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Developmental Biology

Traducción de la purificación de afinidad de ribosoma (TRAP) para investigar el desarrollo de la raíz de Arabidopsis thaliana a una escala específica de tipo de célula

Published: May 14, 2020 doi: 10.3791/60919
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Department of Plant and Microbial Biology, University of Zurich, 2Biophore - UNIL, 3Laboratory of Cell and Molecular Biology, Institute of Biology, University of Neuchâtel

Summary

La traducción de la purificación de afinidad ribosoma (TRAP) ofrece la posibilidad de diseccionar programas de desarrollo con un procesamiento mínimo de órganos y tejidos. El protocolo produce ARN de alta calidad a partir de células dirigidas con una subunidad ribosomal etiquetada con proteína fluorescente verde (GFP). Las herramientas de análisis aguas abajo, como qRT-PCR o RNA-seq, revelan perfiles de expresión específicos del tejido y del tipo de célula.

Abstract

En este artículo, damos instrucciones prácticas para obtener datos de traducción de diferentes tipos de células raíz de Arabidopsis thaliana a través del método de traducción de purificación de afinidad ribosoma (TRAP) y la preparación de bibliotecas de baja entrada optimizadas consecutivas.

Como material de partida, empleamos líneas vegetales que expresan la proteína ribosomal etiquetada por GFP RPL18 de una manera específica del tipo de célula mediante el uso de promotores adecuados. Antes de la inmunopurificación y la extracción de ARN, el tejido se congela a presión, lo que preserva la integridad del tejido y simultáneamente permite la ejecución de estudios de series temporales con alta resolución temporal. En particular, las estructuras de las paredes celulares permanecen intactas, lo que es un inconveniente importante en procedimientos alternativos como enfoques basados en la clasificación celular activado por fluorescencia que se basan en el protoduro de tejidos para aislar poblaciones celulares distintas. Además, no es necesaria ninguna fijación tisular como en las técnicas basadas en microdisección de captura láser, lo que permite obtener ARN de alta calidad.

Sin embargo, el muestreo de subpoblaciones de células y solo el arn asociado al poliso limita gravemente los rendimientos del ARN. Por lo tanto, es necesario aplicar métodos de preparación de bibliotecas suficientemente sensibles para la adquisición exitosa de datos por ARN-seq.

TRAP ofrece una herramienta ideal para la investigación de plantas, ya que muchos procesos de desarrollo implican vías de señalización mecánica y relacionadas con la pared celular. El uso de promotores para dirigirse a poblaciones celulares específicas está cerrando la brecha entre el nivel de órgano y de una sola célula que a su vez sufren de poca resolución o costos muy altos. Aquí, aplicamos TRAP para estudiar la comunicación célula-célula en la formación de raíces laterales.

Introduction

Impulsada por la creciente aplicación de técnicas de secuenciación de próxima generación, se podría aumentar la resolución espacial en la biología del desarrollo. Los estudios contemporáneos tienen como objetivo disuajar tejidos hasta tipos de células especializadas, si no de un solo nivel de células1,,2,3,4. Para ello, en los últimos cincuenta años se ha ideado una plétora de métodos diferentes (véase la Figura 1A)5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.

Muchas herramientas en la ciencia vegetal han sido adaptaciones de técnicas que fueron pioneras en la investigación animal. Este no es el caso del método que estamos introduciendo en detalle aquí. En 2005, equipado con una sólida experiencia en traducción de proteínas, el Bailey-Serres Lab se propuso diseñar proteínas ribosomales para la posterior purificación de afinidad16. Por lo tanto, podrían evitar el perfilado de polisomas que consume mucho tiempo y requiere mucha mano de obra, que se basa en la ultracentrifugación con un gradiente de sacarosa y se utilizó para evaluar la traducción de ribosomas desde la década de 196017,18. Desde entonces, el método se ha denominado purificación de afinidad ribosoma traslacional (TRAP)16. Después de estudios de traducción exitosos en plantas, Heiman et al. adaptó TRAP para animales19 y otros ampliaron su aplicación a la levadura20, Drosophila21, Xenopus22 y zebrafish23,,24.

Aunque la modificación genética del sistema modelo es un requisito previo para trap, que limita su aplicación a especies susceptibles a la transformación genética, se puede aprovechar simultáneamente esta objeción a los subconjuntos objetivo de células que son de especial interés y, por lo tanto, extremadamente difíciles de aislar del tejido/órgano intacto25 (por ejemplo, células dendríticas altamente ramificadas en un cerebro de ratón o hifas fúngicas en el tejido vegetal infectado). En las plantas, todas las células se mantienen en su lugar a través de paredes celulares que forman la base del esqueleto hidrostático26. Para liberar una célula vegetal de esta matriz, los científicos han cortado físicamente la célula de su tejido circundante a través de la microdisección de captura láser (LCM)27 o han realizado digestión enzimática de las paredes celulares28. Entre estas últimas células, las llamadas protoplastias, la población de interés está etiquetada fluorescentemente y se puede separar mediante la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS)7. LCM generalmente requiere que una muestra sea fija e incrustada en la cera, lo que en última instancia deteriora la calidad de su ARN29. Los métodos basados en FACS producen ARN de alta calidad, pero el proceso de protoplasting en sí mismo introduce diferencias en la expresión génica30 y los tejidos con paredes celulares secundarias modificadas y gruesas son notoriamente difíciles de tratar. Además, se supone que muchos procesos de desarrollo en las plantas dependen de señales transmitidas mecánicamente y, por lo tanto, la integridad de la pared celular es de suma importancia31. Dos métodos, que utilizan un acceso directo para eludir el aislamiento celular operando en el nivel de nucleii, son la clasificación nuclear activada por fluorescencia (FANS) y el aislamiento de núcleos etiquetados en tipos de células específicos (INTACT). Al igual que en TRAP, utilizan promotores específicos del tipo de celda para marcar los núcleos, que posteriormente se enriquecen a través de la clasificación o el tirón hacia abajo, respectivamente8,15. Un desafío importante para todos estos enfoques es obtener suficiente material de ARN de subconjuntos de células en un tejido. Como TRAP captura solo una fracción de los ARN celulares, la recolección de muestras es un cuello de botella considerable. Por lo tanto, se necesitan protocolos de preparación de bibliotecas especialmente sensibles para producir datos de alta calidad a partir de cantidades de entrada bajas.

Desde su creación, TRAP se ha utilizado en combinación con microarrays de ADN o, como los costos de secuenciación disminuyeron significativamente en los últimos años, ARN-seq10,32,33. Una multitud de preguntas de investigación ya se ha aclarado como se revisó en Sablok et al.34. Estamos convencidos de que seguirán más informes en los próximos años, ya que la técnica es muy versátil a la hora de combinar diferentes promotores para apuntar a tipos de células específicas. Eventualmente, esto se hará incluso de una manera inducible, y puede combinarse con el sondeo de la reacción de la planta a muchos factores de estrés biótico y abiótico. Además, cuando no se dispone de líneas transgénicas estables, los sistemas de expresión de raíces peludas también se han utilizado con éxito para realizar TRAP en tomate y medicago35,,36.

Figure 1
Figura 1: La traducción de la purificación de afinidad ribosoma (TRAP) complementa la cartera de análisis "omics". A. El aumento de los niveles de precisión analítica, hasta una sola célula o incluso la resolución subcelular se puede lograr mediante una plétora de métodos o combinaciones de los mismos. El esquema ofrece una visión general de las herramientas disponibles actualmente en el campo vegetal y animal. La recolección de tejidos a resolución celular se puede lograr mediante protocolos como LCM o FACS, que luego se acoplan al transcriptoma estándar o al análisis de perfiles/traducción de polisoma. TRAP e INTACT integran la captura de tejido y el aislamiento de ARN, ya que se basan en el etiquetado de epítopos. Sin embargo, INTACT sólo toma muestras de núcleos celulares y constituye, por lo tanto, un caso especial de análisis de transcriptoma. Un pequeño icono de conejo marca los métodos recientemente desarrollados en el campo animal: Mientras que SLAM-ITseq y Flura-seq se basan en el objetivo metabólico de ARN nacientes con bases de uracilo modificadas en células que expresan la enzima permisiva, Slide-seq hace uso de un portaobjetos de vidrio recubierto con códigos de barras de ADN que proporcionan información posicional en el rango celular. Se sigue un enfoque de etiquetado de proximidad en APEX-seq para muestrear ARN en compartimentos subcelulares específicos. En particular, el aumento de la resolución a menudo requiere la generación de material transgénico (asteriscos) y, por lo tanto, estos métodos se utilizan predominantemente para las especies modelo. TRAP es especialmente adecuado para estudios de ciencias vegetales que involucran pared celular (CW) o señalización mecánica, así como especies celulares que son difíciles de liberar de su matriz CW. B. Pasos detallados de laboratorio húmedo del procedimiento TRAP: Las plántulas que expresan proteína ribosomal etiquetada con GFP en distintos tipos de células (por ejemplo, endodermis de raíz) se cultivan en platos De Petri durante siete días y el material radicular cosechado por congelación rápida. Se recoge una muestra de control total de ARN del extracto crudo homogeneizado antes de peletizar los escombros a través de la centrifugación. Las perlas magnéticas anti-GFP se añaden al extracto transparente para realizar la inmunoprecipitación. Después de la incubación y tres pasos de lavado, el ARN asociado al polisoma (ARN TRAP/polisoma) se obtiene directamente a través de la extracción de fenol-cloroformo. LCM: microdisección de captura láser, FACS/FANS: clasificación celular/nuclear activada por fluorescencia, APEX-seq: método basado en ascorbación peroxidasa diseñada, INTACT: aislamiento de núcleos etiquetados en tipos de células específicas, alquilación vinculada a SLAM-ITseq: thiol(SH) para la secuenciación metabólica de ARN en tejido, Flura-seq: secuenciación de ARN con etiqueta de fluorouracilo (Creado con Biorender.com) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El objetivo de este artículo es proporcionar una descripción detallada del método TRAP, resaltar los pasos críticos y proporcionar orientación para un posible método de preparación de biblioteca.

Un experimento trap genérico consistirá esencialmente en los siguientes pasos (véase también la figura 1B):(1) Preparación de material vegetal, incluida la clonación de la construcción de etiquetado de ribosoma, producción y selección de líneas transgénicas, cultivo y abultamiento de semillas, esterilización y chapado, y aplicación/tratamiento de tensión (opcional) y recolección de tejidos; 2) inmunopurificación, incluida la homogeneización tisular y la limpieza del extracto crudo, el lavado de cuentas y la inmunopurificación, y las etapas de lavado; 3) extracción de ARN y evaluación de la calidad; y (4) la preparación de la biblioteca.

La raíz de Arabidopsis ha sido un sistema modelo para estudiar el desarrollo de la planta desde su introducción como planta modelo37,,38. Aquí, la aplicación de TRAP se muestra en el contexto del desarrollo de la raíz lateral de la planta. En las plantas, la acumulación de todo el sistema radicular se basa en la ejecución de este programa y por lo tanto es muy importante para la supervivencia del organismo39. En Arabidopsis,las raíces laterales se originan a partir de tejido periciclo que reside junto a vasos xilemas y, por lo tanto, se denomina periciclo de polo xilem (XPP; véase la figura 2C)40. Algunas células XPP, que se encuentran en lo profundo de la raíz, adquieren una identidad celular fundadora y, tras un desencadenante hormonal local, comienzan a proliferar por hinchazón y división anticlinalmente41. Sin embargo, debido a la presencia de una matriz de pared celular rígida, este proceso ejerce tensión mecánica en los tejidos circundantes. En particular, la endodermis superpuesta se ve afectada, ya que se encuentra en el camino del eje de crecimiento de la raíz lateral42,,43,44. De hecho, el primordium recién formado tendrá que crecer a través de la célula de endodermis superpuesta(Figura 2C2),mientras que las células de corteza y epidermis simplemente se apartan para que el primordium finalmente surja45,46. El trabajo reciente en nuestro laboratorio ha demostrado que la endodermis está contribuyendo activamente a acomodar la proliferación en el periciclo. El bloqueo dirigido de la señalización hormonal endodérmica es suficiente para inhibir incluso la primera división en las células XPP47. Por lo tanto, la comunicación periciclo-endodermis constituye un punto de control muy temprano para el desarrollo de la raíz lateral en Arabidopsis. Sin embargo, no se sabe cómo se realiza esta charla cruzada. Para desentrañar este misterio, elegimos el enfoque TRAP-seq para apuntar a las células XPP y endodeérmicas. Para enriquecer las células en el programa de raíz lateral, imitamos el desencadenante hormonal aplicando exógenamente un análogo de auxina (ácido 1-naftalencia, NAA)48,que al mismo tiempo permitió resolver temporalmente la fase inicial de la formación de la raíz lateral.

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Protocol

1. Clonación de transgénicos, producción de líneas transgénicas y selección

  1. Clonar el promotor de elección en el vector de entrada adecuado. Utilice un método de clonación basado en recombinación (Tabla de materiales) y recombine los promotores en pDONRP4-P1r. Clonar RPL18 (con etiqueta de afinidad o proteína fluorescente de elección) utilizando clonación basada en recombinación en pDONRP1-P249.
  2. Combine el vector de entrada que contiene RPL18 con el vector de entrada que contiene el promotor en una reacción de recombinación de dos fragmentos en el vector de destino adecuado con el cassette de selección FAST-rojo50 para facilitar la selección directa de semillas transgénicas.
  3. Verifique el vector recombinado secuenciando y transformarlo en agrobacterias adecuadas y competentes. Sumergir las plantas de Arabidopsis y después de 3-4 semanas de cosecha y seleccionar semillas T151.
  4. Utilice la microscopía para identificar líneas bien que expresan y verificar los patrones de expresión de acuerdo con la actividad del promotor reportada en varias líneas independientes. Seleccione líneas que muestren un patrón de expresión representativo con una sola inserción de ADN en T. Esto podría ayudar a minimizar el silenciamiento y será ventajoso para los cruces genéticos.
  5. Seleccione la descendencia T3 que sea homocigota para el gen marcador.

2. Propagación y esterilización

  1. TRAP específico del tipo de celda aísla el ARN de un número limitado de células diana por raíz. Para generar el material de partida necesario, propague líneas homocigotas. Con este fin, utilice condiciones de crecimiento estándar con un enfoque especial en el control del crecimiento de hongos.
    NOTA: Si no se pueden obtener líneas de inserción individuales, aumente los lotes en grandes poblaciones a lo largo de pocas generaciones para evitar el silenciamiento transgeneracional inducido por El ADN T.
  2. Esterilice grandes cantidades de semillas de Arabidopsis con una ronda de gas cloro y una ronda de 70% EtOH.
    1. Esparza las semillas uniformemente en platos Petri cuadrados de 12 cm x 12 cm (menos de 0,3 ml de semillas/placa) y apiló las en un desecador u otro recipiente adecuado. Evite la formación de amos o montones, ya que las semillas deben ser accesibles al gas. Realizar la esterilización de gas durante la noche con los volúmenes de lejía y HCl según se informó52: 100 ml de lejía (13%) con 6 ml de conc. HCl en un desecador de 60 L. Desfumigar durante al menos 1 h antes de recoger las semillas en un recipiente estéril.
      ADVERTENCIA: 37% HCl es altamente corrosivo y requiere un manejo cuidadoso. El gas cloro es tóxico, usa una campana de humos.
    2. Tomar 0,1 ml de semillas secas esterilizadas con gas por placa y mezclarlas con solución de esterilización (70% EtOH, 0,01% Tween) a temperatura ambiente. Incubar durante 20 min, decantar EtOH y lavar las semillas 3-4 veces con estéril H2O.
    3. Transfiera las semillas empapadas en tubos de 50 ml y diluya con agar estéril 0,1% para obtener 1 ml de lodo de semillas imbibe por placa (0,1 ml de semilla/1 ml de lodo).
      NOTA: Debido a eventos de integración transgénica, las líneas de plantas pueden ser susceptibles a diferentes técnicas de esterilización; especialmente el tiempo de incubación de EtOH fue crítico. En nuestras manos, los pasos de esterilización dual eran necesarios para evitar la contaminación por hongos durante los experimentos. Esto es especialmente importante cuando se realizan series temporales, ya que la contaminación de un único punto de tiempo dificulta todo el experimento. Bien podría ser que la esterilización dual no siempre es necesaria, dependiendo de las condiciones de cultivo locales.

3. Placado

  1. Prepare estos pasos con antelación. Vierta 1/2 Placas MS (pH 5.8) con 1% de agar en las cantidades necesarias para el experimento (20-30 por muestra/punto de tiempo). Corte las puntas de la pipeta de 1 ml para agrandar el diámetro de la punta a unos 3-4 mm con una cuchilla de afeitar. Autoclave las puntas. Cree un soporte de plantilla para enchapar tres filas de semillas por plato con tapas cuadradas de plato Petri. Prepare una campana de flujo laminar para proporcionar un ambiente de trabajo estéril y etiquete las placas a procesar.
    NOTA: Si se procesan muchas placas al mismo tiempo, las etiquetas de color pueden acelerar el etiquetado.
  2. Coloque las placas de agar vacías en el soporte de la plantilla y distribuya 1 ml de semillas impregnadas uniformemente en tres filas. Coloque las placas procesadas en pilas en el flujo laminar hasta que las semillas estén secas (es decir, se adhieran a la superficie del agar). No deje las placas más tiempo, ya que el agar también se secará.
  3. Una vez que las semillas estén suficientemente secas, cierre las tapas y selle cada placa con cinta adhesiva de microporo. Estratificar las semillas durante dos días a 4oC en la oscuridad y luego colocarlas en una cámara de crecimiento.

4. Tratamiento de tejidos (opcional)

NOTA: En este protocolo, delineamos el tratamiento exógeno de las raíces de Arabidopsis con la variante de auxina sintética NAA. Dependiendo de la pregunta experimental en cuestión, esta parte necesita ser ajustada o puede ser omitida por completo.

  1. Preparar tiras de papel tisú de 1,5 - 2 cm de altura y 10 cm de longitud. Los tiempos de incubación prolongados requieren que el tejido sea autoclavedo antes de su uso.
  2. Retire la cinta de microporos de todas las placas que tienen que someterse al tratamiento hormonal. Diluir 1 ml de NAA de 10 mM (disuelto en DMSO) en 1 L de solución líquida, autoclave 1/2 MS (pH 5.8) y remojar el papel tisú en la solución (10 M NAA).
  3. Use pinzas para aplicar una tira de papel tisú en cada fila de raíces. Utilice suavemente los dedos para eliminar las burbujas de aire. Vacíe el exceso de líquido de la placa, cierre la tapa y etiquete la placa con el tiempo. Para tiempos de incubación prolongados, vuelva a colocar las placas en la cámara de crecimiento.

5. Cosecha

  1. Recuperar placas para cada réplica biológica/ punto de tiempo / tratamiento. Recoja nitrógeno líquido en un recipiente limpio de Dewar y tubos de etiquetas (15 o 50 ml) para las diferentes muestras de tejido. Prepare un soporte de espuma de poliestireno.
    ADVERTENCIA: Familiarícese con los procedimientos de manipulación de nitrógeno líquido (aireación, congelación, tubos potencialmente explosivos).
  2. Abra la placa y retire el papel tisú con fórceps, teniendo cuidado de no separar las raíces de la superficie del agar. Con una cuchilla quirúrgica, corte una vez por fila a lo largo de la unión de raíz de brote en un solo trazo determinado. Limpie las cuchillas entre las muestras e intercambie con frecuencia para garantizar la nitidez.
  3. Con las pinzas, desliza el dedo a lo largo de las raíces de cada fila para recogerlas en tres paquetes. Agarre las raíces y vacíelas en un tubo de 50 ml lleno de nitrógeno líquido para congelarlas.
    NOTA: No intente ensamblar las raíces en estructuras densas (como bolas) ya que son difíciles de moler en el siguiente paso.
  4. Proceder con todas las placas que constituyen una muestra (en el orden de los tiempos de incubación) y verter el exceso de nitrógeno líquido. Utilice la tapa del tubo para evitar que las raíces se derramen. A continuación, cierre la tapa y recoger todos los tubos en el recipiente Dewar. Almacene el tejido radicular a -80 oC.

6. Inmunopurificación

NOTA: Este paso tiene como objetivo obtener ARN TRAP/polisoma de alta calidad. Por lo tanto, siga estrictamente los consejos de buenas prácticas para el manejo del ARN. Realice todos los pasos de esta sección en un banco estéril y limpie todos los equipos y utensilios de laboratorio con una solución de eliminación de RNase(Tabla de materiales). Use guantes y cámbielos inmediatamente cuando estén contaminados con muestras, hielo u otras fuentes que no se hayan limpiado. Dado que este es un aspecto muy crucial, se incluye una sección sobre la reutilización de equipos junto con consejos de eliminación de residuos.

  1. Preparación del búfer
    1. Prepare las soluciones de stock de acuerdo con la Tabla 1 y el autoclave (A) o el esterilizado por filtros. A menos que se especifique lo contrario, el disolvente es agua libre de RNase.
    2. Disolver y alícuota ditiothreitol (TDT), fluoruro de fenimetilsulfonil (PMSF), cicloheximida (CHX) y cloramphenicol (CAM) en sus respectivos disolventes, tal como se indica en la Tabla 1, y almacenarlos a -20oC. Todas las demás existencias pueden permanecer a temperatura ambiente.
    3. Premezcle las existencias - con ingredientes 1-4 para tampón de lavado (WB) y 1-6 para tampón de extracción de polisoma (PEB) - para evitar la mezcla de tampón que consume mucho tiempo antes de cada extracción. Por lo tanto, sólo añadir agua y los ingredientes congelados (7-10) el día de la extracción. Mantener las existencias premezcladas y el agua libre de RNase a 4oC.
      NOTA: La concentración de TDT es 1/5 de la concentración notificada de Zanetti et al. 2005, ya que la interacción de nanobody con el GFP es sensible a las altas concentraciones de TDT.
Ingredientes Concentración de stock Añadir volumen en ml para 50 ml de WB* Añadir volumen en ml para 50 ml de PEB*
1 Tris, pH 9 Un 2 M 5 5
2 Kcl Un 2 M 5 5
3 Egta Un 0.5m 2.5 2.5
4 MgCl2 Un 1 M 1.75 1.75
5 Pte Un 20% (v/v) 0 2.5
6 mezcla de detergente Un 0 2.5
Tween 20 20% (v/v)
Tritón-X 100 20% (v/v)
Brij-35 20% (p/v)
Igepal 20% (v/v)
7 Tdt ₳ 0.5m 0.1 0.1
8 Pmsf ₳ 0,1 M (isopropanol) 0.5 0.5
9 Cicloheximida ₳ 25 mg/ml (EtOH) 0.1 0.1
10 Cloranfenicol ₳ 50 mg/ml (EtOH) 0.05 0.05

Tabla 1: Asesoramiento sobre la composición del búfer y la mezcla. Los ingredientes con las concentraciones de stock dadas mezcladas en las cantidades dadas producen 50 ml de WB o PEB. Tris: tris-(hidroximetil)-aminometano, EGTA: etilenglicol-bis(éter de aminoetilo)-N,N,N',N'-ácido tetraacético, PTE: Polioxietileno-(10)-tridecyl éter, A: autoclave, . *Llenar hasta 50 ml con agua libre de RNase.

  1. Homogeneización/molienda de tejidos
    1. Enfríe la centrífuga y coloque homogeneizadores y tubos de centrífuga en hielo. Descongelar alícuotas de TDT, PMSF, CHX y CAM. Mezclar PEB y WB de las soluciones de stock en tubos de 50 ml de acuerdo con los requisitos del día (a de muestras) y enfriar sobre hielo.
      NOTA: Añadir PMSF sólo poco antes de su uso, ya que la vida media de PMSF en agua es de sólo 30 minutos.
    2. Preparar mucho nitrógeno líquido en un vaso de Dewar y recuperar muestras de tejido de un almacenamiento de -80 oC. Use guantes de algodón debajo de los guantes de laboratorio estándar para evitar quemaduras por morteros fríos. Vierta nitrógeno líquido en morteros y plagas hasta que estén lo suficientemente fríos como para permitir la molienda. Se recomienda idear un sistema para distinguir morteros (etiquetar o mantener en un cierto orden).
    3. Vacíe la muestra de tejido en un mortero y muele cuidadosamente hasta que todo el material sea un polvo blanco. Si es necesario, agregue nitrógeno líquido para mantener el tejido congelado o para facilitar una mejor molienda.
    4. Agregue 5 ml de PEB a la muestra y mezcle rápidamente con el polvo antes de que el búfer se congele. Mientras que esta muestra se descongela (mezcla de vez en cuando) procesar otra muestra.
    5. Tan pronto como la mezcla pueda ser transferida, vacíe la suspensión en un homogeneizador de vidrio y manténgala en hielo. Con 2 ml adicionales de PEB, enjuague el mortero y el pestillo y agréguelo a la muestra en el homogeneizador.
      NOTA: Evite una muestra completamente líquida, ya que esto permite la degradación del ARN.
    6. Moler la suspensión manualmente hasta que el extracto sea homogéneo. Recomendamos un mínimo de 4 a 5 sueldos.
      NOTA: Puede requerir un poco de tiempo de espera adicional para permitir que la suspensión se descontezcan aún más. El manejo de homogeneizadores requiere cierta diligencia. No aplique fuerza bruta y tenga cuidado con las fuerzas de succión. Si no se tiene en cuenta, esto conducirá a derrames, contaminación o destrucción del homogeneizador.
    7. Vierta el extracto de raíz bruta en un tubo de centrífuga de 50 ml (mantener en hielo).
      NOTA: Por lo general, varias muestras se pueden moler antes de la transferencia. Se requiere un manejo paralelo de molienda, transferencia y homogeneización. Trate de trabajar rápidamente, pero no se apresure; mantener la calma. Mantenga siempre las muestras homogeneizadas en hielo.
  2. Colección total de muestras de ARN
    1. Transfiera las alícuotas de 200 l de cada muestra bruta a un tubo de microcentrífuga limpio (etiquetado y enfriado en hielo de antemano).
    2. Proceda con la extracción de ARN como se detalla para las muestras de TRAP en los puntos 7.1 y 7.2. Realice estos pasos mientras las muestras se limpian en la centrífuga.
    3. Realizar un tratamiento DNase con el ARN total resuspendido para eliminar la contaminación del ADN y limpiar la reacción utilizando un kit comercial(Tabla de materiales).
      NOTA: Las extracciones totales de ARN generalmente producen altas concentraciones y las muestras deben diluirse considerablemente. Recomendamos medir la concentración después de la dilución por el protocolo sensible Qubit.
  3. Borrar el extracto crudo
    1. Tome el cubo de hielo con muestras de 6.2.7 y centrifugarlas durante 15 minutos a 16.000 x g y 4oC.
      NOTA: Para equilibrar la centrífuga, empareje las muestras en consecuencia. En caso de que esto no sea del todo posible, ajuste una muestra añadiendo PEB.
    2. Vierta el sobrenadante en un tubo de centrífuga fresco (enfriado en hielo de antemano) y repita la centrifugación (15 min a 16.000 x g y 4 oC). Esta transferencia se puede realizar rápidamente junto a la centrífuga.
    3. Mientras el extracto crudo se está limpiando, inicie el lavado de perlas GFP para el paso 6.6.
      NOTA: Guarde este cubo de hielo para balancearse en la coctelera, pero no vuelva a colocarlo en el banco estéril, ya que podría estar contaminado.
  4. Lavado de cuentas
    1. Perlas magnéticas GFP de Aliquot (#samples x 60 l, mesa de materiales)en un tubo de 1,5 ml. Colocar en el soporte magnético. Una vez que las cuentas hayan recogido, retire el sobrenadante.
    2. Añadir 1 ml de WB frío, resuspender las cuentas y recogerlas de nuevo. Deseche el tampón de lavado y repita una vez más con 1 ml de WB.
    3. En última instancia, resuspenda las perlas en WB al volumen inicial utilizado en el paso 6.5.1.
  5. Inmunopurificación (IP)
    1. Inmediatamente después de la centrifugación, vierta el sobrenadante despejado en tubos etiquetados de 15 ml y agregue 60 ml de perlas lavadas por muestra.
    2. Coloque todas las muestras horizontalmente en el cubo de hielo y colóquelas en una coctelera. Dejar que la mezcla se incuba durante 2 h para unir los polisomas etiquetados con GFP a las perlas.
    3. Recoger las perlas en el soporte magnético para tubos de 15 ml (sobre hielo) y añadir PMSF al PEB restante. Descarta el sobrenadante. Vierta aproximadamente 5 ml de PEB en las perlas y resuspenderlas inclinando. Agitar las muestras durante 15 minutos en la misma configuración que en la sección 6.6.2.
    4. Repita los lavados con WB a un total de 3 lavados (1 x PEB, 2 x WB). Antes de cada intercambio de búfer, agregue PMSF.
    5. Recoger las perlas en 1 ml de WB y transferirlas a un tubo de 1,5 ml. Finalmente, recoja las perlas una vez más en el soporte magnético y retire todo el líquido. Cierre el tubo y manténgalo en hielo hasta que se procesen todas las muestras.
    6. Transporte las muestras a una campana de humos para la extracción de ARN.
  6. Eliminación y reacondicionamiento de residuos de suministros de laboratorio.
    1. Si se realiza de acuerdo con las buenas prácticas de laboratorio (ver sección 2.2.1), el procedimiento de esterilización produce una solución acuosa de NaCl. Deje el gas de cloro, así como el HCl residual y la lejía, para desfumigar en la campana de humos.
    2. Eliminación de PEB y WB: A medida que CHX se descompone a un pH alto, recoger todos los líquidos y llevar al pH>9. Deseche los residuos líquidos en los residuos químicos halogenados. Todos los sólidos (tejidos, pipetas serológicas, guantes, etc.) deben eliminarse como residuos químicos.
    3. Recoger líquidos que contienen fenol por separado, así como material contaminado con fenol (puntas, tubos y guantes).
    4. Lavar a mano morteros, plagas y homogeneizadores (esponjas y cepillos) con jabón y enjuagar bien. Posteriormente, hornee el material a >220 oC durante la noche. Envuelva en papel de aluminio antes del tratamiento o colóquelo en un recipiente cubierto a prueba de calor.
    5. Cepille los tubos de centrífuga limpios con detergente y luego el troto de dietalpirocarbonato (DEPC) en la campana de humos. Para ello, añadir DEPC líquido al agua desionizada (1 ml de DEPC a 1 L de H2O) y mezclar mediante el temblor. Coloque los tubos centrífugos en una bandeja autoclavable que capture el agua DEPC derramada. Vierta la suspensión en los tubos y déjela durante 3 h o durante la noche. DEPC se descompone en el proceso de autoclave posterior.
      ADVERTENCIA: DEPC es altamente tóxico.

7. Extracción de ARN y QC

  1. Extracción de ARN
    1. Enfríe la centrífuga de la mesa a 4 oC.
    2. Añadir 1 ml de reactivo a base de ácido-guanidinio-fenol(Tabla de Materiales)a cada muestra, invertir para resuspender las cuentas o la suspensión total de ARN e incubar durante 5 minutos sobre hielo. ¡No vórtice!
    3. Añadir 200 l de cloroformo e incubar durante 3 minutos sobre hielo. A continuación, vórtice a fondo las muestras.
    4. Para ayudar a la separación de fases, centrífuga a máx. velocidad de 10-15 min, 4oC.
    5. Etiquetar tubos de baja retención de 1,5 ml(Tabla de materiales)y alícuota de 650 ml de isopropanol en cada uno.
    6. Tomar cuidadosamente la fase acuosa superior (ca. 650 oL) y transferir a los tubos preparados con isopropanol. Evite tocar la fase orgánica rosa.
    7. Precipitar el ARN durante la noche a -20 oC.
      NOTA: Se recomienda almacenar las muestras en isopropanol a -20 oC o -80 oC y solo solubilizar en agua cuando sea necesario. El ARN acuoso se degrada incluso a -80 oC cuando se almacena durante semanas/meses.
  2. Precipitación de ARN
    1. Enfríe la centrífuga de la mesa a 4 oC.
    2. Preparar fresco 80% EtOH con agua libre de RNase y enfriar a -20 oC (5 min a -80 oC ayuda a acelerar el proceso).
    3. Centrifugar las muestras a máxima velocidad (ca. 13.000 x g)durante 30 min y desechar el sobrenadante. El pellet no será visible, tan cuidadosamente pipetear como si estuviera allí. Añadir 1 ml de frío 80% EtOH e invertir el tubo una o dos veces.
    4. Centrifugar de nuevo durante 30 minutos a la velocidad máxima y repetir el lavado a un total de dos lavados.
    5. Gire hacia abajo durante 2 minutos y retire todo EtOH residual con una punta de 10 l. Deje que el pellet se seque durante 3-5 minutos (no más) a temperatura ambiente y resuspenda en agua libre de RNase de 20 ol.
    6. Mantenga las muestras en hielo y realice un control de calidad lo antes posible. Proceda a almacenar las muestras a -80 oC. Evite los ciclos de congelación-descongelación.
  3. Control de calidad utilizando equipos dedicados(Tabla de Materiales)de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.

8. Preparación de la biblioteca

  1. síntesis y amplificación de ADNc con el kit de ARN de entrada ultrabaja SMARTer v4
    1. Calcular la dilución de cada muestra para tener 1,5 ng de ARN-TRAMPA o ARN total en un volumen de 4,75 l. Realizar todas las reacciones en tubos PCR y diluir muestras con alícuotas frescas de agua libre de RNase.
    2. Realice todos los pasos de acuerdo con las recomendaciones del fabricante con 1/2 los volúmenes de reacción. Amplifique el ADNc con 12-13 ciclos de PCR.
    3. Limpie el PCR añadiendo 0,5 l de tampón de lisis 10x y 25 l de perlas SPRI(Tabla de materiales). Si se procesan muchas muestras, el búfer de lisis y los perlas se pueden mezclar previamente. Asegúrese de que las perlas estén uniformemente dispersas antes de pipetear.
    4. Continúe con el protocolo en volúmenes de reacción completos (17 l de búfer de elución). No deje que las cuentas se sequen durante más de 3 minutos. Las muestras sobrescadas pueden ser rescatadas potencialmente por tiempos prolongados de incubación.
    5. Mida las concentraciones de muestra con el kit de ADN Qubit HS.
      NOTA: El kit SMARTer v4 puede tolerar hasta 200 pg de entrada. Obtuvimos bibliotecas en casos donde no se pudieron determinar valores de Qubit (por debajo de 250 pg, límite de detección) con un PCR de 16 ciclos. Sin embargo, el material de entrada limitado también puede producir bibliotecas menos complejas.
  2. Fragmentación y ligadura de adaptadores PCR con el kit de preparación de la biblioteca de ADN Nextera XT
    1. Diluir el ADNc con agua libre de RNase para obtener una concentración de 200 pg/l y pipeta de 1,25 l en un tubo PCR.
    2. Realice todos los pasos según el fabricante con 1/4 de los volúmenes de reacción. Amplifique el ADNc con 12 ciclos de PCR y adaptadores compatibles para las muestras que pertenecen a una agrupación de secuenciación. Con los kits de índice A y D de Illumina se pueden multiplexar hasta 384 muestras.
    3. Para la limpieza de PCR, agregue 12,5 l de tampón de resuspensión y 22,5 l de perlas SPRI (relación de 0,9x). Elule la muestra con 22 ml de tampón de elución.
      NOTA: El control de calidad y la agrupación fueron realizados por la empresa de secuenciación(Tabla de materiales)y, por lo tanto, no se necesitaba una normalización basada en cuentas. La reacción de fragmentación enzimática (tagmentation) es muy sensible a la entrada de material, ya que cada enzima solo corta una vez. Por lo tanto, no exceda la recomendación de concentración.

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Representative Results

Para la evaluación de la calidad, el procedimiento antes mencionado debe sondearse en varios pasos intermedios: validación del patrón de expresión en planta, control de calidad del ARN polisómico aislado, así como de las bibliotecas finales. QRT-PCR utilizando genes marcadores conocidos se puede, además, realizar para confirmar la respuesta a la condición de tratamiento o para afinar las condiciones experimentales.

Análisis confocal de la distribución de señales GFP
Para comprobar los patrones de expresión endodérmica y XPP, analizamos líneas homocigotas de pELTP::GFP-RPL18 y pXPP::GFP-RPL18 por microscopía focal. La Figura 2A y la Figura 2B muestran plantas representativas con señales GFP (verde) que han sido contrarretenidas con yoduro propidium (magenta) para esbozar las paredes celulares. La sección transversal de la Figura 2A1 muestra un anillo concéntrico en la tercera capa de celda desde el exterior, que corresponde a la endodermis. La señal GFP endodérmica se inicia poco por encima de la zona meristemática(Figura 2A2)y aparece tanto en el citosol como alrededor de los núcleos de las células, que corresponde a ribosomas. Por el contrario, la línea XPP exhibe dos polos distintos, que corresponde al XPP(Figura 2B1). Aproximadamente tres células en cada polo comienzan por encima de la zona meristemática para exhibir una señal GFP. Por lo tanto, ambas líneas cumplen con el patrón de localización de endodermis y XPP, respectivamente(Figura 2C)53.

Validación de ARN de polisoma
Para determinar la calidad del ARN polisome obtenido realizamos mediciones de control de calidad, utilizando dos sistemas automatizados de electroforesis(Tabla de Materiales)que funcionan con cantidades de entrada de L y también calculamos un número de integridad de ARN (RIN)54. El algoritmo propietario asigna un valor RIN entre 1 y 10 a cada electroferograma y es una medida robusta y reproducible para la calidad del ARN (es decir, la degradación) - cuanto menor sea el valor más degradado es la muestra. La Figura 3 muestra ejemplos de las mediciones que obtuvimos del ARN polisome. La mayoría de las muestras apenas muestran una degradación aparente con valores RIN que van de 9-10, que está de acuerdo con los informes anteriores55,56. Cualquier manipulación inadecuada, especialmente períodos de temperaturas elevadas prolongadas (por ejemplo, temperatura ambiente) o contaminación por RNase sería evidente en esta etapa. Ambos instrumentos también calculan las concentraciones de muestra a partir de sus electroferogramas(Figura 3A). Estos pueden variar sustancialmente y están en su mayoría en el límite de detección más bajo. Por lo tanto, aconsejamos el uso de mediciones fluorométricas para cuantificar con precisión las concentraciones.

Biblioteca QC
Como la mayoría de los laboratorios no realizan la secuenciación de ARN en casa, los controles de calidad a menudo se ejecutan en instalaciones especializadas con dispositivos de alto rendimiento(Tabla de materiales). Evalúan rutinariamente la calidad y cuantifican las concentraciones mediante qPCR y ensayos fluorométricos(Tabla de materiales),ya que las mediciones precisas son requisitos previos para la agrupación de bibliotecas. Sin embargo, si la preparación de la biblioteca no se externaliza, se puede probar el resultado con equipos especializados(Tabla de materiales). La Figura 4 muestra los rastros de las bibliotecas preparadas correctamente con nuestro protocolo recomendado (A) y destaca la robustez del procedimiento a pesar de los volúmenes de reacción reducidos (B). La Parte C ilustra muestras subestándar que pueden resultar de una sobrefragmentación/subfragmentación, pérdida de material durante la limpieza o delación incorrecta del adaptador. En este último caso, otra limpieza con una relación muestra-perla más estricta podría ayudar a eliminar la contaminación. Las muestras completamente fallidas eran extremadamente raras en nuestras manos y podían originarse en varios puntos (por ejemplo, una entrada demasiado alta para la reacción de etiquetado estoquiométrica).

El rendimiento de las bibliotecas secuenciadas se ejemplifica en la Figura 4D para muestras de la endodermis en nuestro fondo mutante. Las bibliotecas de WT y/o periciclo funcionan de manera similar o incluso mejor. Las lecturas ribosomales fueron en promedio alrededor del 2% con sólo pocas muestras por encima del 3%. Las lecturas con una puntuación de calidad media superior a 30 estaban consistentemente por encima del 90% ya antes del filtrado. La capacidad de mapeo de las lecturas secuenciadas era igualmente alta que variaba en promedio en un 85%. Para determinar la correlación entre las réplicas biológicas, se calcularon los coeficientes de Spearman por pares para cada punto de tiempo. Todas las pruebas dieron como resultado valores de coeficiente alto.

Respuesta al tratamiento y análisis de enriquecimiento
Antes de que se produzca un conjunto de datos de expansión del genoma, el ARN TRAP de un experimento piloto puede ser sondeado por qRT-PCR para validar el éxito del tratamiento y/o las condiciones experimentales. Realizamos este tipo de análisis para evaluar las respuestas de auxina después de 2 h de tratamiento en las muestras XPP(Figura 5A). Tres genes diferentes que responden a la auxina (GH3.3, LBD29 y GATA23) se probaron a través del método57. Se observó una inducción muy fuerte en los tres casos después del período de incubación, lo que sugiere que la aplicación exógena de NAA fue exitosa.

Si se utilizan promotores recientemente desarrollados, en este punto también se debe realizar un análisis de enriquecimiento con qRT-PCR. Con este fin, un gen marcador conocido (es decir, el gen impulsado por el promotor utilizado) se amplifica en la muestra de ARN y en la muestra total de ARN normalizada al nivel total de ARN. Si el aislamiento del ARN TRAP del tejido específico se realizó correctamente, se debe obtener un aumento significativo del cambio de pliegue. Alternativamente, se puede recuperar información equivalente de los datos de secuenciación (consulte la figura 5B). La expresión de dos genes relacionados con la suberina, GPAT5 y HORST, está presente en todas las muestras de endodermis y, en particular, ausente de los tejidos XPP. Por el contrario, los genes expresados por periciclo (PHO1 y SKOR) se expresan muy humildemente en la endodermis y se enriquecen en las sondas XPP con una regulación descendente inducida por auxina durante el período de tiempo examinado.

Figure 2
Figura 2: Expresión específica del tipo de celda de GFP-RPL18 en la raíz de Arabidopsis. A-B. Imágenes de microscopía confocal de pELTP::GFP-RPL18 (A) y pXPP::GFP-RPL18 (B) expresando raíces a los seis días posteriores a la germinación. Los contornos de la pared celular se obtuvieron mediante la tinción con yoduro propidium (magenta). Las secciones transversales A1 y B1 son de las posiciones denotadas con líneas discontinuas en A2 y B2, respectivamente. Las últimas imágenes muestran proyecciones máximas (MAX) de las pilas z grabadas. C. Representación esquemática de los tipos de tejido que componen la raíz de Arabidopsis en longitudinal (C1) y sección transversal (C3), así como en un primordio de raíz lateral (C2). La imagen fue modificada con el permiso de F. Bouché. Barras de escala: 100 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Evaluación de la calidad del ARN TRAP/polisome. A. Tapestation - Resultados representativos de 14 muestras medidas en representación de imagen de gel con sus respectivos valores RINe (arriba a la izquierda). La representación del electroferograma se muestra para la muestra A1 (resaltada en azul). La tabla de la derecha informa sobre las concentraciones de la muestra. B. Se obtienen trazas similares a las de A con el bioanalizador. Los paneles de la derecha muestran muestras con niveles crecientes de degradación, lo que se refleja en sus valores RIN decrecientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Perfiles de biblioteca de muestras TRAP/polysome. A. Dos muestras representativas del TRAP (izquierda) corresponden muy bien con las trazas para las bibliotecas acertadas recomendadas por la guía del usuario de Nextera XT. B. Los diferentes volúmenes de reacción producen resultados sólidos en la preparación de la biblioteca. C. Bibliotecas con resultados subóptimos: fragmentos muy cortos (arriba a la izquierda), fragmentos extremadamente largos (abajo a la izquierda), baja concentración (arriba a la derecha) o fallo completo (abajo a la derecha). Tenga en cuenta también fragmentos cortos residuales (elipse azul), que deben eliminarse antes de la secuenciación. Bioanalizador: trazas rojas, LabChip: trazas azules. D. Medidas de calidad seleccionadas para muestras TRAP secuenciadas (endodermis de nuestro mutante lateral libre de raíces) en diferentes puntos de tiempo y distribución de coeficientes de correlación de Spearman calculados entre comparaciones por pares de todas las muestras dentro de un punto de tiempo (n-65). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: qRT-PCR y RNA-seq muestran la respuesta de auxina y el enriquecimiento del tipo de tejido, respectivamente. A. Los niveles de expresión de tres genes conocidos que responden a la auxina se evaluaron después de 2 h de tratamiento con auxina a través de qRT-PCR. Se observó una fuerte inducción en todas las muestras. RT-PCR se realizó en 3 réplicas biológicas independientes y se normalizó a las muestras no tratadas con UBC21 como gen de referencia interno. Las barras de error representan el SEM. GH3.3: Gretchen Hagen 3.3, LDB29: LATERAL BOUNDARY DOMAIN 29, GATA23: FACTOR de transcripción de encuadernación DE motivo GATA 23, UBC21: UBIQUITIN-CONJUGATING ENZYME 21 B. Niveles de expresión de cuatro genes marcadores del conjunto de datos TRAP-seq. Las muestras de la izquierda se derivan de la endodermis (tonos verdes), mientras que las muestras de la derecha se derivan de XPP (tonos azules). Los números representan los intervalos de incubación de auxina en horas. Las puntuaciones z negativas reflejan niveles de expresión bajos y viceversa. Los genes marcadores endodérmicos (GPAT5, HORST) se expresan diferencialmente con altos niveles en muestras de endodermis. Por el contrario, los marcadores de periciclo (PHO1, SKOR) tienen altos niveles de expresión en las células XPP y muestran una regulación descendente sobre el tratamiento con auxina. GPAT5: glicerol-3-fosfato 2-O-acyltransferas (biosíntesis de suberina), HORST: hidroxilasa de tejido suberizado radicular, PHO1: fosfato 1, SKOR: estelar K+ rectificador externo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Patrones de localización pUBQ10::GFP-RPL18 no constitutivos. Microscopía confocal de plántulas de seis días de edad. Los contornos de la pared celular se obtuvieron mediante la tinción con yoduro propidium (magenta). Las secciones transversales A2 y C1 son de las posiciones denotadas con líneas discontinuas en A3 y C2, respectivamente. Las imágenes marcadas como MAX muestran las proyecciones máximas de las pilas z grabadas. A1-A3. Patrones de localización uniformes de la construcción impulsada por UBQ10. B1-C2. Disminución notable en la intensidad de la señal en las capas de tejido externo. A, B y C se registran en tres plantas diferentes. Barras de escala: 100 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Verificación del patrón de localización RPL18
El patrón de expresión adecuado de la subunidad ribosomal etiquetada es fundamental para evitar la interpretación errónea de los datos de cualquier experimento TRAP. Por lo tanto, la incorporación de GFP como etiqueta de epítope a RPL18 permite muy elegantemente la verificación del patrón de expresión deseado y, consecutivamente, la extracción de la fracción de polisoma del mismo tejido. Los enfoques más invasivos para asegurar patrones de promotores adecuados son seguidos por Jiao y Mayerowitz 2010, que requiere la tinción DE GUS y en Tian et al. 2019 que se basa en la inmunomancha con anticuerpos anti-FLAG58,59.

Recomendamos encarecidamente comprobar el patrón de localización en cada generación, ya que las líneas transgénicas de T-DNA pueden ser propensas al silenciamiento y, por lo tanto, la intensidad de la señal puede deteriorarse o la proporción de semillas que expresan disminuye. Con la etiqueta GFP incorporada en la construcción, estos controles frecuentes se realizan fácilmente a través de microscopía.

Sin embargo, incluso un análisis confocal exhaustivo puede llevar en algunos casos a conclusiones falsas. Nos gustaría destacar esto con nuestro intento fallido de producir una línea TRAP de control. Hasta ahora, la comunidad de ciencias vegetales no ha sido capaz de crear una línea de plantas con una distribución uniforme de RPL18 en todas las capas celulares. Incluso el promotor 35S inicialmente empleado fue atribuido a mostrar sólo una distribución "casi constitutiva" con un patrón de localización no uniforme10. Nuestro enfoque fue utilizar el promotor de UBIQUITIN10 (UBQ10) para impulsar la construcción GFP-RPL18. El cribado en la generación T1 ofreció una localización muy prometedora y por lo tanto fue elegido para ser propagado(Figura 6A). Sin embargo, los datos de una ejecución de secuenciación de prueba no mostraron enriquecimiento en comparaciones entre elTP- y las líneas impulsadas por UBQ10para genes específicos de endodermis conocidos. Tras una inspección más detallada de esas plantas, de hecho encontramos una disminución en la señal en las capas de tejido externo, mientras que el tejido estelómico mostró una fuerte expresión(Figura 6B). Los estudios futuros deben buscar candidatos más adecuados en el panorama del promotor y complementar el método TRAP.

ARN total como muestra de control
El establecimiento de una mejor línea de control TRAP aún está pendiente y será muy esperado por el campo. Con esto en mente, hasta ahora la única manera de obtener una distribución uniforme de los ARNm en toda la planta de tejido es recoger el ARN total. Como, en este caso, se muestrea un transcriptoma, esto debe tenerse en cuenta en el análisis bioinformático posterior. En particular, tanto las fracciones totales de ARN como las de ARN polisome se correlacionan ahora, ya que se originan en la misma muestra de tejido.

En busca de un método de preparación de la biblioteca TRAP
Como se mencionó anteriormente, un inconveniente importante del enfoque TRAP son los rendimientos variables y en su mayoría bajos que se pueden lograr. Con muestras que van desde pocas ng a a veces hasta 100 ng un enfoque estándar con el kit Illumina TruSeq (requisito de entrada de 100 ng) se juzgó como demasiado insensible para la construcción de bibliotecas de calidad suficiente. Una búsqueda en el mercado reveló varios kits de preparación de bibliotecas disponibles comercialmente, que se especificaron para trabajar con material de partida tan bajo como 5-10 ng. No probamos el protocolo utilizado por Reynoso et al. 2019, que funciona para sus muestras TRAP de tomate, arroz y Medicago y utiliza el enfoque BrAD-seq60.

Todos nuestros ensayos, sin embargo, con la secuenciación posterior de pruebas arrojaron resultados insatisfactorios. A pesar del uso de pasos de enriquecimiento de poliA, las muestras de TRAP sufrieron de altas contaminaciones ribosomales (hasta el 30% de las lecturas). Además, la tasa de éxito para la preparación de la biblioteca fue variable y especialmente baja para muestras con concentraciones críticamente bajas o valores RIN relativamente más bajos. Nuestras extensas pruebas nos llevan a la conclusión de que la composición específica de ARN de una muestra de TRAP, con un contenido de rRNA muy alto y presumiblemente concentraciones minúsculas de ARNm, requiere un enfoque más sensible para obtener bibliotecas confiables. Por lo tanto, recurrimos a soluciones de última generación para cantidades de entrada ultrabajas: SMARTer v4 y Nextera XT. Resasegurantemente, Song y otros también encontraron este enfoque de preparación de la biblioteca para superar a sus competidores cuando probaron varios métodos y su salida de secuenciación en el tejido hepático TRAPed61. Las métricas de calidad que hemos presentado en la Figura 4D presentan lecturas de alta calidad (Q>30) a bajas tasas de mapeo de rRNA (<3%) concurrentes con altas tasas de mapeo genético. Además, los coeficientes de correlación de Spearman altos muestran que las réplicas tienen perfiles de expresión muy similares. El uso de ambos kits fue sencillo con números de ciclo modestos y dio resultados robustos y confiables. Los datos de secuenciación eran de alta calidad con material de partida de 1,5 ng. Con la toleración del kit SMARTer de tan solo 200 pg, se puede optimizar la cantidad de material de partida de la planta. La aplicabilidad para los tipos de células más raras se determinará en última instancia por la viabilidad de acumular suficiente ARN.

TRAP complementa el conjunto de herramientas de ciencia vegetal
El método TRAP se ha vuelto cada vez más popular entre los científicos de plantas34 y estamos seguros de que adquirirá el estado de una técnica estándar debido a varias razones.

Ninguno de los pasos del protocolo TRAP necesita equipos especializados, como una máquina de clasificación celular o un microscopio de captura láser dedicado, lo que hace posible que muchos laboratorios realicen los experimentos. Hasta la fecha, los factores más costosos son la preparación de la biblioteca y la secuenciación aguas abajo. Sin embargo, con el avance dinámico de las técnicas de secuenciación de próxima generación y el aumento de la demanda de secuenciación de una sola célula, anticipamos que los costos disminuirán significativamente.

Además, el aislamiento de los ARN asociados a los polisoma significa que se recopila información sobre el estado de traducción activo de esos ARN (translatome). Por lo tanto, TRAP captura la salida de todos los pasos reglamentarios que son aguas arriba de la traducción y representa un proxy más directo para la composición de proteína celular. Por supuesto, los ribosomas estancados y las modificaciones post-traduccionales siguen siendo esquivos y deben abordarse mediante otros enfoques (por ejemplo, proteómica).

Como se indicó anteriormente, una clara ventaja que TRAP tiene en un contexto de planta es la preservación de las estructuras CW y las propiedades mecánicas de las células. A medida que sólo comenzamos a entender las intrincadas conexiones y funciones regulatorias que surgen a través de la señalización CW y mecánica31,,62,los enfoques que preservan estas estructuras serán más importantes en muchos contextos de desarrollo diferentes.

Especialmente para especies modelo bien establecidas, TRAP puede beneficiarse de una gran cantidad de diferentes promotores, que se han caracterizado. En Arabidopsis,era posible mapear toda la raíz de una manera específica del tipo de célula utilizando 19 promotores de genes marcadores diferentes30,,63. Con cada experimento ARN-seq, estas selecciones se mejorarán y surgirán nuevos promotores más específicos y refinarán la resolución celular.

TRAP es además aplicable en un uso combinatorio con muchos promotores para poblaciones celulares donde aún no se conocen marcadores. Este es el caso de las células especializadas en la endodermis raíz. Las llamadas células de paso se caracterizan por la absense de la capa de suberina que recubre las células maduras de endodermis53. La combinación de promotores adecuados y posterior en la resta de silico de los distintos perfiles de expresión enriquecerá para las regiones que albergan celdas de paso. El análisis del reportero transcripcional ayudará a identificar los genes de los marcadores celulares de pasaje. Sin embargo, queda por determinar si trap se puede utilizar para analizar la población de células raras sobre esta base.

En este artículo, hemos proporcionado una descripción detallada del método de purificación de afinidad de ribosoma de traducción, sus ventajas y limitaciones, y las aplicaciones potenciales destacadas de los mismos. En la cartera de estudios "omics", ocupa un nicho importante y ayudará a responder a muchas preguntas biológicas.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Nos gustaría dar las gracias a Jean-Claude Walser, del Centro de Diversidad Genética de Zúrich, por su asesoramiento experto crucial en la fase inicial de este proyecto. El trabajo en el laboratorio de Vermeer fue apoyado por una beca de cátedra SNF (PP00P3_157524) y una subvención de equipo R'EQUIP (316030_164086) de la Fundación Nacional Suiza de Ciencias (SNSF) otorgada a JEMV.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sterilization
bleach, 13% Sigma 71696
beaker VWR 214-1172/74/75
desiccator with porcelaine plate (DURAN) Sigma/Merck Z317454-1EA/Z317594-1EA
EtOH, p.a. Honeywell 02860-1L
HCl, 37% Roth 4625.1
Tween 20 Sigma P9416
Plate growth + harvesting
MS salts, basal salt mixture, incl. MES buffer Duchefa M0254
agar plant for cell culture Applichem/Panreac A2111.1000
DMSO Sigma D4540
forcepts Rubis Switzerland 5-SA model
KOH Fluka 60370
micropore/surgical tape 3M 1530-0
NAA Duchefa N0903
petri dishes 120x120 mm Greiner bio-one 688102
scalpel VWR/Swann-Morton 233-5454
tissues, neutral, two-layered any supplier of your choice
Immunoprecipitation
GFP-beads: gtma-100 GFP-Trap_MA Chromotek e.g. gtma-100
Brij-35 Sigma P1254-500G
centrifuge tubes (in accordance with centrifuge) Beckman Coulter 357001
Chloramphenicol Applichem C0378-25G
cotton gloves VWR 113-7355
Cycloheximide, HPLC grade Sigma 01810-1G
DEPC VWR E174 might have long delivery times
DTT Fluka 43815
EGTA Sigma 3054.3
homogenizers DUALL 23 KONTES GLASS CO (via VWR) SCERSP885450-0023 (set) SCERSP885451-0023 pestle only - SCERSP885452-0023 cylinder only; long delivery times
Igepal CA-360 Sigma I3021-100ml
KCl Sigma 60130
MgCl2 hexahydrat Roth 2189.2
mortar and pestle VWR 470148-960 & 470019-978
PMSF Roche 10 837 091 001
Polyoxyethylene-(10)-tridecylether/PTE Sigma P2393-500G
RNase-free water Roth T143.3
RNAZap Thermo Fisher AM9780/AM9782 for cleaning surfaces
Tris, >99.3% Roth AE15.3
Triton X-100 Fluka T8787-250ml
Tween 20 Sigma P9416-100ml
RNA extraction
2-Propanol, p.a. Sigma 33539-1L-GL-R
Chloroform, HPLC grade Scharlau CL02181000
EtOH, p.a. Honeywell 02860-1L
low-retention microcentrifuge tubes, 1.5 ml Eppendorf/Sigma Z666548-250EA LoBind
RNase-free DNase set Qiagen 79254
RNeasy MiniElute Cleanup Kit Qiagen 74204
TRIzol reagent ThermoFisher/Ambion 15596018
Library preparation
15/50 mL Tube Magnetic Separator Abraxis PN 472250
AMPure beads Beckman Coulter A63881
Index Kit A Illumina FC-131-2001
Index Kit D Illumina FC-131-2004
neodymium magnets Amazon/other 6 x 1.5 mm range: N42 (NdFeB)
Nextera XT kit Illumina FC-131-1024/1096 https://emea.support.illumina.com/
PCR strips ThermoScientific AB-0266
SMARTer v4 kit Takara Bioscience 634892 https://www.takarabio.com/
Bioanalyzer Agilent 2100 Bioanalyzer Instrument specialized equipment for RNA/DNA quality control
Tapestation Agilent 4200 Tapestation Instrument specialized equipment for RNA/DNA quality control
Fragment Analyzer Agilent 5400 Fragment Analyzer System specialized equipment for RNA/DNA quality control (high throughput)
LabChip PerkinElmer LabChip GX Touch Nucleic Acid Analyzer specialized equipment for RNA/DNA quality control (high throughput)
Qubit 4 Fluorometer ThermoFisher Q33239 specialized equipment for RNA/DNA concentration determination
qRT-PCR
GATA23 Microsynth fwd: AGTGAGAATGAA
AGAAGAGAAGGG;
rev: GTGGCTGCGAAT
AATATGAATACC
GH3.3 Microsynth fwd: CAAACCAATCCT
CCAAATGAC;
rev: ACTTATCCGCAA
CCCGACT
LBD29 Microsynth fwd: TCTCCAACAACA
GGTTGTGAAT;
rev: AAGGAGCCTTAG
TAGTGTCTCCA
UBC21 Microsynth fwd: TGCGACTCAGGG
AATCTTCT;
rev: TCATCCTTTCTT
AGGCATAGCG
SsoAdvanced Universal SYBR Green Bio-Rad #172-5270
iScript Adv cDNA Kit Bio-Rad #172-5038
miscellaneous
Falcon tubes 15 ml, Cellstar Greiner bio-one 188261
Falcon tubes 50 ml, Cellstar Greiner bio-one 210261
filter tips 1 ml Axygen TF-1000-R-S
filter tips 10 µl Axygen TF-10-R-S
filter tips 100 µl Axygen TF-100-R-S
filter tips 20 µl Axygen TF-20-R-S
filter tips 200 µl Axygen TF-200-R-S
microcentrifuge tubes 1.5 ml SARSTEDT 72.690.001
Propidium iodide Sigma P4170-100MG
sequencing company Novogene en.novogene.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Biología del desarrollo Número 159 Arabidopsis TRAP TRAP-seq perfilado de traducción ARN-seq específico de tipo celular formación de raíces laterales diferenciación de endodermis
Traducción de la purificación de afinidad de ribosoma (TRAP) para investigar el desarrollo de la raíz de <em>Arabidopsis thaliana</em> a una escala específica de tipo de célula
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Thellmann, M., Andersen, T. G., Vermeer, J. E. Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale. J. Vis. Exp. (159), e60919, doi:10.3791/60919 (2020).

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