Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Trekkraft Force mikroskopi å studere B lymfocytt aktivering

Published: July 23, 2020 doi: 10.3791/60947
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Institut Curie, PSL Research University, INSERM U932, 2Laboratoire Interdisciplinaire de Physique, Université Joseph Fourier (Grenoble 1)

Summary

Her presenterer vi en protokoll som brukes til å utføre trekkraft kraft mikroskopi eksperimenter på B-celler. Vi beskriver fremstillingen av myke polyakrylamidgeler og deres funksjonalisering, samt datainnsamling ved mikroskopet og et sammendrag av dataanalyse.

Abstract

Trekkraftmikroskopi (TFM) muliggjør måling av krefter produsert av en celle på et substrat. Denne teknikken infers trekkraft målinger fra en eksperimentelt observert forskyvning felt produsert av en celle trekke på en elastisk substrat. Her tilpasset vi TFM for å undersøke den romlige og timelige strukturen i kraftfeltet som utøves av B-celler når det aktiveres av antigenengasjement av B-cellereseptoren. Gelstivhet, perletetthet og proteinfunksjonalisering må optimaliseres for studiet av relativt små celler (~ 6 μm) som samhandler med, og reagerer spesielt på ligandes for celleoverflatereseptorer.

Introduction

B-celler er antistoffproduserende celler i immunsystemet. For å aktivere den adaptive immunresponsen får de først antigenet i opprinnelig form (det vil si ikke-bearbeidet) gjennom en bestemt reseptor kalt B-cellereseptor (BCR)1. Denne prosessen skjer i lymfeknuten B cellesone. Selv om noen antigener kan nå B-cellen gjennom lymfatiske væsker, de fleste antigener, spesielt med høy molekylvekt (> 70 kDa, som er grensestørrelsen for lymfatiske rør) er faktisk presentert i sin opprinnelige form på overflaten av en antigen presentere celle (APC), vanligvis en subcapsular sinus makrofag eller follikulær dendrittisk celle, gjennom lectin eller Fc reseptorer (ikke-spesifikke). Kontakten med denne cellen fører til dannelsen av en immunsynapse hvor BCR utøver kraft på APC-tilknyttede antigener. Bindingen av et antigen til BCR initierer BCR-signalering, som kan aktivere kraftgenererende mekanismer. Disse kreftene kan være viktige for å forsterke BCR-signalering, men er også avgjørende for B-celler å trekke ut og deretter internalisere antigenet.

Nyere studier har vist at BCR er faktisk mekanosensitiv2. Stivere substrater fremkaller for eksempel forbedret BCR-signalering3. Videre, kraft generert på immunsynapse trekker på enkelt BCRs å sondere sin affinitet til antigen og dermed sikre affinitet diskriminering4. Det er derfor interessant å undersøke den mekaniske responsen fra B-celler til antigenpresentasjon og å dissekere denne responsen når det gjelder type reseptorer innblandet (IgG/IgM)5, vedheftmolekyler (integrinske ligande) eller i farmakologisk og genmodifiserte celler (det vil si deaktivering av et protein nedstrøms av BCR-signalering eller cytoskeletondynamikk)6.

En enkel metode for å observere responsen fra en celle til et substrat av fysiologisk stivhet og samtidig studiekrefter som utøves på substratet er Traction Force Microscopy (TFM). TFM består av å observere forskyvningsfeltet produsert av cellen som trekker på et elastisk substrat. Opprinnelig ble deformasjonen av gelen observert gjennom rynker i elastomeret selv ved fasekontrastmikroskopi7, men innsetting av fluorescensmikroperler som fiducial markører tillatt for bedre oppløsning og har siden blitt standard8. Denne metoden har blitt brukt til å undersøke trekkraft kraften utøves av tilhengerceller, vev, og selv organoider innebygd i geler. Flere varianter av TFM erutviklet 9 inkludert, kombinasjon med superresolution mikroskopi (det vil si STED10 eller SRRF11),endring av brytningsindeksen av gelen for å tillate TIRF mikroskopi12, erstatte perler ved nano-tryktemønstre 13, og bruke nanopillar i stedet for flat overflate14. For en fullstendig gjennomgang av disse variasjonene, se Colin-York et al.15.

Protokollen som presenteres her beskriver en prosedyre for å måle krefter utøves av B-celler på et antigenbelagt substrat. Disse kreftene påføres på ligandene (antigen) for å gruppere dem og deretter trekke dem ut fra antigen-presentere substrat. Vi har tilpasset standard TFM-protokollen for å etterligne stivheten til fysiologiske antigen-presentere substrater, størrelsen og relevant belegg for B-cellene. Denne protokollen tillater studie av flere celler samtidig og kan brukes sammen med fluorescensmikroskopiteknikker og kjemiske behandlinger. Det tar imidlertid ikke sikte på å sondere enkeltmolekylkraftmålinger, som optiske pinsett16, molekylære spenningssonder17,18, biomembrane kraftsonder19, og atomkraftmikroskopi20 er mer egnede teknikker. Sammenlignet med andre enkeltcellede kraftmålingsmetoder (f.eks. mikropipetter21 eller mikroplater22) gjør TFM det mulig å rekonstruksjon av et komplett kart over kreftene som utøves ved synapsen med en oppløsning på ~ 300 nm. Dette er nyttig for å identifisere spatio-temporale mønstre i kreftene som utøves på overflaten, og som gelen er kompatibel med konfokal avbildning, for å korrelere dem med rekruttering av spesifikke proteiner (for eksempel cytoskeleton og signalproteiner).

Selv om 3D TFM er mulig, er den ikke kompatibel med stivheten og oppsettet vi brukte. Deformasjoner i 3D kan oppnås ved andre mer komplekse oppsett som fremspringkraftmikroskopi (AFM som skanner en deformerbar membran der cellene er belagt)23,24 og elastisk resonatorinterferens stressmikroskopi (ERISM, en gel som fungerer som resonerende hulrom for lys og utheving av deformasjoner av substratet med nøyaktighet av noen få nanometer)25. Selv om disse teknikkene er svært lovende, har de ennå ikke vært ansatt i B-celler. Andre typer TFM, for eksempel på nanopillars14,kan brukes til å ha mer reproduserbare underlag. Denne geometrien er imidlertid ikke tilpasset myke celler, da cellen interpenetrates pilarene, noe som kompliserer analysen. Denne tilnærmingen har faktisk blitt brukt i T-celler for å observere cellens evne til å bygge strukturer rundt søylene26.

Til tross for sin enkelhet, TFM ved hjelp av polyakrylamid geler gjør det mulig for samtidig observasjon av mange celler og kan enkelt og billig implementeres i ethvert laboratorium utstyrt med en benk og en epifluorescence mikroskop (selv om vi anbefaler konfokal / spinning disk).

For å etterligne den fysiologiske stivheten til en APC, brukte vi polyakrylamidgeler med en stivhet på ~ 500 Pa27 og funksjonaliserte gelen med aktivering av antigener. I denne protokollen funksjonaliserte vi overflaten av polyakrylamidgelen med hønseegglysozym (HEL). Dette gjør det mulig for måling av krefter generert ved stimulering av BCR gjennom engasjement av antigenbindingsstedet. Bruken av dette antigenet og HEL-spesifikke B-cellene fra MD4-mus sikrer relativt jevn kraftgenerering som svar på antigenligation28. Andre molekyler (som anti-IgM for B6-mus) kan imidlertid transplanteres på gelen, men kreftene som genereres i disse tilfellene kan være mer heterogene og mindre intense. Fordi B-celler er små celler (diameter ~ 6 μm), har antall perler blitt optimalisert for å være maksimalt, men fortsatt sporbart. For store celler som utøver ~ kPa krefter på sine substrater, kan man oppnå tilfredsstillende resultater ved hjelp av relativt sparsomme perler eller utføre enkle partikkelbilde velocimetry (PIV) for å rekonstruere deformasjonsfeltet. Men for små celler som B-lymfocytter som utøver stress så lite som ~ 50 Pa, er bruk av enkeltpartikkelsporing nødvendig (partikkelsporing velocimetry, PTV) for å oppnå ønsket nøyaktighet når rekonstruering av deformasjonsfeltet. For å kunne spore perler individuelt, må forstørrelsen av objektivobjektivet være minst 60x og den numeriske blenderåpningen rundt 1,3. Dermed må gelene være relativt tynne (<50 μm), ellers er perlene ikke synlige da de er over målstandens arbeidsavstand.

Hovedprotokollen består av tre seksjoner: gel forberedelse, gel funksjonalisering og avbildning; to seksjoner er valgfrie og er dedikert til antigenekstraksjonsekvantifisering og avbildning av fluorescerende celler.

Protocol

1. Gel forberedelse

  1. Silanisering av gelstøtten
    1. Aktiver dekkslipp eller glassbunn petriskål (som vil bli brukt som gelstøtte) med uv-lampe i 2 min (vent 30 s før eksponering for UV-lampen for å unngå eksponering for gjenværende ozon).
    2. Silanize dekkglasset/glassbunnsfatet ved hjelp av 200 μL aminopropyltrimetoksysilan (APTMS) i 5 min. Dette vil forberede støtten til den kovalente bindingen av gelen.
    3. Vask dekkglasset/glassbunnsfatet grundig med ultra rent vann.
    4. Tørk dekkslippen/glassbunnsfatet ved hjelp av vakuumaspirasjon.
  2. Tilberedning av 18mm dekkslipp som brukes til å flate gelen
    1. For å forberede dekkglassene, legg dem først inn i en keramisk dekkslippholder. Sett deretter dekkslipholderen i et lite beger (50 ml) og hell silikoniseringsreagensen (lagret ved 4 °C, gjenbrukbar) over dekkslipsene, og sørg for å dekke dem helt.
    2. Dekk begeret med aluminiumsfolie og inkuber i 3 min ved romtemperatur. Mens du venter, fyll et stort beger (500 ml) med ultra-rent vann. Etter 3 min inkubasjon i silikoniseringsreagens, overfør dekkslipsholderen med dekkslips til begeret av vann.
    3. Skyll dekkslipper med ultra rent vann grundig, tørk dem godt og hold papirservietter. For best resultat, fortsett umiddelbart til neste avsnitt.
  3. Gel polymerisering
    1. For geler på 0,5 kPa, bland 75 μL 40 % akrylamid med 30 μL på 2 % bisacrylamid (krysskobling) og 895 μL fosfatbufret saltvann (PBS). Denne premiksen kan oppbevares i opptil én måned ved 4 °C.
    2. Til 167 μL på 0,5 kPa gel premix, tilsett 1% (1,67 μL) perler, vortex og sonikerat i 5 min i et bad sonicator (standard benk ultralyd renere med kraft på 50-100 W og frekvens 40 kHz). Hold blandingen beskyttet mot lys ved hjelp av aluminiumsfolie.
      MERK: Premiksen polymeriserer ikke før initiativtakeren (TEMED) er lagt til.
    3. For å katalysere polymerisering, tilsett 1% (1,67 μL) på 10% w / v ammonium persulfat (APS).
    4. For å initiere polymerisering, tilsett 0,1% (0,2 μL) N, N, N,N′,N′-Tetramethylenediamine (TEMED). Bland med en pipette. Når APS og TEMED er lagt til, polymeriserer gelen raskt så fortsett raskt til gelstøping.
  4. Gel støping
    1. Pipet 9 μL gelblanding på hver dekkglass/glassbunnsfat (slipp i midten, figur 1A)
    2. Plasser den silaniserte/hydrofobe dekkglasset og flat gelen (figur 1B). Bruk tang til å trykke på dekkslippen for å sikre at gelen sprer seg over hele området av dekkslippen (figur 1C) til den begynner å lekke ut.
    3. Inverter dekkglasset/glassbunnsfatet i en stor petriskål og bank den på benken for å tvinge perler som går mot geloverflaten (figur 1D).
    4. Dekk med aluminiumsfolie og la det være 1 time å polymerisere ved romtemperatur i et fuktig kammer (det vil si legg et vått vev over fatet for å forhindre fordampning).
    5. Etter 1 t legger du til PBS i prøven for å lette dekkglassutløsningen. Fjern forsiktig dekkslepperen med en nål (belegget med forskjellige silaner skal tillate enkel peeling av dekkslippen fra gelen, figur 1E).
    6. La gelen stå i PBS.
      MERK: Geler kan nå oppbevares i PBS ved 4 °C i 5–7 dager, men det anbefales å bruke dem innen 48 timer.

2. Gel funksjonalisering

  1. Klargjør sulfosuccinimidyl 6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino)heksaanoat (Sulfo SANPAH) oppløsning ved 0,5 mg/ml i 10 mM HEPES buffer. Dette kan oppbevares ved 4 °C dekket med aluminiumsfolie i opptil en uke.
  2. Aspirer PBS fra geler.
  3. Tilsett 150 μL Sulfo SANPAH i gelen ved romtemperatur (figur 1F).
  4. Utsett gelen for UV-behandling i 2 min for å fotoaktivere stedene til Sulfo SANPAH og få den til å holde seg til geloverflaten.
  5. Vask med PBS tre ganger (figur 1G).
  6. Gjenta trinn 2.2–2.5.
  7. Tilsett 250 μL HEL (100 μg/ml) i hver gel og inkuber over natten i et fuktig kammer ved 4 °C over natten mens den er dekket med aluminiumsfolie (figur 1H).
  8. Fjern HEL-antigenet og vask med PBS tre ganger.
    MERK: HEL fungerer både som et antigen og som et vedheftsmolekyl. Den kan erstattes av andre molekyler som binder seg til reseptoren (f.eks. en anti-mus IgM, Bovine Serum Albumin, Ovalbumin) eller blandet med integrinske ligander (f.eks. ICAM1 binding til LFA1). Om nødvendig kan antigenekstraksjon observeres med en fluorescerende versjon av HEL (oppnås ved å farge molekylet med et proteinmerkingssett, se trinn 4). Legg merke til at en gitt konsentrasjon i bulk kanskje ikke gir samme overflatekonsentrasjon på gelen som på glasset: dette må kvantifiseres med sekundær farging hvis direkte sammenligning er nødvendig.

3. Cellelasting og bildebehandling

  1. Før avbildning, fjern PBS fra gelene og tilsett 500 μL B-cellemedier (RPMI 1640, 10% decomplemented fosterkalvserum, 1% penicillin-streptomycin, 2% natriumpyuvat, 50uM Mercaptoethanol og 1X ikke essensielle aminosyrer) og la dem likevekte til RT.
  2. Celle forberedelse
    1. Rens primære B-celler fra milten i henhold til en negativ utvalgsprotokoll (se Materialseksjon). Typisk siste B celleutbytte er rundt 1 x 107 celler. Konsentrat dette til 3 x 106 celler/ml i B-cellemedium (RPMI-1640 supplert med 10 % føtal kalveserum, 1 % penicillin–streptomycin, 0,1 % mercaptoethanol og 2 % natriumpyuvat).
    2. Oppbevar celler etter behov i opptil 6 timer ved 4 °C.
    3. Hold cellene ved 37 °C i 30 min før bildeinnhenting.
  3. Imaging
    1. Bruk et konfokalt mikroskop med termisk og (muligens) CO2-kontroll.
      MERK: Uansett om et konfokalt eller roterende diskmikroskop brukes, er det viktig å bruke et objektiv/pinhole som gjør det mulig for en pikselstørrelse <200 nm å komfortabelt spore perlene i analysefasen (f.eks. 60x, NA 1.3). Epifluorescence mikroskopi kan også brukes, men det gir lavere signal til støy forholdet og kan gjøre individuell perle sporing vanskeligere.
    2. To hovedlag av perler vises på bunnen og toppen av gelen. Fokuser på gelplanet.
      MERK: En fin gel vil vises som en stjernehimmel, med perler omtrent jevnt fordelt på samme plan.
    3. Programmer oppkjøpet i 30 min med en bildefrekvens på 5 s (dette er tilpasningsdyktig til behovene til eksperimentet, for eksempel skaffe andre farger, skaffe z stack, etc.)
    4. Aspirer mediet fra gelen, og la ca 200 μL med media på gelen. Plasser gelen på mikroskopet og finn overflatelaget av perler og et fint jevnt område på gelen.
    5. Tilsett 80 μL celler (unngå å berøre gelen for å opprettholde fokus).
    6. Sørg for at fokuset fortsatt er riktig og at celler kan ses synkende i området (under overført lys). Start oppkjøpet før cellene når gelen.
    7. Ved utilsiktet kontakt med gel, vibrasjoner eller fokusdrift, juster fokuset.
      MERK: Det er avgjørende å samle et bilde av den avslappede gelen, og dette kan være et hvilket som helst bilde tatt før cellene kommer på gelen.

4. Fluorescerende HEL ekstraksjon eksperiment

  1. Forbered fluorescerende HEL ved å binde et fluorescerende fargestoff (av en farge forskjellig fra perlene en som Alexa 555), se Materialse tabell.
  2. I trinn 2.7 erstatter du konvensjonell HEL med den fluorescerende HEL.
  3. Skaff deg bilder med lav belysningsinnstillinger eller lav bildefrekvens (f.eks. 2 bilder per minutt) for å unngå bleking av bilder.
  4. For å kvantifisere HEL-ekstraksjon, databehandling intensiteten integrert over celleområdet for hver ramme I (t) korrigert og normalisert av intensiteten I(0) av ramme 0 i henhold til formelen:
    Equation 1
    MERK: Antigenet konjugert med fluorofor er ikke synlig (sannsynligvis på grunn av slukking av fluorofor på geloverflaten), men dens tilstedeværelse på gelen kan verifiseres med et anti-HEL og et fluorescerende sekundært antistoff. Det kan verifiseres at fluoroforen faktisk er fluorescerende når den løsnes ved å strippe den fra gelen med en dekkslip belagt med anti-HEL og avsløre det med et sekundært fluorescerende antistoff (på dekkslipsen)6. Signalet til det ekstraherte antigenet er veldig svakt og maskeres noen ganger ved å lekke perlene. Hvis man bare er interessert i antigenekstraksjon, anbefales det å forberede gelen uten perler (hopp over trinn 1.3.2 og 1.4.3).

5. Fluorescensavbildning

  1. Få fluorescerende B-celler ved å rense B-celle fra miltene av genmodifiserte mus som gjort for villtypen (f.eks. fra Lifeact-GFP- eller Myosin II GFP-mus).
  2. For bildebehandling fluorescerende celler, bruk (om mulig) en spinnende disk mikroskop med en vann nedsenking langdistanse 40x-100x mål.
  3. Hold eksponeringsvarigheten og bildefrekvensen lav for å unngå bleking.
    MERK: Poengspredningsfunksjonen i Z er sterkt degradert av gelens tilstedeværelse, derfor foreslår vi at du bruker et vannnedsenkingsmål. Levende oppreist mikroskopi med vanndyppingsmål lider av sterke sfæriske avvik forårsaket av tilstedeværelsen av den (sfæriske) cellen (og cellekjernen) i utslippsbanen.

6. Analyse

MERK: Dataanalyse utføres generelt ved først å korrigere hele bunken for drift, finne perlene i hver ramme, spore bevegelsene deres med hensyn til en referanseramme (tatt i fravær av celler), interpolere forskyvningsfeltet og invertere problemet for å oppnå stresset ved hjelp av Fourier transform29. For dette formål foreslår vi at du bruker en kombinasjon av ImageJ Macro og MATLAB-programmer som kan lastes ned fra et online repositorium30.

  1. Åpne filmen i ImageJ som stabel med bilder
  2. Kjør makroen "Crop_and_save.ijm"
    1. Velg interesseområdene (ROI) med "Rektangel"-verktøyet, og legg dem til i roi-listen ved hjelp av t-tasten.
    2. Når du beskjærer cellen, må du passe på å inkludere et område på minst 5–10 piksler immobile perler. Utelat celler som er for nær grensene eller til andre celler fra analysen. Når du er ferdig, klikker du på "OK".
    3. Makroen foreslår en maske av cellen: hvis dette er tilfredsstillende klikk på "OK". Hvis ikke tilfredsstillende, klikk på "Ikke ok" og deretter manuelt velge en lukket region med et valgverktøy (f.eks "Freehand" eller "Oval") og klikk på "Fortsett".
  3. Åpne MATLAB og kjør "TFM_v1.m".
    1. Skriv inn de nødvendige parametrene: Kontroller spesielt bildeegenskapene (pikselstørrelse, tidsintervall for oppkjøp) og gelegenskapene (Young modulus E, Poisson ratio).
    2. Referansebildet er satt til å være det første som standard. Sett den til en annen ramme om nødvendig, eller sett den til "0" for å laste inn en ekstern fil.
    3. Finn utdataene fra programvaren i samme katalog som den opprinnelige filen (for en beskrivelse se User_notice.pdf filen). Dette inkluderer et foreløpig spor av perlene ("FILENAME.fig"), en tomt av kontraktil energi over tid ("FILENAME_energy.fig"), en tabell med flere mengder integrert over cellen (energi, område, øyeblikk, etc) "FILENAME_finaltable.mat", en struktur som inneholder forskyvning og kraftfelt, filmer av perlen, forskyvning felt, stress og energi (som kan åpnes med noen avi leser).
      MERK: I inngangsparametrene er "Vindusstørrelse" vinduet som forskyvningen interpoleres over, derav den endelige oppløsningen av stress- og forskyvningsfeltet. Dette er satt til noen (som standard fire) piksler. Det er ikke tilrådelig å redusere dette da det kunstig vil øke oppløsningen ved å interpolere regioner der det ikke er perler.

Representative Results

Gitt størrelsen på cellene, algoritmer som trekker ut forskyvning kartet over perlene via korrelative teknikker (for eksempel partikkel bilde velocimetry) er generelt ikke veldig presis. Men avhengig av graden av oppløsning som kreves, kan man enkelt få kvalitative resultater ved hjelp av en gratis Fiji / ImageJ plugin31,32. Selv om denne tilnærmingen er tilstrekkelig til å sammenligne stimulerende versus ikke-stimulerende forhold, anbefaler vi for en grundig analyse å bruke vår programvare nedlastbar fra et online repositorium30, som sporer perlene individuelt og gir forskyvningsfeltkartet på et gitt tidspunkt som interpolering av den enkelteperleforskyvninger 33. Flere kvantifiseringer er mulig på dette punktet. For eksempel (ved å anta at forskyvningen bare skyldes stress tangential til geloverflaten) gir programvaren også stress på hvert punkt som forårsaker at spesifikk forskyvning kart. Dette er en type "inversjonsproblem": forskyvningen på et visst tidspunkt avhenger av summen av alle kreftene som brukes over de andre punktene. "Inversjonsalgoritmen" tar hensyn til de fysiske parametrene til substratet: dens stivhet (Young modulus) og Poisson-forholdet. Direkte algoritmer er vanligvis svært nøyaktige, men beregningsmessig dyre. Algoritmer basert på Fourier transformere, som vår, utføre i hovedsak en overføring i Fourier plass og er mer effektive, men utsatt for noen feil (hovedsakelig på grunn av interpolering trinn). Disse algoritmene krever vanligvis justering av en parameter som hindrer små lokale (og potensielt artefaktiske) forskyvninger for å bli for relevante i beregningen av stressfeltet (Tikhonov regularisering parameter8,29; "Regularisering" variabel i dialogvinduet; her setter vi vanligvis lik 5 x 10-19). For mer avansert tolkning og analyse, for eksempel spatio-temporale korrelasjoner, lokale bevegelser, korrelasjoner med fluorescerende kanaler, anbefaler vi å samarbeide med eksperter på feltet. For en gjennomgang av beregningsmetoder se Schwarz et al.9.

Som nevnt ovenfor ser riktige perlebilder ut som en "stjernehimmel", en jevn og tilfeldig fordeling av lyse flekker (figur 2A). Data og analyser er ikke pålitelige når antall perler er for lavt (figur 2B) eller bildet er ute av fokus (figur 2C). Når B-cellene har slått seg ned på overflaten av gelen, begynner perlene under cellene å bevege seg på grunn av trekkraftkraften som utøves av cellen på gelen. Rammer som perlene ikke er sporbare skal kastes.

Som en sjekk er det mulig å observere med øye bevegelsen av perler som sammenligner "referanserammen", vanligvis den forut for den første kontakten av cellen med substratet. Omtrentlige resultater kan oppnås fra enkeltpartikkelsporing (f.eks. Trackmate, Fiji 34) som gjort i figur 3A. Analysen gir en segmentering av perlene i referansebildet ("FILENAME.fig") som en kontroll.

Med programvaren vi foreslår, kan man få forskyvning (Figur 3B) og stressfelt (vektoren av det lokale stresset på hver piksel og hvert gangpunkt oppnådd ved inversjon fra forskyvningsfeltet, Figur 3C). Scalar produkt av forskyvning og kraft felt integrert på området av cellen gir totalt arbeid utøves av cellen på underlaget (Figur 4A). Denne beregningen krever masken til cellen introdusert i trinn 6.2 i protokollen.

For å sammenligne to biologiske tilstander (som aktivering av HEL versus ikke-aktiverende substrat BSA, eller vill type versus knock-out) er det nyttig å beregne gjennomsnittskurven (figur 4B) eller enda mer syntetisk, en gjennomsnittlig verdi over siste gangs punkter (20 min) hvor energien når et platå (figur 4C). Når den romlige informasjonen til kreftene er relevant, er det mulig å sammenligne enkelttidspunkter for hver tilstand (figur 4D). Se Kumari et al.6 for dypere analyse.

Et eksempel på fluorescens antigen ekstraksjon tidsforløp er vist i figur 5A: progressivt utseende av fluorescens signaler ved synapse indikert antigen løsrivelse fra gelen. Den gjennomsnittlige ekstraksjonskurven med konfidensintervallet (standardfeil av gjennomsnittet) over 15 celler er vist i figur 5B.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk visning av fremstillingen av gelen og dens funksjonalisering. Trinnene er beskrevet i protokollen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Tre eksempler på perlebilder av forskjellige kvaliteter. (A) Eksempel på perlebilde med riktig signal-til-støy-forhold og riktig tetthet. (B)Eksempler på bilder med for utilstrekkelig antall perler og (C) ute av fokusplan. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Behandling av bildene for å trekke ut kraftfeltet. (A) Eksempel på et bilde av perlene (omrisset av cellen i hvitt, ekstrahert fra overføringsbildet), perlesporing til annen tid t = 5 min (rødt overlegg) og forskyvning (piler) i forhold til tid t = 0 min (skala bar 5 μm). (B)Interpolert forskyvning felt (representert som vektor quiver og størrelse kart, piler er proporsjonal med forskyvning [nm]; se fargelinjen til høyre); bunn: et jevnere bilde av størrelsen (oppnådd ved interpolering med en bikub funksjon). (C) Stressfelt fra forskyvningsfelt i panel B (representert som vektorquiver og størrelseskart; piler er proporsjonale med skjærstresset [Pa]; se fargelinjen til høyre); bunn: et jevnere bilde av størrelsen (oppnådd ved interpolering med en bikub funksjon). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Eksempel på informasjon som kan hentes ut fra kraft- og forskyvningsfelt. (A) Eksempel på utvikling av energi i tide for en enkelt celle: en platåfase (uthevet i grått) vises etter ca. 10 min. (B) Sammenligning av de gjennomsnittlige energikurvene og (C) av de relative platånivåene for 65 celler belagt på HEL (aktivere) belagt gel og 35 celler på BSA (ikke-aktiverende) belagt gel (median ± interkvartile områder vises, Mann-Whitney test ble brukt for statistisk signifikans). (D) Time-lapse fargekart over stress for HEL og kontrollere BSA tilstand; både størrelsesorden og quiver tomter er vist. Disse bildene er tilpasset fra Kumari et al.6. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Eksempel på eksperimenter med fluorescerende antigen. (A) Tidsforløp av ekstraksjon av fluorescerende HEL (under: prosentandel av maksimum, skala bar = 3μm). (B) Antigensamling over tid (Middel ± SEM, n = 15). Disse bildene er tilpasset fra Kumari et al.6. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

TFM-metoden som er beskrevet her, muliggjør systematisk studie av de aktive mekaniske egenskapene til B-celler. I sammenheng med B-celler er dette relatert til evnen til å trekke ut og internalisere antigenet. Sammenlignet med andre TFM-metoder, er protokollen som presenteres her enkel og ganske reproduserbar: stivheten, målt ved innrykk av en glassmikrosfære og bruk av Hertz-modell, er mellom 400 og 600 Pa. Lignende protokoller har blitt brukt ikke bare forB-celler 35, men også for T-celler36. Sammenlignet med nanopillars (også brukt for T lymfocytter37) det gir en flat homogen overflate, derfor resultatene er lettere å tolke som samspillet mellom gelen er hovedsakelig begrenset til å være tangential til overflaten.

Protokollen vi beskrev gir tilgang til spatiotemporal dynamikken i kreftene utøves av B-celler på antigen-presentere substrater. På romlig nivå gir dette informasjon om lokalisering av krefter, og i kombinasjon med fluorescensmikroskopi gjør det mulig for eksperimentereren å korrelere lokale krefter med tilstedeværelsen av spesifikke molekyler (det vil si komponenter i cytoskeleton eller BCR-signalkaskade). På timelig nivå er det mulig å integrere mengder (for eksempel total energi eller total stress) for å gi en verdi per tidspunkt og redusere støyen. Dette gjør det mulig for observasjon av utviklingen av trekkraft kraft i tid (vekst og platå) og tilstedeværelsen av pulsatile mønstre.

Kritiske eksperimentelle aspekter for analysen er beskrevet som følgende. (i) Celletetthet: For å utføre en korrekt analyse, bør cellene skilles tilstrekkelig. Vi anser en celle for å være analyseres hvis den har et tomt område av sin egen størrelse rundt den. (ii) Overføringsbilde: Det anbefales å samle minst et overføringsbilde av cellene under forsøket som skal brukes som maske i analysen. (iii) Antall perler i bildet: Vi foreslår å analysere bare bilder der antall perler i synapsen er mellom 30 og 200 (det vil si 1–8 perler/μm²). Lavere tettheter tillater ikke tilstrekkelig kartforskyvning rekonstruksjon. Høye perletettheter gjør enkel partikkelsporing upålitelig. (iv) Antall perler bør være konstant under forsøket; Svingninger kan imidlertid oppstå på grunn av liten variasjon i bildeforholdene (spesielt i perler som er for nær hverandre). Fokusdrift, hvis det oppstår, må korrigeres og problematiske rammer skal kastes. (v) Gelkvalitet: geler med for mange sprekker, variasjon i perler distribusjon eller geler som er for tykke bør kastes. (vi) Avhengig av celletypen, etter gjentatte eksponeringer, kan celler på sene tidspunkter (> 300 rammer) lide fototoksiske effekter. Det anbefales å kjøre programmet på en maske blottet for celler som en "baseline" som skal sammenlignes med dataene. Dette gir en størrelsesorden av støynivået utelukkende på grunn av de eksperimentelle forholdene.

Geler som brukes til å måle trekkraft i klassisk vedheft tillater undersøkelse av prosesser som oppstår ved fokal vedheft (actin flyter og rekruttering av signalmolekyler) - punktene der krefter brukes38,39. Imidlertid brukes ikke krefter ved synapse gjennom fokale adhesjoner. Spatiotemporal mønster av kraftgenerering ved B-celle immunsynapse har ikke blitt kvantitativt undersøkt ved hjelp av denne metoden før nylig. Ved hjelp av TFM observerte vi for første gang, kraftmønster ved B-cellemunmunsynapse, som presentert i vår sistestudie 6, og åpnet oppmuntrende perspektiver i studiet av lymfocytter.

Spesielt bruker denne metoden et bilde tatt før ankomsten av cellene på gelen som et referansebilde for kraftberegningen. Vanlige TFM-protokoller foreslår å ta referansebildet på slutten av eksperimentet, etter å ha løsnet cellene med trypsin; Dette gjør at eksperimentereren kan lete etter et område rikt på celler. Selv om dette er mulig her også, trypsin er ganske ineffektiv på å løsne B-celler fra antigenbelagt gel, må man vente lenge på løsrivelse og risikoen for gel modifikasjon og bevegelser (som gjør hele datasettet uutnyttelig) er høyere.

Metoden som presenteres her er fleksibel og kan brukes til å studere effekten av andre signaler på immunsynapse som det gjør det mulig å pode andre proteiner på geloverflaten (f.eks integrinske ligandends og immunglobuliner har blitt testet) og til og med fluorescerende antigen (se avsnitt 4). Videre forblir celler tilgjengelige for eksperimentereren for narkotikabehandling og lokale perturbasjoner. Til slutt er metoden også kompatibel med bilde av faste celler. For disse observasjonene anbefales det å lage gelen på en dekkslipp, flekke cellene, lime dekkslippen på et lysbilde og først da legge til monteringsmedier og en annen dekkslip. Observasjon vil da bli gjort med gelen på toppen for å unngå nedbrytning av bildet gjennom gelen.

Mulige fallgruver er variasjonen i gel i polymerisering og belegg. Polymeriseringsproblemer skyldes hovedsakelig kvaliteten på initiativtaker/katalysator. Også gelen kan blåse opp, spesielt hvis den ikke brukes rett etter montering. Dette problemet ser ikke ut til å dramatisk påvirke gelens mekaniske egenskaper, men det kan gjøre perlelaget utilgjengelig for målet, noe som effektivt gjør gelen ubrukelig. Vi anbefaler å tilberede ekstra geler for hver tilstand når dette problemet oppstår. Det kan også være en viss variasjon i belegget, og det er avgjørende å ha nyfortynnet Sulfo SANPAH.

Til slutt har vi beskrevet en enkel, billig og reproduserbar metode for å måle kreftene som utøves av B-celler ved immunologisk synapse når de aktiveres av BCR ligand. Det kan tilpasses for å studere reaksjonen på andre ligands og andre typer lymfocytter (minne B-celler, T-celler, etc.) ved bruk av riktig reseptor ligand.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker M. Bolger-Munro for kritisk lesing og anerkjenner Nikon Imaging Center@CNRS-InstitutCurie og PICT-IBiSA, Institut Curie, Paris, medlem av Den nasjonale forskningsinfrastrukturen i Frankrike-BioImaging, for støtte til bildeoppkjøp og Curie Animal Facility. PP ble støttet av CNRS. AK og JP ble støttet av Paris Descartes PhD-stipend og Ecole Doctorale FIRE- Program Bettencourt. Dette prosjektet ble finansiert av tilskudd til PP (ANR-10-JCJC-1504-Immuphy) og AMLD (ANR-PoLyBex-12-BSV3-0014-001, ERC-Strapacemi-GA 243103).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) Sigma-Aldrich 281778 Store aliquoted, protected from humidity
40% Acrylamide Solution Biorad 1610140
Alexa555 microscale protein labeling kit Molecular Probes A30007
Ammonium Persulfate (APS) Sigma-Aldrich A3678
B cell Isolation Kit, Mouse Miltenyi Biotec 130-090-862
B-mercaptoethanol Gibco 31350-010
2% Bis Solution Biorad 161-0142
Bovine Serum Albumin (BSA) Euromedex 04-100-812-C
Coverslip 18mm VWR 631-1580
Fetal calf serum PAA A15-151 Decomplemented (40min @56°C)
Fluorodishes FD35 World Precision Instruments, Inc FD35100
Fluosphere: carboxylate-modified, 0.2um, dark red Molecular Probes F8807
Hen Egg Lysozyme Sigma-Aldrich L6876 Stocked in aliquote 100mg/ml
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Thermofisher/Gibco 11140035
N,N,N',N'-tetrametiletilendiammine (TEMED) Euromedex 50406-B
PBS (Phosfate Buffer Saline) Gibco 10010-015
Penicillin–streptomycin Gibco 15140-010
RMPI 1640 – Glutamax I Thermofisher 61870-010
Sigmacote Sigma-Aldrich SL2
Sodium pyruvate Gibco 11360-039
sulfosuccinimidyl 6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino)hexanoate (Sulfo-SANPAH) Thermo Scientific 22589

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yuseff, M. -I., Pierobon, P., Reversat, A., Lennon-Duménil, A. -M. How B cells capture, process and present antigens: a crucial role for cell polarity. Nature Reviews. Immunology. 13 (7), 475-486 (2013).
  2. Spillane, K. M., Tolar, P. B cell antigen extraction is regulated by physical properties of antigen-presenting cells. The Journal of Cell Biology. 216 (1), 217-230 (2017).
  3. Shaheen, S., Wan, Z., et al. Substrate stiffness governs the initiation of B cell activation by the concerted signaling of PKCβ and focal adhesion kinase. eLife. 6, (2017).
  4. Natkanski, E., et al. B cells use mechanical energy to discriminate antigen affinities. Science. 340 (6140), 1587-1590 (2013).
  5. Wan, Z., Chen, X., et al. The activation of IgM- or isotype-switched IgG- and IgE-BCR exhibits distinct mechanical force sensitivity and threshold. eLife. 4, (2015).
  6. Kumari, A., Pineau, J., et al. Actomyosin-driven force patterning controls endocytosis at the immune synapse. Nature Communications. 10 (1), 2870 (2019).
  7. Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
  8. Sabass, B., Gardel, M. L., Waterman, C. M., Schwarz, U. S. High resolution traction force microscopy based on experimental and computational advances. Biophysical Journal. 94 (1), 207-220 (2008).
  9. Schwarz, U. S., Soiné, J. R. D. Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances. Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (11), Pt B 3095-3104 (2015).
  10. Colin-York, H., Shrestha, D., et al. Super-Resolved Traction Force Microscopy (STFM). Nano Letters. 16 (4), 2633-2638 (2016).
  11. Stubb, A., Laine, R. F., Guzmán, C., Henriques, R., Jacquemet, G., Ivaska, J. Fluctuation-Based Super-Resolution Traction Force Microscopy. BioRxiv. , (2019).
  12. Gutierrez, E., Tkachenko, E., et al. High refractive index silicone gels for simultaneous total internal reflection fluorescence and traction force microscopy of adherent cells. Plos One. 6 (9), 23807 (2011).
  13. Bergert, M., Lendenmann, T., et al. Confocal reference free traction force microscopy. Nature Communications. 7, 12814 (2016).
  14. Schoen, I., Hu, W., Klotzsch, E., Vogel, V. Probing cellular traction forces by micropillar arrays: contribution of substrate warping to pillar deflection. Nano Letters. 10 (5), 1823-1830 (2010).
  15. Colin-York, H., Fritzsche, M. The future of traction force microscopy. Current Opinion in Biomedical Engineering. 5, 1-5 (2018).
  16. Feng, Y., et al. Mechanosensing drives acuity of αβ T-cell recognition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (39), 8204-8213 (2017).
  17. Spillane, K. M., Tolar, P. DNA-Based Probes for Measuring Mechanical Forces in Cell-Cell Contacts: Application to B Cell Antigen Extraction from Immune Synapses. Methods in Molecular Biology. 1707, 69-80 (2018).
  18. Stabley, D. R., Jurchenko, C., Marshall, S. S., Salaita, K. S. Visualizing mechanical tension across membrane receptors with a fluorescent sensor. Nature Methods. 9 (1), 64-67 (2011).
  19. Merkel, R., Nassoy, P., Leung, A., Ritchie, K., Evans, E. Energy landscapes of receptor-ligand bonds explored with dynamic force spectroscopy. Nature. 397 (6714), 50-53 (1999).
  20. Hinterdorfer, P., Dufrêne, Y. F. Detection and localization of single molecular recognition events using atomic force microscopy. Nature Methods. 3 (5), 347-355 (2006).
  21. Sawicka, A., Babataheri, A., et al. Micropipette force probe to quantify single-cell force generation: application to T-cell activation. Molecular Biology of the Cell. 28 (23), 3229-3239 (2017).
  22. Desprat, N., Guiroy, A., Asnacios, A. Microplates-based rheometer for a single living cell. Review of Scientific Instruments. 77 (5), 055111 (2006).
  23. Labernadie, A., Bouissou, A., et al. Protrusion force microscopy reveals oscillatory force generation and mechanosensing activity of human macrophage podosomes. Nature Communications. 5, 5343 (2014).
  24. Bouissou, A., Proag, A., et al. Protrusion force microscopy: A method to quantify forces developed by cell protrusions. Journal of Visualized Experiments. (136), 57636 (2018).
  25. Kronenberg, N. M., Liehm, P., et al. Long-term imaging of cellular forces with high precision by elastic resonator interference stress microscopy. Nature Cell Biology. 19 (7), 864-872 (2017).
  26. Basu, R., Whitlock, B. M., et al. Cytotoxic T cells use mechanical force to potentiate target cell killing. Cell. 165 (1), 100-110 (2016).
  27. Bufi, N., Saitakis, M., et al. Human Primary Immune Cells Exhibit Distinct Mechanical Properties that Are Modified by Inflammation. Biophysical Journal. 108 (9), 2181-2190 (2015).
  28. Goodnow, C. C., Crosbie, J., et al. Altered immunoglobulin expression and functional silencing of self-reactive B lymphocytes in transgenic mice. Nature. 334 (6184), 676-682 (1988).
  29. Butler, J. P., Tolić-Nørrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
  30. MBPPlab/TFM_v1: Software for Time dependent Traction Force Microscopy. , Available from: https://github.com/MBPPlab/TFM_v1 (2019).
  31. Tseng, Q., Duchemin-Pelletier, E., et al. Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell-cell junction positioning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (5), 1506-1511 (2012).
  32. ImageJ plugins by Qingzong TSENG. , Available from: https://sites.google.com/site/qingzongtseng/ (2019).
  33. Plotnikov, S. V., Sabass, B., Schwarz, U. S., Waterman, C. M. High-resolution traction force microscopy. Methods in Cell Biology. 123, 367-394 (2014).
  34. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  35. Wang, J., Lin, F., et al. Profiling the origin, dynamics, and function of traction force in B cell activation. Science Signaling. 11 (542), (2018).
  36. Hui, K. L., Balagopalan, L., Samelson, L. E., Upadhyaya, A. Cytoskeletal forces during signaling activation in Jurkat T-cells. Molecular Biology of the Cell. 26 (4), 685-695 (2015).
  37. Bashour, K. T., Gondarenko, A., et al. CD28 and CD3 have complementary roles in T-cell traction forces. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (6), 2241-2246 (2014).
  38. Gardel, M. L., Sabass, B., Ji, L., Danuser, G., Schwarz, U. S., Waterman, C. M. Traction stress in focal adhesions correlates biphasically with actin retrograde flow speed. The Journal of Cell Biology. 183 (6), 999-1005 (2008).
  39. Stricker, J., Sabass, B., Schwarz, U. S., Gardel, M. L. Optimization of traction force microscopy for micron-sized focal adhesions. Journal of Physics. Condensed Matter. 22 (19), 194104 (2010).

Tags

Bioengineering Utgave 161 Bioengineering myke geler trekkraft kraft antigen biofysikk immunologi B-celler
Trekkraft Force mikroskopi å studere B lymfocytt aktivering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kumari, A., Pineau, J.,… More

Kumari, A., Pineau, J., Lennon-Duménil, A. M., Balland, M., Pierobon, P. Traction Force Microscopy to Study B Lymphocyte Activation. J. Vis. Exp. (161), e60947, doi:10.3791/60947 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter