Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Overvågning af protein-RNA-interaktionsdynamik in vivo ved høj tidsmæssig opløsning ved hjælp af χCRAC

Published: May 9, 2020 doi: 10.3791/61027
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1, 1, 4, 4, 3, 1
1Centre for Engineering Biology, University of Edinburgh, 2Institute of Cell Biology, University of Edinburgh, 3Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, 4UVO3 Ltd.

ERRATUM NOTICE

Summary

Kinetisk tværbinding og analyse af cDNA er en metode, der muliggør undersøgelse af dynamikken i protein-RNA-interaktioner i levende celler ved høj tidsmæssig opløsning. Her beskrives protokollen detaljeret, herunder vækst af gærceller, UV-tværbinding, høst, proteinrensning og næste generations sekventeringsbiblioteksforberedelsestrin.

Abstract

Interaktionen mellem RNA-bindende proteiner (RBP'er) og deres RNA-substrater udviser fluiditet og kompleksitet. Inden for sin levetid kan et enkelt RNA være bundet af mange forskellige RBP'er, der regulerer dets produktion, stabilitet, aktivitet og nedbrydning. Som sådan er der gjort meget for at forstå dynamikken, der eksisterer mellem disse to typer molekyler. Et særligt vigtigt gennembrud kom med fremkomsten af 'cross-l inking and immunoprecipitation' (CLIP). Denne teknik tillod streng undersøgelse af, hvilke RNA'er der er bundet af en bestemt RBP. Kort sagt er proteinet af interesse UV-tværbundet til dets RNA-substrater in vivo, oprenset under meget strenge betingelser, og derefter omdannes RNA'erne, der er kovalent tværbundet til proteinet, til cDNA-biblioteker og sekventeres. Siden grundlæggelsen er der udviklet mange afledte teknikker for at gøre CLIP egnet til bestemte fagområder. Imidlertid er tværbinding ved hjælp af ultraviolet lys notorisk ineffektiv. Dette resulterer i forlængede eksponeringstider, der gør den tidsmæssige undersøgelse af RBP-RNA-interaktioner umulig. For at løse dette problem har vi for nylig designet og bygget meget forbedrede UV-bestrålings- og cellehøstningsenheder. Ved hjælp af disse nye værktøjer udviklede vi en protokol til tidsopløste analyser af RBP-RNA-interaktioner i levende celler ved høj tidsmæssig opløsning: Kinetisk CR-oss-binding og Analysis of cDNAs (χCRAC). Vi brugte for nylig denne teknik til at studere rollen som gær RBP'er i næringsstofstresstilpasning. Dette manuskript giver et detaljeret overblik over χCRAC-metoden og præsenterer de seneste resultater, der er opnået med Nrd1 RBP.

Introduction

RNA'er er ofte afhængige af RBP'er for at udøve deres funktion, hvilket har ført til stor interesse for at forstå dynamikken mellem disse molekyler. Mange RBP'er er blevet identificeret i en lang række organismer. Det har dog altid været notorisk vanskeligt at studere RBP-RNA-interaktioner in vivo. Et stort gennembrud i studiet af sådanne interaktioner kom med fremkomsten af CLIP1. Denne metode anvender ultraviolet (UV, 254 nm) bestråling til at inducere kovalente bindinger mellem RBP'er og deres direkte bundne RNA'er (dvs. nul-distance tværbinding). Derefter immunrenses RBP af interesse under strenge betingelser for at sikre, at kun RNA'er, der er kovalent tværbundet til proteinerne, identificeres. Bundne RNA'er fordøjes derefter delvist med RNaser og omdannes derefter til cDNA-biblioteker til sekventering. Den høje oprensningsstrenghed er vigtig, da den i høj grad øger specificiteten af protein- og RNA-gendannelse, hvilket også forbedres yderligere gennem SDS-PAGE-oprensning af det tværbundne ribonukleoproteinkompleks (RNP). CLIP og relaterede metoder giver også nukleotidopløsningsindsigt i proteinbindingsstedet, fordi aminosyrer, der tværbundet til RNA'et under forberedelsen af sekventeringsbiblioteket, ofte afslutter revers transkriptasen eller får enzymet til at introducere mutationer på dette sted 1,2,3.

Siden introduktionen har den originale CLIP-protokol produceret en bemærkelsesværdig række afledte metoder. Et særligt vigtigt gennembrud kom med udviklingen af HITS-CLIP (eller CLIP-seq), som fusionerer high-throughput sekventering med CLIP tilgang3. Dette er siden blevet vedtaget af alle CLIP-baserede metoder. iCLIP introducerede forbedringer i de RNase-medierede trimnings- og adapterligeringsteknikker, der letter en mere nøjagtig kortlægning af RBP-bindingsstederne4. PAR-CLIP kombinerede 4thio-uridin/uracil-mærkning med tværbinding ved 365 nm, hvilket gjorde det muligt at kortlægge tværbindingssteder ved at analysere T-C-substitutioner5. CRAC, urea-iCLIP, dCLIP og uvCLAP introducerede denatureringsbetingelser og trin med dobbelt affinitetsrensning, der yderligere reducerer baggrundsbinding til affinitetsharpiksen og yderligere øger specificiteten af proteinfangst 2,6,7,8,9. Derudover introducerede CRAC, uvCLAP og dCLIP mærkning af RBP af interesse med et affinitetsmærke og overvandt dermed behovet for at generere specifikke antistoffer.

Der er også foretaget flere optimeringer for at fremskynde CLIP-metoden. Den oprindelige CLIP-protokol anvendte radiomærkning af de fangede RNA'er for at visualisere RBP-RNA-komplekserne efter SDS-PAGE. Brugen af radioaktivitet kan imidlertid være problematisk for laboratorier, der ikke er oprettet til sådant arbejde. irCLIP indeholder en fluoroforkoblet adapter, der letter visualisering gennem infrarød billeddannelse10 , og sCLIP anvender biotinylering af indfangede RNA'er for at visualisere dem gennem streptavidin-konjugeret HRP11. Desuden giver eCLIP helt afkald på RNA-mærkning; I stedet udskæres proteinet udelukkende baseret på dets kendte størrelse12. Streptavidin-baseret oprensning er også blevet brugt til at fremskynde processen med biblioteksforberedelse i FAST-iCLIP, hvor en biotinyleret 3'-adapter ligeres på RNA'erne og bruges til at muliggøre oprensning efter revers transkription og cirkularisering13. Yderligere forbedringer af iCLIP-protokollen øgede også bibliotekernes kompleksitetbetydeligt.

Endelig er CLIP blevet modificeret for at muliggøre indfangning af RBP'er fra forskellige cellulære underrum 14,15, for at visualisere nyligt transkriberede RNA'er ved hjælp af pulserende induktion af fotoaktiverbare ribonukleosider 5,16,17, for at fange methylerede RNA'er 18,19,20, for at undersøge RNA-RNA-interaktioner 21,22 og for at kortlægge 3' ender 23,24.

På trods af de store bidrag fra CLIP-baserede teknikker til at hjælpe vores forståelse af interaktionerne mellem RBP'er og RNA'er, har det været begrænset af ineffektiviteten af UV-tværbinding. Selvom dyrkningsceller dyrket i et monolag generelt er relativt lette at tværbinde, er dette betydeligt mere udfordrende i væv eller celler i opløsning. Væv kan kræve flere runder UV-eksponering for at trænge ind i de krævede cellelag, mens mikrobielle celler ofte dyrkes i rige medier, der indeholder aromatiske, UV-absorberende forbindelser25. Faktisk er UV-bestrålingstider på op til 30 min blevet brugt til at generere tilstrækkelig tværbinding mellem RBP'er og deres bundne RNA'er til sådanne prøver26,27,28. Denne udvidede UV-eksponering inducerer stressresponser i cellen, såsom UV-induceret DNA-skade, som kan forurene de endelige data i nogle applikationer.

De fleste CLIP-undersøgelser har fokuseret på at generere enkelte "snapshots" af specifikke protein-RNA-interaktioner i en celle. Imidlertid er protein-RNA-interaktioner iboende dynamiske, især når celler udsættes for ændringer i deres miljø. Dette kan omfatte en pludselig reduktion i tilgængeligheden af essentielle næringsstoffer eller hurtige temperaturændringer. For virkelig at forstå en RBP's rolle under stress er det bedst at udføre tidsopløste analyser, fordi de kan fange hele spektret af RBP-mål under stress og bestemme, på hvilket stadium af stressresponsen den valgte RBP er aktiv. Især undersøgelser i gær viste, at de første par minutters tilpasning er helt afgørende for overlevelse, og RNA-halveringstider i bakterier kan variere fra minutter til sekunder 29,30,31,32,33. Derfor bør sådanne tidsopløste analyser ideelt set udføres ved høj tidsmæssig opløsning. De lange tværbindingstider gør imidlertid undersøgelsen af adaptive reaktioner på tidlige stadier særligt udfordrende.

For at overvinde disse problemer udviklede vi for nylig en forbedret metode, der er i stand til at krydsbinde og høste celler på minutlange tidsskalaer. Vores χCRAC metode tillader kvantitativ måling af dynamiske ændringer i RBP-RNA interaktioner ved tidligere uvidne opløsning. Afgørende for denne metode var udviklingen af en ny UV-bestrålingsanordning32 , der reducerer den krævede tværbindingstid i gær og bakterier i opløsning omkring 10 gange, hvilket effektivt fryser RBP-RNA-interaktioner øjeblikkeligt. For hurtigt at høste cellerne efter UV-bestråling udviklede vi desuden en vakuumfiltreringsanordning, der kan høste eksponentielt voksende gær i en 0,5 L kultur på omkring 30 s32. Disse teknologiske innovationer tillader undersøgelse af RBP-RNA-dynamik ved opløsning i minutskala. Derudover introducerede vi også flere optimeringer til den originale CRAC protokol2 for at øge dens anvendelighed.

Ved hjælp af χCRAC studerede vi for nylig targetomet for en gærnuklear RBP, Nab3, som reaktion på glukosemangel. I Saccharomyces cerevisiae kan Nab3 danne et kompleks med Nrd1, en RBP og RNA-helicase Sen1 for at danne NNS-komplekset. NNS-binding til RNA-polymerasen og det spirende transkript kan udløse transkriptionel afslutning34. Dette kompleks er for det meste involveret i fjernelse af kryptiske ikke-kodende RNA-transkripter, men har også vist sig at regulere ekspression af proteinkodende gener. Undersøgelsen viste differentiel målretning af Nab3 til ikke-kodende og kodende udskrifter efter kun et minuts stress32. Vi demonstrerede, at co-transkriptionel afslutning af Nab3 resulterer i en meget forbigående, pulslignende ekspression af retrotransposongener, som ville have været vanskelige at opdage ved hjælp af traditionelle CLIP-baserede tilgange. Derudover øgede de korte UV-bestrålingstider i vores UV-tværbinding også signifikant genvindingen af kortlivede ikke-kodende RNA'er32. χCRAC vil sandsynligvis være et afgørende redskab til at belyse ikke blot, hvordan vandområdeplaner former reaktionen på stress på umiddelbare tidshorisonter, men også deres skiftende roller i hele en respons' livscyklus. Dette manuskript giver en detaljeret oversigt over alle trin i χCRAC-protokollen. Til illustrative formål blev metoden brugt til at studere gær Nrd1-proteinet, som er involveret i transkriptionel terminering og RNA-henfald35,36, og dets RNA-targetom som reaktion på glukosemangel over en lang række tidspunkter. Endelig demonstrerer vi også, at vores UV-bestrålingsenhed hurtigt kan krydsbinde RBP'er til RNA i HeLa-celler, hvilket gør det muligt også at udføre tidsopløste analyser med høj opløsning i vedhængende celler.

Protocol

TN150
50 mM Tris pH 7,8
150 mM NaCl
0,1% NP-40
1X proteasehæmmer
TN1000
50 mM Tris pH 7,8
1M NaCl
0,1% NP-40
NP-PNK
50 mM Tris-HCl pH 7,8
10 mM MgCl2
0,1% NP-40
5 mM beta-mercaptoethanol
5 x PNK
250 mM Tris-HCl pH 7,8
50 mM MgCl2
50 mM beta-mercaptoethanol
WB I
50 mM Tris-HCl pH 7,8
300 mM NaCl
10 mM imidazol
6M guanidin-HCI
0,1% NP-40
5 mM beta-mercaptoethanol
WB II
50 mM Tris-HCl pH 7,8
50 mM NaCl
10 mM imidazol
0,1% NP-40
5 mM beta-mercaptoethanol
Elueringsbuffer
50 mM Tris pH 7,8
50 mM NaCl
250 mM imidazol
0,1% NP-40
5 mM beta-mercaptoethanol
Protease K-buffer
50 mM Tris
0,1% NP-40
5 mM β-mercaptoethanol
1% SDS
5 mM EDTA
50 mM NaCl2
Pattedyrs lysisbuffer
50 mM Tris-HCl pH 8
100 mM NaCl
0,5% v/v Triton X-100
0,25% w/v Na-deoxycholat
0,1% w/v SDS
5 mM EDTA
1 mM DTT (tilsat frisk)
1X proteasehæmmer

Tabel 1: De buffere, der kræves til χCRAC og deres sammensætning.

1. UV-tværbinding og lysatproduktion

  1. Mikroorganismer i opløsning
    1. Pod 3,5 L af det ønskede medium med gær fra en kultur natten over til en start-OD600 på 0,05. Der dyrkes ved 30 °C under kontinuerlig omrystning ved 180 o/min.
    2. Under væksten skal du forberede andre nødvendige materialer.
      1. Forbered en beholder med flydende nitrogen.
      2. Forbered 3 liter stressfremkaldende medium og varm op til 30 °C i et vandbad.
      3. Indstil filterapparatet, tænd tværbindingen (figur 2A) og mærk 50 ml koniske rør, et for hvert tidspunkt.
    3. Når cellerne når den ønskede OD 600, hældes500 ml celler direkte i tværbindingen, og UV-bestråles med 250 mJ 254 nm UV. Se figur 2A og figur 3A for detaljer om brug af tværbindingen.
      BEMÆRK: UV-bestrålingsenergien skal optimeres omhyggeligt for hvert protein af interesse. Se diskussionen for yderligere oplysninger.
    4. Efter tværbinding filtreres cellerne ved hjælp af en af vakuumfiltreringsanordningerne (figur 2B,C). Rul membranen op med de filtrerede celler, læg den i t = 0 (tid nul) 50 ml konisk rør, og lynfrys i flydende nitrogen.
    5. Filtrer de resterende celler over seks forskellige filtre. Resuspender de opsamlede celler i 3 liter tidligere opvarmet stressinducerende medium ved at droppe membranerne i mediet og blande kraftigt med en stripette i 50 s. Efter 50 s skal du forberede dig på at tage t = 1-prøven.
    6. Efter 1 min tværbindes 500 ml celler og høstes gennem filtrering som i trin 1.1.3–1.1.4. Gentag efter 2, 4, 8, 14 og 20 minutter eller forskellige tidspunkter efter behov.
    7. De koniske rør, der indeholder cellerne, opbevares ved -80 °C. Fosfatbufret saltvand (PBS) indstilles til 4 °C natten over.
    8. Den næste dag skal du tage hvert konisk rør indeholdende en tværbundet prøve og resuspendere cellerne i 25 ml koldt PBS ved at ryste kraftigt.
    9. Cellesuspensionerne overføres til nye koniske rør og centrifugeres ved 4.600 x g, 5 minutter ved 4 °C.
    10. Hæld PBS'en af, drej hurtigt igen for at opsamle resterende PBS, og dekanter derefter den resterende væske med en pipette.
    11. Beregn vægten af pelleten i røret ved at sammenligne den med et tomt rør.
    12. Tilsæt to pelletvolumener iskold TN150, 60 μL DNase 1 og 10 μL RNase-hæmmer. Inkuber på is i 30 min.
      1. For eksempel tilsættes 800 μL iskold TN150 til 400 mg celler.
      2. Tilsætningen af DNase er ikke afgørende for de fleste opløselige proteiner, men er meget vigtig, når man studerer kromatinbundne proteiner, såsom RNA-polymerase. Derudover reducerer det viskositeten af bakterielle lysater. Det er meget vigtigt at bruge nøjagtigt to pelletvolumener af lysisbufferen, ellers kan lysiseffektiviteten falde.
    13. Tilsæt tre pelletvolumener (i ml) zirconia perler til cellesuspensionen. Til gær skal du bruge perler med en diameter på 0,5 mm, og til bakterier skal du bruge 0,1 mm.
      1. For eksempel for 400 mg celler måles 1,2 ml zirconiaperler i et 1,5 ml rør og tilsættes dem til cellerne resuspenderet i lysisbuffer.
    14. Vortex cellesuspensionerne i 1 min, og læg dem derefter på is i 1 min. Gentag i alt 5x.
    15. Tilsæt to pelletvolumener TN150 buffer og hvirvel kraftigt for at blande.
    16. Suspensionen centrifugeres i det koniske rør ved 4,600 g i 20 minutter ved 4 °C i en bordcentrifuge.
      1. Efter centrifugering udtages en prøve på 50 μL af supernatanten til fremtidig Western blot-analyse for at undersøge helcelleproteinekspressionen.
    17. Supernatanterne overføres til 1,5 ml reagensglas og spindes lysatet i 20 minutter ved 20.000 x g ved 4 °C i en mikrofuge.
      1. Alternativt, hvis der anvendes 5 ml rør, centrifugeres ved 13.000 x g i 20 min.
      2. Efter centrifugeringen udtages en prøve på 50 μL af supernatanten til fremtidig Western blot-analyse for at undersøge proteinets opløselige ekspression.
    18. Fortsæt til RBP-optagelse (afsnit 2).
  2. Dyrkede klæbende celler
    1. Frø nok klæbende celler i en petriskål 24 timer før UV-tværbinding, så de kan nå 80% sammenløb den næste dag. Dyrk natten over i det ønskede medium i en cellekulturinkubator ved 37 ° C, 5% CO2.
      BEMÆRK: Hvis du bruger kvarts petriskåle, er det gavnligt at fremme celleadhæsion gennem behandling af kulturvaren med poly-D-lysin (70.000-140.000 vægt) og føtal kalveserum (FCS) 2,5 timer før såning. Tilsæt nok poly-D-lysin til at dække hele vækstoverfladen og inkubere ved stuetemperatur (RT) i 5 min. Derefter skylles kvarts petriskålen grundigt med vand og tørres i cellekulturinkubatoren i 2 timer eller indtil den er helt tør. Derefter tilsættes nok FCS til helt at dække vækstoverfladen og placeres i inkubatoren i mindst 30 minutter. FCS skal fjernes fuldstændigt inden såning af celler.
    2. Når cellerne har nået 80% sammenløb, fjernes mediet og vaskes med 15 ml iskold PBS. Fjern derefter al resterende væske helt og fortsæt straks til næste trin.
    3. Petriskålen overføres til bakken til vedhængende celler (figur 3B) og UV-bestråles med 300 mJ 254 nm UV. Se figur 2A og figur 3B for detaljer om brug af tværbindingen.
      BEMÆRK: UV-bestrålingsenergien skal optimeres omhyggeligt for hvert protein af interesse. Se diskussionen for yderligere oplysninger.
    4. Umiddelbart efter tværbinding lægges petriskålen på is og tilsættes 10 ml iskold PBS. Saml celler ved at skrabe og overføre til et 15 ml konisk rør. Pellet gennem centrifugering ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C.
    5. Fjern PBS og resuspender cellepelleten i 1 ml iskold PBS, og overfør til et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Pillecellerne centrifugeres igen i 5 minutter ved 300 x g ved 4 °C.
    6. Fjern PBS og snap-frys cellepillerne på tøris. Opbevar cellepillerne ved -80 °C, indtil de skal bruges.
    7. Gentag trin 1.2.3-1.2.6 for hvert tidspunkt.
    8. Resuspender cellepillerne i 1 ml lysisbuffer og overfør til et 15 ml konisk rør. Derefter tilsættes 1 ml lysisbuffer til i alt 2 ml.
    9. Der tilsættes 5 μL RNase-hæmmer fra pattedyr.
    10. Sonikere 5x for 10 s på is ved 10 amp. Vent 30 s mellem sonikeringsrunder.
    11. Beregn proteinkoncentrationen af hver prøve og normaliser til den laveste koncentration.
    12. Overfør 1,98 ml lysat til et 2 ml rør.
    13. Der tilsættes 10 μL DNase I og inkuberes ved 37 °C i 5 minutter under omrystning ved 1.200 o/min.
    14. Lysatet centrifugeres ved 16.000 x g i 20 minutter ved 4 °C.
      1. Efter centrifugeringen udtages en prøve på 50 μL af supernatanten til fremtidig Western blot-analyse for at undersøge proteinets opløselige ekspression.
    15. Fortsæt til RBP-optagelse (afsnit 2).

2. RBP-optagelse

  1. De magnetiske anti-FLAG-perler (75 μL gylle pr. prøve) eller IgG-agarose (500 μL gylle pr. prøve) vaskes 3x med 5 ml TN150. Resuspender i et slutvolumen på 700 μL TN150 og tilsæt 100 μL vaskede perler til syv 15 ml koniske rør.
    1. Opbevares på is, indtil det er nødvendigt.
  2. Når lysaterne er klaret, tilsættes supernatanten til glasset med anti-FLAG/IgG-perlerne.
  3. Nutate ved 4 °C i 2 timer.
    BEMÆRK: Nogle protokoller beskriver inkubationer natten over med perlerne, men dette anbefales ikke, fordi lange inkubationstider dramatisk kan reducere genopretningen af tværbundne RNA'er.

3. Vask perlerne og TEV-spaltningen af mærkerne

  1. Høst perlerne og fjern lysatet.
    1. Der udtages en prøve på 50 μL af supernatanten til fremtidig Western blot-analyse for at undersøge det ikke-opfangede protein.
  2. Resuspender perlerne i iskold TN1000 og overfør dem til et 1,5 ml rør. Vask i 10 min, 4 °C, med nutation. Gentag i alt tre vaske.
    1. Hvis du bruger IgG agaroseperler, skal du vaske med 5 ml TN1000. Hvis du bruger anti-FLAG-perler, skal du bruge 2 ml.
  3. Vask derefter perlerne 3x med TN150 med samme volumen som ovenfor.
  4. Efter den tredje vask resuspenderes perlerne i 600 μL TN150.
  5. Tilsæt 30 U hjemmelavet GST-TEV-protease til perleophænget og drej i 2 timer ved RT.
    BEMÆRK: Rekombinant GST-TEV-protease er nu også kommercielt tilgængelig, men den er ikke testet med denne protokol.
    1. Under fordøjelsen skal du forberede dig på de næste trin ved at oprette kolonner med tre 1,5 ml rør til hver prøve (dvs. for syv prøver skal du have tre rækker med syv kolonner).
    2. Til den sidste række rør tilsættes 0,4 g guanidiumhydrochlorid, 27 μL 5M natriumchlorid og 3 μL 2,5 M imidazol (pH = 8). Bemærk, at imidazolens pH-værdi skal være 8. Dette er afgørende for at opretholde RNA-integritet.
    3. Derudover vaskes det nødvendige volumen nikkelperler i WB I 3x. Brug 100 μL gylle pr. prøve. Efter den sidste vask resuspenderes perlerne i samme originale volumen WB I og opbevares på is.
  6. Når TEV-nedbrydningen er afsluttet, opsamles supernatanten ved hjælp af et magnetstativ til anti-FLAG-perler eller centrifugering til IgG-perler og overføres til den første række af de tidligere opstillede rør.
    1. Der udtages en prøve på 50 μL TEV-eluatet til Western blot-analyse.
  7. Indstil en termoblok inkubator til 37 ° C. Til den anden række rør tilsættes 1 μL RNase-cocktail (1:50 fortynding).
  8. Der tages 550 μL TEV-eluat fra første række rør, og det tilsættes til anden række (indeholdende RNase-cocktailen). Pipetten afpipetteres kraftigt for at sikre blanding.
  9. Når du har gennemført dette for den første prøve, skal du straks placere røret i termoblokken og starte en timer. Gå videre til de efterfølgende prøver, således at hver er forskudt.
  10. Inkuber i præcis 5 min. Når den er færdig, fjernes den første prøve fra termoblokken og overføres opløsningen til den tredje række rør (indeholdende guanidiumhydrochloridpulveret).
    BEMÆRK: En 5 minutters inkubation med en 1:50 fortynding af RNase-cocktailen er normalt velegnet til de fleste proteiner, men dette trin skal optimeres omhyggeligt med forskellige inkubationstider eller koncentrationer for hvert protein for at sikre, at de tværbundne RNA'er har den korrekte størrelse (30-100 nt).
  11. Straks hvirvel i et par sekunder ved fuld hastighed for at opløse guanidiumpulveret og derefter gå videre til næste prøve.
  12. Når alle prøver er blevet overført til guanidiumpulveret, hvirvel igen for at sikre, at alt pulveret er helt opløst.
  13. Der tilsættes 100 μL vaskede nikkelperler og roteres natten over ved 4 °C. Denne inkubation kan forkortes til 2 timer.

4. Behandling af alkalisk fosfatase på perler

  1. Indstil en termoblok til 37 °C.
  2. Der anbringes en oprensningscentrifugeringssøjle i et 2 ml rør, et for hver prøve. Nikkelperlerne overføres til kolonnerne, og supernatanten får lov til at løbe igennem. Derefter skal du sikre dig, at alle nikkelperlerne blev fjernet fra 1,5 ml røret ved skylning med WB I og påføring på søjlen.
  3. Opsæt 2 ml rør, seks pr. prøve (en til at opsamle hver vask). Hold ydersiden af søjlerne tørre for at opretholde flowet. Vask perlerne 3x med 500 μL WB I og derefter 3x med 500 μL NP-PNK.
  4. Luk låget på centrifugeringssøjlen, og drej kort perlerne for at fjerne overskydende buffer.
  5. Sæt proppen på søjlen, sæt kolonnerne i 1,5 ml rør, og tilsæt 60 μL af reaktionsblandingen vist i tabel 2.
Komponent 1x 7,5x
5 x PNK buffer 12 90
Alkalisk fosfatase 4 30
RNase-hæmmer 2 15
H2O 42 315
Sidste bind 60 μL 450 μL

Tabel 2: Alkalisk fosfatasereaktionsblanding.

  1. Perlerne inkuberes i 1 time ved 37 °C.
  2. Puds perlerne 1x med 500 μL WB I for at inaktivere den alkaliske fosfatase og derefter 3x med 500 μL NP-PNK buffer. Sørg for at skylle indersiden af søjlen grundigt med NP-PNK-bufferen for at fjerne spor af guanidium.

5. On-bead ligering af App-PE-linkeren til 3'-enden af RNA'et

  1. Den resterende buffer centrifugeres og tilsættes 60 μL af den blanding, der er angivet i tabel 3 (se App-PE-sekvensen i tabel 4), til kolonnerne. Der inkuberes reaktionen i 6 timer ved 25 °C.
Komponent 1x 7,5x
5 x PNK buffer 12 90
App-PE-adapter (100 μM) 0.6 4.5
T4 RNA ligase 2 afkortet K227Q 3 22.5
RNase-hæmmer 1.5 11.25
50% PEG 8000 12 90
H2O 30.9 231.75
Sidste bind 60 μL 450 μL

Tabel 3: App-PE linker liger reaktion blanding.

Oligonukleotid navn Sekvens (5'-3')
L5Aa invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrUrArArGrCrN-OH
L5Ab invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrArUrUrArGrCrN-OH
L5Ac invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrCrGrCrArGrCrN-OH
L5Ad invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrCrGrCrUrArGrCrN-OH
L5Ba invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrArGrArGrCrN-OH
L5Bb invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrUrGrArGrCrN-OH
L5Bc invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrCrArCrUrArGrCrN-OH
L5Bd invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrUrCrUrCrUrArGrCrN-OH
L5Ca invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrCrUrArGrCrN-OH
L5Cb invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrUrGrGrGrCrN-OH
L5Cc invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrArCrUrCrArGrCrN-OH
L5Cd invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrGrArCrUrUrArGrCrN-OH
L5Da invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrCrGrUrGrArUrN-OH
L5Db invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrCrArCrUrArN-OH
L5Dc invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrUrUrGrCrN-OH
L5Dd invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrArUrCrArCrRN-OH
L5Ea invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrCrArCrUrGrUrN-OH
L5Eb invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrUrGrArCrArN-OH
L5Ec invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrUrUrCrArCrN-OH
L5Ed invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrArCrArGrUrGrN-OH
App_PE App-NAGATCGGAAGAGCACACGTCTG-ddC

Tabel 4: Sekvenserne af DNA- og RNA-adapterne, der kræves til ligering på 5' og 3' enderne af fangede RNA'er. Disse blev renset gennem RNase-fri HPLC.

  1. Vask perler 1x med 500 μL WB I og 3x med 500 μL NP-PNK buffer. Sæt søjlen i et nyt rør og drej den resterende buffer ud.

6. On-bead phosphorylering af RNA'ets 5' ender

  1. Der tilsættes 80 μL af den blanding, der er angivet i tabel 5 , til kolonnerne. Der inkuberes reaktionen i 40 minutter ved 37 °C.
    BEMÆRK: Prøverne vil nu være meget radioaktive. Således skal alt efterfølgende arbejde udføres bag en beskyttende skærm, og affald skal bortskaffes i henhold til lokale sundheds- og sikkerhedsregler.
Komponent 1x 7,5x
5 x PNK buffer 16 120
32P-ɣATP (10 μCi / μL) 3 22.5
T4 PNK 3 22.5
H2O 58 435
Sidste bind 80 μL 600 μL

Tabel 5: Phosphorylering reaktion blanding.

  1. Der tilsættes 1 μL 100 mM ATP, og reaktionen gentages i yderligere 20 minutter. Dette vil sikre, at næsten alle 5'-enderne har fosfater for at lette ligering af 5'-linkeren.
  2. Opsæt 2 ml rør, fem pr. prøve.
  3. Vask perler 1x med 500 μL WB I og 3x med 500 μL NP-PNK buffer. Bemærk, at disse elutioner vil være meget radioaktive og derfor bør bortskaffes korrekt.
  4. Flyt søjlen til det sidste rør, og drej den resterende buffer ud.

7. On-bead ligering af 5' linker

BEMÆRK: 5'-linkerne indeholder en RNA-stregkode, der bruges til identifikation af hver prøve efter sekventering. Det er således helt afgørende at bemærke, hvilken linker der bruges til hvilken prøve.

  1. Der tilsættes 78 μL af blandingen beskrevet i tabel 6 til kolonnerne. Der tilsættes 2 μL 5' adapter (100 μM; se tabel 4) til hvert rør, og der inkuberes natten over ved 18 °C.
Komponent 1x 7,5x
5 x PNK buffer 16 120
ATP (10 mM) 8 60
RNase-hæmmer 2 15
T4 RNA ligase 4 30
H2O 48 360
Sidste bind 78 μL 585 μL

Tabel 6: 5' linker ligation reaktion blanding.

  1. Den følgende dag vaskes perler 1x med 500 μL WB I og 3x med 500 μL WB II og overføres kolonnerne til et nyt 2 ml rør.

8. Eluering, SDS-PAGE og RNA-ekstraktion

  1. Indstil centrifugen til 4 °C. Forbered to rækker med 1,5 ml rør pr. prøve til eluering.
  2. Spin kolonnernes tomrumsvolumen ud med nikkelperler med et hurtigt spin. Kolonnerne anbringes i den første række elueringsrør, og der tilsættes 200 μL elueringsbuffer. Vent 2 minutter, og tving derefter bufferen gennem kolonnen med et hurtigt spin.
  3. Flyt kolonnerne til den anden række rør, og gentag trin 8.2. Hver prøve vil nu have 400 μL eluat i alt, fordelt på to 1,5 ml rør.
    1. Tag alle eluaterne og overfør dem sammen til et 5 ml rør. Der tilsættes 2 μL 20 mg/ml glykogen. Hvis der således anvendes syv prøver, vil der nu være 2,8 ml poolet eluat i 5 ml røret.
  4. Der tilsættes 100 μl trichloreddikesyre (TCA) pr. prøve [f.eks. 700 μl TCA til 7 prøver (2,8 ml poolet eluat)] til 5 ml reagensglas og hvirvelbrønd i 30 s.
  5. Inkuber på is i 20 min.
  6. Der centrifugeres i 30 minutter ved 17.000 x g, 4 °C, i en bordcentrifuge.
  7. Supernatanten fjernes forsigtigt fra det koniske rør, og pipetten kontrolleres med en geigertæller for at sikre, at pelletsen ikke er blevet fjernet ved et uheld. Hvis det er tilfældet, sættes supernatanten tilbage i glasset og centrifugeres i yderligere 10 minutter.
    BEMÆRK: Supernatanten kan stadig være meget radioaktiv. Sørg for at bruge korrekt afskærmning.
  8. Resuspender pelleten fuldstændigt i 2 ml iskold acetone.
  9. Der centrifugeres i 15 minutter ved 17.000 x g, 4 °C.
  10. Fjern så meget af acetonen med en P1000-pipette som muligt. Derefter drejes røret kort for at samle små dråber acetone, og fjern derefter med en P10-pipette. Tør i 2 min i en stinkhætte.
    BEMÆRK: Acetonesupernatanten kan stadig være radioaktiv. Sørg for at bruge korrekt afskærmning.
  11. Resuspender prøven i 30 μL 1x proteinbelastningsbuffer. For at sikre, at pelleten er korrekt resuspenderet, skal du kontrollere, at langt størstedelen af radioaktiviteten nu er til stede i påfyldningsbufferen og ikke efterlades i 1,5 ml røret ved at fjerne opløsningen i en P200-pipette og måle aktiviteten tilbage i 1,5 ml røret ved hjælp af en geigertæller.
  12. Prøven opvarmes i 10 minutter ved 65 °C. Påfyld en 1 mm, 4-12% præfabrikeret Bis-Tris gel og kør i 1,5 time ved 125 V i MOPS-buffer.
  13. Når gelen er færdig med at køre, skal du åbne gelkassetten. Gelen skal bevares på bundpladen. Bortskaf toppen.
  14. Pak gelen ind i husholdningsfilm, og fastgør den derefter med tape på indersiden af en lystæt kassette. Sørg for, at kassetten har en forstærkende skærm for at forbedre signalet.
  15. En autoradiografisk film udsættes for gelen, og kassetten opbevares ved -80 °C under eksponeringen. Eksponeringstiden vil variere mellem proteiner med forskellige tværbindingseffektiviteter.
    1. Når du placerer filmen, skal der være en måde at justere den på kassetten for at skære interessebåndet ud i det efterfølgende trin. For at sikre dette skal du bruge en fluorescerende lineal og også sikre, at gelen er i et hjørne af kassetten, som derefter dækkes af filmen, der også er placeret i det yderste hjørne.
      BEMÆRK: Som tommelfingerregel giver eluater i belastningsbuffer, der giver en aflæsning på mindst ~ 250 cps, når de vises til en Geiger-tæller, tilstrækkeligt signal til en eksponering på 3 timer. Ellers udføres eksponering natten over.
  16. Udvikl filmen. Skær husholdningsfilmen, der dækker gelen, væk, men flyt ikke gelen. Ellers vil billedet blive forskudt fra gelen.
    BEMÆRK: Gelen vil sandsynligvis være meget radioaktiv. Sørg for at bruge korrekt afskærmning, når du skærer gelskiven ud.
  17. Placer filmen over gelen og punktafgifter båndet af interesse. Kom gelskiven i et 2 ml rør.
  18. Knus gelskiven med en P1000-pipettespids, og tilsæt 600 μL proteinase K-buffer plus 200 μg proteinase K (denne protokol bruger 10 μL af en 20 mg/ml proteinase K-opløsning). Der inkuberes i 2 timer ved 55 °C under kraftig omrystning.
  19. Derefter skæres enden af en P1000-spids af med en ren skalpel og supernatant- og gelstykkerne overføres til en centrifugeringssøjle anbragt i et 2 ml rør.
  20. Drej søjlen i 1 min ved 17.000 x g ved RT. Opsaml gennemstrømningen, som indeholder de radioaktive, isolerede RNA'er.
  21. Udfør en phenol: chloroform ekstraktion.
    1. Tilsæt 50 μL 3 M natriumacetat, pH = 5,2 og 500 μL phenol: chloroform og hvirvelbrønd. Spin i 5 min ved 17.000 x g. Fjern det vandige toplag og læg det i et nyt 1,5 ml rør.
    2. Tilsæt 500 μL chloroform og hvirvel kraftigt i 10-15 s. Drej i 5 minutter ved 17.000 x g ved RT. Fjern det vandige lag og læg det i et nyt 1,5 ml rør.
    3. Tilsæt 1 μL 20 mg/ml glykogen og 1 ml iskold, 96% ethanol. Bundfald i 30 minutter ved -80 °C eller natten over ved -20 °C.
    4. Der centrifugeres i 30 minutter ved 4 °C, 17.000 x g. Supernatanten fjernes, der tilsættes 500 μl 70 % ethanol, og der centrifugeres i 5 min. 4 °C ved 17 000 x g. Fjern al ethanol, udfør en hurtig centrifugering for at samle rester og fjern overskydende med en P10-pipette.
    5. Tør pillen i ~3 min i en stinkhætte. Resuspender i 20 μL DEPC-behandlet vand.
  22. RNA'et opbevares ved -80 °C natten over, eller der fortsættes straks til det omvendte transkriptionstrin.

9. Omvendt transkription

  1. Der tilsættes 2 μL 10 μM RT oligo (PE_reverse; se tabel 7) og 4 μL 5 mM dNTP'er til 20 μL RNA.
Oligonukleotid navn Sekvens (5'-3')
P5 fremad AATGATACGGCGACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTTCCGATCT
BC1 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
BC3 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGCTCTTCCGATCT
BC4 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
BC5 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
BC7 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAGATCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
BC8 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTAGCTTGTGACTGGAGTTCAGACGTGCTCTTCCGATCT
BC9 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
BC10 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCACGGTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGCTCTTCCGATCT
PE_reverse CAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

Tabel 7: PCR-primerne (inklusive stregkodesekvenserne) og den omvendte transkriptionsprimer.

  1. Overfør til en forvarmet termoblok ved 85 °C i 3 minutter, og snap-chill derefter på is i 5 minutter. Indholdet af røret opsamles ved kort centrifugering, og derefter tilsættes 8 μL 5x revers transkriptasebuffer, 2 μL 100 mM DTT og 2 μL RNase-hæmmer.
  2. Blandingen inkuberes ved 50 °C i 3 minutter, hvorefter der tilsættes 2 μL revers transkriptase og inkuberes i 1 time ved 50 °C.
  3. Den omvendte transkriptase inaktiveres ved inkubation ved 65 °C i 15 min.
  4. Overfør rørene til en forvarmet termoblok ved 37 °C og lad dem akklimatisere sig i 3 minutter.
  5. Der tilsættes 2 μL RNase H, og der inkuberes i 30 minutter ved 37 °C.
  6. Isoler cDNA'et ved hjælp af SPRI-perler.
    1. Tilsæt to volumener på 84 μL perler. Inkuber i 15 min. Sæt perlerne på et magnetstativ og lad dem stå i 1 min for at høste perlerne.
    2. Supernatanten fjernes og bortskaffes, og der tilsættes 200 μl 70% ethanol. Fjern ikke perlerne fra magnetstativet. Inkuber perlerne med ethanol i 30 s.
    3. Fjern ethanolen, og gentag vasketrinnet. Fjern al den resterende ethanol ved hjælp af en P10-spids.
    4. Kom perlerne i en stinkhætte i 2 min for at tørre dem. Fjern perlerne fra stativet, ophæng dem igen i 12 μL vand, og sæt derefter perlerne tilbage på stativet. Der fjernes 11 μl supernatant.
  7. cDNA'et fryses ved -20 °C eller fortsæt straks til PCR-trinnet.

10. qPCR-reaktion

  1. Før den endelige PCR til amplifikation af cDNA'erne udføres en kvantitativ polymerasekædereaktion (qPCR) for at identificere det optimale antal cyklusser til forstærkning af cDNA'erne for at forhindre overforstærkning af biblioteket.
  2. Opsæt en qPCR-reaktion på is i henhold til tabel 8. Se tabel 7 for alle primere.
Komponent 1x
2x qPCR reaktion mastermix 5
0,1 μM P5 primer (fremad) 0.8
0,1 μM BC primer (omvendt) 0.8
cDNA (eller vand som negativ kontrol) 1
H2O 2.4
Sidste bind 10 μL

Tabel 8: qPCR-reaktionsblanding.

  1. For korrekt kvantificering af de cyklusser, der er nødvendige for amplifikation, skal du bruge tre tekniske replikater til cDNA'et og tre negative (dvs. vand) kontroller.
  2. Forsegl pladerne med optisk gennemsigtig film, og kør qPCR i henhold til kitproducentens instruktioner.
  3. Prøverne analyseres ved hjælp af en absolut kvantificeringsmetode for at identificere antallet af cyklusser (n), hvor knæet for eksponentiel vækst nås (se figur 4C for et eksempel). Dette antal cyklusser bruges derefter til den endelige forstærkning af resten af cDNA'et.

11. PCR-reaktion og gelekstraktion

  1. Opsæt PCR-reaktionen på is i henhold til tabel 9. Se tabel 7 for alle primere.
    BEMÆRK: Der anvendes kun 5 μL af cDNA-biblioteket.
Komponent 1x
10 x korrekturlæsning polymerasebuffer 5
10 μM P5 primer (fremad) 1
10 μM BC primer (omvendt) 1
5 mM dNTP'er 2.5
Korrekturlæsning af polymeraseenzym 1
cDNA 5
H2O 34.5
Sidste bind 50 μL

Tabel 9: PCR-reaktionsblanding.

  1. Kør PCR som følger: 95 °C i 2 minutter; n cyklusser på 98 °C i 20 s, 52 °C i 30 s og 72 °C i 1 min; og 72 °C i 5 min. Antallet (n) af cyklusser til forstærkning af χCRAC-biblioteket bestemmes af qPCR beskrevet i afsnit 10.
  2. Der tilsættes 1 μl eksonuklease I og inkuberes ved 37 °C i 60 minutter.
  3. Rens det amplificerede cDNA ved hjælp af SPRI-perler som beskrevet ovenfor ved hjælp af to volumener perler (dvs. 100 μL). Eluere i 11 μL.
  4. Tilsæt 3 μL 6x ilægningsfarvestof og kør på en præfabrikeret 6% TBE-gel ved 100 V i 1 time i 1x TBE-buffer. Brug en stige, der er egnet til kvantificering af korte DNA-fragmenter.
  5. Når du er færdig, fjernes gelen fra kassetten og anbringes i en passende, væsketæt beholder med tilstrækkelig 1x TBE til at dække gelen (f.eks. ~ 50 ml). Tilsæt en passende mængde SYBR-sikkert farvestof (f.eks. til 50 ml, brug 5 μL af et 10.000x farvestof)
  6. Lad gelen plette gennem mild blanding i 15 minutter ved RT. Tøm den SYBR-holdige 1x TBE og udskift med ren 1x TBE. Vask gelen i 10 min med forsigtig omrystning ved RT.
  7. Tøm 1x TBE, og læg gelen i en gennemsigtig mappe. Klip mappen til en passende størrelse.
  8. Billede gelen på passende måde, såsom en phosphorimager. Punktafgifter DNA-fragmenter mellem ~ 175 bp og ~ 400 bp. Kom gelskiven i et 1,5 ml rør.
  9. Knus gelskiven grundigt med en P1000-spids, og der tilsættes 400 μL H2O. Der inkuberes ved 37 °C under omrystning i 1 time i en termoblok.
  10. Prøven fryses på tøris i 10 minutter, hvorefter den anbringes tilbage i termoblokken ved 37 °C under omrystning i 1 time.
  11. Opret en filterenhed ved at tage en filtersøjle og indsætte to glasmikrofiberfiltre indeni. Anbring enheden i et 1,5 ml rør.
  12. Skær enden af en P1000-spids af med en ren skalpel, og tag den knuste TBE-gelsuspension op, og dispenser derefter i filterenheden, der blev oprettet i trin 11.12. Spin ved 17.000 x g i 30 s.
  13. Der tilsættes 1 μl glykogen til supernatanten sammen med 40 μL natriumacetat, pH = 5,2, og 1 ml 96% ethanol. Der inkuberes ved -80 °C i 30 min.
  14. Der centrifugeres i 30 minutter ved 17.000 x g, 4 °C. Supernatanten kasseres og vaskes med 500 μl 70% ethanol.
  15. Drej i 5 min, fjern ethanolen helt og tør derefter pillen i en stinkhætte i 3 min.
  16. Der resuspenderes i 10 μLH2O, og DNA-koncentrationen måles.

Representative Results

For at demonstrere effektiviteten af χCRAC-metoden blev der udført et tidsforløbsforsøg med gærstammer, der udtrykte et HTP-mærket Nrd1-protein. Figur 1 indeholder en detaljeret skematisk fremstilling, der beskriver, hvordan metoden fungerer. Ligesom Nab3 er Nrd1 involveret i nukleært RNA-henfald af en række RNA-transkripter37. Tidligere arbejde fra Corden-laboratoriet foreslog, at Nrd1-binding til dets RNA-mål ændres markant, når celler udsættes for glukosesult28,38. Som sådan blev celler, der voksede eksponentielt i medium indeholdende glucose (SD-TRP), flyttet til det samme medium uden glukose (S-TRP) over et tidsforløb for at overvåge dynamiske ændringer i Nrd1-RNA-interaktioner. Prøver blev taget og tværbundet i Vari-X-linkerkammeret (figur 3A) før skiftet og derefter efter 1, 2, 4, 8, 14 og 20 min. Mediet, der anvendes til cellevækst, var bevidst mangelfuldt i tryptofan for at reducere UV-absorptionen af denne aromatiske aminosyre. Bemærk, at det er bedst at bruge syntetisk medium, der er filtreret, steriliseret, fordi autoklavering af mediet kan føre til karamellisering af sukkerarterne. Dette reducerer derefter tværbindingseffektiviteten.

Figur 4A viser et repræsentativt autorøntgenbillede fra et χCRAC eksperiment. Bemærk, at prøverne i dette eksempel ikke blev samlet sammen. I stedet blev hver kørt individuelt på gelen. Dette anbefales til indledende eksperimentelle tests for at vise, at proteinet krydsbinder effektivt til RNA på alle de testede tidspunkter. Et særligt intenst signal blev observeret ved den forventede molekylvægt af RBP, der repræsenterer proteinet bundet til meget korte, radioaktivt mærkede RNA'er, der ikke er modtagelige for sekventering. Derfor blev smearysignalet over dette bånd, som er proteinet tværbundet til længere RNA-fragmenter, isoleret. Fragmentet blev skåret fra lige over proteinbåndet plus omkring 30 kDa. Figur 4B viser et autoradiogram efter excision, hvor proteinet er krydsbundet til korte RNA'er tilbage i gelen, og det tidligere smære signal nu er udskåret.

Efter omvendt transkription skal cDNA-biblioteket amplificeres ved hjælp af PCR. Overforstærkning af biblioteket skal dog undgås, da dette kan introducere bias mod sekvenser, der fortrinsvis forstærkes af polymerasen og generere PCR-artefakter. Overforstærkede biblioteker indeholder også et stort antal duplikatsekvenser, som spilder læser på sequenceren. For at beregne det ideelle antal PCR-cyklusser til amplifikation af det endelige bibliotek blev en alikvote af cDNA'et amplificeret gennem qPCR under anvendelse af P5- og BC-oligonukleotiderne. Den første cyklus, hvor biblioteket nåede maksimal fluorescens, blev valgt som PCR-cyklustælling. Figur 4C giver et eksempel på en qPCR fra et typisk cDNA-bibliotek, som gav et topcyklustal på 16. Denne værdi blev derefter anvendt til den endelige χCRAC PCR. For at behandle de sekventerede data brugte vi software, der tidligere var udviklet i vores laboratorium (pyCRAC) og den tilsvarende pipeline til analyse af de kinetiske CRAC-data (Nues et al., 2017; https://git.ecdf.ed.ac.uk/sgrannem/pycrac, https://bitbucket.org/sgrann/kinetic_crac_pipeline/src/default/). Disse open source-softwareværktøjer muliggør demultiplexing og trimning af dataene, fjernelse af PCR-duplikater, identifikation af statistisk signifikante toppe, klyngelæsninger i sammenhængende sekvenser og identifikation af bindingsmotiver39. Yderligere oplysninger om, hvordan disse værktøjer fungerer, findes på deres respektive websider.

Vi begyndte også at udvikle en χCRAC protokol for pattedyrceller. Størstedelen af pattedyrs cellelinjer dyrkes som et monolag, og bakken i vores tværbinding med den UV-gennemtrængelige pose er ikke egnet til forsøg med klæbende celler. For at overvinde dette problem udviklede vi et trin, hvor brugerne kan UV-bestråle 1-2 petriskåle (150 mm i diameter og 25 mm i dybden) med klæbende celler (figur 3B). Som en første test blev effektiviteten af tværbindingen til pattedyrceller målt gennem tværbinding og indfangning af stabilt mærket GFP-RBM7 ved hjælp af anti-GFP-antistoffer og en traditionel CLIP-baseret oprensning. Som vist i figur 5A var tværbindingen i stand til at genvinde protein-RNA-komplekser fra pattedyrceller dyrket som et monolag ved hjælp af 254 nm UV-bestråling ved effektiviteter, der kan sammenlignes med en almindeligt anvendt UV-bestrålingsanordning. Imidlertid er standard cellekulturplastvarer, der normalt anvendes til UV-tværbindingseksperimenter, uigennemtrængelige for 254 nm UV. Derfor ville cellerne i vores tværbinding kun modtage bestråling fra den øverste bred af UV-lamper. For at overvinde dette udviklede vi en UV-permeabel kvarts petriskål til cellevækst og tværbinding. Anvendelse af kvartskulturen viste robust genvinding af protein-RNA-komplekser med så få som 2 s UV-bestråling (figur 5B). Når de kombineres med RBP-indfangningsmetoder for pattedyrceller, såsom CLIP-teknologier, er disse korte tværbindingstider tilgængelige med tidsforløb til at genvinde spatiotemporale RNA-bindingsprofiler af RBP'er som reaktion på genotoksiske belastninger eller hurtige udtømninger af proteinfaktorer eller parallelt med transkriptionel eller cellecyklussynkronisering.

Figur 6 viser flere eksempler på Nrd1-data, der behandles af χCRAC-rørledningen. Dette tal blev udarbejdet ved hjælp af de bedgraph-filer, der genereres af pipelinen og python GenomeBrowser-pakken (https://pypi.org/project/GenomeBrowser/1.6.3/), som vi har designet til at forenkle gengivelsen af genombrowserbilleder af dataene i publikationskvalitet. De grå rektangler repræsenterer genomiske regioner, der udtrykte ikke-kodende RNA'er, såsom det kryptiske ustabile transkript (CUT'er), stabile ukarakteriserede transkripter (SUT'er)40 og Xrn1-følsomme ustabile transkripter (XUT'er)41. Dataene i figur 6 viser, at Nrd1 binder til mange af disse ikke-kodende RNA-transkripter, i overensstemmelse med ideen om, at dette protein er involveret i nedbrydning af denne klasse af transkripter42. Figur 6A viser en ~ 15 kb region på kromosom IV. Her var der en signifikant stigning i binding af Nrd1 til transkripter, der koder for glukosetransportørerne med høj affinitet HXT6 og HXT7, som begge opreguleres under glukosesult. Det er sandsynligt, at transkriptionsafslutning af NNS-komplekset kan påvirke induktionskinetikken af disse gener under glukosesult. Figur 6B viser et eksempel på Nrd1-tværbinding til Imd3-transkriptet, som vides at være reguleret af Nab343. I dette tilfælde viste dataene en signifikant reduktion i binding ved glukosesult. Tidligere arbejde viste nedsat binding af Nab3 til Tye7-transkriptet under glukosesult44. I overensstemmelse med denne observation tyder χCRAC-dataene på, at bindingen af Nrd1 faldt under glukosesult, og Nrd1-tværbindingen til Tye7 var på sit laveste efter 8 minutters stress (figur 4C). Det ser imidlertid ud til, at denne effekt kun var forbigående, fordi Nrd1-bindingen efter 14 minutters glukosesult gik tilbage til startniveauerne.

Figure 1
Figur 1: Skematisk gengivelse af χCRAC-protokollen. Mærkede stammer blev dyrket indtil den ønskede tæthed. RBP indikerer RNA-bindende protein. Derefter blev der taget en referenceprøve og tværbundet med 254 nm UV-lys. De resterende celler blev høstet ved filtrering og derefter hurtigt skiftet til det stressfremkaldende medium. Til χCRAC eksperimentet, der er beskrevet her, blev der udtaget prøver og tværbundet 1, 2, 4, 8, 14 og 20 minutter efter skiftet (1). RBP af interesse blev derefter renset ved hjælp af en meget streng to-trins affinitetsrensning (2). Derefter blev de fangede tværbundne RNA'er delvist fordøjet med RNaser, radioaktivt mærket i 5'-enden, og adaptere blev ligeret på dem (3). 5'-adapterne indeholdt unikke "in-read" stregkodesekvenser, så de enkelte prøver kunne adskilles bioinformatisk efter sekventering. RBP-RNA-komplekserne blev derefter elueret, samlet og udfældet sammen (4), opløst af SDS-PAGE og visualiseret gennem autoradiografi (5). Derefter blev en enkelt gelskive indeholdende det radioaktive signal lige over hovedbåndet, illustreret med stiplet rød boks i autoradiografibilledet, skåret fra gelen (5). Gelskiverne blev behandlet med protease K, og RNA'et blev efterfølgende ekstraheret (6), omdannet til cDNA'er og amplificeret gennem PCR (7). PCR-trinnet introducerede yderligere stregkoder (gul blok introduceret af P7 oligo), så mange biblioteker kunne multiplexeres til en enkelt bane. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Tværbinding og vakuumfiltrering. a) Tværbindingen. Cellesuspensionen hældes i en tragt øverst til højre på maskinen (se også figur 3A for nærbillede) og opbevares i en UV-gennemsigtig pose placeret i den midterste bakke. Denne pose flankeres af to skodder, der forbliver lukkede, indtil brugeren instruerer maskinen i at starte bestrålingstrinnet. Cellerne bestråles med UV-lys fra bakkerne både over og under. Maskinen leveres med 254 og 365 nm UV-lamper, hvor sidstnævnte kan anvendes til PAR-CLIP-eksperimenter. Maskinen betjenes via et berøringsskærmpanel placeret øverst til højre, som gør det muligt at kontrollere UV-dosering eller eksponeringstid. (B) Efter tværbinding drænes cellerne fra maskinens venstre side. Cellesuspensioner genvindes gennem vakuum og drænes i en glaskolbe, hvor de efterfølgende kan hældes i en vakuumfiltreringsanordning til høst. C) Vakuumfiltreringsanordninger. Disse åbnes og lukkes via et klip, og der indsættes et filter mellem det. Fire filtreringsanordninger blev brugt parallelt i meget korte tidsserier for ikke at miste tid som følge af udskiftning af filtre. D) Efter filtrering blev mediesupernatanten drænet i kolber med henblik på senere bortskaffelse. Ventiler blev installeret under vakuumfiltreringsanordningerne for at opretholde vakuumet i systemet, når filteret fjernes. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Tværbinding suspenderet vs. klæbende celler. A) Tværbindingen med Vari-X-bindingskammeret for suspensionsceller. Cellekulturen hældes i prøveindløbet (tragten) placeret øverst til højre på bakken. (B) Bakke, der kan indeholde plast- eller kvartspetriskåle til tværbinding af klæbende celler eller små mængder suspensionsceller. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Forberedelse af biblioteket. (A) Eksempel på et autoradiogram fra et Nrd1-HTP χCRAC eksperiment. Det stærke, koncentrerede signal repræsenterer proteinet tværbundet til meget korte RNA'er, mens udstrygningen ovenfor repræsenterer proteinet tværbundet til RNA'er af tilstrækkelig længde til sekventering. (B) Udstrygningen blev udskåret som vist i et autoradiogram taget efter geludskæring. (C) En repræsentativ qPCR fra et χCRAC cDNA-bibliotek. I dette eksempel blev maksimal amplifikation af cDNA'et nået ved 16 cyklusser. Således blev 16 cyklusser brugt til den endelige forstærkning. Fejllinjen repræsenterer standardafvigelsen for tre tekniske qPCR-replikater. (D) Eksempel på et fosforbillede fra et cDNA-bibliotek på en 6% TBE-gel. E) cDNA-længde og kvalitetsanalyse fra en chipbaseret kapillærelektroforese. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: High RNase-test iCLIP-eksperiment for at teste tværbinding i pattedyrceller. Vist er autoradiogrammer fra GFP-RBM7 iCLIP-eksperimenter, der testede effektiviteten af RNP-genvinding på tværs af forskellige tværbindingsenergier. Immunudfældninger blev udført ved anvendelse af anti-GFP-antistoffer koblet til magnetiske perler på tværbundne celler, som stabilt udtrykte GFP-RBM7. Immunoprecipitater blev inkuberet med høje koncentrationer af RNase I for at trimme associerede RNA'er til korte, ensartede længder. RNP'er blev visualiseret ved 32P-mærkning og SDS-PAGE og migrerer som et defineret bånd tæt på migrationen af det ikke-tværbundne protein. Kvantificering indikerer resultaterne af densitometriske analyser af radioaktivt mærket RBM7-RNA-signal normaliseret til anti-GFP western blot-signalet. (A) Tværbindingstidsforløb for den almindeligt anvendte UVP-tværbinding versus vores tværbinding (Vari-X-linker; VxL). (B) Tværbindingstidsforløb for vores tværbinding på kvarts (venstre) og plast (højre) kulturartikler. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Eksempel på genombrowserplot, der viser χCRAC's evne til at vise differentiel, tidsmæssig binding af Nrd1 til dens mål. Hver boks viser plots for individuelle genomiske regioner. Pilene angiver, hvilken streng generne er kodet på (venstre pegepil = minusstreng; højre pegepil = plusstreng). Tidspunkterne (min) er angivet med t0, t1, t2 osv. på y-akserne i hvert delområde. Romertal, der angiver kromosomerne og koordinaterne, vises. (A) Ved glukosemangel binder Nrd1 to glukosetransportører med høj affinitet, HXT6 og HXT7, som begge er opreguleret i denne tilstand. (B) Nrd1 observeres at binde til Imd3, et allerede valideret mål for Nab344, med faldende intensitet efter glukosesult. (C) Nrd1-binding af Tye7 udviser en dynamisk og forbigående karakter, der falder efter glukosesult til et minimum efter 8 minutters stress. Imidlertid vender bindingen efterfølgende tilbage til basale niveauer efter 14 min. Læsninger blev normaliseret til "læsninger pr. million" (RPM; y-akse). Grå felter angiver regioner, der koder for ikke-kodende RNA'er. Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

χCRAC-metoden kombineret med de nye krydsbindings- og cellehøstningsanordninger har et stort potentiale, fordi den kan anvendes på en lang række modelorganismer og derfor bør være af almen interesse for RNA-feltet. Der er mange områder, hvor χCRAC kan anvendes. For eksempel kan metoden bruges til at måle den hierarkiske samling af proteiner i store makromolekylære komplekser, såsom spliceosomet og ribosomet, som ofte involverer dynamiske interaktioner mellem proteiner og RNA-molekyler. Vi bruger det nu også rutinemæssigt til at overvåge interaktioner mellem RNA-henfaldsfaktorer og deres substrater, når celler udsættes for forskellige former for stress. Dette gør det muligt for os at bestemme, på hvilket stadium af det adaptive respons disse faktorer er mest aktive, hvilke substrater de binder til, og hvor dynamiske disse interaktioner er. Sådanne data skal sætte forskerne i stand til at bestemme hver enkelt faktors relative bidrag til tilpasningen til miljøændringer.

χCRAC bruger dual affinity purification tags (HTF eller HTP) til at rense proteinet under meget strenge og denaturerende betingelser. Dette sikrer, at det copurified RNA er stærkt beriget for RNA'er, der var kovalent tværbundet til proteinet af interesse. Det har dog ulemper at stole på affinitetsmærker. For eksempel kan mærket forstyrre proteinfunktionen, hvilket kan give en forvrænget aflæsning af dets RNA-bindende interaktom. Derudover er det for nogle modelorganismer måske ikke altid muligt at bruge tags, fordi de genetiske værktøjer til at integrere DNA-fragmenter i genomet eller til at transformere ekspressionsplasmider endnu ikke er tilgængelige. Det er imidlertid ligetil at ændre nogle dele af χCRAC-protokollen for at gøre den kompatibel med CLIP-baserede protokoller, der er afhængige af antistoffer til oprensning af RBP. Faktisk viste denne undersøgelse, at det er muligt at kombinere iCLIP-baserede oprensninger med vores tværbinding. Vi er nu i gang med at udvikle CLIP-protokoller til at studere den tidsmæssige sammenhæng mellem humane RNA-bindende proteiner og spirende RNA-transkripter.

Når der udføres χCRAC på et nyt protein, skal UV-eksponeringen optimeres for at inducere maksimal tværbinding. Dette er vigtigt, fordi høje UV-eksponeringer kan reducere genopretningen af RNA under rensningstrinnet. Celler, der udtrykte den rekombinante RBP, blev udsat for forskellige UV-doser, 100 mJ/cm2, 250 mJ/cm2, 500 mJ/cm2 og 1J/cm2. RNP'erne blev derefter fanget, og RNA'erne blev fragmenteret og radioaktivt mærket. Derefter blev RNP'erne løst af SDS-PAGE, og der blev taget et autoradiogram for at udlede, hvilken eksponering der gav det mest intense signal (dvs. den maksimale tværbinding).

Når forsøgsbetingelserne er optimeret, anbefales flere kontroleksperimenter ved udførelse af χCRAC. For det første kan en UV-bestrålet, umærket prøve bruges til at overvåge baggrundsbinding til rensningsperlerne. For det andet, når der anvendes χCRAC under et skifteksperiment, muliggør en anden tidsserie, hvor cellerne forskydes tilbage til det oprindelige medium, undersøgelse af, om filtreringen af cellerne selv inducerer ændringer i RNA-niveauer eller protein-RNA-interaktioner.

Som nævnt i indledningen foreslår adskillige nyligt offentliggjorte papirer en række optimeringer af CLIP-protokollen. Dette inkluderer brugen af fluorescerende mærkede adaptere til påvisning af protein-RNA-komplekset gennem infrarød scanning10 samt optimeringer til forskellige nukleinsyrerensnings- og størrelsesvalgstrin, der har vist sig at øge kompleksiteten af de resulterende biblioteker 12,45. Vi er i øjeblikket ved at gennemføre nogle af disse forbedringer for yderligere at forbedre χCRAC-protokollen. Den protokol, der præsenteres her, indeholder allerede en række forbedringer af de oprindelige CRAC- og χCRAC-protokoller, som øger dataenes kompleksitet. For eksempel blev de tidligere, efter at have opløst de tværbundne, radioaktive protein-RNA-komplekser på SDS-PAGE-geler, overført til en nitrocellulosemembran, og det tværbundne RNA blev isoleret fra blottet. Imidlertid kan overførslen af RNP og efterfølgende RNA-ekstraktion være meget ineffektiv, især når man beskæftiger sig med store RBP'er såsom RNA-polymeraseunderenheder. Dette kan resultere i en signifikant reduktion i genopretningen af det tværbundne RNA. I den nuværende protokol ekstraheres det tværbundne RNA direkte fra SDS-PAGE gelskiver som illustreret i figur 1. Dette øgede genopretningen af tværbundne RNA'er. Derudover blev produktet efter PCR-amplifikation af cDNA'erne oprindeligt opløst på 3%, agarosegeler med lav smeltetemperatur, og derefter blev 175-300 bp PCR-produkter ekstraheret fra gelen. Imidlertid kan disse geler let overbelastes, hvilket resulterer i meget dårlig adskillelse af DNA'et. Udskiftning af agarosegeler med præfabrikerede TBE-geler resulterede i mere ensartet størrelsesadskillelse og bedre genopretning af PCR-produkter.

Disclosures

A. Langford og W. Worboys er tilknyttet UVO3, et kommercielt selskab. De havde ingen rolle i undersøgelsesdesign, dataindsamling og fortolkning eller beslutningen om at indsende arbejdet til offentliggørelse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Wellcome Trust (091549 til SG og 109093/Z/15/A til S.M.), Wellcome Trust Center for Cell Biology core grant (092076) og Medical Research Council Non-Clinical Senior Research Fellowship (MR/R008205/1 til S.G.), European Molecular Biology Organization under et langsigtet postdoc-stipendium (ALTF 1070-2017 til R.A.C), og Danmarks Frie Forskningsfond (T.H.J).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,4-dithioreitol Merck 10708984001 Buffer component in mammalian cell lysis
1.5 mL tubes Eppendorf 0030 120.086 General reaction tube
2 mL tubes Eppendorf 0030 123.344 For holding columns and collection of waste
32P-yATP Perkin Elmer NEG502Z-250 For radiolabelling the 5' end of the RNA
4-12% Bis-Tris gel Invitrogen NP0321BOX SDS-PAGE gel
4X loading buffer Novex NP0008 Protein loading dye concentrate
50 bp ladder New England Biolabs N3236 Reference ladder for excising region of interest from the amplified cDNA library
50% PEG NEB B100045 For the L5 linker ligation
6% TBE gel Invitrogen EC6265BOX For separation and purification of the cDNA library
Acetone ACROS Organics 423245000 Washing of TCA-precipitated proteins
anti-FLAG beads Sigma Aldrich M8823-1ML For purifcation of FLAG-tagged RBPs
ATP (100 mM) Thermo Fisher Scientific R0441 For ligation of the L5 linker onto the 5' end of captured RNAs
Beta-mercaptoethanol Sigma Aldrich M3148-100ML Buffer component
Biomax MS intensifying screen Sigma Aldrich Z363162-1EA For intensifying the autoradiogram signal
Chloroform Thermo Fisher Scientific 1010219 For phenol-chloroform extraction following RNA purification
cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail Roche 11873580001 For inhibition of cellular proteases after lysis
Complete supplement mixture -TRP Formedium DCS0149 For preparation of synthetic defined medium
Costar Spin-X 0.22 µm filters Sigma Aldrich CLS8160 For isolating the excised cDNAs following gel extraction
DNase RQ1 Promega M6101 For DNA digest following cell lysis
dNTPs (10 mM) Sigma Aldrich 4638956001 For reverse transcription and PCR
Ethanol Thermo Fisher Scientific 10041814 For phenol-chloroform extraction following RNA purification and DNA precipitation
Ethylenediaminetetraacetic acid Invitrogen AM9261 For protease K buffer
Exonuclease I New England Biolabs M0293 For degradation of primers following PCR
Glass microfiber filters Whatman 1823-010 For isolating the excised cDNAs following gel extraction
Glucose Formedium GLU03 For preparation of glucose-containing, synthetic defined medium
Glycogen (20 mg/mL) Roche 10901393001 Precipitation of proteins, RNA and DNA
GST-TEV Homemade Construct and purification protocol is available upon request
Guanidium hydrochloroide Thermo Fisher Scientific 10071503 Required for pulldown denaturing conditions and washing buffer
IgG beads GE Healthcare 17-0969-01 For purification of protein A-tagged RBPs
Imidazole Sigma Aldrich I2399-100G For elution of captured proteins from Nickel beads
Isoamyl alcohol Thermo Fisher Scientific A393-500 For phenol-chloroform extraction following RNA purification
Luna Universal One-Step RT-qPCR NEB E3005S For qPCR of the cDNA in order to calculate required number of PCR cycles
Magnesium chloride Fluka Analytical 63020-1L For PNK buffer
Membrane filters Millipore AAWP09000 for yeast or HAWP09000 for bacteria For vacuum filtration of cells
Micro bio-spin columns Biorad 732-6204 For collecting eluate after gel extraction
Ni-NTA beads Qiagen 30210 For secondary protein capture
NP-40 Sigma Aldrich I8896-100ML Buffer component
Pfu polymerase Promega M7741 For amplification of the cDNA library
Phenol Sigma Aldrich P4682-400ML For phenol-chloroform extraction following RNA purification
Pierce spin columns Thermo Fisher Scientific 69725 For on-column enzymatic reactions
Protease K Roche 3115887001 For degradation of the RBP following gel extraction
Quartz Petri dish UVO3 N/A For cross-linking of adherent cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 400 GBP
Radiography films Amersham 28906843 For autoradiography visualisation
RNAClean XP beads Beckmann A63987 SPRI beads for clean up of RNAs and cDNAs
RNase H New England Biolabs M0297 For degradation of RNAs following reverse transcription
RNase-It Agilent 400720 For RNA digestion
rRNasin Promega N2511 For inhibition of any contaminating RNases during enzymatic reaction
Sodium acetate Sigma Aldrich S2889-1KG For phenol-chloroform extraction following RNA purification and DNA precipitation
Sodium chloride Thermo Fisher Scientific 7647-14-5 Buffer component
Sodium deoxycholate Sigma Aldrich D6750-100G Buffer component in mammalian cell lysis
Sodium dodecylsulfate Sigma Aldrich L3771-1KG For protease K buffer
SUPERase-In Invitrogen AM2694 For inhibition of cellular RNases after lysis
SuperScript IV Thermo Fisher Scientific 18090010 For reverse transcription
T4 PNK New England Biolabs M0201 For radiolabelling the 5' end of the RNA
T4 RNA ligase 1 New England Biolabs M0204 For ligation of the L5 adaptor onto the RNA 5' end
T4 RNase ligase 2, truncated K222Q NEB M0351S For ligation of the App_PE linker onto the 3' end of captured RNAs
TBE buffer (10X) Invitrogen 15581-028 For running TBE gels
TEV protease Homemade For eluting captured proteins following FLAG capture
Thermosensitive alkaline phosphatase Promega M9910 For 5' and 3' dephosphorylation of RNAs
Trichloroacetic acid (100%) Sigma Aldrich T0699-100ML For precipitation of RBP-RNA complexes
Tris hydrochloride Invitrogen 15504-020 Buffer component
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787-100ML Buffer component in mammalian cell lysis
Vari Filter UVO3 N/A Device for vacuum harvesting cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 100 GBP
Vari-X-Linker UVO3 N/A Cross-linker for cross-linking cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 16,000 GBP
Yeast nitrogen base Formedium CYN0410 For preparation of synthetic defined medium
Zirconia beads Thistle 11079105Z for yeast or 11079101Z for bacteria For cell lysis via bead beating

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ule, J., et al. CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain. Science. 302 (5648), 1212-1215 (2003).
  2. Granneman, S., Kudla, G., Petfalski, E., Tollervey, D. Identification of protein binding sites on U3 snoRNA and pre-rRNA by UV cross-linking and high-throughput analysis of cDNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (24), 9613-9618 (2009).
  3. Licatalosi, D. D., et al. HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing. Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).
  4. König, J., et al. iCLIP reveals the function of hnRNP particles in splicing at individual nucleotide resolution. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (7), 909-915 (2010).
  5. Hafner, M., et al. Transcriptome-wide Identification of RNA-Binding Protein and MicroRNA Target Sites by PAR-CLIP. Cell. 141 (1), 129-141 (2010).
  6. Aktaş, T., et al. DHX9 suppresses RNA processing defects originating from the Alu invasion of the human genome. Nature. 544 (7648), 115-119 (2017).
  7. Huppertz, I., et al. iCLIP: Protein–RNA interactions at nucleotide resolution. Methods. 65 (3), 274-287 (2014).
  8. Li, X., et al. Comprehensive in vivo RNA-binding site analyses reveal a role of Prp8 in spliceosomal assembly. Nucleic Acids Research. 41 (6), 3805-3818 (2013).
  9. Rosenberg, M., et al. Denaturing CLIP, dCLIP, Pipeline Identifies Discrete RNA Footprints on Chromatin-Associated Proteins and Reveals that CBX7 Targets 3′ UTRs to Regulate mRNA Expression. Cell Systems. 5 (4), 368-385 (2017).
  10. Zarnegar, B. J., et al. irCLIP platform for efficient characterization of protein–RNA interactions. Nature Methods. 13 (6), 489-492 (2016).
  11. Kargapolova, Y., Levin, M., Lackner, K., Danckwardt, S. sCLIP—an integrated platform to study RNA–protein interactomes in biomedical research: identification of CSTF2tau in alternative processing of small nuclear RNAs. Nucleic Acids Research. 45 (10), 6074-6086 (2017).
  12. Van Nostrand, E. L., et al. Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP). Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).
  13. Flynn, R. A., et al. Dissecting noncoding and pathogen RNA–protein interactomes. RNA. 21 (1), 135-143 (2015).
  14. Brugiolo, M., Botti, V., Liu, N., Müller-McNicoll, M., Neugebauer, K. M. Fractionation iCLIP detects persistent SR protein binding to conserved, retained introns in chromatin, nucleoplasm and cytoplasm. Nucleic Acids Research. 45 (18), 10452-10465 (2017).
  15. Sanford, J. R., et al. Identification of Nuclear and Cytoplasmic mRNA Targets for the Shuttling Protein SF2/ASF. PLOS ONE. 3 (10), e3369 (2008).
  16. Garzia, A., Meyer, C., Morozov, P., Sajek, M., Tuschl, T. Optimization of PAR-CLIP for transcriptome-wide identification of binding sites of RNA-binding proteins. Methods. 118-119, 24-40 (2017).
  17. Windhager, L., et al. Ultrashort and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution. Genome Research. 22 (10), 2031-2042 (2012).
  18. Chen, K., et al. High-Resolution N6-Methyladenosine (m6A) Map Using Photo-Crosslinking-Assisted m6A Sequencing. Angewandte Chemie International Edition. 54 (5), 1587-1590 (2015).
  19. Ke, S., et al. A majority of m6A residues are in the last exons, allowing the potential for 3′ UTR regulation. Genes & Development. 29 (19), 2037-2053 (2015).
  20. Linder, B., et al. Single-nucleotide-resolution mapping of m6A and m6Am throughout the transcriptome. Nature Methods. 12 (8), 767-772 (2015).
  21. Kudla, G., Granneman, S., Hahn, D., Beggs, J. D., Tollervey, D. Cross-linking, ligation, and sequencing of hybrids reveals RNA–RNA interactions in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (24), 10010-10015 (2011).
  22. Sugimoto, Y., et al. hiCLIP reveals the in vivo atlas of mRNA secondary structures recognized by Staufen 1. Nature. 519 (7544), 491-494 (2015).
  23. Hwang, H. W., et al. cTag-PAPERCLIP Reveals Alternative Polyadenylation Promotes Cell-Type Specific Protein Diversity and Shifts Araf Isoforms with Microglia Activation. Neuron. 95 (6), 1334-1349 (2017).
  24. Hwang, H. W., et al. PAPERCLIP Identifies MicroRNA Targets and a Role of CstF64/64tau in Promoting Non-canonical poly(A) Site Usage. Cell Reports. 15 (2), 423-435 (2016).
  25. Lee, F. C. Y., Ule, J. Advances in CLIP Technologies for Studies of Protein-RNA Interactions. Molecular Cell. 69 (3), 354-369 (2018).
  26. Beckmann, B. M. RNA interactome capture in yeast. Methods. 118-119, 82-92 (2017).
  27. Granneman, S., Petfalski, E., Tollervey, D. A cluster of ribosome synthesis factors regulate pre-rRNA folding and 5.8S rRNA maturation by the Rat1 exonuclease. The EMBO Journal. 30 (19), 4006-4019 (2011).
  28. Schaughency, P., Merran, J., Corden, J. L. Genome-Wide Mapping of Yeast RNA Polymerase II Termination. PLOS Genetics. 10 (10), e1004632 (2014).
  29. Bernstein, J. A., Khodursky, A. B., Lin, P. H., Lin-Chao, S., Cohen, S. N. Global analysis of mRNA decay and abundance in Escherichia coli at single-gene resolution using two-color fluorescent DNA microarrays. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (15), 9697-9702 (2002).
  30. Kresnowati, M. T. A. P., et al. When transcriptome meets metabolome: fast cellular responses of yeast to sudden relief of glucose limitation. Molecular Systems Biology. 2, 49 (2006).
  31. Marguerat, S., Lawler, K., Brazma, A., Bähler, J. Contributions of transcription and mRNA decay to gene expression dynamics of fission yeast in response to oxidative stress. RNA Biology. 11 (6), 702-714 (2014).
  32. van Nues, R., et al. Kinetic CRAC uncovers a role for Nab3 in determining gene expression profiles during stress. Nature Communications. 8 (1), 12 (2017).
  33. Selinger, D. W., Saxena, R. M., Cheung, K. J., Church, G. M., Rosenow, C. Global RNA Half-Life Analysis in Escherichia coli Reveals Positional Patterns of Transcript Degradation. Genome Research. 13 (2), 216-223 (2003).
  34. Tudek, A., Candelli, T., Libri, D. Non-coding transcription by RNA polymerase II in yeast: Hasard or nécessité? Biochimie. 117, 28-36 (2015).
  35. Lingaraju, M., et al. The MTR4 helicase recruits nuclear adaptors of the human RNA exosome using distinct arch-interacting motifs. Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).
  36. Lubas, M., et al. Interaction Profiling Identifies the Human Nuclear Exosome Targeting Complex. Molecular Cell. 43 (4), 624-637 (2011).
  37. Conrad, N. K., et al. A yeast heterogeneous nuclear ribonucleoprotein complex associated with RNA polymerase II. Genetics. 154 (2), 557-571 (2000).
  38. Darby, M. M., Serebreni, L., Pan, X., Boeke, J. D., Corden, J. L. The Saccharomyces cerevisiae Nrd1-Nab3 Transcription Termination Pathway Acts in Opposition to Ras Signaling and Mediates Response to Nutrient Depletion. Molecular and Cellular Biology. 32 (10), 1762-1775 (2012).
  39. Webb, S., Hector, R. D., Kudla, G., Granneman, S. PAR-CLIP data indicate that Nrd1-Nab3-dependent transcription termination regulates expression of hundreds of protein coding genes in yeast. Genome Biology. 15 (1), R8 (2014).
  40. Jensen, T. H., Jacquier, A., Libri, D. Dealing with Pervasive Transcription. Molecular Cell. 52 (4), 473-484 (2013).
  41. van Dijk, E. L., et al. XUTs are a class of Xrn1-sensitive antisense regulatory non-coding RNA in yeast. Nature. 475 (7354), 114-117 (2011).
  42. Thiebaut, M., et al. Futile Cycle of Transcription Initiation and Termination Modulates the Response to Nucleotide Shortage in S. cerevisiae. Molecular Cell. 31 (5), 671-682 (2008).
  43. Merran, J., Corden, J. L. Yeast RNA-Binding Protein Nab3 Regulates Genes Involved in Nitrogen Metabolism. Molecular and Cellular Biology. 37 (18), e00154-e00117 (2017).
  44. Bresson, S., Tuck, A., Staneva, D., Tollervey, D. Nuclear RNA Decay Pathways Aid Rapid Remodeling of Gene Expression in Yeast. Molecular Cell. 65 (5), 787-800 (2017).
  45. Buchbender, A., et al. Improved library preparation with the new iCLIP2 protocol. Methods. , (2019).

Tags

Biokemi udgave 159 CRAC KLIP RNA-proteininteraktion UV-tværbinding teknik stressrespons tidsløst

Erratum

Formal Correction: Erratum: Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using χCRAC
Posted by JoVE Editors on 02/17/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using χCRAC. The Authors section was updated from:

Stuart W. McKellar1
Ivayla Ivanova1
Robert W. van Nues2
Ross A. Cordiner3
Will Worboys4
Andrew Langford4
Torben Heick Jensen3
Sander Granneman1
1Centre for Synthetic and Systems Biology, University of Edinburgh
2Institute of Cell Biology, University of Edinburgh
3Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, 4UVO3 Ltd.

to:

Stuart W. McKellar1
Ivayla Ivanova1
Robert W. van Nues2
Ross A. Cordiner3
Mehak Chauhan1
Niki Christopoulou1
Will Worboys4
Andrew Langford4
Torben Heick Jensen3
Sander Granneman1
1Centre for Engineering Biology, University of Edinburgh
2Institute of Cell Biology, University of Edinburgh
3Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, 4UVO3 Ltd.

Overvågning af protein-RNA-interaktionsdynamik in vivo ved høj tidsmæssig opløsning ved hjælp af χCRAC
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McKellar, S. W., Ivanova, I., van… More

McKellar, S. W., Ivanova, I., van Nues, R. W., Cordiner, R. A., Chauhan, M., Christopoulou, N., Worboys, W., Langford, A., Jensen, T. H., Granneman, S. Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using χCRAC. J. Vis. Exp. (159), e61027, doi:10.3791/61027 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter