Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Самосвечение гибридных липидных мембран с гидрофобными органическими молекулами на водно-воздушном интерфейсе

Published: May 1, 2020 doi: 10.3791/60957
Automatic Translation
1, 2, 1, 1,2
1Research Institute of Electrical Communication, Tohoku University, 2Advanced Institute for Materials Research, Tohoku University

Summary

Мы сообщаем о протоколе для производства гибридной липидной мембраны на водно-воздушном интерфейсе путем применения допинга липидным билейером с медью (II) 2,9,16,23-тетра-терт-бутил-29Н,31H-фталокянин (CuPc) молекул. Полученная гибридная липидная мембрана имеет липидную/cuPc/липидную структуру сэндвича. Этот протокол также может быть применен к формированию других функциональных наноматериалов.

Abstract

Из-за своих уникальных свойств, в том числе ультратонкой толщины (3-4 нм), сверхвысокой резистентности, текучести и способности к самосвалу, липидные билейеры могут быть легко функционализированы и использовались в различных областях применения, таких как биосенсоры и био-устройства. В этом исследовании мы ввели планаре органическую молекулу: медь (II) 2,9,16,23-тетра-терт-бутил-29H,31H-фталокянин (CuPc) для допинг липидных мембран. Гибридная мембрана CuPc/lipid образуется на водном/воздушном интерфейсе путем самосвербли. В этой мембране, гидрофобные молекулы CuPc расположены между гидрофобными хвостами липидных молекул, образуя липидную/CuPc/липидную структуру сэндвича. Интересно, что воздушно-стабильный гибридный липидный билейлер может быть легко сформирован путем переноса гибридной мембраны на субстрат Si. Мы сообщаем о простом методе включения наноматериалов в липидную двухслойную систему, которая представляет собой новую методологию изготовления биосенсоров и биоустройств.

Introduction

Как основные рамки клеточных мембран, внутренняя часть клеток отделена от внешней липидной системой. Эта система состоит из амфифильных фосфолипидов, которые состоят из гидрофильных фосфорных эстеровых «голов» и гидрофобных жирных кислот «хвостов». Благодаря замечательной текучести и способности самосвалов липидных билейеровв акальной среде 1,2, искусственные липидныебилейеры могут образовывалисьпростыми методами 3,4. Различные типы мембранных белков, таких как ионные каналы, мембранные рецепторы и ферменты, были включены в искусственный липидный бислой для имитации и изучения функцийклеточных мембран 5,6. Совсем недавно, липидные билейеры были допинг с наноматериалами (например, металлические наночастицы, графен, и углеродные нанотрубки) для формирования функциональных гибридных мембран7,8,9,10,11,12,13. Широко используемый метод для формирования таких гибридных мембран включает в себя образование допинг липидных пузырьков, которые содержат гидрофобные материалы, такие как модифицированные Au-nanoparticles7 или углеродных нанотрубок 11, и в результате пузырьки затем сливаются в планар поддерживается липидных билейдеров. Однако такой подход является сложным и трудоемким, что ограничивает потенциальное использование таких гибридных мембран.

В этой работе, липидные мембраны были допинг с органическими молекулами для производства гибридных липидных мембран, которые образуются на воде / воздуха интерфейс самостоятельной сборки. Этот протокол включает в себя три этапа: подготовка смешанного раствора, формирование гибридной мембраны на водно-воздушном интерфейсе и перенос мембраны на субстрат Si. По сравнению с другими ранее зарегистрированными методами описанный здесь метод проще и не требует сложных приборов. Используя этот метод, воздушно-стабильные гибридные липидные мембраны с большей площадью могут образовыться в более короткие сроки. Наноматериал, используемый в этом исследовании является полупроводящих органических молекул, медь (II) 2,9,16,23-тетра-терт-бутил-29H,31H-фталокянин (CuPc), который широко используется в ряде приложений, в том числе солнечных батарей, фотодетекторов, газовых датчиков и катализ14,15. CuPc, небольшая органическая молекула с планарной структурой, имеет высокое сродство к "хвосты" фосфолипидов дуэт его гидрофобных характеристик. Другие группы сообщили, что молекулы CuPc могут самостоятельно собираться на однокристаллированных поверхностях собразованием высоко заказанных структур 16,17. Таким образом, вполне возможно, что молекулы CuPc могут быть включены в липидные двуслойные через самосвал.

Мы предоставляем подробное описание процедур, используемых для формирования мембран и представить некоторые предложения для плавного осуществления этой процедуры. Кроме того, мы представляем некоторые представления результатов гибридных липидных мембран, и обсуждаем потенциальное применение этого метода.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка гибридного решения

  1. Вымойте четыре 4 мл одноразовых стеклянных флаконов и винтовых колпачков (с PTFE покрытием уплотнения) в ультразвуковой ванне в течение 10 минут в дистиллированной воде (очищены с системой фильтрации), а затем этанола и хлороформа, соответственно. Высушите стеклянные флаконы и колпачки в потоке азотного газа.
  2. В анаэробной перчаточной коробке приготовьте раствор бульона CuPc (10 мг/мл) в промытом стеклянном флаконе путем растворения порошкообразного CuPc в хлороформе.
  3. Фильтровать раствор CuPc через мембрану политетрафторэтилена (PTFE) 0,2 мкм.
  4. Храните отфильтрованный раствор в промытом стеклянном флаконе, наполненном азотом, и запечатайте флакон парафильмом.
  5. Возьмите приобретенный 1,2-дифитаноил-sn-glycero-3-фосфохолин (DPhPC) хлороформный раствор (25 мг/мл) из холодильника -80 градусов по Цельсию и дайте ему прогреться до комнатной температуры.
  6. Перемешать решение DPhPC с помощью вихревого смесителя при 2300 об/мин при 10 с.
  7. Промыть стеклянный микро-шприц хлороформом 5 раз.
  8. Перенесите 200 МКЛ хлороформного раствора DPhPC в предварительно вымытый стеклянный флакон с помощью промытого шприца. Испарить растворитель во флаконе с нежным потоком азота.
  9. Промыть стеклянный микро-шприц 5 раз хлороформом.
  10. Добавьте 202,6 мл хлороформа в стеклянный флакон с DPhPC с помощью очищенного шприца.
  11. Добавьте 47,4 л отфильтрованного раствора CuPc 10 мг/мл в раствор DPhPC. Соотношение моляров DPhPC к CuPc должно быть 10:1.
  12. Промыть стеклянный микро-шприц 5 раз хлороформом.
  13. Добавьте 250 мкл шестиугольа в раствор с помощью шприца. Окончательная концентрация раствора должна быть 10 мг/мл.
  14. Смешайте подготовленное решение с помощью вихревого миксера при 2300 об/мин за 10 с.
  15. Фильтровать раствор CuPc через мембрану политетрафторэтилена (PTFE) 0,2 мкм.
  16. Печать стеклянного флакона с парафильмом. Положите его в сцепление запечатанный мешок, наполненный азотом и поместите сцепление запечатанный мешок в морозильную камеру при -20 градусов по Цельсию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После шага 1.13 DPhPC и CuPc растворились в смешанном растворители, который состоял из хлороформа и шестина (коэффициент объема 1:1). Кроме того, соотношение моляров DPhPC к CuPc не ограничивается 10:1. При постоянной концентрации липидов (10 мг/мл) можно использовать различные молярные соотношения. Согласно предыдущим экспериментальным результатам, диапазон от 10:1 до 3:1 предпочтительнее для формирования высококачественной гибридной липидной мембраны.

2. Формирование гибридной мембраны на водно-воздушном интерфейсе

  1. Вырезать Si субстраты (3 см х 3 см) от Si.
  2. Очистите 3 см х 3 см Si субстратов в ультразвуковой ванне в течение 10 мин в очищенной воде, а затем этанол, а затем хлороформ. Лечить Si субстрат с O2 плазмы в течение 5 минут, чтобы удалить адсорбированы органические материалы с поверхности и для улучшения гидрофилиности.
  3. Вымойте стакан тефлона с внутренним диаметром 7,5 см с проточной очищенной водой в течение 3 мин.
  4. Положите очищенный субстрат Si в вымытый стакан PTFE. Субстрат наклонен под углом 30 градусов к горизонтали.
  5. Налейте достаточное количество очищенной воды в стакан тефлона до тех пор, пока весь субстрат Si не будет погружен.
  6. Возьмите подготовленный гибридный раствор из морозильной камеры и дайте ему прогреться до комнатной температуры.
  7. Перемешать гибридный раствор с помощью вихревого миксера при 2300 об/мин при 15 с.
  8. Промыть стеклянный микро-шприц (50 МКЛ) 5 раз хлороформом.
  9. Падение 3-5 йл гибридного раствора на поверхность воды с помощью шприца для формирования плавающей гибридной липидной мембраны.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При падении раствора важно удерживать каплю близко к (менее 1 см) поверхности воды. Следует также отметить, что однослойная гибридная мембрана не видна невооруженным глазом, но многослойная гибридная мембрана выглядит как тонкая, синего цвета пленка. Для того, чтобы перенести многослойную гибридную мембрану в субстрат Si, важно как можно ближе уронить смешанный раствор к субстрату Si.

3. Передача мембраны на субстрат Si

  1. После испарения органического растворителя (это займет менее 2 секунд), снизить уровень воды со скоростью 3 мм/мин, откачивая воду через резиновую трубку, которая управляется перистальтическим насосом, чтобы перенести плавающую гибридную мембрану на субстрат Si.
  2. После завершения процесса передачи (около 5 минут) поместите субстрат Si на стеклоочиститель и дайте всей остаточной воде испариться.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Снижение уровня воды при такой низкой скорости служит для минимизации турбулентности воды и для защиты мембраны.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Как-сформированная мембрана имеет равномерный светло-голубой цвет из-за присутствия молекул CuPc. Площадь цветной мембраны обычно составляет несколько квадратных сантиметров. На рисунке 1A и рисунке 1Bмы показываем микроскопическое изображение и изображение атомного силового микроскопа (AFM) (включая профиль высоты) гибридной липидной мембраны на субстрате Si. На изображении AFM мембрана в левом верхнем слева толстая, толщиной 79,4 нм, а в правом нижнем - тонкая, толщина 4,9 нм. Тонкая мембрана показывает поверхностную шероховатость Ra 0,4 нм, которая близка к очищенной субстрат си. Кроме того, на основе нескольких измерений толщина мембраны показывает дискретное распределение с 5-нм шагом18. Так как сообщили толщина мембраны DPhPC липидного двуслойного составляет около 4нм 19, можно сделать вывод, что 5 нм тонкая мембрана является CuPc допинг липидной двуслойной мембраны и что толстые мембраны состоят из стеков допинг липидных билейеров.

Для дальнейшего исследования состава гибридной мембраны на субстрате Si был использован анализ энергодисперсивного рентгеновского излучения (EDX). Как и подсчитано на рисунке 2,атомные соотношения репрезентативных элементов, таких как Cu, P, N и C, являются 0,33%, 0,97%, 4,06% и 68,56%. Учитывая, что при подготовке гибридной мембраны использовалось молярное соотношение 3 к 1 (DPhPC к CuPc), теоретическое соотношение моляров Cu:P:N:C должно быть 1:3:11:192, что близко к измеренной соотношению элементов в гибридной мембране, что указывает на то, что соотношение между липидами и молекулами CuPc сохраняется после процесса формирования и переноса пленки.

Figure 1
Рисунок 1: Как-сформированная гибридная мембрана лега с CuPc. (A)Конфокальные микроскопии изображение гибридной мембраны. (B) AFM изображение гибридной мембраны. Мембрана, показанная в (B) включает в себя гибридную многослойную мембрану толщиной 79,4 нм и сопредельную монослойную гибридную мембрану толщиной 4,9 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: EDX узор гибридной мембраны на субстрате Si. Соответствующие элементы к функциям отображаются на рисунке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В растворе прекурсора гибридной мембраны, смешанный органический растворитель (хлороформ и гексан), а не чистый хлороформ используется для растворения липидов и CuPc. При использовании чистого хлороформа плотность раствора прекурсора будет выше, чем у воды. Поэтому весьма вероятно, что раствор опустится на дно воды, а не будет распространяться по поверхности воды. Добавление шестиугольного растворителя низкой плотности к раствору прекурсора гарантирует, что раствор будет плавать по поверхности воды и образовывать единую гибридную мембрану после испарения растворителя. Следует также отметить, что сразу после контакта раствора с поверхностью воды всегда наблюдалась небольшая поверхностная волна, возможно, из-за распространения мембраны и органического растворителя, что изменило бы поверхностное натяжение воды. Так как гибридная мембрана ультратонкий и хрупкий, небольшое нарушение повредит неповрежденность мембраны с видимыми трещинами формируется. Поэтому, чтобы предотвратить дальнейшее повреждение, очень важно минимизировать воздушный поток вокруг мембраны и избежать любых вибраций воды после образования гибридных мембран. По возможности стакан тефлона следует поместить на вибрационный изоляционный стол.

Устоявшийся метод Лангмуир-Блоджетт (LB) широко используется для формирования липидных монослой на водно-воздушном интерфейсе, где гидрофильные головки липидов ориентированы на воду, в то время как гидрофобные хвосты ориентированы на воздух. В отличается от метода LB, путем допинга с молекулами CuPc, наш метод позволил гибридных мембран со структурой bilayer быть сформированы на воде / воздуха интерфейс в один шаг. В гибридной мембране предполагается, что гидрофобные молекулы CuPc расположены между гидрофобными «хвостами» липидных молекул, образуя интригующую структуру липидов/cuPc/lipid sandwich. Мы подтвердили это предположение, проведя измерения флуоресценции резонансной передачи энергии (FRET)18.

Кроме того, мы повторили процесс формирования пленки, используя несколько различных молярных соотношений DPhPC к CuPc в соответствии с тем же протоколом, описанным выше. Как правило, низкое соотношение CuPc (например, молярный коэффициент 20:1) привело к созданию гибридной мембраны с более светлым цветом и меньшей площадью, чем подготовленная с использованием высокого соотношения CuPc (например, 3:1 и 10:1). Похоже, что молекулы CuPc помочь в формировании двуслойного, а также выступать в качестве клея, в результате чего образование мембран с большими площадями. Кроме того, при отсутствии липидных молекул молекулы CuPc, как правило, агрегируются какна поверхности воды 20,так и на твердом субстрате после испарениярастворителя 21. Однако, в случае гибридной мембраны, результаты XRD показали, что молекулы CuPc не агрегируются, чтобы сформировать небольшие кристаллы в гибридноймембране 18. Это говорит о том, что агрегация молекул CuPc была предотвращена взаимодействием гидрофобных «хвостов» липидов с CuPc. Однако, когда больше молекул CuPc были использованы для подготовки липидного раствора (например, молярное соотношение 1:1), гибридные мембраны не только показывают более темный синий цвет, но молекулы CuPc также заметно агрегируются в мембранах. Учитывая, что размер молекулы CuPc (1,7 нм) немного больше, чем диаметр головной группы липидной молекулы (около 1 нм), соотношение моляров выше 3:1, как правило, приводит к пленкам, которые содержат агрегированные молекулы CuPc. Соотношение моляров 10:1, которое использовалось в репрезентативных экспериментах, является компромиссом между областью мембраны и нежелательной агрегацией.

В соответствии с описанным протоколом на водно-воздушном интерфейсе образовались гибридные липидные мембраны со структурой сэндвича. Путем допинга с молекулами CuPc, гибридная липидная мембрана обладала бы некоторыми из функциональных возможностей semiconducting молекул, включая оптоэлектронные и фотокаталитические свойства, которые значительно расширяли бы применения структур липидного bilayer. Следует также отметить, что допинговый материал не ограничивается молекулами CuPc. Мы также сформировали аналогичные гибридные мембраны с липидными/pc/lipid сэндвич структур, используя 2,9,16,23-тетра-терт-бутил-29H,31H-фталокянин (H2PC) и цинк 2,9,16,23-тетра-терт-бутил-29H,31H-фталокянин (НПЦ) в качестве допинг-материалов. Другие группы продемонстрировали, что поверхностно модифицированные Au-nanoparticles, графеновые нанолисты и фуллерены могут стабилизироваться внутри липидногобилейера 7,9,12. Таким образом, можно допинг липидного билейера с другими гидрофобными молекулами и наноматериалами, что еще больше расширит спектр применения гибридных липидных мембран.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторов нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана программой CREST Японского агентства по науке и технике (JPMJCR14F3) и Грантом помощи от Японского общества содействия науке (19H00846 и 18K14120). Эта работа была частично проведена в Лаборатории наноэлектроники и спинтроники, Научно-исследовательском институте электросвязи Университета Тохоку.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chloroform Wako Chemicals 033-08631
CuPc Sigma-Aldrich 423165
DPhPc Avanti Polar Lipids 850356C
Glass vials with screw cap Nichiden-Rike Glass Co., Ltd 6-29801
Hexane Wako Chemicals 084-03421
Membrane filters Merck Millipore Ltd. R8CA42836
Micro-syringe Hamilton 80530
Peristaltic pump Tokyo Rikakikai Co., Ltd. 11914199
Vortex mixer Scientific Industries, Inc. SI-0286

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Israelachvili, J. N., Mitchell, D. J., Ninham, B. W. Theory of self-assembly of lipid bilayers and vesicles. Biochimica Et Biophysica Acta-Biomembranes. 470 (2), 185-201 (1977).
  2. Venable, R. M., Zhang, Y., Hardy, B. J., Pastor, R. W. Molecular dynamics simulations of a lipid bilayer and of hexadecane: an investigation of membrane fluidity. Science. 262 (5131), 223-226 (1993).
  3. Ide, T., Ichikawa, T. A novel method for artificial lipid-bilayer formation. Biosensors and Bioelectronics. 21 (4), 672-677 (2005).
  4. Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Lipid bilayer formation by contacting monolayers in a microfluidic device for membrane protein analysis. Analytical Chemistry. 78 (24), 8169-8174 (2006).
  5. Kongsuphol, P., Fang, K. B., Ding, Z. Lipid bilayer technologies in ion channel recordings and their potential in drug screening assay. Sensors and Actuators B: Chemical. 185, 530-542 (2013).
  6. Demarche, S., Sugihara, K., Zambelli, T., Tiefenauer, L., Voros, J. Techniques for recording reconstituted ion channels. Analyst. 136 (6), 1077-1089 (2011).
  7. Sakaguchi, N., Kimura, Y., Hirano-Iwata, A., Ogino, T. Fabrication of Au-nanoparticle-embedded lipid bilayer membranes supported on solid substrates. The Journal of Physical Chemistry B. 121 (17), 4474-4481 (2017).
  8. Schulz, M., Olubummo, A., Binder, W. H. Beyond the lipid bilayer: interaction of polymers and nanoparticles with membranes. Soft Matter. 8 (18), 4849-4864 (2012).
  9. Wang, J., Wei, Y., Shi, X., Gao, H. Cellular entry of graphene nanosheets: the role of thickness, oxidation and surface adsorption. RSC Advances. 3 (36), 15776-15782 (2013).
  10. Vögele, M., Köfinger, J., Hummer, G. Molecular dynamics simulations of carbon nanotube porins in lipid bilayers. Faraday Discussions. 209, 341-358 (2018).
  11. Kanomata, K., Deguchi, T., Ma, T., Haseyama, T., Miura, M., Yamaura, D., Tadaki, D., Niwano, M., Hirano-Iwata, A., Hirose, F. Photomodulation of electrical conductivity of a PCBM-doped free-standing lipid bilayer in buffer solution. Journal of Electroanalytical Chemistry. 832, 55-58 (2019).
  12. Barnoud, J., Rossi, G., Monticelli, L. Lipid Membranes as Solvents for Carbon Nanoparticles. Physical Review Letters. 112, 068102 (2014).
  13. Dichello, G. A., et al. Preparation of liposomes containing small gold nanoparticles using electrostatic interactions. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 105, 55-63 (2017).
  14. Sullivan, P., Heutz, S., Schultes, S. M., Jones, T. S. Influence of codeposition on the performance of CuPc−C60 heterojunction photovoltaic devices. Applied Physics Letters. 84 (7), 1210-1212 (2004).
  15. Miyata, T., Kawaguchi, S., Ishii, M., Minami, T. High sensitivity chlorine gas sensors using Cu−phthalocyanine thin films. Thin Solid Films. 425 (1-2), 255-259 (2003).
  16. Barrena, E., de Oteyza, D. G., Dosch, H., Wakayama, Y. 2D supramolecular self-assembly of binary organic monolayers. ChemPhysChem. 8 (13), 1915-1918 (2007).
  17. Xiao, K., et al. Surface-induced orientation control of CuPc molecules for the epitaxial growth of highly ordered organic crystals on graphene. Journal of the American Chemical Society. 135 (9), 3680-3687 (2013).
  18. Feng, X., Ma, T., Yamaura, D., Tadaki, D., Hirano-Iwata, A. Formation and characterization of air-stable lipid bilayer membranes incorporated with phthalocyanine molecules. The Journal of Physical Chemistry B. 123 (30), 6515-6520 (2019).
  19. Wu, Y., He, K., Ludtke, S. J., Huang, H. W. X-ray diffraction study of lipid bilayer membranes interacting with amphiphilic helical peptides: diphytanoyl phosphatidylcholine with alamethicin at low concentrations. Biophysical Journal. 68 (6), 2361-2369 (1995).
  20. Zaitseva, S. V., Bettini, S., Valli, L., Kolker, A. M., Borovkov, N. Y. Atypical film-forming behavior of soluble tetra-3-nitro-substituted copper phthalocyanine. ChemPhysChem. 20 (3), 422-428 (2019).
  21. Ghani, F., Gojzewski, H., Riegler, H. Nucleation and growth of copper phthalocyanine aggregates deposited from solution on planar surfaces. Applied Surface Science. 351, 969-976 (2015).

Tags

Химия Выпуск 159 Липидные билейеры органическая молекула тонкая пленка интерфейс воды/воздуха самосвал гибридная липидная мембрана
Самосвечение гибридных липидных мембран с гидрофобными органическими молекулами на водно-воздушном интерфейсе
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Feng, X., Ma, T., Tadaki, D.,… More

Feng, X., Ma, T., Tadaki, D., Hirano-Iwata, A. Self-Assembly of Hybrid Lipid Membranes Doped with Hydrophobic Organic Molecules at the Water/Air Interface. J. Vis. Exp. (159), e60957, doi:10.3791/60957 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter