1 contiennent un tableau tandem de sept transgènes P[lac-w], qui ont l’expression/dépression variée selon l’hétérochromatinisation, par conséquent, l’étendue de la variété dans la couleur des yeux reflètent le niveau d’hétérochromatine. Plus précisément, l’augmentation de l’hétérochromatine pourrait être détectée par la proportion croissante de couleur des yeux panachées (oeil blanc). Au contraire, la diminution de l’hétérochromatine serait détectée par la proportion croissante de l’expression transgénique P[lac-w] (œil rouge)9,10,11,12.
Par conséquent, nous profitons de ce système transgène Drosophila qui produit un phénotype de couleur œil panachée puisque son expression est directement corrélée à la quantité d’hétérochromatine présente. Lors de la découverte de composés qui sont soupçonnés de favoriser la formation d’hétérochromatine, nous pouvons confirmer ce soupçon en utilisant d’autres méthodes telles que la tache occidentale. Ces substances hétérochromatine-promotion peuvent être développées plus loin pour des essais cliniques chez les patients à l’avenir.
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Protocol
1. Préparation de la bibliothèque de médicaments
- Identifier et préparer une pharmacie à dépister à l’aide d’un solvant approprié à une concentration désirée (p. ex., 10 mM dans DMSO).
REMARQUE : Un exemple spécifique pour une bibliothèque de médicaments est le Set III d’oncologie du Programme thérapeutique du développement (DTP) du National Cancer Institute (NCI). Les composés de cet ensemble sont fournis sous la forme de 20 l à 10 mM en DMSO à 100 % dans deux plaques à fond U PP de 96 puits et stockées à -20 oC. Les cartes NCI Plate, et les données chimiques de base de chaque médicament pourraient être trouvées sur les sites Web suivants:
Numéro de plaque NCI 4740
Numéro de plaque NCI 4741
2. Écran pour les médicaments favorisant l’hétérochromatine utilisant Drosophila
-
Drosophila Drosophila Stratégie d’élevage(figure 1A)
- Jour 1: Cross three w1118/Y; DX1/CyO mouches mâles et trois mouches vierges ou plus w1118 femelles dans un flacon alimentaire de 25 mm x 95 mm avec 9 ml de médias alimentaires Drosophila standard (recette Bloomington). Configurez trois flacons de réplique pour chaque médicament et un contrôle pour l’écran.
REMARQUE: DX1 mouches ont été gentiment fournis par James Birchler (Université du Missouri)9,13. - Jour 2 et Jour 3 : Permettre aux mouches de pondre des œufs pendant 2 jours à température ambiante (22 oC).
- Jour 4 : Utilisez une courte rafale de gaz CO2 pour anesthésier les mouches parentes et éliminer les mouches du parent dans une « morgue à mouches » (une bouteille contenant 70 % d’alcool).
- Jour 1: Cross three w1118/Y; DX1/CyO mouches mâles et trois mouches vierges ou plus w1118 femelles dans un flacon alimentaire de 25 mm x 95 mm avec 9 ml de médias alimentaires Drosophila standard (recette Bloomington). Configurez trois flacons de réplique pour chaque médicament et un contrôle pour l’écran.
- Nourrir les médicaments à Drosophila pour le dépistage.
- Diluer chaque composé de drogue du stock d’origine (20 l à 10 mM en DMSO à 100 % dans des plaques à fond U PP 96-well) à une concentration finale de 10 M avec 33% DMSO dans l’eau. Utilisez 33% DMSO dans l’eau sans aucun médicament comme le contrôle.
REMARQUE : Certains médicaments sont mal solubles dans l’eau et ont été dissous dans DMSO. 100% DMSO est toxique pour les mouches. 33% est tolérable. - Jour 4 : Pipette 60 l d’une solution médicamenteuse de 10 M ou contrôle sur le dessus de la nourriture à mouche. À ce stade, assurez-vous que les mouches parentes ont été enlevées et il ya des œufs de mouche et rampant larves de première étoile sur la nourriture.
- Jour 6 : Répétez le tuyauterie de 60 l de la même solution de drogue de 10 M à la fiole de nourriture.
REMARQUE : Étant donné que les médicaments ont été ajoutés à la nourriture à la mouche, les aliments de surface supérieure contiennent près de 10 m de concentration et les aliments de fond ne pouvaient pas être entièrement pénétrés. Toutes les mouches pondent des œufs sur le dessus de la nourriture et mangent les aliments de surface supérieure.
- Diluer chaque composé de drogue du stock d’origine (20 l à 10 mM en DMSO à 100 % dans des plaques à fond U PP 96-well) à une concentration finale de 10 M avec 33% DMSO dans l’eau. Utilisez 33% DMSO dans l’eau sans aucun médicament comme le contrôle.
- Observez et marquez des changements de couleur des yeux.
- Deux jours après l’émergence des mouches F1 (environ le jour 14), examinez les mouches. Utilisez une courte rafale de CO2 pour anesthésier les mouches F1 et retirer les mouches de leur fiole sur un tampon de dissection poreux avec du CO2 en sirotant sous un papier filtre.
- Inspectez les mouches sur ce tampon sous un microscope à dissection. Examiner l’ensemble de la mouche et identifier tousw1118/Y; DX1/MD heterozygous mâles par leur manque du phénotype dominant cyO aile bouclée.
- Marquez la couleur des yeux de chacun des w1118/Y; DX1/MD heterozygous mâle vole sur une échelle de 1 à 5(figure 1B). Le pourcentage de couleur des yeux blancs a été évalué comme suit :
1. la surface totale de surface totale des yeux dispersés rouges
2. 6% - 25% taches rouges surface totale des yeux
3. 26% - 50% taches rouges surface totale des yeux
4. 51% - 75% taches rouges surface totale des yeux
5. -gt;75% taches rouges œil surface totale
REMARQUE : Alternativement, homogénéiser les têtes de mouche dans le méthanol à 100 % et utiliser un spectromètre pour mesurer la pigmentation oculaire à 450 nm d’OD. Sélectionnez seulement les mâles parce que PEV est plus prononcé chez les mâles DX1. Marquez plus de 10 mâles dans chaque flacon. - Calculez l’indice de couleur moyen de tous les mâles de chaque flacon marqué. Effectuer des triplicates pour chaque composé (figure 1C).
REMARQUE : Puisque la couleur des yeux varie selon l’âge, il s’agit d’une étape sensible au temps. La couleur des yeux doit être calculée au même âge - 2 jours. Habituellement , 10 mouches doivent être notées dans chaque flacon. - Pour confirmer que les composés favorisent en effet la formation d’hétérochromatine, utilisez une technique différente comme le ballonnement occidental pour valider (figure 1G).
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Representative Results
Ce protocole a été utilisé avec succès pour dépister les composés qui favorisent la formation d’hétérochromatine à Drosophila, qui est un système in vivo efficace et peu coûteux pour le développement de médicaments (figure 1). Nous avons examiné une bibliothèque de médicaments à petites molécules, Oncology Set III, qui est composé de 97 médicaments autorisés par la FDA en oncologie, en utilisant la souche DX1 de Drosophila melanogaster (figure 1B). Les résultats d’un médicament important ont été représentés dans un graphique à barres(figure 1C,D). Selon l’analyse de dépistage, le méthotrexate (acide 4-aminopteroylglutamic), codé comme E7 dans la bibliothèque, a causé la plus grande variété dans la souche DX1, ce qui suggère que le méthotrexate pourrait être le médicament le plus prometteur favorisant l’hétérochromatine pour le futur cancer ciblé-thérapie(figure 1E,F). Pour confirmer en outre qu’il s’agit en effet de tester les composés favorisant la formation d’hétérochromatine, les données occidentales de tache montrent que la formation d’hétérochromatine protéine associée H3K9me3 est upregulated(figure 1G), vérifiant en outre que le méthotrexate pourrait être le médicament le plus prometteur hétérochromatine-promotion.
Figure 1 : Une illustration du dépistage des médicaments à Drosophila. (A) Méthodologie d’écran Drosophila. Un aperçu du schéma pour le dépistage des composés heterochromatin-promotion en utilisant le modèle Drosophila. Trois w1118/Y; Les mâles DX1/CyO et trois w1118 vierges sont croisés à température ambiante. Ensuite, retirez les mouches adultes au quatrième jour et ajoutez 60 L du médicament de 10 M dissous dans la solution DMSO à 33 % en haut de la nourriture volante au quatrième et au sixième jour, respectivement. 33% de solution DMSO a été utilisée comme un contrôle. Le rapport couleur des yeux (blanc à rouge) de la génération masculine de F1 a été observé. (B) Analyse et score de phénotype de couleur d’oeil. Images représentatives de la couleur des yeux montrant le phénotype varié. Le pourcentage de la couleur des yeux de variété a été évalué comme suivant : 1, 1-5% taches rouges dans la surface totale ; 2, 6-25% taches rouges dans la surface totale; 3, 26-50% taches rouges dans la surface totale; 4, 51-75% taches rouges dans la surface totale; et 5, 75% de taches rouges dans la surface totale. (Barre d’échelle à 200 m) (C) Chaque médicament a été analysé comme les valeurs moyennes de trois expériences indépendantes - s.d. (déviation standard). La barre rouge montre le contrôle. (D) Résultats de l’échelle effectuée dans le médicament E7 et le contrôle. Les différences entre l’E7 et les groupes témoins étaient considérées comme significatives si les valeurs P étaient de lt;0,05 (MD) par le t-Test de l’étudiant. (E) La structure moléculaire d’un composé chimique qui a appelé E7 utilisé dans l’exemple de pharmacie. (F) Images représentatives des yeux de mouche dans le groupe de traitement E7 et de contrôle. (Scale Bar, 200 m) (G) La tache occidentale a été exécutée avec des anticorps spécifiques pour H3K9me3, H3, ou -Tubulin en utilisant la protéine totale de 3rd instar sans ou avec le traitement de methotrexate aux concentrations indiquées. Ce chiffre a été modifié à partir de Loyola et al14. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
L’hétérochromatine est une forme condensée d’ADN qui joue un rôle central dans la régulation de l’expression des gènes. Il est de plus en plus reconnu dans le cancer et peut servir de cible potentielle pour la thérapie contre le cancer15,16,17,18. Les composés à petites molécules sont couramment utilisés dans le développement de médicaments en raison des avantages dans la fabrication, la préservation et le métabolisme dans les corps humains. Pour identifier les composés à petites molécules présentant l’hétérochromatine, une méthode efficace a été conçue et présentée en utilisant la souche DX1Drosophila, qui a été prouvée pour affecter la couleur des yeux des mouches d’une manière hétérochromatine dépendante(figure 1).
Notre protocole de dépistage est un système in vivo simple, peu coûteux et facile à suivre pour le développement de médicaments. Cependant, l’une des limites de la stratégie de dépistage est de déterminer une concentration efficace de médicaments. La mouche des fruits femelle pond ses œufs à la surface de la mouche semisolide. Pour le traitement de la drogue, nous pipet la solution de drogue à la surface de la nourriture, qui est censé contenir une concentration prédéterminée. Cependant, étant donné que différents médicaments pourraient avoir des gains d’efficacité différents dans la diffusion au fond de la nourriture, la concentration de médicaments n’est pas garantie d’être cohérente sous la surface ou vers le fond de la nourriture. À 10 M de concentration, la létalité a été rarement observée chez les larves traitées avec l’un des médicaments de la bibliothèque que nous avons examiné. Cependant, la plupart des médicaments ont causé une létalité sévère aux larves à 100 m de concentration, ce qui suggère que la concentration de médicaments pourrait également être considérée comme un facteur important pour l’écran.
Ici, nous remarquons que les répétitions en tandem telles que celles utilisées ici peuvent déclencher PEV par un mécanisme qui diffère à certains égards de celui vu dans l’hétérochromatine péricentrique. Un médicament qui a un impact sur le PEV pendant le développement embryonnaire et larvaire (le test décrit ici) n’identifiera que les médicaments qui ont un impact sur le maintien de l’hétérochromatine dans les cellules somatiques et n’identifiera pas les médicaments qui ont un impact sur la formation initiale de l’hétérochromatine, qui se produit très probablement pendant le blastoderm (cycles nucléaires 10-14). Néanmoins, cela pourrait être un essai utile pour un écran de départ rapide.
Ce protocole est fiable et rentable en raison de la sensibilité de ce cluster transgène (DX1) à la formation hétérochromatine, reflétée par la quantité de pigmentation rouge présente dans l’œil. En outre, la courte durée de vie de Drosophila rend ce protocole plus efficace que d’autres organismes modèles tels que le poisson zèbre ou les cellules humaines. Bien qu’il puisse y avoir probablement un système génétique reporter présent dans le poisson zèbre qui est tout aussi sensible aux niveaux d’hétérochromatine, leur durée de vie est beaucoup plus longue que Drosophila et prendrait plus de temps pour obtenir des résultats. En outre, l’utilisation de cellules humaines ne serait pas possible puisque ce protocole se concentre spécifiquement sur l’utilisation des changements phénotypiques de la régulation épigénétique pour déterminer les niveaux d’hétérochromatine. Ainsi, ce protocole fournit une méthode in vivo efficace pour déterminer quelle petite molécule de drogue pourrait potentiellement servir de candidat pour supprimer les oncogènes dans la thérapeutique de cancer. Bien que la méthode de dépistage des médicaments Drosophila soit une approche lente pour identifier les composés par rapport à certaines méthodes de dépistage in vitro, elle est relativement sensible et nous permet de tester des composés in vivo. En combinaison avec la méthode de criblage cellulaire, qui est relativement peu coûteuse, facile à effectuer et est à haut débit, la méthode de dépistage Drosophila pourrait également être utilisé pour confirmer les hits comme méthode supplémentaire.
En résumé, avec un intérêt à identifier les composés pour d’autres recherches et le ciblage de l’hétérochromatine pour le traitement du cancer, bien que le mécanisme dans lequel cela se produit n’est pas encore entièrement compris, un simple dépistage a été effectué afin d’identifier médicaments antérochromatine-promotion. Découvrir une faible concentration à laquelle un médicament peut favoriser la formation d’hétérochromatine pourrait offrir des traitements plus uniques qui peuvent entraîner moins d’effets secondaires par rapport aux traitements de chimiothérapie modernes.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions J. Birchler, E. Bach et le Bloomington Drosophila Stock Center pour diverses souches Drosophila; le Programme de thérapeutique du développement du National Cancer Institute (NCI) pour la bibliothèque de médicaments à petites molécules oncologie; Étudiants de premier cycle de l’UCSD, y compris Amy Chang, Taesik You, Jessica Singh-Banga, Rachel Meza et Alex Chavez. La recherche rapportée dans cette publication a été soutenue par une subvention de recherche de l’American Thoracic Society à J.L. et le financement des NIH : R01GM131044 à W.X.L.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila | DX1 strain | DX1 flies were kindly provided by James Birchler (University of Missouri) | |
| Drosophila food media | UCSD fly kitchen | ||
| Methotrexate | NCI drug library | ||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Ethyl alcohol | Sigma | E7023-500ML |
References
- Morgan, M. A., Shilatifard, A.
- Saksouk, N., Simboeck, E., Dejardin, J. Constitutive heterochromatin formation and transcription in mammals. Epigenetics Chromatin. 8, 3 (2015).
- Allshire, R. C., Madhani, H. D. Ten principles of heterochromatin formation and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 229-244 (2018).
- Jenuwein, T., Allis, C. D.
- Grewal, S. I., Moazed, D. Heterochromatin and epigenetic control of gene expression. Science. 301 (5634), 798-802 (2003).
- Heard, E. Delving into the diversity of facultative heterochromatin: the epigenetics of the inactive X chromosome. Current Opinion in Genetics & Development. 15 (5), 482-489 (2005).
- Ci, X., et al. Heterochromatin Protein 1alpha Mediates Development and Aggressiveness of Neuroendocrine Prostate Cancer. Cancer Research. 78 (10), 2691-2704 (2018).
- Zhu, Q., et al. Heterochromatin-Encoded Satellite RNAs Induce Breast Cancer. Molecular Cell. 70 (5), 842-853 (2018).
- Dorer, D. R., Henikoff, S. Expansions of transgene repeats cause heterochromatin formation and gene silencing in Drosophila. Cell. 77 (7), 993-1002 (1994).
- Fanti, L., Dorer, D. R., Berloco, M., Henikoff, S., Pimpinelli, S.
- Shi, S., et al. JAK signaling globally counteracts heterochromatic gene silencing. Nature Genetics. 38 (9), 1071-1076 (2006).
- Shi, S., et al. Drosophila STAT is required for directly maintaining HP1 localization and heterochromatin stability. Nature Cell Biology. 10 (4), 489-496 (2008).
- Ronsseray, S., Boivin, A., Anxolabehere, D. P-Element repression in Drosophila melanogaster by variegating clusters of P-lacZ-white transgenes. Genetics. 159 (4), 1631-1642 (2001).
- Loyola, A. C., et al. Identification of methotrexate as a heterochromatin-promoting drug. Scientific Reports. 9 (1), 11673 (2019).
- Dialynas, G. K., Vitalini, M. W., Wallrath, L. L. Linking Heterochromatin Protein 1 (HP1) to cancer progression. Mutation Research. 647 (1-2), 13-20 (2008).
- Janssen, A., Colmenares, S. U., Karpen, G. H.
- Zhu, Q., et al. BRCA1 tumour suppression occurs via heterochromatin-mediated silencing. Nature. 477 (7363), 179-184 (2011).
- Hu, X., et al. Unphosphorylated STAT5A stabilizes heterochromatin and suppresses tumor growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10213-10218 (2013).
