Summary
Cette méthode utilise l’imagerie par spectrométrie de masse (MSI) pour comprendre les processus métaboliques des feuilles de S. alba exposées aux xénobiotiques. La méthode permet la localisation spatiale des composés d’intérêt et de leurs métabolites prédits dans des tissus spécifiques et intacts.
Abstract
La méthode présentée utilise l’imagerie par spectrométrie de masse (MSI) pour établir le profil métabolique des feuilles de S. alba lorsqu’elles sont exposées à des xénobiotiques. À l’aide d’une approche non ciblée, les métabolites végétaux et les xénobiotiques d’intérêt sont identifiés et localisés dans les tissus végétaux afin de découvrir des modèles de distribution spécifiques. Ensuite, la prédiction in silico des métabolites potentiels (c’est-à-dire les catabolites et les conjugués) à partir des xénobiotiques identifiés est effectuée. Lorsqu’un métabolite xénobiotique est situé dans le tissu, le type d’enzyme impliqué dans son altération par la plante est enregistré. Ces résultats ont été utilisés pour décrire différents types de réactions biologiques survenant dans les feuilles de S. alba en réponse à l’accumulation xénobiotique dans les feuilles. Les métabolites ont été prédits en deux générations, permettant la documentation des réactions biologiques successives pour transformer les xénobiotiques dans les tissus foliaires.
Introduction
Les xénobiotiques sont largement distribués dans le monde entier en raison des activités humaines. Certains de ces composés sont solubles dans l’eau et absorbés par le sol1,et entrent dans la chaîne alimentaire lorsqu’ils s’accumulent dans les tissus végétaux2,3,4. Les plantes sont consommées par les insectes et les herbivores, qui sont la proie d’autres organismes. L’ingestion de certains xénobiotiques et leur impact sur la santé d’une plante ont été décrits5,6,7,8,mais seulement récemment au niveau tissulaire9. Par conséquent, on ne sait toujours pas où ni comment le métabolisme des xénobiotiques se produit, ni si des métabolites végétaux spécifiques sont corrélés à l’accumulation de plantes xénobiotiques dans des tissus spécifiques10. De plus, la plupart des recherches ont négligé le métabolisme des xénobiotiques et de leurs métabolites dans les plantes, de sorte que l’on sait peu de choses sur ces réactions dans les tissus végétaux.
Proposé ici est une méthode pour étudier les réactions enzymatiques dans des échantillons biologiques qui peuvent être associés à la localisation tissulaire des substrats et des produits des réactions. La méthode peut dessiner le profil métabolique complet d’un échantillon biologique dans une expérience, car l’analyse n’est pas ciblée et peut être étudiée à l’aide de listes personnalisées d’analytes d’intérêt. Une liste de candidats suivis dans le jeu de données d’origine est fournie. Si un ou plusieurs analytes d’intérêt sont notés dans l’échantillon, la localisation tissulaire spécifique peut fournir des informations importantes sur les processus biologiques connexes. Les analytes d’intérêt peuvent ensuite être modifiés in silico en utilisant les lois biologiques pertinentes pour rechercher d’éventuels produits/métabolites. La liste des métabolites obtenus est ensuite utilisée pour analyser les données originales en identifiant les enzymes impliquées et en localisant les réactions dans les tissus, aidant ainsi à comprendre les processus métaboliques qui se produisent. Aucune autre méthode ne fournit d’informations sur les types de réactions survenant dans les échantillons biologiques, la localisation des composés d’intérêt et leurs métabolites connexes. Cette méthode peut être utilisée sur n’importe quel type de matériel biologique une fois que des tissus frais et intacts sont disponibles et que les composés d’intérêt peuvent être ionisés. Le protocole proposé a été publié dans Villette et al.12 et est détaillé ici pour être utilisé par la communauté scientifique.
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Protocol
1. Préparation de l’échantillon
- Obtenir l’échantillon biologique et le garder frais et intact (p. ex., ne pas le forcer dans un tube) ou le congeler. Le protocole proposé s’applique à tout type d’échantillon biologique solide (c.-à-d. tissus végétaux, animaux ou humains) afin de localiser les composés dans des tissus spécifiques.
- Refroidir un cryomicrotome à -20 °C. Gardez le porte-échantillon et la lame à la même température.
- Si nécessaire, intégrez l’objet dans un support d’incorporation M1 pour le préserver pendant la coupe.
- Versez une matrice dans un moule en plastique placé dans la chambre cryomicrotome. Ajoutez rapidement l’échantillon et versez un peu plus de support d’intégration pour le couvrir. Maintenez l’échantillon au centre du moule pendant que la matrice se solidifie tout en refroidissant.
REMARQUE : L’incorporation n’est pas nécessaire pour tous les objets biologiques. Les objets homogènes tels que les cerveaux de souris n’ont pas besoin de milieu d’intégration et peuvent être coupés congelés.
- Versez une matrice dans un moule en plastique placé dans la chambre cryomicrotome. Ajoutez rapidement l’échantillon et versez un peu plus de support d’intégration pour le couvrir. Maintenez l’échantillon au centre du moule pendant que la matrice se solidifie tout en refroidissant.
- Placez l’échantillon incorporé ou congelé sur le support du cryomicrotome et coupez-le avec une lame tranchante. Une épaisseur de 5 à 30 μm est bonne pour les échantillons de plantes, qui sont difficiles à couper en raison de leur hétérogénéité. Adaptez l’épaisseur et la température de coupe à l’échantillon, en faisant plusieurs coupes pour trouver les meilleures conditions. Dans l’exemple fourni, l’échantillon a été coupé à -20 °C. Envisager de maintenir l’échantillon en dessous de 0 °C pour éviter la dégradation de l’échantillon.
REMARQUE: L’utilisation d’un microscope binoculaire placé à côté du cryomicrotome peut aider à déterminer la qualité des tranches. Les tissus doivent rester intacts. - Déplacez soigneusement la tranche sur une lame recouverte d’ITO à l’aide d’une pince ou d’un petit pinceau, puis placez un doigt sous la lame pour réchauffer et sécher l’échantillon. Conservez la lame dans la chambre du cryomicrotome jusqu’à ce que tous les échantillons soient prêts. Sortez lentement la glissière de la chambre pour éviter les chocs thermiques.
REMARQUE: Pour vérifier de quel côté de la diapositive est revêtu d’ITO, placez une goutte d’eau sur la glissière à température ambiante (RT). La goutte restera ronde sur le côté enduit d’ITO ou s’aplatira du côté non couché. - Dessinez des marques sur la diapositive à l’aide d’un stylo marqueur mince ou d’un fluide correcteur et numérisez-la avec un scanner haute résolution avant le dépôt matriciel. Les marques seront utilisées pour déterminer la position exacte de l’échantillon sur la lame lorsqu’il est dans le spectromètre de masse. La meilleure façon d’obtenir des points de référence précis est de dessiner une croix.
2. Dépôt matriciel
- Préparer la matrice MALDI : peser 70 mg de matrice d’acide α-cyano-4-hydroxycinnamique (HCCA) et la diluer dans 10 mL d’une solution d’eau et de méthanol (50:50) avec 0,2 % de TFA. Soniquez la matrice pendant 10 minutes à RT. Il peut y avoir une matrice très solide après la sonication.
REMARQUE: Différents types de matrices MALDI peuvent être utilisés en fonction des analytes d’intérêt. - Nettoyez le robot de dépôt matriciel avec 100% de méthanol.
- À l’aide de méthanol et d’une lingette de précision, nettoyez la lame, en maintenant les échantillons sans les toucher et sans enlever les marques. Ajoutez une lame de couverture propre sur la lame dans une zone sans échantillon. Cette partie de la lame est ensuite placée sur le détecteur optique pour suivre le dépôt de matrice.
REMARQUE: Pour suivre optiquement l’épaisseur de la matrice, la lame et la lame de couverture doivent être très propres. - Utilisez le robot pour le dépôt matriciel : placez seulement 6 mL de la solution matricielle dans le réservoir et ajoutez 2 mL de méthanol à 100 % pour un volume total de 8 mL.
REMARQUE: L’enregistrement de l’épaisseur de la matrice le long du dépôt est automatique et peut être récupéré à l’aide d’une clé USB. Le développement d’une méthode de pulvérisation n’est pas détaillé ici.
3. Acquisition de données
- Placez 1 μL de la matrice sur une plaque MALDI pour étalonner le spectromètre de masse en utilisant les pics de la matrice comme références. Le développement d’une méthode d’acquisition sur le spectromètre de masse n’est pas détaillé ici.
- Insérez la plaque MALDI dans la source, cliquez sur "Load Target" dans le logiciel ftmsControl, et attendez que la plaque soit chargée.
- Choisissez la position du spot matriciel en cliquant sur le spot dans l’image représentant la plaque MALDI.
- Indiquez le nom de l’échantillon et le dossier dansl’onglet" Sample Info " du logiciel.
- Commencez l’acquisition en cliquant sur "Acquisition« .
- Déplacez légèrement la plaque pendant l’acquisition à l’aide du pointeur de la souris sur l’onglet "VIDÉO MALDI" afin que le laser pointe vers différents endroits.
- Une fois l’acquisition terminée, allez dans l’onglet "Étalonnage« , choisissez la liste d’étalonnage HCCA en mode quadratique et cliquez sur Automatique. Le résultat global de l’étalonnage est indiqué dans la fenêtre "Calibration Plot" et doit être inférieur à 0,2 ppm pour un SolariX XR 7T.
- Si l’étalonnage est bon, cliquez sur "Accepter" et enregistrez la méthode.
- Une fois le dépôt matriciel sur les échantillons terminé, placez la diapositive dans un adaptateur de diapositive et récupérez la position des marques à l’aide d’un couvercle en plastique.
- Dans le logiciel flexImaging, configurez une nouvelle exécution d’imagerie à l’aide de la première fenêtre qui s’ouvre avec le logiciel.
- Nommez l’exécution de la création d’images, sélectionnez le répertoire de résultats, puis cliquez sur Suivant.
- Indiquez la taille du raster (c’est-à-dire la région de mesure définie par l’utilisateur), choisissez la méthode à utiliser (calibrée à la section 3.1), puis cliquez sur Suivant.
- Chargez l’image optique de la diapositive obtenue à l’étape 1.6 après avoir numérisé la diapositive et cliquez sur Suivant.
- L’image s’ouvre dans une fenêtre plus large. Utilisez les repères sur la diapositive pour enseigner la position des diapositives : dans ftmsControl, placez la cible de la fenêtre vidéo MALDI sur la position exacte d’une marque, puis revenez à felxImaging et cliquez exactement sur le même point sur l’image optique. Répétez cette opération pour trois points indépendants. Le couvercle en plastique portant les marques est placé sur une plaque MALDI pour retrouver sa position et faciliter l’enseignement.
REMARQUE: Si les marques ont été faites avec un marqueur, l’ajout de liquide de correction blanc à l’arrière de la diapositive peut les faire ressortir pendant l’enseignement.
- Dessinez les régions d’intérêt dans les échantillons du logiciel flexImaging à l’aide des outils "Ajouter des régions de mesure« .
- Enregistrez l’exécution de l’imagerie et une "Séquence AutoXecute" si plusieurs échantillons doivent être analysés.
- Lancez une séquence en utilisant "AutoXecute Batch Runner" si plusieurs échantillons sont analysés.
Remarque : synchronisez les données régulièrement à un emplacement sécurisé.
4. Traitement des données
- Importez les données brutes dans le logiciel de visualisation (SCiLS Lab) et créez un jeu de données. Cela se fait en deux étapes distinctes dans ce logiciel.
- Utilisez l’outil "Batch Importer" et sélectionnez les données brutes, indiquez le répertoire cible, et cliquez sur "Importer« .
- Après l’importation, plusieurs jeux de données peuvent être combinés pour une analyse plus approfondie. Pour combiner des jeux de données, utilisez le "Fichier| Nouveau | Jeu de données" outil.
- Sélectionnez le type d’instrument utilisé pour l’acquisition, ajoutez les jeux de données importés en cliquant sur "+« , et disposez les images en cliquant et en faisant glisser les objets.
- Vérifiez les paramètres de la plage de masse ou modifiez-les si nécessaire en indiquant la plage d’intérêt. Cliquez sur Suivant pour afficher le résumé de l’importation et lancer l’importation.
- Visualisez le m/z d’intérêt dans les différents tissus d’un échantillon et/ou dans différents échantillons. Cliquez simplement sur les spectres pour sélectionner le m/z d’intérêt ou tapez la valeur dans la case m/z .
- Effectuer des tests statistiques si nécessaire pour rechercher des valeurs colocalisées ou discriminantes entre différents tissus et/ou différents échantillons afin de déterminer le m/z d’intérêt. Les outils sont disponibles dans le menu "Outil" et ne seront pas décrits dans ce protocole.
- Exportez le m/z d’intérêt (par exemple, composés discriminants colocalisés) en tant que fichier .csv à partir de l’onglet Objet. L’ensemble du jeu de données peut également être exporté s’il n’est pas trop volumineux (c’est-à-dire, un maximum de 60 000 lignes). Cliquez sur l’icône "Exporter" sur le côté droit de la région d’intérêt indiquée par une flèche rouge.
- Importez le fichier .csv pour créer un jeu de données dans le logiciel d’annotation (Metaboscape). Cliquez sur "Projets | Importer un projet CSV« . Sachez que seul le m/z exact sera pris en compte et que le profil isotopique est perdu.
REMARQUE : la version du logiciel 5.0 permet l’importation directe de données à partir du logiciel de visualisation, ce qui permet une annotation plus précise, car le profil isotopique peut être pris en compte. - Annoter avec des listes d’analytes sur mesure, qui peuvent être dérivées de bases de données accessibles au public. Un modèle est donné par le logiciel pour créer des listes d’analytes.
- Utilisez le logiciel de prédiction (Metabolite Predict) pour effectuer une prédiction in silico des métabolites des composés annotés. La formule développée du composé d’intérêt est nécessaire, soit dessinée par l’utilisateur dans le logiciel, soit importée sous la forme d’un fichier .mol. Ensuite, la méthode est un protocole simple étape par étape.
- Récupérez la liste des métabolites, créez une liste d’analytes et utilisez-la dans le logiciel d’annotation pour annoter les données brutes avec les métabolites prédits. Alternativement, si la liste des métabolites est courte, recherchez-la manuellement à l’étape 4.8.
- Visualisez la distribution tissulaire des métabolites dans les données brutes du logiciel de visualisation.
- Récupérez les noms des enzymes impliquées dans les processus métaboliques dans le logiciel de prédiction en cliquant avec le bouton droit sur le métabolite d’intérêt prédit.
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Representative Results
Ce protocole a été appliqué aux feuilles fraîches échantillonnées d’un arbre de S. alba exposé aux xénobiotiques dans l’environnement. Le processus est illustré à la figure 1. La première étape consiste à préparer de fines tranches de l’échantillon d’intérêt. Les échantillons de plantes sont souvent plus difficiles à couper que les échantillons d’animaux, car les tissus sont hétérogènes et peuvent contenir de l’eau et/ou de l’air. Cette difficulté est traitée à l’aide d’un milieu d’incorporation, qui forme un bloc homogène autour de l’échantillon. Le dépôt matriciel est facilité par l’utilisation d’un robot, évitant la manipulation de la main et assurant des résultats reproductibles. L’épaisseur de la couche matricielle MALDI est suivie tout au long du processus et peut être enregistrée. L’acquisition de données nécessite d’apprendre à manipuler un spectromètre de masse à haute résolution et à adapter la méthode au type d’échantillons et de composés étudiés. Les données brutes sont importées dans un logiciel de visualisation pour rechercher les composés d’intérêt et afficher leur localisation tissulaire. Les composés discriminatifs ou colocalisés peuvent être trouvés à l’aide d’outils statistiques disponibles dans le logiciel. A cette étape, seuls les m/z exacts des composés sont connus. Les composés d’intérêt sont ensuite exportés vers le logiciel d’annotation, qui peut comparer le m/z exact avec une liste personnalisée de composés d’intérêt définis par l’utilisateur. Si le m/z exact correspond au m/z d’un composé d’intérêt, il est annoté. Dans le cadre d’une étude de profil métabolique, les composés annotés sont sélectionnés pour la prédiction in silico des métabolites. Les types de règles de réaction biologique utilisées pour générer des métabolites sont facilement choisis par l’utilisateur, ainsi que le nombre de générations sur lesquelles les métabolites sont prédits. La liste des métabolites prédits peut être utilisée dans le logiciel d’annotation pour rechercher des correspondances entre les données brutes exactes m/z et les métabolites prédits m/z (Figure 1). Les métabolites annotés peuvent être recherchés dans le logiciel de visualisation pour obtenir leur localisation tissulaire (Figure 2). Les enzymes impliquées dans le métabolisme des composés d’origine d’intérêt peuvent être récupérées pour tirer les réactions métaboliques survenant dans l’échantillon biologique(figure 3).
Dans cet exemple, le médicament telmisartan a été identifié dans les feuilles de la plante; il a été distribué dans tous les tissus. Les métabolites du telmisartan ont été prédits et recherchés dans les données brutes. Les annotations ont montré qu’un métabolite de première génération (I) a été détecté dans les tissus internes des feuilles et dégradé en métabolites de deuxième génération (II), qui ont été localisés dans les tissus internes ou ont été plus généralement distribués dans tous les tissus foliaires (Figure 2). Ces résultats suggèrent une réaction métabolique active dans les feuilles pour dégrader le telmisartan. Le procédé a été appliqué à plusieurs composés d’intérêt annotés dans les feuilles, et les enzymes impliquées dans les réactions ont été récupérées pour étudier leur rôle dans la réponse de la plante à l’accumulation de xénobiotiques. Cela donne un aperçu des enzymes impliquées dans le métabolisme des xénobiotiques chez les feuilles de S. alba (Figure 3).
Figure 1. Structure générale de la méthode. Un échantillon frais est coupé et placé sur une lame recouverte d’ITO pulvérisée avec la matrice MALDI appropriée. L’acquisition de MALDI fournit des données brutes à partir desquelles la localisation dans le tissu peut être observée avec le logiciel SCiLS Lab. Metaboscape est utilisé pour l’annotation, et Metabolite Predict est utilisé pour la prédiction des métabolites (c’est-à-dire les catabolites et les conjugués). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Exemple des résultats obtenus sur des feuilles de S. alba exposées aux xénobiotiques. Telmisartan a été identifié dans les feuilles de la plante et visualisé dans tous les tissus. Des métabolites de Telmisartan ont été prévus et annotés sur les données brutes pour visualiser leur localisation de tissu. Le métabolite de première génération (I)C33H32N4O3 a été localisé principalement dans les tissus internes, tandis que les métabolites de deuxième génération (II) étaient parfois plus généralement distribués. Ce chiffre a été adapté avec la permission de Villette et al.12. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Profil enzymatique global proposé pour les réactions potentielles survenant dans les feuilles de S. alba en réponse à l’exposition aux xénobiotiques. La prédiction et l’annotation du métabolite sur l’objet d’intérêt ont suggéré les réactions enzymatiques potentielles responsables du métabolisme du composé d’intérêt. Ce chiffre a été adapté avec la permission de Villette et al.12. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
La partie critique de ce protocole est la préparation de l’échantillon: l’échantillon doit être doux et intact. La coupe est la partie la plus difficile, car la température et l’épaisseur de l’échantillon peuvent varier en fonction du type d’échantillon étudié. Les tissus animaux sont généralement homogènes et plus faciles à couper. Les échantillons de plantes incorporent souvent différentes structures et sont donc plus difficiles à garder intacts car la lame rencontre des tissus vasculaires mous, durs ou vides. Il est fortement recommandé d’utiliser des tissus frais lorsque vous travaillez avec des échantillons de plantes pour éviter la formation de glace dans les tissus hydrophiles et leur destruction. Les tranches doivent être déplacées doucement lorsqu’elles sont déposées sur la lame recouverte d’ITO. La matrice MALDI a été légèrement diluée pour éviter le colmatage de la feuille pulvérisée avec des cristaux matriciels, ce qui peut se produire si les 2 mL de méthanol à 100% ne sont pas ajoutés à l’étape 2.4.
Cette méthode offre un protocole facile de préparation d’échantillons d’une journée qui fournit des résultats reproductibles grâce à l’utilisation d’un robot pour le dépôt matriciel MALDI. Le protocole proposé nécessite une compétence en coupe tissulaire et en imagerie par spectrométrie de masse et ne s’applique qu’aux composés qui peuvent être ionisés. Cependant, il fournit une identification moléculaire sans avoir besoin d’étiquetage tel qu’utilisé en immunohistochimie11. Une sensibilité élevée est obtenue car les composés sont directement ionisés dans les tissus ou cellules, évitant ainsi les effets de dilution produits par un protocole d’extraction12. Les échantillons sont analysés de manière non ciblée, ce qui permet un profilage à grande échelle des composés endogènes ou xénobiotiques dans les échantillons. Par conséquent, les réponses biologiques aux composés exogènes peuvent être suivies. La prédiction in silico des métabolites couplés à l’analyse non ciblée ajoute une autre dimension à l’imagerie par spectrométrie de masse classique, car les réactions métaboliques peuvent être surveillées sans connaissance a priori des composés exogènes qui s’accumuleront dans les tissus. À ce jour, seuls des composés connus et quelques métabolites ont été suivis avec cette méthode (p. ex. médicaments d’intérêt administrés à des rats)13. Avec le protocole proposé, les composés originaux et leurs métabolites peuvent être localisés dans les tissus, et les réponses biologiques à l’accumulation des composés exogènes et/ou de leurs métabolites peuvent être suivies.
Ce protocole ne s’applique pas seulement à la réponse des plantes aux xénobiotiques, mais peut également être utilisé pour comprendre le métabolisme animal en réponse aux médicaments, pour suivre les interactions plantes/champignons, la réponse des plantes aux stress biotiques ou abiotiques, ou pour comprendre l’évolution des maladies, révélant les processus métaboliques dans les tissus d’intérêt.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions Charles Pineau, Mélanie Lagarrigue et Régis Lavigne pour leurs trucs et astuces concernant la préparation d’échantillons pour l’imagerie MALDI d’échantillons de plantes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cover slips | Bruker Daltonics | 267942 | |
| Cryomicrotome | Thermo Scientific | ||
| Excel | Microsoft corporation | ||
| flexImaging | Bruker Daltonics | ||
| ftmsControl | Bruker Daltonics | ||
| GTX primescan | GX Microscopes | ||
| HCCA MALDI matrix | Bruker Daltonics | 8201344 | |
| ImagePrep | Bruker Daltonics | ||
| ITO-coated slides | Bruker Daltonics | 237001 | |
| M1-embedding matrix | ThermoScientific | 1310 | |
| Metabolite Predict | Bruker Daltonics | ||
| Metaboscape | Bruker Daltonics | ||
| Methanol | Fisher Chemicals | No specific reference needed | |
| MX 35 Ultra blades | Thermo Scientific | 15835682 | |
| Plastic molds | No specific reference needed | ||
| SCiLS Lab | Bruker Daltonics | ||
| SolariX XR 7Tesla | Bruker Daltonics | The method proposed is not limited to this instrument | |
| Spray sheets for ImagePrep | Bruker Daltonics | 8261614 | |
| TFA | Sigma Aldrich | No specific reference needed |
References
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