Summary
Descriviamo un'iniezione intracisternache che impiega un ago piegato sulla punta che può essere stabilizzato al cranio, eliminando così il rischio di danni al parenchyma sottostante. L'approccio può essere utilizzato per la mappatura genetica del destino e manipolazioni delle cellule leptomeningeee e per il monitoraggio del movimento del fluido cerebrospinale.
Abstract
Il protocollo qui descritto descrive come iniettare soluzioni in modo sicuro e manuale attraverso la cisterna magna, eliminando il rischio di danni al parenchyma sottostante. I protocolli pubblicati in precedenza raccomandano l'utilizzo di aghi dritti che devono essere abbassati a un massimo di 1-2 mm dalla superficie durale. L'improvviso calo di resistenza una volta che la membrana durale è stata forata rende difficile mantenere l'ago in una posizione costante. Il nostro metodo, invece, impiega un ago piegato alla punta che può essere stabilizzato contro l'osso occipitale del cranio, impedendo così alla siringa di penetrare nel tessuto dopo la perforazione della membrana durale. La procedura è semplice, riproducibile e non causa disagio duraturo negli animali operati. Descriviamo la strategia di iniezione intracisternale nel contesto della mappatura genetica del destino delle cellule leptomeningeali vascolari. La stessa tecnica può, inoltre, essere utilizzata per affrontare una vasta gamma di questioni di ricerca, come sondare il ruolo dei leptomeningi nel neurosviluppo e la diffusione della meningite batterica, attraverso l'ablazione genetica dei geni putativamente implicati in questi fenomeni. Inoltre, la procedura può essere combinata con un sistema di infusione automatizzato per una consegna costante e utilizzato per monitorare il movimento del fluido cerebrospinale tramite iniezione di molecole fluorescenti etichettate.
Introduction
Le cellule leptomeningeali sono una popolazione fibroblasta di cellule organizzate in uno strato sottile sovrapponendo il cervello ed esprimendo geni implicati nel crosslinking collagene (ad esempio, Dcn e Lum), e nella creazione di una barriera rompi-meningea (ad esempio, Cldn11)1,2. Le cellule leptomeningee sono implicate in una vasta gamma di funzioni fisiologiche, dal rigoroso controllo sul drenaggio del liquido cerebrospinale3 alla guida di progenitori neurali nel cervello in via di sviluppo4,5. Uno studio recente ha anche proposto che i leptomeningi nel neonato possano ospitare cellule radiali simili a glia che migrano nel parenchyma cerebrale e si sviluppano in neuroni corticali funzionali6.
Le cellule leptomeningealsi si trovano in prossimità di astrociti di superficie e condividere con loro, così come altri astroglia parenchymal, espressione di connexin-30 (Cx30)7. La procedura chirurgica descritta di seguito consente l'etichettatura diffusa e specifica di queste cellule meningee attraverso una consegna una tantum di endoxife nella cisterna magna di topi transgenici che esprimono condizionalmente tdTomato in Cx30- cellule (cioè, utilizzando un sistema CreER-loxP per la mappatura del destino). Endoxifen è un metabolita attivo del Tamoxifeen e induce la ricombinazione delle cellule che esprimono CreER allo stesso modo di Tamoxifen. È, tuttavia, la soluzione consigliata per l'applicazione topica perché si dissolve in 5-10% DMSO, invece di alte concentrazioni di etanolo. Inoltre, endoxifen non attraversa la barriera cervello-meningea, consentendo in tal modo una ricombinazione specifica delle cellule leptomeningeali, senza etichettatura della popolazione+ astrogliale sottostante (vedi Risultati rappresentativi).
La tecnica qui presentata mira a iniettare manualmente e in modo sicuro il composto nel liquido cerebrospinale, attraverso l'accesso diretto alla cisterna magna. A differenza di altre procedure più invasive che richiedono craniotomia, questo approccio consente di infondere composti senza causare danni al cranio o al parenchyma cerebrale. Pertanto, non è associato all'induzione di reazioni infiammatorie innescate dall'attivazione di cellule glia parenchychimiche. Simile ad altre strategie di iniezione descritte primadi 8,9,10, l'approccio attuale si basa sull'esposizione chirurgica della membrana durale atlanto-occipital che copre la cisterna magna, dopo una dissezione smussata dei muscoli del collo sovrapposti. Tuttavia, a differenza di altre procedure, si consiglia l'uso di un ago piegato sulla punta, che può essere stabilizzato contro l'osso occipitale durante la somministrazione. Ciò eviterà il rischio che l'ago penda troppo in profondità e danneggi il cervelletto sottostante e la medulla.
Questa procedura chirurgica è compatibile con le indagini di tracciamento del lignaggio che mirano a mappare i cambiamenti nelle identità cellulari e le rotte migratorie attraverso strati parenchyschi. Può anche essere adattato agli studi di ablazione genetica che intendono sondare il ruolo delle cellule leptomeningeali nella salute e nella malattia, come il loro contributo allo sviluppo corticale5 o la diffusione della meningite batterica3,11. Infine, può essere utilizzato per monitorare il movimento del fluido cerebrospinale quando combinato con la consegna di traccianti fluorescenti in animali selvatici.
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Protocol
Le procedure chirurgiche qui presentate sono state approvate da Norra Djurf'ksetiska N'mnd di Stoccolma e realizzate in accordo con le specifiche fornite dall'istituto di ricerca (Karolinska Institute, Svezia).
NOT: L'iniezione intracisternale può essere adattata in modo flessibile per molteplici scopi di ricerca. Di seguito è riportata una procedura sviluppata per etichettare in modo efficiente le cellule leptomeningeali per la mappatura del destino basata sull'iniezione di endoxifeen in una linea di mouse transgenica che trasporta R26R-tdTomato12 e CreER, quest'ultima sotto il promotore Cx3013. L'etichettatura di questa popolazione di cellule può essere ottenuta attraverso l'iniezione di costrutti virali utilizzando la stessa procedura descritta di seguito. Infine, questo approccio può essere impiegato per tracciare il flusso del liquido cerebrospinale, mediante infusione di traccianti fluorescenti.
1. Preparazione del sistema di iniezione
NOT: Si consiglia di eseguire la procedura in una sala chirurgica adatta e in condizioni asettiche. Gli utensili chirurgici possono essere sterilizzati utilizzando il calore (autoclave, sterilizzatore di perline di vetro) o sanificati utilizzando un disinfettante chimico di alto livello se sono sensibili al calore. Risciacquare gli strumenti prima dell'uso quando si impiegano disinfezioni chimiche o lasciarli raffreddare quando sanificati con calore.
- Usando le pinze, piegare l'ago della siringa di iniezione a 30 gradi a 3 mm dalla punta.
NOT: Usa le siringhe Hamilton con un ago smussato da 30 G. - Preparare 1 mg/mL di soluzione endoxifen, diluita in 10% DMSO e riempire la siringa con l'ago piegato.
NOTA: Amministrare 5 -L del composto per garantire un'esposizione diffusa delle cellule meningeali nel topo adulto C57Bl/6j (ca. 25-30 g), anche se gli esperimenti pilota che testano diverse concentrazioni e volumi di iniezione possono essere necessari durante il trattamento di animali di età e ceppi diversi. - Regolare il supporto della testa del mouse in modo che il pezzo della bocca si trova a circa 30 gradi dalla superficie del tavolo chirurgico.
NOT: Un telaio stereotassico con fissazione a tre punti (cioè orecchie e bocca) può essere utilizzato anche per questa procedura. In questo caso, tuttavia, l'animale sarà fissato solo con il pezzo della bocca, mentre le barre dell'orecchio possono essere estese sotto gli arti anteriori dell'animale e possono essere utilizzate per sostenere il corpo dell'animale durante la procedura.
2. Induzione di anestesia
- Per gli anestetici iniettabili, utilizzare le concentrazioni e le modalità di somministrazione raccomandate dall'unità veterinaria dell'istituto locale.
- Per gli anestetici inalatori, come l'isoflurane, preparare l'unità di somministrazione secondo le specifiche del produttore.
- Con isoflurane, impostare la concentrazione del composto al 4% per l'induzione dell'anestesia.
- Consegnare l'aria ad una velocità di 400 mL/min.
- Lasciare che l'unità di anestesia riempia la camera con l'anestesia per alcuni minuti e posizionare il mouse nella camera in seguito.
NOT: Per gli esperimenti attuali, abbiamo usato topi transgenici maschi e femmine adulti (>2 mesi e circa 30 g) che trasportano Cx30-CreER e R26R-tdTomato e allevati su uno sfondo C57Bl/6j. - Monitorare l'animale durante l'induzione dell'anestesia. Il modello respiratorio dovrebbe rallentare quando il mouse è in anestesia completa.
- Togliere l'animale dalla camera e verificare la soppressione del riflesso della zampa pizzicando delicatamente le zampe posteriori.
NOT: Il riflesso può essere ancora presente, ma ritardato di un paio di secondi. In tal caso, riporre l'animale nella camera fino a ottenere la completa soppressione del riflesso della zampa. - Somministrare analgesico (ad esempio, Carprofen, 5 mg/kg attraverso l'iniezione sottocutanea) per aiutare la gestione post-operatoria del dolore.
3. Posizionamento dell'animale per la procedura
- Fissare la testa dell'animale sul supporto della testa. Per migliorare l'accessibilità alla cisterna magna, posizionare il corpo dell'animale a circa 30 gradi dalla superficie del tavolo e la testa titolata verso il basso, per stabilire un angolo di 120 gradi con il resto del corpo ed estendere la parte posteriore del collo per facilitare l'accesso alla cisterna magna (Figura 1A).
- Aggiungere asciugamani di carta sotto l'animale per sostenere il suo corpo durante tutta la procedura.
- Assicurare la consegna dell'anestesia attraverso il pezzo della bocca e ridurre la concentrazione di isoflurane al 2,5% e la consegna dell'aria a 200 ml/min.
- Applicare unguento oftalmico.
4. Esposizione della Cisterna Magna
- Rasare la parte posteriore del collo dell'animale e sanificare l'area con 70% etanolo e Betadine.
- Utilizzando forbici chirurgiche, eseguire un'incisione media (c. 7 mm di lunghezza) a partire dal livello dell'osso occipitale e estendendolo posteriormente.
- Separare delicatamente i muscoli superficiali del tessuto connettivo e del collo tirando lateralmente dalla linea mediana con pinzette a punta fine. Questo esporrà la membrana durale sovrapposta alla magna della cisterna, modellata come un triangolo invertito.
- Utilizzare lance sterili di assorbimento o tamponi di cotone per controllare eventuali emorragie risultanti.
- Posizionare un piccolo separatore chirurgico per mantenere da parte i muscoli del collo e consentire la visualizzazione della cisterna magna durante tutta la procedura.
5. Iniezione intracisternale
- Per ottenere l'accesso alla cisterna magna, identificare l'estremità caudale dell'osso occipitale e inserire l'ago precedentemente piegato immediatamente sotto.
NOT: Ci sarà un improvviso calo di resistenza come la membrana durale è forata. Tuttavia, la punta dell'ago penetrerà solo leggermente sotto la superficie meningea, grazie alla sua forma agganciata. - Una volta che la dura è stata perforata, lasciare che la punta piegata dell'ago penetri sotto la superficie durale tirando delicatamente la siringa verso l'alto e parallela al corpo dell'animale, al fine di "agganciare" l'ago al cranio (vedi Figura 1B). Ciò garantirà una migliore stabilità e impedirà all'ago di penetrare più in profondità, evitando così il rischio di danneggiare il cervelletto sottostante o la medulla.
- Iniettare lentamente il composto per evitare interferenze con il flusso naturale del liquido cerebrospinale.
NOT: A seconda dello scopo dell'esperimento, il tasso di infusione può variare. Se è richiesto un tasso di infusione lento e costante (ad esempio, quando si utilizza la procedura per tracciare il movimento del fluido cerebrospinale), può essere consigliabile utilizzare un sistema di microinfusione automatizzato in combinazione con la siringa. - Dopo l'iniezione, lasciare riposare l'ago in loco per 1 min e rimuoverlo con attenzione. Utilizzare pinze di punta fine per facilitare la retrazione dell'ago dalla sua posizione agganciata.
NOT: L'uso di un ago sottile (ad esempio, 30 G) non comporta danni sostanziali della membrana meningea e conseguente deflusso del liquido cerebrospinale. Se sono necessarie dimensioni di ago più grandi, si consiglia di arrestare la perdita di liquido applicando pressione presso il sito di iniezione utilizzando una punta di cotone sterile.
6. Conclusione della procedura e assistenza post-operatoria
- Rimuovere il separatore e consentire ai muscoli di tornare alla loro posizione originale sovrapponendo la membrana durale.
- Chiudere l'incisione cutanea con alcune gocce di adesivo cianoacrilato.
NOT: In alternativa, utilizzare suture assorbibili (ad esempio, suture in vicrino 5-0) e chiudere l'incisione cutanea con punti interrotti. - Applicare l'anestetico locale (ad es., 100 - L of 5% lidocaine) nel sito di incisione.
- Rimuovere l'animale dal supporto e posizionare in una gabbia pulita posizionata su un pad di riscaldamento. Monitorare l'animale fino a quando non riacquista conoscenza.
NOT: La procedura non dovrebbe causare dolore o disagio duraturo nell'animale. Tuttavia, il topo deve essere monitorato attentamente per i primi giorni postoperatori e le misure di sollievo dal dolore possono essere intraprese quando ritenuto necessario, e in conformità con le raccomandazioni fornite dall'unità veterinaria presso il vostro istituto.
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Representative Results
L'iniezione intracisternale di endoxifeen in topi transgenici che esprimono CreER sotto il promotore Cx30 sotto il promotore Cx3013 e un reporter fluorescente inducibile consente una ricombinazione specifica delle cellule leptomeningeali senza etichettare la superficie che esprime Cx30 e gli astrociti traditi vicini nella corteccia (Figura 1). Al fine di ottenere l'accesso alla cisterna magna, l'animale anestetizzato è posizionato con il suo corpo e la testa con un angolo di circa 120 gradi, permettendo così la parte posteriore del collo da allungare (Figura 1A). La porzione atlanto-occipital della membrana durale viene quindi esposta attraverso la dissezione smussata dei muscoli del collo, ottenendo così l'accesso alla magna della cisterna sottostante. Un'iniezione manuale sicura viene eseguita con un ago piegato a circa 30 gradi a 3 mm dalla punta. Ciò consente di tenere la siringa contro l'osso occipitale del cranio, migliorando così la stabilità durante la somministrazione (Figura 1B). Approfittando del movimento fisiologico del liquido cerebrospinale, la soluzione endoxifen viene distribuita in tutto lo spazio subaracnoideo per ricombinare in modo efficiente le cellule leptomeningeeee sovrapposte a bulbi olfattivi, corteccia e cervelletto (Figura 1C). Come dimostrato nella Figura 1, la soluzione non attraversa la barriera rompicapo-meningea e non entra in contatto con cellule astrogliali del parenchyma, al contrario della somministrazione sistemica attraverso gavage orale (2 mg/mL al giorno, in cinque giorni consecutivi; Figura 1C-E).
Figura 1: etichettatura specifica delle cellule leptomeningeali tramite iniezione intracisternale di endoxife. I gruppi A e B illustrano la procedura sviluppata per la somministrazione intracisternale. Al fine di ottenere l'accesso alla cisterna magna, la parte posteriore del collo dovrebbe essere allungata. L'animale anestesizzato è quindi posizionato ad un angolo approssimativo di 120 gradi tra il corpo e la testa, che è inclinato verso il basso (A). L'ago agganciato permette di fissare la siringa al cranio e di procedere in modo sicuro con una somministrazione manuale della soluzione (B). Pannello C mostra una sezione sagittale del cervello dopo la somministrazione intracisterna di endoxife in un modello murino transgenico che trasporta CreER sotto il promotore Cx30 e espressione inducibile di tdTomato reporter fluorescente. L'asterisco (-) contrassegna il sito di iniezione e dimostra l'assenza di danni operativi a seguito della procedura. Endoxifen induce selettivamente la ricombinazione genetica e l'espressione genica reporter nelle cellule dello strato meningeo sovrapponendo il bulbo olfattivo (Ob), la corteccia (Ctx) e il cervelletto (Cb). Solo pochi astrociti nel midbrain (punta di freccia) vengono ricombinati dopo la consegna intracisternale di endoxife. I pannelli D-F sono ingrandimenti dell'area in scatola in C in animali trattati con soluzione veicolo (D), sottoposti a iniezione intracisternale di endoxifen (E) o trattati sistemicamente attraverso gavage orale (F). Mentre la somministrazione intracisternale etichetta specificamente le celle dei leptomeningi, la consegna sistemica porta anche alla ricombinazione degli astrociti che esprimono Cx30 in tutti gli strati corticali (da L1 a L6). Il gruppo G illustra la ricombinazione delle celle leptomeningeali (asterisco), identificate attraverso la reattività di Pdgfra, dopo l'iniezione intracisternale. Al contrario, gli astrociti superficiali (freccia) e parenchymal (freccia) che esprimono Gfap rimangono senza etichetta. Barre della scala, ovvero 1.000 m (C), 150 m (D-F) e 40 m (G). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il protocollo qui descritto presenta una procedura semplice e riproducibile per etichettare le cellule leptomeningeali per la mappatura del destino. Usiamo l'iniezione intracisternale di endoxife, un metabolita attivo di Tamoxifen, per indurre l'espressione del reporter fluorescente tdTomato in Cx30-CreER; Topo R26R-tdTomato12,13.
Rispetto ad altri protocolli utilizzati per ottenere l'accesso al liquido cerebrospinale attraverso la cisterna magna9, il nostro approccio garantisce un'amministrazione manuale sicura grazie all'uso di un ago piegato che può essere stabilizzato all'osso occipitale del cranio. Una volta che la membrana durale della cisterna magna è perforata, c'è un improvviso calo della resistenza. A questo punto, altri protocolli raccomandano di abbassare l'ago ad un massimo di 1-2 mm dalla superficie durale e di mantenerlo manualmente in una posizione costante per tutta la procedura9. A differenza di un ago dritto, l'ago agganciato è fissato al cranio e non può penetrare più in profondità nel tessuto, eliminando così il rischio di danneggiare il cervelletto sottostante o la medulla. Il nostro sistema agganciato consente una somministrazione più sicura della soluzione, in particolare quando si utilizza una lentezza di infusione.
La procedura qui descritta non dovrebbe causare disagio duraturo all'animale operato. Tuttavia, è necessario prestare attenzione quando si amministrano grandi volumi di soluzione. Un tasso di consegna veloce può portare ad alterazioni della pressione intracranica e allo sviluppo di sintomi neurologici nel topo. Suggeriamo di iniettare volumi fino a 5-10 gradi l per evitare questo rischio o di assemblare la siringa su un micromanipolatore che ha il controllo sulla velocità di consegna. Ciò è particolarmente importante quando si adatta questa procedura allo studio del movimento del fluido cerebrospinale. Si raccomanda di evitare l'iniezione manuale e di utilizzare una lentezza di infusione (ad es., 1 l/min) per evitare un'eccessiva perturbance del flusso fisiologico. Inoltre, il presente protocollo è progettato per eseguire una singola iniezione intracisternale, che etichetta in modo efficiente le cellule leptomeningeal. Si consiglia di prendere in considerazione le specifiche etiche, così come la capacità dell'animale di sopportare più procedure chirurgiche, se lo studio richiede la somministrazione ripetuta di composti.
Oltre alla somministrazione endoxifeen, la tecnica qui descritta può essere combinata con la consegna di virus che trasportano geni reporter sotto un promotore leptomeningeale specifico delle cellule. Inoltre, l'attuale sistema di somministrazione può essere utilizzato per tracciare acutamente il flusso di liquido cerebrospinale10. A tale scopo, i traccianti fluorescenti come Cell Tracker (ca. 700 Da) o Dextran Fluorescin (ca. 3000 Da) possono essere consegnati attraverso la cisterna magna e la siringa può essere montata su un micromanipolatore per consentire il controllo sul tasso di infusione del composto. Questo può essere importante al fine di evitare un'eccessiva perturbazione del movimento naturale del fluido cerebrospinale negli esperimenti di tracciamento.
Le cellule leptomeningeee esprimono claudine-11 e altre proteine associate a giunzioni strette, che contribuiscono alla creazione di una barriera fluida cerebrospinale nel sangue nello spazio subaracnoideo e al controllo omeostatico del fluido e della circolazione3 . L'approccio qui delineato può essere combinato con l'ablazione condizionale dei geni implicati nel controllo giunzionale della barriera per sondare il loro ruolo putativo nel mantenere la composizione del liquido cerebrospinale rigorosamente regolata. Inoltre, le cellule dei leptomeningi svolgono un ruolo nello sviluppo, dove forniscono segnali estrinseci che contribuiscono alla generazione di neuroni corticali5 e alla formazione di connessioni callosali4. Il nostro metodo può anche essere adattato per ottenere ulteriori informazioni sul ruolo dei leptomeninges nel corretto sviluppo corticale e nella ricerca del percorso assonale. Infine, batteri come Neisseria meningitidis hanno dimostrato di attaccarsi alle cellule leptomeningeali umane14, e modelli animali per la malattia sono stati sviluppati per studiare l'invasione batterica e conseguente danno neurologico15,16, anche se i ligandi superficiali responsabili dell'infezione devono ancora essere completamente determinati. La ricombinazione selettiva delle cellule leptomeningeeee conseguite con la nostra tecnica potrebbe aiutare l'identificazione dei siti di adesione utilizzati dai batteri per infettare lo spazio subaracnoideo. Da notare che il protocollo presentato può richiedere modifiche per tenere conto dei requisiti etici e di sicurezza aggiuntivi necessari per eseguire procedure che comportino infezioni batteriche.
In conclusione, l'iniezione intracisternale qui descritta rappresenta un approccio chirurgico semplice e ben tollerato che offre l'opportunità di indagare una vasta gamma di funzioni del fluido leptomeningeeeeeeeee e cerebrospinale, quando combinato con approcci di modifica genica o infusione di molecole etichettate.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni del Consiglio svedese della ricerca, della Società svedese contro il cancro, della Fondazione svedese per la ricerca strategica, di Knut och Alice Wallenbergs Stiftelse e del programma di ricerca strategica nelle cellule staminali e nella medicina rigenerativa presso l'Istituto Karolinska (StratRegen).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia unit | Univentor 410 | 8323102 | Complete of vaporizer, chamber, and tubing that connects to chamber and mouse head holder |
| Anesthesia (Isoflurane) | Baxter Medical AB | 000890 | |
| Betadine | Sigma-Aldrich | PVP1 | |
| Carprofen | Orion Pharma AB | 014920 | Commercial name Rymadil |
| Cyanoacrylate glue | Carl Roth | 0258.1 | Use silk 5-0 sutures, in alternative |
| Medbond Tissue Glue | Stoelting | 50479 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Endoxifen | Sigma-Aldrich | E8284 | |
| Ethanol 70% | Histolab | 01370 | |
| Hamilton syringe (30 G beveled needle) | Hamilton | 80300 | |
| Lidocaine | Aspen Nordic | 520455 | |
| Mouse head holder | Narishige International | SGM-4 | With mouth piece for inhalational anhestetics. Alternatively, use a stereotactic frame |
| Scissors | Fine Science Tools | 15009-08 | |
| Shaver | Aesculap | GT420 | |
| Sterile absorption spears | Fine Science Tools | 18105-01 | Sterile cotton swabs are also a good option |
| Surgical separator | World Precision Instrument | 501897 | |
| Tweezers | Dumont | 11251-35 | |
| Viscotears | Bausch&Lomb Nordic AB | 541760 |
References
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