Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Oversette ribosom affinitet rensing (TRAP) for å undersøke Arabidopsis thaliana Root Development på en celle type-spesifikk skala

Published: May 14, 2020 doi: 10.3791/60919
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Department of Plant and Microbial Biology, University of Zurich, 2Biophore - UNIL, 3Laboratory of Cell and Molecular Biology, Institute of Biology, University of Neuchâtel

Summary

Oversette ribosome affinitet rensing (TRAP) gir mulighet til å dissekere utviklingsprogrammer med minimal behandling av organer og vev. Protokollen gir høy kvalitet RNA fra celler målrettet med en grønn fluorescerende protein (GFP)-merket ribosomal subunit. Nedstrøms analyseverktøy, for eksempel qRT-PCR eller RNA-seq, avslører vevs- og celletypespesifikke uttrykksprofiler.

Abstract

I denne artikkelen gir vi praktiske instruksjoner for å få translatome data fra forskjellige Arabidopsis thaliana rotcelletyper via den oversette ribosome affinitetsrensing (TRAP) metoden og påfølgende optimalisert lav-input bibliotek forberedelse.

Som startmateriale bruker vi plantelinjer som uttrykker GFP-merket ribosomalt protein RPL18 på en celletypespesifikk måte ved bruk av tilstrekkelige arrangører. Før immunrensing og RNA-ekstraksjon blir vevet frosset, noe som bevarer vevsintegritet og samtidig tillater gjennomføring av tidsseriestudier med høy temporal oppløsning. Spesielt forblir celleveggstrukturer intakte, noe som er en stor ulempe i alternative prosedyrer som fluorescensaktiverte cellesorteringsbaserte tilnærminger som er avhengige av vevsomforsynt for å isolere forskjellige cellepopulasjoner. I tillegg er ingen vevfiksering nødvendig som i laserfangst mikrodisseksjonsbaserte teknikker, noe som gjør at høykvalitets RNA kan oppnås.

Prøvetaking fra underpopulasjoner av celler og bare isolere polysom-assosiert RNA begrenser rna-utbytter alvorlig. Det er derfor nødvendig å anvende tilstrekkelig sensitive bibliotekforberedelsesmetoder for vellykket datainnhenting av RNA-seq.

TRAP tilbyr et ideelt verktøy for planteforskning, da mange utviklingsprosesser involverer celleveggrelaterte og mekaniske signalveier. Bruken av arrangører for å målrette spesifikke cellepopulasjoner er å bygge bro mellom organ- og encellenivå som igjen lider av liten oppløsning eller svært høye kostnader. Her bruker vi TRAP for å studere cellecellekommunikasjon i lateral rotdannelse.

Introduction

Drevet av den økende anvendelsen av neste generasjons sekvenseringsteknikker, kan romlig oppløsning i utviklingsbiologi økes. Moderne studier tar sikte på å dissekere vev ned til spesialiserte celletyper, om ikke encellede nivå1,2,3,4. For dette formål har en mengde forskjellige metoder blitt utarbeidet i løpet av de siste femti årene (se figur 1A)5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.

Mange verktøy i plantevitenskap har vært tilpasninger av teknikker som var pionerer i dyreforskning. Dette er ikke tilfelle for metoden vi introduserer i detalj her. I 2005, utstyrt med sterk bakgrunn i proteinoversettelse, satte Bailey-Serres Lab ut for å konstruere ribosomale proteiner for påfølgende affinitetsrensing16. Dermed kunne de unngå tidkrevende og arbeidskrevende polysom profilering, som er basert på ultracentrifugering med en sukrosegradient og ble brukt til å vurdere å oversette ribosomer siden 1960-tallet17,18. Metoden har siden blitt referert til som translasjonell ribosom affinitet rensing (TRAP)16. Etter vellykkede translatome studier i planter, Heiman et al. tilpasset TRAP for dyr19 og andre utvidet sin søknad til gjær20, Drosophila21, Xenopus22 og sebrafisk23,24.

Selv om genetisk modifisering av modellsystemet er en forutsetning for TRAP, som begrenser anvendelsen til arter som er egnet til genetisk transformasjon, kan man samtidig utnytte denne innvendingen mot undergrupper av celler som er av spesiell interesse og ellers ekstremt vanskelig å isolere fra det intakte vevet/orgelet25 (f.eks. svært forgrenede dendrittiske celler i en mushjerne eller sopphyphae i infisert plantevev). I planter holdes alle celler på plass via cellevegger som danner grunnlaget for det hydrostatiske skjelettet26. For å frigjøre en plantecelle fra denne matrisen, har forskere enten fysisk kuttet cellen ut av sitt omkringliggende vev gjennom laserfangstmikrodisseksjon (LCM)27 eller utført enzymatisk fordøyelse av celleveggene28. Blant de sistnevnte cellene, såkalte protoplasts, er befolkningen av interesse fluorescerende merket og kan skilles via fluorescensaktivert cellesortering (FACS)7. LCM krever vanligvis en prøve som skal festes og bygges inn i voks, noe som til slutt forverrer kvaliteten på RNA29. FACS-baserte metoder gir høy kvalitet RNA, men prosessen med å protopelastere i seg selv introduserer forskjeller i genuttrykk30 og vev med modifiserte og tykke sekundære cellevegger er notorisk vanskelig å behandle. Videre antas mange utviklingsprosesser i planter å stole på mekanisk overførte signaler, og derfor er integriteten til celleveggen av avgjørende betydning31. To metoder, som bruker en snarvei til å omgå celleisolasjon ved å operere på nivået av kjerner, er fluorescensaktivert kjernefysisk sortering (FANS) og isolering av kjerner merket i bestemte celletyper (INTAKT). Som i TRAP bruker de celletypespesifikke arrangører for å markere kjerner, som senere blir beriket via sortering eller pull down, henholdsvis8,15. En stor utfordring for alle disse tilnærmingene er å få tilstrekkelig RNA-materiale fra undergrupper av celler i et vev. Som TRAP fanger bare en brøkdel av cellulære RNAs, prøvesamling er en betydelig flaskehals. Spesielt sensitive bibliotekforberedelsesprotokoller er derfor nødvendig for å produsere data av høy kvalitet fra lave inngangsbeløp.

Siden etableringen har TRAP enten blitt brukt i kombinasjon med DNA-mikroarrayer eller, som sekvenseringskostnader falt betydelig de siste årene, RNA-seq10,32,33. En rekke forskningsspørsmål har allerede blitt belyst som gjennomgått i Sablok et al.34. Vi er overbevist om at flere rapporter vil følge i de kommende årene som teknikken er svært allsidig når du kombinerer ulike arrangører for å målrette bestemte celletyper. Til slutt vil dette bli gjort selv på en utilbørlig måte, og kan kombineres med å undersøke anleggets reaksjon på mange biotiske og abiotiske stressfaktorer. I tillegg, der stabile transgene linjer ikke er tilgjengelige, har hårete rotuttrykkssystemer også blitt brukt til å utføre TRAP i tomat og medicago35,36.

Figure 1
Figur 1: Translating ribosome affinity purification (TRAP) utfyller "omics" analyseporteføljen. A. Økende nivåer av analytisk presisjon, ned til encellede eller til og med subcellulær oppløsning kan oppnås ved en mengde metoder eller kombinasjoner av disse. Ordningen gir en oversikt over tilgjengelige verktøy i plante- og dyrefeltet. Vevsinnsamling ved cellulær oppløsning kan oppnås ved protokoller som LCM eller FACS, som deretter kobles til standard transkripsjon eller polysome profilering / translatome analyse. TRAP og INTAKT integrerer både vevsfangst og RNA-isolasjon som de er basert på epitop-tagging. Intakte prøver bare cellekjerner og utgjør derfor et spesielt tilfelle av transkripsjonsanalyse. Et lite kaninikon markerer nyutviklede metoder i dyrefeltet: Mens SLAM-ITseq og Flura-seq er avhengige av metabolsk targetting av nascent RNAs med modifiserte uracilbaser i celler som uttrykker det tillatte enzymet, bruker Slide-seq et belagt glasslysbilde med DNA-strekkoder som gir posisjonsinformasjon i cellulærområdet. En nærhetsmerkingstilnærming følges i APEX-seq for å prøve RNAer i bestemte undercellulære rom. Spesielt krever økt oppløsning ofte generering av transgen materiale (stjerner) og disse metodene brukes dermed hovedsakelig til modellarter. TRAP er spesielt egnet for plantevitenskapsstudier som involverer cellevegg (CW) eller mekanikersignalering samt cellearter som er vanskelige å frigjøre fra cw-matrisen. B. Detaljerte våtlabtrinn i TRAP-prosedyren: Frøplanter som uttrykker GFP-merket ribosomalt protein i forskjellige celletyper (f.eks. rotendodermis) dyrkes på Petri-retter i syv dager og rotmateriale høstet ved snap frysing. En total RNA-kontrollprøve samles inn fra det homogeniserte råoljeekstraktet før ruskene blir avstøtende via sentrifugering. Magnetiske anti-GFP perler legges til det klarerte ekstraktet for å utføre immunnedbør. Etter inkubasjon og tre vasketrinn oppnås polysomassosiert RNA (TRAP/polysome RNA) direkte via fenol-kloroformekstraksjon. LCM: laser fangst mikrodisseksjon, FACS / FANS: fluorescens-aktivert celle / kjernefysisk sortering, APEX-seq: metode basert på konstruert ascorbat peroksidans, INTAKT: isolering av kjerner merket i spesifikke celletyper, SLAM-ITseq: tiol (SH)-koblet alkylation for metabolsk sekvensering av RNA i vev, Flura-seq: fluorouracil-merket RNA sekvensering (Opprettet med Biorender.com) Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Målet med denne artikkelen er å gi en detaljert beskrivelse av TRAP-metoden, for å markere kritiske trinn og gi veiledning for en mulig bibliotekklargjøringsmetode.

Et generisk TRAP-eksperiment vil i hovedsak bestå av følgende trinn (se også figur 1B): (1) Tilberedning av plantemateriale, inkludert kloning av ribosom-tagging konstruksjon, transgen linjeproduksjon og valg, voksende og bulking opp av frø, sterilisering og plating, og stress søknad / behandling (valgfritt) og vev høsting; (2) immunrensing inkludert vevhomogenisering og rydding av råekstrakt, perlevask og immunrensing, og vasketrinn; (3) RNA-ekstraksjon og kvalitetsvurdering; og (4) bibliotekforberedelse.

Arabidopsis roten har vært et modellsystem for å studere planteutvikling helt siden introduksjonen som modellanlegg37,38. Her vises anvendelsen av TRAP i sammenheng med plantesiderotutvikling. I planter er oppbyggingen av hele rotsystemet avhengig av utførelsen av dette programmet og er derfor svært viktig for organismens overlevelse39. I Arabidopsisstammer laterale røtter fra pericycle vev som ligger ved siden av xylem fartøy og derfor kalles xylem pole pericycle (XPP; se figur 2C)40. Noen XPP-celler, som ligger dypt inne i roten, får en grunnleggercelleidentitet og, på en lokal hormonell utløser, begynner å spre seg ved hevelse og dele anticlinally41. Men på grunn av tilstedeværelsen av en stiv celleveggmatrise, utøver denne prosessen mekanisk stress på det omkringliggende vevet. Spesielt påvirkes den overliggende endodermis, da den er i veien for den laterale rotvekstaksen42,43,44. Faktisk må det nylig dannede primordium vokse gjennom den overliggende endodermiscellen (Figur 2C2) mens cortex- og epidermis-celler bare skyves til side for primordium å endelig dukke opp45,46. Nylig arbeid i laboratoriet vårt har vist at endodermis aktivt bidrar til å imøtekomme spredningen i perisyklusen. Målrettet blokkering av endodermal hormonell signalisering er tilstrekkelig til å hemme selv den aller første divisjonen i XPP-cellene47. Derfor utgjør pericycle-endodermis kommunikasjon et svært tidlig kontrollpunkt for lateral rotutvikling i arabidopsis. Det er imidlertid ikke kjent hvordan denne crosstalk utføres. For å løse dette mysteriet valgte vi TRAP-seq-tilnærmingen for å målrette XPP og endodermale celler. For å berike for celler i siderotprogrammet, etterlignet vi den hormonelle utløseren ved å eksogene bruke en auxin analog (1-naftaleneddiksyre, NAA)48, som samtidig lov til å midlertidig løse den første fasen av lateral rotdannelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Kloning av transgene, transgen linjeproduksjon og valg

  1. Klone arrangøren av valget i riktig oppføring vektor. Bruk en rekombinasjonsbasert kloningsmetode (Materialtabellen) og kombiner arrangørene på nytt i pDONRP4-P1r. Clone RPL18 (med affinitetsmerke eller fluorescerende protein) ved hjelp av rekombinasjonsbasert kloning i pDONRP1-P249.
  2. Kombiner inngangsvektoren som inneholder RPL18 med den promoterholdige inngangsvektoren i en tofragments rekombinasjonsreaksjon i riktig destinasjonsvektor med FAST-rød utvalgskassett50 for å lette direkte valg av transgene frø.
  3. Kontroller den kombinerte vektoren ved sekvensering og forvandle den til egnede, kompetente agrobakterier. Flower dip Arabidopsis planter og etter 3-4 uker høste og velg T1 frø51.
  4. Bruk mikroskopi til å identifisere godt uttrykkende linjer og verifisere uttrykksmønstre i henhold til den rapporterte promoteraktiviteten i flere uavhengige linjer. Velg linjer som viser et representativt uttrykksmønster med én enkelt T-DNA-innsetting. Dette kan bidra til å minimere deaktivering og vil være en fordel for genetiske kors.
  5. Velg T3 avkom som er homozygot for markørgenet.

2. Forplantning og sterilisering

  1. Celletypespesifikk TRAP isolerer RNA fra et begrenset antall målceller per rot. For å generere det nødvendige startmaterialet, forplante homozygote linjer. For dette formål, bruk standard vekstforhold med et spesielt fokus på soppvekstkontroll.
    MERK: Hvis enkelt innsettingslinjer ikke kan oppnås, kan du vokse partier i store populasjoner over noen generasjoner for å unngå T-DNA-indusert transgenerasjonell deaktivering.
  2. Steriliser store mengder arabidopsisfrø med en runde klorgass og en runde på 70% EtOH.
    1. Spre frø jevnt på 12 cm x 12 cm firkantede Petri retter (mindre enn 0,3 ml frø / plate) og stable dem i en tørkebånd eller annen egnet beholder. Unngå klump eller heap formasjon som frøene må være tilgjengelig for gassen. Utfør gasssterilisering over natten med blekemiddel- og HCl-volumer som rapportert52:100 ml blekemiddel (13 %) med 6 ml conc. HCl i en 60 L uttørkende. Defumigate i minst 1 h før du samler frøene i en steril beholder.
      FORSIKTIG: 37 % HCl er svært korroderende og krever nøye håndtering. Klorgass er giftig, bruk en røykhette.
    2. Ta 0,1 ml tørre, gasssteriliserte frø per plate og bland dem med steriliseringsløsning (70% EtOH, 0,01% Tween) ved romtemperatur. Inkuber i 20 min, dekanter EtOH og vask frøene 3-4 ganger med steril H2O.
    3. Overfør de fuktede frøene til 50 ml rør og fortynn med steril 0,1% agar for å få 1 ml imbibed frø slam per plate (0,1 ml frø / 1 ml slurry).
      MERK: På grunn av transgeneintegrasjonshendelser kan plantelinjer være utsatt for ulike steriliseringsteknikker; spesielt EtOH inkubasjonstid ble funnet å være kritisk. I våre hender var de doble steriliseringstrinnene nødvendige for å unngå soppforurensning under forsøkene. Dette er spesielt viktig når du utfører tidsserier som forurensning av et enkelt tidspunkt hindrer hele eksperimentet. Det kan godt være at dobbel sterilisering ikke alltid er nødvendig, avhengig av lokale vekstforhold.

3. Plating

  1. Klargjør disse trinnene på forhånd. Hell 1/2 MS-plater (pH 5.8) med 1% agar i mengdene som trengs for eksperimentet (20-30 per prøve /tidspunkt). Klipp 1 ml pipettespisser for å forstørre spissens diameter til ca. 3-4 mm med barberblad. Autoklav tipsene. Lag en malholder for plating tre rader frø per plate med firkantede Petri parabollokk. Forbered en lamiarstrømningshette for å gi et sterilt arbeidsmiljø og merke platene som skal behandles.
    MERK: Hvis mange plater behandles samtidig, kan fargede etiketter øke hastigheten på merkingen.
  2. Plasser tomme agarplater i malholderen og fordel 1 ml imbibed frø jevnt på tre rader. Plasser de behandlede platene i stabler i lamitarstrømmen til frøene er tørre (dvs. hold deg til agaroverflaten). Ikke la platene lenger som agar vil tørke ut også.
  3. Når frøene er tilstrekkelig tørre, lukk lokkene og forsegle hver plate med mikroporetape. Stratifiser frøene i to dager ved 4 °C i mørket og legg dem deretter inn i et vekstkammer.

4. Vevbehandling (valgfritt)

MERK: I denne protokollen skisserer vi eksogene behandling av arabidopserøtter med den syntetiske auxin-varianten NAA. Avhengig av det eksperimentelle spørsmålet for hånden, må denne delen justeres eller utelates helt.

  1. Forbered strimler av silkepapir på 1,5 - 2 cm i høyden og 10 cm i lengde. Forlengede inkubasjonstider krever at vevet autoklineres før bruk.
  2. Fjern mikroporebåndet fra alle plater som må gjennomgå hormonbehandlingen. Fortynn 1 ml 10 mM NAA (oppløst i DMSO) i 1 l væske, autoklet 1/2 MS-oppløsning (pH 5.8) og bløtlegg vevspapiret i oppløsningen (10 μM NAA).
  3. Bruk pinsett til å bruke en stripe av vevpapir på hver rad med røtter. Bruk forsiktig fingrene til å fjerne luftbobler. Tøm overflødig væske fra platen, lukk lokket og merk platen med tiden. For lengre inkubasjonstider, plasser platene tilbake i vekstkammeret.

5. Høsting

  1. Hent plater for hver biologiske replika/tidspunkt/behandling. Samle flytende nitrogen i et rent Dewar fartøy og etikett rør (15 eller 50 ml) for de forskjellige vevsprøvene. Forbered en Styrofoam holder.
    FORSIKTIG: Bli kjent med flytende nitrogenhåndteringsprosedyrer (lufting, frostbitt, potensielt eksploderende rør).
  2. Åpne platen og fjern vevspapiret med tang, vær forsiktig så du ikke løsner røttene fra agaroverflaten. Med et kirurgisk blad, kuttet en gang per rad langs skyte-rot-krysset i et enkelt, bestemt slag. Rengjør bladene mellom prøvene og bytt ofte for å garantere skarphet.
  3. Med pinsett sveiper du langs røttene til hver rad for å samle dem i tre bunter. Ta på røttene og tøm dem i et 50 ml rør fylt med flytende nitrogen for å få frysing.
    MERK: Ikke prøv å sette sammen røtter i tette strukturer (som baller) da de er vanskelige å male i neste trinn.
  4. Fortsett med alle plater som utgjør en prøve (i rekkefølge av inkubasjonstider) og hell ut overflødig flytende nitrogen. Bruk rørlokket for å hindre at røttene søler. Lukk deretter lokket og samle alle rørene i Dewar-fartøyet. Oppbevar rotvevet ved -80 °C.

6. Immunrensing

MERK: Dette trinnet tar sikte på å oppnå høy kvalitets TRAP / polysome RNA. Følg derfor nøye råd om god praksis for RNA-håndtering. Utfør alle trinnene i denne delen i en steril benk og rengjør alt utstyr og labware med en RNase-fjerningsløsning (Materialtabellen). Bruk hansker og bytt dem umiddelbart når de er forurenset med prøve, is eller andre kilder som ikke er rengjort. Siden dette er et svært avgjørende aspekt, er en seksjon om gjenbruk av utstyr sammen med råd om avfallshåndtering inkludert.

  1. Buffer forberedelse
    1. Forbered lagerløsninger i henhold til tabell 1 og autoklav (A) eller filtersteriliser ().). Med mindre annet er spesifisert, er oppløsningsvæsken RNase-fritt vann.
    2. Oppløs og aliquot dithiothreitol (DTT), fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF), cykloheksimid (CHX) og kloramfenikol (CAM) i sine respektive løsemidler som angitt i tabell 1 og oppbevar dem ved -20 °C. Alle andre aksjer kan forbli ved romtemperatur.
    3. Forhåndsbland bestandene - med ingredienser 1-4 for vaskebuffer (WB) og 1-6 for polysom ekstraksjonsbuffer (PEB) - for å unngå tidkrevende bufferblanding før hver ekstraksjon. Dermed bare tilsett vann og frosne ingredienser (7-10) på dagen for utvinning. Oppbevar de forhåndsblandede bestandene og RNase-fritt vann ved 4 °C.
      MERK: DTT-konsentrasjonen er 1/5 av den rapporterte konsentrasjonen fra Zanetti et al. 2005, da nanobody-interaksjonen med GFP er følsom for høye DTT-konsentrasjoner.
Ingredienser Konsentrasjon av lager Legg til volum i ml for 50 ml WB* Tilsett volum i ml for 50 ml PEB*
1 Tris, pH 9 A 2 M (andre kan være på den 5 5
2 KCl (andre er) A 2 M (andre kan være på den 5 5
3 EGTA (andre er i seg selv) A 0,5 M (andre kan være på samme siden) 2.5 2.5
4 MgCl 2 (andre eri seg selv) A 1 M (andre kan være på denne 1.75 1.75
5 Pte A 20% (v/ v) 0 2.5
6 vaskemiddel blanding A 0 2.5
Tween 20 (andre kan være på vei til Tween 20 20% (v/ v)
Triton-X 100 (andre betydninger) 20% (v/ v)
Brij-35 (Andre) 20 % (m/v)
Igepal (andre er ire) 20% (v/ v)
7 Dtt ₳ 0,5 M (andre kan være på samme siden) 0.1 0.1
8 Pmsf (andre kan være på den siden) ₳ 0.1 M (isopropanol) 0.5 0.5
9 Cykloheksimid ₳ 25 mg/ml (EtOH) 0.1 0.1
10 Kloramfenikol ₳ 50 mg/ml (EtOH) 0.05 0.05

Tabell 1: Buffersammensetning og blanderåd. Ingredienser med gitte lagerkonsentrasjoner blandet i de gitte beløpene gir 50 ml WB eller PEB. Tris: tris-(hydroksymetyl)-aminometan, EGTA: etylen glykol-bis(β-aminoetyleter)-N,N,N',N'-tetra-eddiksyre, PTE: Polyoksystylen-(10)-tridecyl eter, A: autoklaven, 1: filtersterilisere; *fyll opptil 50 ml med RNase-fritt vann.

  1. Vev homogenisering/sliping
    1. Avkjøl sentrifugen og legg homogenisatorer og sentrifugerør på is. Tine aliquots av DTT, PMSF, CHX og CAM. Bland PEB og WB fra lagerløsningene i 50 ml rør i henhold til dagens krav (# av prøver) og avkjøl på is.
      MERK: Tilsett PMSF bare kort tid før bruk, da halveringstiden til PMSF i vann bare er 30 min.
    2. Forbered rikelig med flytende nitrogen i et Dewar-fartøy og hent vevsprøver fra -80 °C-lagring. Bruk bomullshansker under standard laboratoriehansker for å forhindre brannskader fra kalde mørtel. Hell flytende nitrogen i mørtel og til de er kalde nok til å tillate sliping. Det anbefales å utarbeide et system for å skille mørtel (etikett eller holde i en bestemt rekkefølge).
    3. Tøm vevsprøven i en mørtel og slip forsiktig til alt materiale er et hvitt pulver. Om nødvendig, tilsett flytende nitrogen for å holde vevet frosset eller for å lette bedre sliping.
    4. Tilsett 5 ml PEB i prøven og bland raskt med pulveret før bufferen fryser. Mens denne prøven tiner (bland fra tid til annen) behandle en annen prøve.
    5. Så snart blandingen kan overføres, tøm slurry i et glass homogenisator og holde på is. Med ytterligere 2 ml PEB, skyll mørtelen og pestle og legg den til prøven i homogenisatoren.
      MERK: Unngå en helt flytende prøve, da dette tillater RNA-nedbrytning.
    6. Slip opp slurrymanuelt til ekstraktet er homogent. Vi anbefaler minst 4 til 5 stup.
      MERK: Det kan kreve litt ekstra ventetid for at slammet kan tine ytterligere. Håndtering av homogenisatorer krever litt flid. Ikke påfør rå kraft og pass opp for sugekrefter. Hvis det ikke tas hensyn til, vil dette føre til søl, forurensning eller ødeleggelse av homogenisatoren.
    7. Hell rårotekstraktet i et 50 ml sentrifugerør (hold deg på is).
      MERK: Vanligvis kan flere prøver være malt før overføring. Parallell håndtering av sliping, overføring og homogenisering er nødvendig. Prøv å jobbe raskt, men ikke rush; hold deg rolig. Hold alltid homogeniserte prøver på is.
  2. Total RNA-prøvesamling
    1. Overfør 200 μL aliquots av hver råoljeprøve til et rent mikrosentrifugerør (merket og avkjølt på is på forhånd).
    2. Fortsett med RNA-ekstraksjonen som beskrevet for TRAP-prøver i punkt 7.1 og 7.2. Gjør disse trinnene mens prøvene rydder i sentrifugen.
    3. Utfør en DNase-behandling med den resuspenderte totale RNA for å eliminere DNA-kontaminering og rydde opp i reaksjonen ved hjelp av et kommersielt sett (Materialtabellen).
      MERK: Totale RNA-ekstraksjoner gir vanligvis høye konsentrasjoner og prøver må fortynnes betydelig. Vi anbefaler å måle konsentrasjonen etter fortynning av den følsomme Qubit-protokollen.
  3. Rydde råekstraktet
    1. Ta isbøtten med prøver fra 6,2,7 og sentrifuge dem i 15 min ved 16.000 x g og 4 °C.
      MERK: For å balansere ut sentrifugen, par prøver tilsvarende. Hvis dette ikke er fullt mulig, juster ett utvalg ved å legge til PEB.
    2. Hell supernatanten til et friskt sentrifugerør (avkjølt på is på forhånd) og gjenta sentrifugering (15 min ved 16 000 x g og 4 °C). Denne overføringen kan raskt utføres ved siden av sentrifugen.
    3. Mens råekstraktet er rydding, start vasking av GFP-perler for trinn 6.6.
      MERK: Oppbevar denne isbøtten for gynge på shakeren, men ikke plasser tilbake i den sterile benken, da den kan være forurenset.
  4. Perle vask
    1. Aliquot magnetiske GFP-perler (#samples x 60 μL, Materialbord) i et 1,5 ml rør. Plasser på det magnetiske stativet. Når perlene har samlet seg, fjern supernatanten.
    2. Tilsett 1 ml kald WB, resuspend perlene og samle dem igjen. Kast vaskebufferen og gjenta snyk si mer med 1 ml WB.
    3. Til slutt, resuspend perlene i WB til det opprinnelige volumet som brukes i trinn 6.5.1.
  5. Immunforpurring (IP)
    1. Umiddelbart etter sentrifugering, hell det ryddet supernatanti merket 15 ml rør og tilsett 60 μL vasket perler per prøve.
    2. Legg alle prøvene horisontalt inn i isbøtten og legg den på en shaker. La blandingen inkubere i 2 timer for å binde GFP-merkede polysomer til perlene.
    3. Samle perlene på magnetstativet for 15 ml rør (på is) og tilsett PMSF til de resterende PEB. Kast supernatanten. Hell ca 5 ml PEB til perlene og resuspend dem ved å vippe. Rist prøvene i 15 min i samme oppsett som i avsnitt 6.6.2.
    4. Gjenta vaskene med WB til totalt 3 vask (1 x PEB, 2 x WB). Før hver bufferutveksling, legg til PMSF.
    5. Samle perlene i 1 ml WB og overfør dem til et 1,5 ml rør. Til slutt, samle perlene en gang til på det magnetiske stativet og fjern all væske. Lukk røret og hold på is til alle prøvene er behandlet.
    6. Transporter prøvene til en røykhette for RNA-ekstraksjon.
  6. Avfallshåndtering og rekondisjonering av laboratorieforsyninger.
    1. Hvis det utføres i henhold til god laboratoriepraksis (se pkt. 2.2.1), gir steriliseringsprosedyren en vandig NaCl-løsning. La klorgassen, samt gjenværende HCl og blekemiddel, defumigate i røykhetten.
    2. PEB og WB avhending: Som CHX brytes ned ved høy pH, samle alle væsker og bringe til pH>9. Kast væskeavfallet i halogenated kjemisk avfall. Alle faste stoffer (vev, serologiske pipetter, hansker osv.) skal kastes som kjemisk avfall.
    3. Samle fenolholdige væsker separat, samt fenol-forurenset materiale (tips, rør og hansker).
    4. Håndvask mørtel, pestles og homogenisatorer (svamper og børste) med såpe og skyll grundig. Deretter steker materialet ved >220 °C over natten. Pakk enten inn i tinnfolie før behandlingen eller legg i en varmebestandig, dekket beholder.
    5. Pensle rene sentrifugerør med vaskemiddel og deretter dietylpyrokarbonat (DEPC)-godbit i røykhetten. For dette formål, tilsett flytende DEPC til deionisert vann (1 ml DEPC til 1 L h2O) og bland via risting. Plasser sentrifugerørene på et autoklaverbart brett som fanger sølt DEPC-vann. Hell suspensjonen i rørene og la den stå i 3 timer eller over natten. DEPC brytes ned i den påfølgende autoklavingsprosessen.
      FORSIKTIG: DEPC er svært giftig.

7. RNA-ekstraksjon og QC

  1. RNA-ekstraksjon
    1. Avkjøl sentrifugen på bordplaten til 4 °C.
    2. Tilsett 1 ml syre-guanidinium-fenolbasert reagens (Table of Materials) til hver prøve, invertere for å resuspendere perlene eller total RNA slam og inkubere i 5 min på is. Ikke vortex!
    3. Tilsett 200 μL kloroform og inkuber i 3 min på is. Deretter virvler prøvene grundig.
    4. For å hjelpe faseseparasjon, sentrifuge på maks. hastighet i 10-15 min, 4 °C.
    5. Etikett 1,5 ml rør med lav oppbevaring (Materialtabell) og aliquot 650 μL isopropanol inn i hver.
    6. Ta forsiktig den øvre vandige fasen (ca. 650 μL) og overfør til de tilberedte rørene med isopropanol. Unngå å berøre den rosa organiske fasen.
    7. Stupfall RNA over natten ved -20 °C.
      MERK: Det anbefales å oppbevare prøvene i isopropanol ved -20 °C eller -80 °C og kun løses i vann ved behov. Vandig RNA forringer selv ved -80 °C når den lagres i uker/måneder.
  2. RNA nedbør
    1. Avkjøl sentrifugen på bordplaten til 4 °C.
    2. Forbered frisk 80% EtOH med RNase-fritt vann og avkjøl ved -20 °C (5 min ved -80 °C bidrar til å fremskynde prosessen).
    3. Sentrifugerprøvene med maksimal hastighet (ca. 13 000 x g)i 30 min og kast supernatanten. Pelleten vil ikke være synlig, så nøye pipette som om den var der. Tilsett 1 ml kald 80% EtOH og inverter røret en eller to ganger.
    4. Sentrifuge igjen i 30 min ved maksimal hastighet og gjenta vasken til totalt to vasker.
    5. Snurr ned i 2 min og fjern alle gjenværende EtOH med en 10 μL-spiss. La pelleten tørke i 3-5 min (ikke mer) ved romtemperatur og resuspendere i 20 μL RNase-fritt vann.
    6. Hold prøvene på is og utfør kvalitetskontroll så snart som mulig. Fortsett å lagre prøvene ved -80 °C. Unngå fryse-tine sykluser.
  3. Kvalitetskontroll ved hjelp av dedikert utstyr (Materialtabellen) i henhold til produsentens anbefalinger.

8. Forberedelse av bibliotek

  1. cDNA-syntese og forsterkning med SMARTer v4 Ultra Low Input RNA Kit
    1. Beregn fortynning av hver prøve for å ha 1,5 ng av TRAP-RNA eller totalt RNA i et volum på 4,75 μL. Utfør alle reaksjoner i PCR-rør og fortynn prøver med ferske aliquots av RNase-fritt vann.
    2. Utfør alle trinn i henhold til produsentens anbefalinger med 1/2 reaksjonsvolumene. Forsterke cDNA med 12-13 PCR sykluser.
    3. Rengjør PCR ved å legge til 0,5 μL av 10x lysis buffer og 25 μL SPRI perler (Materialtabellen). Hvis mange prøver behandles lysis buffer og perler kan pre-mixed. Pass på at perlene er jevnt spredt før pipettering.
    4. Fortsett med protokollen i full reaksjonsvolum (17 μL elutionbuffer). Ikke la perlene tørke i mer enn 3 minutter. Overtørkede prøver kan potensielt reddes ved lengre inkubasjonstider.
    5. Mål prøvekonsentrasjonene med Qubit HS DNA-settet.
      MERK: SMARTer v4-settet tåler ned til 200 pg-inngang. Vi fikk biblioteker i tilfeller der Qubit-verdier ikke kunne bestemmes (under 250 pg, deteksjonsgrense) med en 16-syklus PCR. Det begrensede inngangsmaterialet kan imidlertid også gi mindre komplekse biblioteker.
  2. Fragmentering og adapterligation PCR med Nextera XT DNA Library Preparation Kit
    1. Fortynn cDNA med RNase-fritt vann for å oppnå en konsentrasjon på 200 pg/μl og pipette 1,25 μL i et PCR-rør.
    2. Utfør alle trinnene i henhold til produsenten med 1/4 reaksjonsvolumene. Forsterke cDNA med 12 PCR sykluser og kompatible adaptere for prøvene som tilhører en sekvensering basseng. Med Illuminas indekssett A og D kan opptil 384 prøver multiplekseres.
    3. For PCR-oppryddingen tilsett 12,5 μL resuspensjonsbuffer og 22,5 μL SPRI-perler (0,9x-forhold). Elute prøven med 22 μL elutionbuffer.
      MERK: QC og pooling ble utført av sekvenseringsselskapet (Table of Materials) og dermed var det ikke nødvendig med perlebasert normalisering. Den enzymatiske fragmenteringsreaksjonen (tagmentation) er svært følsom for materialinndata, da hvert enzym bare kutter én gang. Derfor ikke overskridkonsentrasjonsanbefalingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For kvalitetsvurdering bør den ovennevnte prosedyren undersøkes ved flere mellomliggende trinn: validering av uttrykksmønster i planta, kvalitetskontroll av den isolerte polysomale RNA samt av de endelige bibliotekene. qRT-PCR ved hjelp av kjente markørgener kan i tillegg utføres for å bekrefte responsen på behandlingstilstanden eller for å finjustere de eksperimentelle forholdene.

Konfokal analyse av GFP-signalfordeling
For å se etter både endodermal og XPP uttrykkmønstre, analyserte vi homozygote linjer av pELTP::GFP-RPL18 og pXPP::GFP-RPL18 ved konfokal mikroskopi. Figur 2A og figur 2B viser representative planter med GFP-signaler (grønn) som har blitt motet med propidiumjodid (magenta) for å skissere cellevegger. Tverrsnittet i figur 2A1 viser en konsentrisk ring i det tredje cellelaget fra utsiden, noe som tilsvarer endodermis. Endodermal GFP-signalet initieres kort tid over den meristematiske sonen (Figur 2A2) og vises både i cytosol og rundt cellenes kjerner, noe som tilsvarer ribosomer. Xpp-linjen viser derimot to forskjellige poler, noe som tilsvarer XPP (figur 2B1). Omtrent tre celler på hver pol starter over den meristematiske sonen for å vise et GFP-signal. Dermed er begge linjene i samsvar med lokaliseringsmønsteret til henholdsvis endodermis og XPP (figur 2C)53.

Polysom RNA-validering
For å bestemme kvaliteten på den oppnådde polysome RNA utførte vi kvalitetskontrollmålinger, ved hjelp av to automatiserte elektroforesesystemer (Materialtabellen) som fungerer med μL inngangsmengder og også beregner et RNA-integritetsnummer (RIN)54. Den proprietære algoritmen tildeler en RIN-verdi mellom 1 og 10 til hvert elektroferogram og er et robust og reproduserbart mål for RNA-kvalitet (dvs. nedbrytning) - jo lavere verdi jo mer forringet er prøven. Figur 3 viser eksempler på målingene vi fikk fra polysom RNA. De fleste prøver viser knapt noen tilsynelatende nedbrytning med RIN-verdier fra 9-10, som er i samsvar med tidligere rapporter55,56. Feil håndtering, spesielt perioder med langvarige forhøyede temperaturer (f.eks. romtemperatur) eller RNase-kontaminering vil være tydelig på dette stadiet. Begge instrumentene beregner også prøvekonsentrasjoner fra elektroferogrammer (figur 3A). Disse kan variere betydelig og er for det meste på den nedre deteksjonsgrensen. Vi anbefaler derfor å bruke fluorometriske målinger for å kvantifisere konsentrasjoner nøyaktig.

Bibliotek QC
Siden de fleste laboratorier ikke utfører RNA-sekvenseringen i huset, kjøres kvalitetskontroller ofte på spesialiserte anlegg med høy gjennomstrømningsenheter (Materialtabellen). De vurderer rutinemessig kvalitet og kvantifiserer konsentrasjoner ved qPCR og fluorometriske analyser (Materialtabellen) som nøyaktige målinger er nødvendige for bibliotekpooling. Likevel, hvis bibliotekforberedelse ikke outsources, kan man prøve utfallet med spesialisert utstyr (Materialtabellen). Figur 4 viser spor av vellykket forberedte biblioteker med vår anbefalte protokoll (A) og fremhever robustheten i prosedyren til tross for nedskalerte reaksjonsvolumer (B). Del C illustrerer sub-standard prøver som kan skyldes over-/underfragmentering, materialtap under fjerning av rene eller mislykkede adapterer. I sistnevnte tilfelle kan en annen opprydding med et strengere prøve-perle-forhold bidra til å eliminere forurensningen. Helt mislykkede prøver var ekstremt sjeldne i våre hender og kunne oppstå på flere punkter (f.eks for høy inngang for den stochiometriske tagmentation reaksjonen).

Ytelsen til sekvenserte biblioteker er eksemplifisert i figur 4D for prøver fra endodermis i vår mutant bakgrunn. Biblioteker fra WT og/eller pericycle utfører lignende eller enda bedre. Ribosomal leser var i gjennomsnitt rundt 2% med bare få prøver over 3%. Leser med en gjennomsnittlig kvalitetsscore over 30 var konsekvent over 90% allerede før filtreringen. Kartingen sto for sekvensert lesninger var like høy i gjennomsnitt på 85 %. For å bestemme korrelasjonen mellom biologiske replikater ble parvise Spearman-koeffisienter beregnet for hvert tidspunkt. Alle tester resulterte i høye koeffisientverdier.

Analyse av behandlingsrespons og berikelse
Før et datasett som spenner over genomet produseres, kan TRAP RNA fra et piloteksperiment undersøkes av qRT-PCR for å validere behandlingssuksess og/eller eksperimentelle forhold. Vi utførte denne typen analyse for å vurdere auxin responser etter 2 timer behandling i XPP-prøvene (Figur 5A). Tre forskjellige auxinresponsive gener (GH3.3, LBD29 og GATA23) ble testet via metoden Ct57. Svært sterk induksjon ble observert i alle tre tilfellene etter inkubasjonsperioden, noe som tyder på at den eksogene NAA-applikasjonen var vellykket.

Hvis nyutviklede arrangører benyttes, bør man på dette tidspunktet også utføre berikelsesanalyse med qRT-PCR. For dette formål forsterkes et kjent markørgen (dvs. genet drevet av arrangøren som brukes) i TRAP og totale RNA-prøve- og uttrykksnivåer normalisert til det totale RNA-nivået. Hvis isolasjonen av TRAP RNA fra det spesifikke vevet var vellykket, bør det oppnås en betydelig endringsøkning. Tilsvarende informasjon kan også hentes fra sekvenseringsdataene (se figur 5B). Uttrykk for to suberinrelaterte gener, GPAT5 og HORST, er til stede i alle endodermisprøver og spesielt fraværende fra XPP-vevet. Tvert imot er pericycle-uttrykte gener (PHO1 og SKOR) bare svært lavt uttrykt i endodermis og beriket i XPP-sondene med en auxin-indusert nedregulering over den undersøkte tidsrammen.

Figure 2
Figur 2: Celletypespesifikt uttrykk for GFP-RPL18 i Arabidopsis-roten. A-B. Confocal mikroskopi bilder av pELTP::GFP-RPL18 (A) og pXPP::GFP-RPL18 (B) uttrykker røtter på seks dager etter spiring. Celleveggkonturer ble oppnådd gjennom farging med propidiumjodid (magenta). Tverrsnitt A1 og B1 er fra posisjonene merket med stiplede linjer i henholdsvis A2 og B2. De sistnevnte bildene viser maksimale projeksjoner (MAX) av de innspilte z-stackene. C. Skjematisk representasjon av vevstypene som består arabidopsisroten i langsgående (C1) og tverrsnitt (C3) samt i en lateral rotprimordium (C2). Bildet ble endret med tillatelse fra F. Bouché. Skala barer: 100 μm. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: TRAP/polysome RNA kvalitetsvurdering. A. Tapstation - Representative resultater fra 14 målte prøver i gel bilde representasjon med sinerespektive RIN e verdier (øverst til venstre). Elektroferogramrepresentasjon vises for prøve A1 (uthevet i blått). Tabellen til høyre informerer om prøvekonsentrasjonene. B. Lignende spor som i A oppnås med Bioanalyzer. Panelene til høyre viser prøver med økende nivåer av nedbrytning, noe som reflekterer i deres synkende RIN-verdier. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Bibliotekprofiler fra TRAP/polysome prøver. A. To representative TRAP-prøver (venstre) samsvarer veldig godt med sporene for vellykkede biblioteker anbefalt av brukerhåndboken for Nextera XT. B. Ulike reaksjonsvolumer gir robuste bibliotekforberedelsesresultater. C. Biblioteker med suboptimale resultater: svært korte fragmenter (øverst til venstre), ekstremt lange fragmenter (nederst til venstre), lav konsentrasjon (øverst til høyre) eller fullstendig feil (nederst til høyre). Legg også merke til gjenværende korte fragmenter (blå ellipse), som må fjernes før sekvensering. Bioanalysator: røde spor, LabChip: blå spor. D. Valgte kvalitetsmål for sekvenserte TRAP-prøver (endodermis av vår laterale rotfrie mutant) på forskjellige tidspunkter og distribusjon av Spearman korrelasjonskoeffisienter beregnet mellom parvise sammenligninger av alle prøver innen et tidspunkt (n = 65). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: qRT-PCR og RNA-seq viser henholdsvis auxin-respons og vevstypeberikelse. A. Uttrykksnivåer av tre kjente auxinresponsive gener ble vurdert etter 2 timers auxinbehandling via qRT-PCR. Sterk induksjon ble observert i alle prøver. RT-PCR ble utført på 3 uavhengige biologiske replikater og normalisert til de ikke-behandlede prøvene med UBC21 som internt referansegen. Feilfelt representerer SEM. GH3.3: Gretchen Hagen 3.3, LDB29: LATERAL BOUNDARY DOMAIN 29, GATA23: GATA-motiv binding transkripsjonfaktor 23, UBC21: UBIQUITIN-CONJUGATING ENZYME 21 B. Uttrykksnivåer av fire markørgener fra TRAP-seq-datasettet. Eksempler til venstre er endodermis-avledet (grønne nyanser), mens prøver til høyre er XPP-avledede (blå nyanser). Tall representerer auxin inkubasjonsintervallene i timer. Negative z-score gjenspeiler lave uttrykksnivåer og omvendt. Endodermal markør gener (GPAT5, HORST) er differensialt uttrykt med høye nivåer i endodermis prøver. Tvert imot har pericycle markører (PHO1, SKOR) høye uttrykksnivåer i XPP-celler og viser nedregulering ved auxin behandling. GPAT5: glyserol-3-fosfat 2-O-acyltransferas (suberin biosynthse), HORST: hydroksylase av rot suberized vev, PHO1: fosfat 1, SKOR: stelar K+ ytre rektittier. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Ikke-konstituerende pUBQ10::GFP-RPL18 lokaliseringsmønstre. Konfokal mikroskopi av seks dager gamle frøplanter. Celleveggkonturer ble oppnådd gjennom farging med propidiumjodid (magenta). Tverrsnitt A2 og C1 er fra posisjonene merket med stiplede linjer i henholdsvis A3 og C2. Bilder merket MAX viser maksimale projeksjoner av de innspilte z-stablene. A1-A3. Uniform lokalisering mønstre av UBQ10-drevetkonstruksjon. B1-C2. Merkbar reduksjon i signalstyrken i ytre vevslag. A, B og C er registrert i tre forskjellige planter. Skala barer: 100 μm. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Verifisering av RPL18 lokaliseringsmønster
Avgjørende for å unngå feiltolkning av data fra et TRAP-eksperiment er riktig uttrykksmønster for den kodede ribosomale underenheten. Derfor tillater inkorporering av GFP som en epitoptag til RPL18 svært elegant verifisering av ønsket uttrykksmønster og fortløpende, nedtrekking av polysome fraksjonen fra samme vev. Mer invasive tilnærminger for å sikre riktig promotor mønstre etterfølges av Jiao og Mayerowitz 2010, som krever GUS-farging og i Tian et al. 2019 som er avhengig av immunfarging med anti-FLAG antistoffer58,59.

Vi anbefaler på det sterkeste å sjekke lokaliseringsmønsteret i hver generasjon, da T-DNA-transgene linjer kan være utsatt for deaktivering og dermed signalstyrke kan forverres eller andelen av uttrykkende frø reduseres. Med GFP-koden innlemmet i konstruksjonen, utføres disse hyppige kontrollene enkelt via mikroskopi.

Men selv grundig konfokal analyse kan i noen tilfeller føre til falske konklusjoner. Vi ønsker å fremheve dette med vårt mislykkede forsøk på å produsere en kontroll TRAP linje. Så langt har plantevitenskapssamfunnet ikke vært i stand til å skape en plantelinje med en ensartet RPL18-fordeling gjennom alle cellelag. Selv den opprinnelig ansatte 35S arrangøren ble tilskrevet bare vise "nær constitutive" distribusjon med en ikke-uniform lokalisering mønster10. Vår tilnærming var å bruke arrangøren av UBIQUITIN10 (UBQ10) til å drive GFP-RPL18-konstruksjonen. Screening i T1-generasjonen tilbød svært lovende lokalisering og ble dermed valgt å bli overført (Figur 6A). Data for en testsekvenseringskjøring viste imidlertid ikke berikelse i sammenligninger mellom ELTP- og UBQ10-drevnelinjer for kjente endodermisspesifikke gener. Ved nærmere inspeksjon av disse plantene, faktisk fant vi en nedgang i signal i ytre vev lag mens stele vev viste sterkt uttrykk (Figur 6B). Fremtidige studier bør søke i arrangørlandskapet etter mer egnede kandidater og utfylle TRAP-metoden.

Total RNA som kontrollprøve
Etableringen av en bedre TRAP kontrolllinje er fortsatt venter og vil være etterlengtet av feltet. Med dette i tankene, så langt den eneste måten å få en vev-wide uniform fordeling av mRNAs er å samle total RNA. Som i dette tilfellet er et transkripsjonsprogram samplet, må dette gjøres rede for i den videre bioinformatikkanalysen. Spesielt er både totale RNA og polysome RNA-fraksjoner nå korrelert som de stammer fra samme vevsprøve.

I søk etter en TRAP bibliotek forberedelsesmetode
Som nevnt tidligere, en stor ulempe av TRAP tilnærming er varierende og for det meste lave avkastninger som kan oppnås. Med prøver fra få ng til noen ganger opp til 100 ng en standard tilnærming med Illumina TruSeq kit (100 ng input krav) ble dømt som for ufølsom for bygging av biblioteker av tilstrekkelig kvalitet. Et markedssøk avslørte flere kommersielt tilgjengelige bibliotekforberedelsessett, som ble spesifisert for å fungere med så lavt som 5-10 ng startmateriale. Vi testet ikke protokollen som ble brukt av Reynoso et al. 2019, som fungerer for deres TRAP-prøver fra tomat, ris og Medicago og bruker BrAD-seq-tilnærmingen60.

Alle våre forsøk, men med påfølgende testsekvensering ga utilfredsstillende resultater. Til tross for bruk av polyA-berikelsestrinn, led TRAP-prøvene av høy ribosomal forurensning (opptil 30% av lesingene). Videre var suksessraten for bibliotekpreparatet variabel og spesielt lav for prøver med kritisk lave konsentrasjoner eller relativt lavere RIN-verdier. Vår omfattende testing fører oss til konklusjonen, at den spesifikke RNA-sammensetningen av en TRAP-prøve, med svært høyt rRNA-innhold og antagelig minutt mRNA-konsentrasjoner, krever en mer følsom tilnærming for å oppnå pålitelige biblioteker. Dermed gikk vi over til toppmoderne løsninger for ultralave inngangsbeløp: SMARTer v4 og Nextera XT. Betryggende, Song et al. fant også dette biblioteket forberedelse tilnærming til å overgå sine konkurrenter når de testet flere metoder og deres sekvensering utgang på TRAPed levervev61. Kvalitetsberegningene vi har presentert i figur 4D viser lyder av høy kvalitet (Q>30) ved lave rRNA-kartsrater (<3%) samtidig med høye genkartleggingsrater. I tillegg viser konsekvent høye Spearman korrelasjonskoeffisienter at replikerer faktisk har svært lignende uttrykksprofiler. Bruken av begge settene var grei med beskjedne syklustall og ga robuste og pålitelige resultater. Sekvenseringsdata var av høy kvalitet med 1,5 ng startmateriale. Med SMARTer-settet som tolerating så lavt som 200 pg-inngang, kan mengden plantestartmateriale optimaliseres. Anvendelsen for sjeldnere celletyper vil til slutt bli bestemt av muligheten til å påløpe nok RNA.

TRAP utfyller anleggsvitenskapsverktøysettet
TRAP-metoden har blitt stadig mer populært blant planteforskere34, og vi er sikre på at den vil tilegne seg statusen til en standardteknikk på grunn av flere grunner.

Ingen av trinnene i TRAP-protokollen trenger spesialisert utstyr, som en cellesorteringsmaskin eller et dedikert laserfangstmikroskop, noe som gjør det mulig for mange laboratorier å utføre eksperimentene. Til dags dato er de mest kostbare faktorene bibliotekforberedelse og nedstrøms sekvensering. Likevel, med den dynamiske utviklingen av neste generasjons sekvenseringsteknikker og økende etterspørsel etter encellede sekvensering, forventer vi at kostnadene vil avta betydelig.

Videre betyr isolasjonen av polysom-tilknyttede RNAer at informasjon samles inn om den aktive oversettelsesstatusen til disse RNAene (translatome). Trap fanger derfor utdataene fra alle regulatoriske trinn som er oppstrøms av oversettelse og representerer en mer direkte proxy for den cellulære proteinsammensetningen. Selvfølgelig forblir stalled ribosomer og post-translational modifikasjoner fortsatt unnvikende og må løses av andre tilnærminger (f.eks proteomics).

Som nevnt tidligere, en klar fordel som TRAP har i en plantesammenheng er bevaring av CW strukturer og mekaniske egenskaper av cellene. Som vi bare begynner å forstå intrikate tilkoblinger og regulatoriske funksjoner som oppstår gjennom CW- og mekanisk signalering31,62, tilnærminger som bevarer disse strukturene vil bli viktigere i mange forskjellige utviklingssammenhenger.

Spesielt for veletablerte modellarter kan TRAP tjene på et vell av forskjellige arrangører, som har blitt karakterisert. I Arabidopsisvar det dermed mulig å kartlegge hele roten på en celletypespesifikk måte ved hjelp av 19 forskjellige markørgenarrangører30,63. Med hvert RNA-seq-eksperiment vil disse valgene bli forbedret, og nye, mer spesifikke arrangører vil oppstå og avgrense cellulære oppløsningen.

TRAP er i tillegg anvendelig i en kombinatoriell bruk med mange arrangører for cellepopulasjoner der ingen markører ennå er kjent. Dette er tilfelle for spesialiserte celler i rotenendodermis. De såkalte passasjecellene er preget av absense av suberin laget som strøk modne endodermis celler53. Kombinere egnede arrangører og påfølgende i silico subtraksjon av de distinkte uttrykkprofiler vil berike for regioner som havnen passasje celler. Transkripsjonsreporteranalyse vil da bidra til å identifisere avsnittscellemarkørgener. Men om TRAP kan brukes til å analysere den sjeldne cellepopulasjonen på dette grunnlaget gjenstår å bli bestemt.

I denne artikkelen har vi gitt en detaljert beskrivelse av den oversette-ribosom affinitetsrensemetoden, dens fordeler og begrensninger, og fremhevet potensielle anvendelser derav. I porteføljen av "omics" studier, opptar det en viktig nisje og vil bidra til å svare på mange biologiske spørsmål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi vil gjerne takke Jean-Claude Walser fra Genetic Diversity Center Zurich for avgjørende ekspertråd i den tidlige fasen av dette prosjektet. Arbeidet i Vermeer-laboratoriet ble støttet av et SNF Professorship-stipend (PP00P3_157524) og et R'EQUIP-utstyrsstipend (316030_164086) fra Swiss National Science Foundation (SNSF) tildelt JEMV.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sterilization
bleach, 13% Sigma 71696
beaker VWR 214-1172/74/75
desiccator with porcelaine plate (DURAN) Sigma/Merck Z317454-1EA/Z317594-1EA
EtOH, p.a. Honeywell 02860-1L
HCl, 37% Roth 4625.1
Tween 20 Sigma P9416
Plate growth + harvesting
MS salts, basal salt mixture, incl. MES buffer Duchefa M0254
agar plant for cell culture Applichem/Panreac A2111.1000
DMSO Sigma D4540
forcepts Rubis Switzerland 5-SA model
KOH Fluka 60370
micropore/surgical tape 3M 1530-0
NAA Duchefa N0903
petri dishes 120x120 mm Greiner bio-one 688102
scalpel VWR/Swann-Morton 233-5454
tissues, neutral, two-layered any supplier of your choice
Immunoprecipitation
GFP-beads: gtma-100 GFP-Trap_MA Chromotek e.g. gtma-100
Brij-35 Sigma P1254-500G
centrifuge tubes (in accordance with centrifuge) Beckman Coulter 357001
Chloramphenicol Applichem C0378-25G
cotton gloves VWR 113-7355
Cycloheximide, HPLC grade Sigma 01810-1G
DEPC VWR E174 might have long delivery times
DTT Fluka 43815
EGTA Sigma 3054.3
homogenizers DUALL 23 KONTES GLASS CO (via VWR) SCERSP885450-0023 (set) SCERSP885451-0023 pestle only - SCERSP885452-0023 cylinder only; long delivery times
Igepal CA-360 Sigma I3021-100ml
KCl Sigma 60130
MgCl2 hexahydrat Roth 2189.2
mortar and pestle VWR 470148-960 & 470019-978
PMSF Roche 10 837 091 001
Polyoxyethylene-(10)-tridecylether/PTE Sigma P2393-500G
RNase-free water Roth T143.3
RNAZap Thermo Fisher AM9780/AM9782 for cleaning surfaces
Tris, >99.3% Roth AE15.3
Triton X-100 Fluka T8787-250ml
Tween 20 Sigma P9416-100ml
RNA extraction
2-Propanol, p.a. Sigma 33539-1L-GL-R
Chloroform, HPLC grade Scharlau CL02181000
EtOH, p.a. Honeywell 02860-1L
low-retention microcentrifuge tubes, 1.5 ml Eppendorf/Sigma Z666548-250EA LoBind
RNase-free DNase set Qiagen 79254
RNeasy MiniElute Cleanup Kit Qiagen 74204
TRIzol reagent ThermoFisher/Ambion 15596018
Library preparation
15/50 mL Tube Magnetic Separator Abraxis PN 472250
AMPure beads Beckman Coulter A63881
Index Kit A Illumina FC-131-2001
Index Kit D Illumina FC-131-2004
neodymium magnets Amazon/other 6 x 1.5 mm range: N42 (NdFeB)
Nextera XT kit Illumina FC-131-1024/1096 https://emea.support.illumina.com/
PCR strips ThermoScientific AB-0266
SMARTer v4 kit Takara Bioscience 634892 https://www.takarabio.com/
Bioanalyzer Agilent 2100 Bioanalyzer Instrument specialized equipment for RNA/DNA quality control
Tapestation Agilent 4200 Tapestation Instrument specialized equipment for RNA/DNA quality control
Fragment Analyzer Agilent 5400 Fragment Analyzer System specialized equipment for RNA/DNA quality control (high throughput)
LabChip PerkinElmer LabChip GX Touch Nucleic Acid Analyzer specialized equipment for RNA/DNA quality control (high throughput)
Qubit 4 Fluorometer ThermoFisher Q33239 specialized equipment for RNA/DNA concentration determination
qRT-PCR
GATA23 Microsynth fwd: AGTGAGAATGAA
AGAAGAGAAGGG;
rev: GTGGCTGCGAAT
AATATGAATACC
GH3.3 Microsynth fwd: CAAACCAATCCT
CCAAATGAC;
rev: ACTTATCCGCAA
CCCGACT
LBD29 Microsynth fwd: TCTCCAACAACA
GGTTGTGAAT;
rev: AAGGAGCCTTAG
TAGTGTCTCCA
UBC21 Microsynth fwd: TGCGACTCAGGG
AATCTTCT;
rev: TCATCCTTTCTT
AGGCATAGCG
SsoAdvanced Universal SYBR Green Bio-Rad #172-5270
iScript Adv cDNA Kit Bio-Rad #172-5038
miscellaneous
Falcon tubes 15 ml, Cellstar Greiner bio-one 188261
Falcon tubes 50 ml, Cellstar Greiner bio-one 210261
filter tips 1 ml Axygen TF-1000-R-S
filter tips 10 µl Axygen TF-10-R-S
filter tips 100 µl Axygen TF-100-R-S
filter tips 20 µl Axygen TF-20-R-S
filter tips 200 µl Axygen TF-200-R-S
microcentrifuge tubes 1.5 ml SARSTEDT 72.690.001
Propidium iodide Sigma P4170-100MG
sequencing company Novogene en.novogene.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Van Verk, M. C., Hickman, R., Corné, M. J., Pieterse, M., Van Wees, S. C. RNA-Seq: Revelation Of The Messengers. Trends In Plant Science. 18 (4), 175-179 (2013).
  2. Libault, M., Pingault, L., Zogli, P., Schiefelbein, J. Plant Systems Biology At The Single-Cell Level. Trends In Plant Science. 22 (11), 949-960 (2017).
  3. Mustroph, A., et al. Profiling Translatomes Of Discrete Cell Populations Resolves Altered Cellular Priorities During Hypoxia In Arabidopsis. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 106 (44), 18843-18848 (2009).
  4. Karve, R., Iyer-Pascuzzi, A. S. Digging Deeper: High-Resolution Genome-Scale Data Yields New Insights Into Root Biology. Current Opinion In Plant Biology. 24, 24-30 (2015).
  5. Warner, J. R., Knopf, P. M., Rich, A. A Multiple Ribosomal Structure In Protein Synthesis. Proceedings of The National Academy of Sciences of The United States of America. 49 (1), 122-129 (1963).
  6. Gautam, V., Sarkar, A. K. Laser Assisted Microdissection, An Efficient Technique To Understand Tissue Specific Gene Expression Patterns And Functional Genomics In Plants. Molecular Biotechnology. 57 (4), 299-308 (2015).
  7. Bargmann, B. O. R., Birnbaum, K. D. Fluorescence Activated Cell Sorting Of Plant Protoplasts. Journal of Visualized Experiments. (36), e1673 (2010).
  8. Deal, R. B., Henikoff, S. The Intact Method For Cell Type-Specific Gene Expression And Chromatin Profiling In Arabidopsis Thaliana. Nature Protocols. 6 (1), 56-68 (2011).
  9. Dougherty, J. D. The Expanding Toolkit Of Translating Ribosome Affinity Purification. The Journal of Neuroscience: The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 37 (50), 12079-12087 (2017).
  10. Mustroph, A., Juntawong, P., Bailey-Serres, J. Isolation Of Plant Polysomal mRNA By Differential Centrifugation And Ribosome Immunopurification Methods. Methods in Molecular Biology. 553, 109-126 (2009).
  11. Matsushima, W., et al. SLAM-ITseq: Sequencing Cell Type-Specific Transcriptomes Without Cell Sorting. Development. 145 (13), (2018).
  12. Basnet, H., et al. Flura-Seq Identifies Organ-Specific Metabolic Adaptations During Early Metastatic Colonization. Elife. 8, (2019).
  13. Rodriques, S. G., et al. Slide-Seq: A Scalable Technology For Measuring Genome-Wide Expression At High Spatial Resolution. Science. 363 (6434), 1463-1467 (2019).
  14. Fazal, F. M., et al. Atlas Of Subcellular RNA Localization Revealed By Apex-Seq. Cell. 178 (2), 473-490 (2019).
  15. Slane, D., Bayer, M. Cell Type-Specific Gene Expression Profiling Using Fluorescence-Activated Nuclear Sorting. Plant Gene Regulatory Networks: Methods And Protocols. Kaufmann, K., Mueller-Roeber, B. , Springer. New York, NY. 27-35 (2017).
  16. Zanetti, M. E., Chang, I. F., Gong, F., Galbraith, D. W., Bailey-Serres, J. Immunopurification Of Polyribosomal Complexes Of Arabidopsis For Global Analysis Of Gene Expression. Plant Physiology. 138 (2), 624-635 (2005).
  17. King, H. A., Gerber, A. P. Translatome Profiling: Methods For Genome-Scale Analysis Of mRNA Translation. Briefings In Functional Genomics. 15 (1), 22-31 (2016).
  18. Mašek, T., Valášek, L., Pospíšek, M. Polysome Analysis And RNA Purification From Sucrose Gradients. RNA: Methods And Protocols. Nielsen, H. , Humana Press. Totowa, NJ. 293-309 (2011).
  19. Heiman, M., et al. A Translational Profiling Approach For The Molecular Characterization Of Cns Cell Types. Cell. 135 (4), 738-748 (2008).
  20. Halbeisen, R. E., Scherrer, T., Gerber, A. P. Affinity Purification Of Ribosomes To Access The Translatome. Methods. 48 (3), 306-310 (2009).
  21. Thomas, A., et al. A Versatile Method For Cell-Specific Profiling Of Translated mRNAs In Drosophila. Plos One. 7 (7), e40276 (2012).
  22. Watson, F. L., et al. Cell Type-Specific Translational Profiling In The Xenopus Laevis Retina. Developmental Dynamics. 241 (12), 1960-1972 (2012).
  23. Lam, P. Y., Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Heat Shock Modulates Neutrophil Motility In Zebrafish. Plos One. 8 (12), e84436 (2013).
  24. Fang, Y., et al. Translational Profiling Of Cardiomyocytes Identifies An Early Jak1/Stat3 Injury Response Required For Zebrafish Heart Regeneration. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 110 (33), 13416-13421 (2013).
  25. Mustroph, A., Zanetti, M. E., Girke, T., Bailey-Serres, J. Isolation And Analysis Of mRNAs From Specific Cell Types Of Plants By Ribosome Immunopurification. Methods In Molecular Biology. 959, 277-302 (2013).
  26. Monshausen, G. B., Gilroy, S. Feeling Green: Mechanosensing In Plants. Trends In Cell Biology. 19 (5), 228-235 (2009).
  27. Day, R. C., Grossniklaus, U., Macknight, R. C. Be More Specific! Laser-Assisted Microdissection Of Plant Cells. Trends In Plant Science. 10 (8), 397-406 (2005).
  28. Sheen, J. Signal Transduction In Maize And Arabidopsis Mesophyll Protoplasts. Plant Physiology. 127 (4), 1466-1475 (2001).
  29. Datta, S., et al. Laser Capture Microdissection: Big Data From Small Samples. Histology And Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
  30. Birnbaum, K., et al. A Gene Expression Map Of The Arabidopsis Root. Science. 302 (5652), 1956 (2003).
  31. Hamant, O., Haswell, E. S. Life Behind The Wall: Sensing Mechanical Cues In Plants. BMC Biology. 15 (1), 1354 (2017).
  32. Vragović, K., et al. Translatome Analyses Capture Of Opposing Tissue-Specific Brassinosteroid Signals Orchestrating Root Meristem Differentiation. Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 923-928 (2015).
  33. Wang, Y., Jiao, Y. Translating Ribosome Affinity Purification (Trap) For Cell-Specific Translation Profiling In Developing Flowers. Methods In Molecular Biology. 1110, 323-328 (2014).
  34. Sablok, G., Powell, J. J., Kazan, K. Emerging Roles And Landscape Of Translating mRNAs In Plants. Frontiers in Plant Science. 8, 1443 (2017).
  35. Ron, M., et al. Hairy Root Transformation Using Agrobacterium Rhizogenes As A Tool For Exploring Cell Type-Specific Gene Expression And Function Using Tomato As A Model. Plant Physiology. 166 (2), 455-469 (2014).
  36. Reynoso, M. A., et al. Evolutionary Flexibility In Flooding Response Circuitry In Angiosperms. Science. 365 (6459), 1291-1295 (2019).
  37. Dolan, L., et al. Cellular Organisation Of The Arabidopsis Thaliana Root. Development. 119 (1), 71 (1993).
  38. Ristova, D., Barbez, E. Root Development. , Springer. New York, NY. (2018).
  39. Shekhar, V., Stӧckle, D., Thellmann, M., Vermeer, J. E. M. The Role Of Plant Root Systems In Evolutionary Adaptation. Current Topics in Developmental Biology. 131, 55-80 (2019).
  40. Malamy, J. E., Benfey, P. N. Down And Out In Arabidopsis: The Formation Of Lateral Roots. Trends in Plant Science. 2 (10), 390-396 (1997).
  41. de Smet, I., et al. Bimodular Auxin Response Controls Organogenesis In Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of The United States of America. 107 (6), 2705-2710 (2010).
  42. Péret, B., et al. Arabidopsis Lateral Root Development: An Emerging Story. Trends In Plant Science. 14 (7), 399-408 (2009).
  43. Vilches-Barro, A., Maizel, A. Talking Through Walls: Mechanisms Of Lateral Root Emergence In Arabidopsis Thaliana. Current Opinion in Plant Biology. 23, 31-38 (2015).
  44. Porco, S., et al. Lateral Root Emergence In Arabidopsis Is Dependent On Transcription Factor Lbd29 Regulation Of Auxin Influx Carrier Lax3. Development. 143 (18), 3340-3349 (2016).
  45. Stoeckle, D., Thellmann, M., Vermeer, J. E. Breakout-Lateral Root Emergence In Arabidopsis Thaliana. Current Opinion in Plant Biology. 41, 67-72 (2018).
  46. Banda, J., et al. Lateral Root Formation In Arabidopsis: A Well-Ordered Lrexit. Trends in Plant Science. 24 (9), 826-839 (2019).
  47. Vermeer, J. E. M., et al. A Spatial Accommodation By Neighboring Cells Is Required For Organ Initiation In Arabidopsis. Science. 343 (6167), 178-183 (2014).
  48. Vanneste, S., et al. Cell Cycle Progression In The Pericycle Is Not Sufficient For Solitary Root/Iaa14-Mediated Lateral Root Initiation In Arabidopsis Thaliana. The Plant Cell. 17 (11), 3035-3050 (2005).
  49. Marques-Bueno, M. M., et al. A Versatile Multisite Gateway-Compatible Promoter And Transgenic Line Collection For Cell Type-Specific Functional Genomics In Arabidopsis. The Plant Journal : For Cell and Molecular Biology. 85 (2), 320-333 (2016).
  50. Shimada, T. L., Shimada, T., Hara-Nishimura, I. A Rapid And Non-Destructive Screenable Marker, Fast, For Identifying Transformed Seeds Of Arabidopsis Thaliana. The Plant Journal : For Cell and Molecular Biology. 61 (3), 519-528 (2010).
  51. Clough, S. J., Bent, A. F. Floral Dip: A Simplified Method For Agrobacterium Mediated Transformation Of Arabidopsis Thaliana. The Plant Journal. 16 (6), 735-743 (1998).
  52. Lindsey, B. E., Rivero, L., Calhoun, C. S., Grotewold, E., Brkljacic, J. Standardized Method For High-Throughput Sterilization Of Arabidopsis Seeds. Journal Of Visualized Experiments. (128), e56587 (2017).
  53. Andersen, T. G., et al. Diffusible Repression Of Cytokinin Signalling Produces Endodermal Symmetry And Passage Cells. Nature. 555, 529-533 (2018).
  54. Schroeder, A., et al. The Rin: An Rna Integrity Number For Assigning Integrity Values To Rna Measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).
  55. Vragović, K., Bartom, E., Savaldi-Goldstein, S. Quantitation Of Cell Type-Specific Responses To Brassinosteroid By Deep Sequencing Of Polysome-Associated Polyadenylated RNA. Methods in Molecular Biology. 1564, 81-102 (2017).
  56. Bertin, B., Renaud, Y., Aradhya, R., Jagla, K., Junion, G. Trap-Rc, Translating Ribosome Affinity Purification From Rare Cell Populations Of Drosophila Embryos. Journal Of Visualized Experiments. (103), e52985 (2015).
  57. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis Of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR And The 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  58. Jiao, Y., Meyerowitz, E. M. Cell-Type Specific Analysis Of Translating Rnas In Developing Flowers Reveals New Levels Of Control. Molecular Systems Biology. 6, 419 (2010).
  59. Tian, C., et al. A Gene Expression Map Of Shoot Domains Reveals Regulatory Mechanisms. Nature Communications. 10 (1), 141 (2019).
  60. Townsley, B. T., Covington, M. F., Ichihashi, Y., Zumstein, K., Sinha, N. R. Brad-Seq: Breath Adapter Directional Sequencing: A Streamlined, Ultra-Simple And Fast Library Preparation Protocol For Strand Specific mRNA Library Construction. Frontiers in Plant Science. 6, 366 (2015).
  61. Song, Y., et al. A Comparative Analysis Of Library Prep Approaches For Sequencing Low Input Translatome Samples. BMC Genomics. 19 (1), 696 (2018).
  62. Basu, D., Haswell, E. S. Plant Mechanosensitive Ion Channels: An Ocean Of Possibilities. Current Opinion in Plant Biology. 40, 43-48 (2017).
  63. Brady, S. M., et al. A High-Resolution Root Spatiotemporal Map Reveals Dominant Expression Patterns. Science. 318 (5851), 801 (2007).

Tags

Utviklingsbiologi Utgave 159 Arabidopsis TRAP TRAP-seq translatome profilering celletypespesifikk RNA-seq lateral rotdannelse endodermis differensiering
Oversette ribosom affinitet rensing (TRAP) for å undersøke <em>Arabidopsis thaliana</em> Root Development på en celle type-spesifikk skala
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Thellmann, M., Andersen, T. G.,… More

Thellmann, M., Andersen, T. G., Vermeer, J. E. Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale. J. Vis. Exp. (159), e60919, doi:10.3791/60919 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter