Summary
Här presenteras standardiserade protokoll för att bedöma induktion av värmechocksvaret (HSR) i Caenorhabditis elegans med RT-qPCR på molekylär nivå, fluorescerande reportrar på cellnivå och termorecovery på organismnivå.
Abstract
Värmechocksvaret (HSR) är ett cellulärt stressrespons som framkallas av cytosoliska proteinmissvikningar som fungerar för att återställa proteinvikning homeostas, eller proteostas. Caenorhabditis elegans upptar en unik och kraftfull nisch för HSR-forskning eftersom HSR kan bedömas på molekylära, cellulära och organismala nivåer. Därför kan förändringar på molekylär nivå visualiseras på cellnivå och deras inverkan på fysiologi kan kvantifieras på organismnivå. Medan analyser för att mäta HSR är enkla, variationer i timing, temperatur och metod som beskrivs i litteraturen gör det svårt att jämföra resultat över studier. Dessutom fungerar dessa frågor som ett hinder för alla som vill införliva HSR-analys i sin forskning. Här presenteras en serie protokoll för mätning av induktion av HSR på ett robust och reproducerbart sätt med RT-qPCR, fluorescerande reportrar och en organismisk thermorecovery analys. Dessutom visar vi att en allmänt använd termotolerance analys inte är beroende av den väletablerade huvudregulator av HSR, HSF-1, och därför inte bör användas för HSR forskning. Slutligen, variationer i dessa analyser som finns i litteraturen diskuteras och bästa praxis föreslås för att standardisera resultat över hela området, i slutändan underlätta neurodegenerativa sjukdomar, åldrande, och HSR forskning.
Introduction
Värmechockresponsen (HSR) är ett universellt cellulärt stressrespons som orsakas av cytosoliska proteinmissvikningar orsakade av temperaturökningar och andra proteotoxiska påfrestningar. Aktivering av HSR i Caenorhabditis elegans leder till transkriptionella uppreglering av värmechockgener som hsp-70 och hsp-16.2. Många värmechockproteiner (HSP) fungerar som molekylära förkläde som återställer proteinvikbara homeostas, eller proteostas, genom att direkt interagera med felvikta eller skadade proteiner. Huvudregulatorn för HSR är transkriptionsfaktorn Heat Shock Factor 1 (HSF-1), vars aktivering är elegant kontrollerad via flera mekanismer1.
Rollen av HSF-1 är inte begränsad till stress. HSF-1 krävs för normal tillväxt och utveckling, eftersom radering av hsf-1 leder till larvgripande2. HSF-1 är också viktigt under åldrande och åldersrelaterade neurodegenerativa sjukdomar som kännetecknas av ackumulering av proteinaggregat och en oförmåga att upprätthålla proteostas. Knockdown av hsf-1 orsakar ansamling av proteinaggregat och en förkortad livslängd, medan överuttryck av hsf-1 minskar proteinaggregering och förlängerlivslängden 3,4. Därför har reglering av HSF-1 på molekylär nivå breda konsekvenser för organismfysiologi och sjukdom.
C. elegans är en kraftfull modell organism för HSR forskning eftersom HSR kan mätas på molekylära, cellulära och organismala nivåer4,,5,6. Belysa kraften i denna modell, viktiga framsteg i delineating HSR utbildningsavsnitt, såsom vävnadsspecifika skillnader i HSR reglering, har upptäckts i C. elegans7,8. Dessutom används C. elegans i stor utsträckning för åldrande forskning och är ett framväxande system för modellering av sjukdomar kopplade till proteostasstörningar.
Även om värmechocksexperiment med C. elegans kan vara snabba och reproducerbara, finns det flera frågor att tänka på innan du börjar. Till exempel, vilken temperatur ska användas för induktion av HSR och hur länge ska maskarna exponeras? Är det bättre att använda en torr inkubator eller ett vattenbad? Vilket utvecklingsstadium ska användas? Tyvärr varierar de metoder som används för att undersöka HSR kraftigt från laboratorium till laboratorium, vilket orsakar förvirring när man väljer de bästa metoderna och gör det svårt att jämföra resultat över hela fältet.
Vi presenterar robusta och standardiserade protokoll för att använda RT-qPCR, fluorescerande reportrar och thermorecovery för att mäta HSR. Även om dessa tre metoder kompletterar varandra, har de var och en unika fördelar och nackdelar. Till exempel är RT-qPCR den mest direkta och kvantitativa mätningen av HSR, och denna analys kan enkelt utökas till att omfatta många olika värmechock-inducerbara gener. Dock är RT-qPCR den dyraste, kan vara tekniskt svårt, och kräver användning av specialiserad utrustning. Däremot har fluorescerande reportrar fördelen att mäta vävnadsspecifika skillnader i HSR-induktion. De är dock svåra att kvantifiera exakt, kan bara mäta induktion över en viss tröskel och kräva användning av ett fluorescensmikroskop. Dessutom är de reporterstammar som beskrivs här utvecklingsmässigt försenade jämfört med standard N2-stammen. Även om nyare reporter stammar som innehåller single-copy transgener finns tillgängliga, har de inte testats här9. Den tredje analysen, termorecovery, har fördelen av att ge en fysiologiskt relevant avläsning på organismnivå. Emellertid, denna analys är utan tvekan den minst känsliga och mest indirekta. Slutligen diskuterar vi några vanliga variationer som finns i dessa analyser och föreslår en uppsättning bästa praxis för att underlätta forskning på detta område.
Protocol
1. Underhåll och synkronisering av C. elegans
- Underhåll maskar vid 20 °C på Nematode Growth Medium (NGM) plattor sådd med OP50 Escherichia coli bakterier genom att överföra flera vuxna till färska plattor ca 2x per vecka10. Försiktighet bör iakttas för att förhindra att maskar får på mat, eftersom detta kan påverka deras fysiologi11.
- Beredning av NGM-plattor.
- Blanda 3 g NaCl, 2,5 g Bacto-pepton, 20 g agar och avjoniserad (DI) H2O upp till 1 L i en kolv.
- Autoklav blandningen för sterilisering.
- Låt blandningen svalna till ~50 °C.
- Tillsätt 25 ml 1 M KH2PO4 (pH = 6), 1 ml 1 M CaCl2,1 ml 1 M MgSO4och 1 ml kolesterol (5 mg/ml i 100% etanol).
- Med hjälp av steril teknik, häll blandningen i 6 cm plattor för att ge cirka 100 plattor. Hällplattor är lättare om blandningen först överförs till en 300 ml steril bägare.
- Låt 1 dag stelna vid rumstemperatur (RT) innan du sådd med bakterier eller förvara vid 4 °C.
- Sådd av OP50 bakterier på NGM plattor.
- Odla en mättad OP50-bakterieodling över natten i LB vid 30 °C eller 37 °C.
- Placera ungefär 300 μL av kulturen på mitten av en 6 cm NGM platta.
- Låt plattorna torka vid RT i 1-3 dagar efter behov för att bakteriemattan ska kunna fästas på plattan. Plattor kan sedan användas eller förvaras vid 4 °C.
- Beredning av NGM-plattor.
- Odla maskarna synkront antingen genom att isolera nylagda ägg (beskrivs här) eller alternativt genom att samla ägg efter upplösning av maskar med blekmedel.
- Överför cirka 10 gravid vuxna maskar till en ny tallrik med hjälp av en platina tråd plocka. Ägg-låg synkronisering fungerar bäst om de vuxna är i den första dagen av vuxen ålder.
- Efter ca 1 h, ta bort maskarna från plattan. Detta bör resultera i 40-60 ägg per tallrik, beroende på förhållandena och stammen.
2. Fluorescerande avbildning av HSR-reportrar
- Synkronisera maskarna (avsnitt 1.2) och håll kvar vid 20 °C tills det önskade utvecklingsstadiet. För AM446(hsp-70p::gfp)och CL2070 (hsp-16.2p::gfp)fluorescerande reporter stammar, unga vuxna maskar som ännu inte har nått reproduktiv mognad genereras 64 h efter äggläggning synkronisering.
OBS: Utvecklingstidsinställningen varierar med varje stam och den temperatur vid vilken maskarna höjs. Båda HSR reporter stammar uppvisar en liten utvecklingsmässiga dröjsmål i förhållande till N2. Viktigt, nedgången storlek av HSR induktion ungefärligt 2-4x efter uppkomsten av reproduktiv mognad (se Diskussion). - Värme chockmaskarna genom att slå in plattor med paraffinfilm och doppa i ett cirkulerande vattenbad vid 33 °C i 1 h. En tunn remsa av paraffinfilm bör lindas 2x runt plattan för att täta kanterna. Täck inte över botten av plattan eller det kan störa värmeöverföringen. Sänk plattorna upp och ner med hjälp av ett provrörsställ och en blyvikt. Kom ihåg att inkludera ett negativt kontrollprov (ingen värmechock) om det behövs.
OBS: Om paraffinfilmen inte är säker kommer vattnet in i plattan och plattan ska inte användas för datainsamling. - Återställ maskarna genom att ta bort plattorna från vattenbadet och torka med en pappershandduk. Ta bort paraffinfilmen och inkubera maskarna vid 20 °C i 6-24 timmar. Denna återhämtningsperiod ger tillräckligt med tid för GFP-syntes och vikning före avbildning.
- Förbered bilder för bildbehandling. Diabilder bör beredas färska för varje användning.
- Gör en 3% agaroslösning i vatten och värme med hjälp av en mikrovågsugn tills agaroset är upplöst.
- Placera ett mikroskop bild för bildbehandling mellan två andra mikroskop diabilder som har en remsa av laboratorietejp på dem för att skapa en distans för agarose pad.
- Använd en 1 000 μl pipett och placera en droppe (~150 μL) av den uppvärmda 3% agarose i mitten av mikroskopbilden.
- Täck omedelbart mikroskopbilden med en tom mikroskoprutschbana vinkelrätt mot den första bilden så att den övre bilden vilar på laboratorietejpen på de intilliggande rutschbanorna. Detta sprider ut droppe agarose för att skapa en pad av enhetlig bredd.
- Ta försiktigt bort den övre bilden.
- Immobilisera maskarna med hjälp av en 200 μL pipett för att lägga till en liten droppe (~5 μL) på 1 mM levamisole i M9-bufferten till mitten av agarose pad. Överför sedan 10 maskar till droppe levamisole med hjälp av en platinatrådsval. Täck med ett täckslip. Tätning av täcket är inte nödvändigt för ett upprätt mikroskop. Alternativt kan maskarna anpassas när de blir förlamade genom att sprida levamisole av, på utsidan av agarose pad, och anpassa maskar med en platina tråd plocka. Alternativt kan levamisole indränkt med hjälp av ett laboratorium torka.
OBS: Bild så snart som möjligt, eftersom långvarig inkubation i levamisole kan förändra fluorescens. - Bild av maskarna med hjälp av ett fluorescensmikroskop. Detaljerna i bildtagningen varierar beroende på mikroskop och programvara.
Om du vill jämföra bildintensiteter direkt använder du identiska mikroskopinställningar i en bildsession. Undvik att överuppsema bilden.
3. Mätning av HSR genuttryck med RT-qPCR
- Synkronisera maskar (avsnitt 1.2) och håll kvar vid 20 °C tills det önskade utvecklingsstadiet. För N2 maskar, unga vuxna maskar som ännu inte har nått reproduktiv mognad genereras 60 h efter äggläggning synkronisering.
OBS: Utvecklingstidsinställningen varierar med varje stam och den temperatur vid vilken maskarna höjs. Viktigt, nedgången storlek av HSR induktion ungefärligt 2-4x efter uppkomsten av reproduktiv mognad (se Diskussion). - Värmechockmaskar enligt beskrivningen i steg 2.2.
- Ta plattorna ur vattenbadet, ta bort paraffinfilmen och samla omedelbart maskarna. Maskarna kan samlas in genom att tvätta plattorna försiktigt med 1 ml M9, samla vätskan i ett mikrocentrifugrör och sedan ta bort M9 efter centrifugering vid 400 x g i 1 min.
- Lyse maskarna och rena RNA med hjälp av organisk extraktion.
- Tillsätt 250 μl RNA-isoleringsreagens (se Tabell över material).
- Vortexrör för hand i 30 s.
- Virvelrör i 20 min vid 4 °C med hjälp av ett mikrocentrifugrörsfäste (se Tabell över material).
- Tillsätt 50 μL kloroform.
- Vortex för 30 s.
- Inkubera proverna på RT i 3 min.
- Centrifug vid ≥14 000 x g i 15 min vid 4 °C.
- Överför vattenskiktet (t.ex. toppskiktet, ~125 μL) till ett nytt mikrocentrifugrör.
OBS: Undvik det organiska skiktet och materialet i gränssnittet. - Tillsätt 50 μL kloroform.
- Vortex för 30 s.
- Inkubera proverna på RT i 3 min.
- Centrifug vid ≥14 000 x g i 5 min vid 4 °C.
- Överför vattenskiktet (~100 μL) till ett nytt mikrocentrifugrör.
OBS: Undvik det organiska skiktet och materialet i gränssnittet. - Fäll ut RNA med samma volym (dvs. 100 μL) isopropanol.
- Inkubera vid -20 °C i minst 30 min, men helst över natten.
OBS: Experimentet kan pausas här och RNA kan lagras vid -20 °C. - Pellet RNA genom centrifugering vid ≥14 000 x g för ≥30 min vid 4 °C.
- Ta bort så mycket av supernatanten som möjligt utan att störa pelleten.
PELLETen är liten och kanske inte synlig. Pelleten kanske inte sitter tätt på sidan av röret, så försiktighet är nödvändig för att undvika att lossa den. - Tvätta pelleten med 250 μL 70% iskall etanol gjord med RNase-fri H2O.
- Centrifug vid ≥14 000 x g i ≥5 min vid 4 °C.
- Ta bort så mycket supernatant som möjligt utan att störa pelleten.
- Utför en snabb snurr på RT för att ta bort eventuella återstående 70% etanol.
- Torka pelleten genom att lämna rören öppna vid RT så länge det behövs; vanligtvis minst 20 min. Rör kan täckas med en luddfri vävnad eller aluminiumfolie för att förhindra kontaminering.
- Resuspend pelleten i 20 μL RNase-fria H2O.
- Bestäm RNA-koncentrationen med hjälp av en liten volymspektrofotometer (2 μL).
OBS: Experimentet kan pausas här och RNA kan tillfälligt lagras vid eller under -20 °C.
- Ta bort kvarvarande DNA genom att ruva med DNase I. Det rekommenderas att använda en utrustning som är tillgänglig i kommersiellt bruk (se Materialförteckning)och att följa tillverkarens anvisningar.
- Med detta kit, förbereda en 20 μL reaktion med 500 ng RNA och 1 μL DNase I i ett 37 °C vattenbad i 30 min.
- Tillsätt 2,5 μl DNase-reagens för inaktivering (ingår i satsen) till varje prov och inkubera vid RT i 5 min med tillfällig snärtning/virvelning.
- Spin ner på 14.000 x g för 2 min.
- Utan att störa den vita pelleten, överför 15 μL supernatant till en ny mikrotube för cDNA-syntes.
- Genomföra cDNA-syntes. Det rekommenderas att använda en utrustning som är tillgänglig i kommersiellt bruk (se Materialförteckning)och att följa tillverkarens anvisningar.
- Med satsen, förbered en 20 μL reaktion med 15 μL DNase I-behandlat RNA från föregående steg och 1 μl omvänd transkriptas.
- Använd följande program för cDNA-syntes: 25 °C i 5 min, 46 °C i 20 min, 95 °C i 1 min, 4 °C håll.
- Späd cDNA genom att tillsätta 80 μL RNase-fritt H2O direkt till provet.
- Kort virvel, snurra sedan ner och förvara på -20 °C tills det behövs.
- Utför qPCR. Det rekommenderas att använda en utrustning som är tillgänglig i kommersiellt bruk (se Materialförteckning)och att följa tillverkarens anvisningar.
- Med satsen, förbered en 25 μL reaktion som innehåller 2 μL cDNA och 200 nM (vardera) av framåt och omvända grundfärger i en brunn av en 96-brunnsplatta.
- Primersekvenser för mätning av värmechockgener, hsp-70 och hsp-16.2och 18S rRNA (för normaliseringskontroll) listas i tabellen över material. Flera normaliseringskontroller kan användas som önskat.
- Späd cDNA-prover 50x före mätning av 18S för att säkerställa att analysen är i det linjära området. Lämpliga qPCR-villkor varierar med de satser och grundfärger som används (se Representativa resultat).
- Använd ett PCR-detekteringssystem i realtid (se Materialförteckning)för qPCR med 40 cykler på 95 °C för 5 s denaturering, 58 °C för 30 s glödgning och 72 °C för förlängning med 30 s.
Optimal glödgningstemperatur kan variera beroende på grundfärger och förhållanden. - Kvantifiera med hjälp av antingen ΔΔCt eller standardkurvametod12.
4. Termorecovery analys för mätning av HSR på organismnivå
- Synkronisera maskarna (avsnitt 1.2) och håll kvar vid 20 °C tills det önskade utvecklingsstadiet. För N2 maskar, unga vuxna maskar som ännu inte har nått reproduktiv mognad genereras 60 h efter äggläggning synkronisering.
OBS: Utvecklingstidsinställningen varierar med varje stam och den temperatur vid vilken maskarna höjs. Viktigt, nedgången storlek av HSR induktion ungefärligt 2-4x efter uppkomsten av reproduktiv mognad (se Diskussion). - Värme chock maskarna som beskrivs i steg 2.2 för 6 h.
- Ta bort plattorna från vattenbadet, ta bort paraffinfilmen och låt maskarna återhämta sig genom inkubation vid 20 °C i 48 timmar.
- Räkna antalet maskar som omedelbart kan krypa bort efter mekanisk stimulering utan ryckig rörelse eller förlamning.
OBS: 6 h inkubationen är optimal för att undersöka förhållanden som minskar termoskydd, men längre exponeringstider kan behövas för att leta efter förhållanden som förbättrar termoskydd.
Representative Results
Med hjälp av de protokoll som beskrivs i detta manuskript mättes HSR-induktion med hjälp av fluorescerande reportrar, RT-qPCR och termorecovery-analyser. I varje enskilt fall användes förfarandet i avsnitt 1.2 för att generera synkroniserade, unga vuxna maskar som inte hade nått reproduktiv mognad.
För att visualisera HSR induktion på cellnivå analyserades AM446(hsp-70p::gfp)och CL2070 (hsp-16.2p::gfp) fluorescerande reporter stammar efter avsnitt 2 i protokollet. I de negativa kontrollproverna utan värmechock visade hsp-16.2-reportern bara normal autofluorescens, men hsp-70-reportern hade konstituerande fluorescens i analdepressormuskeln som tidigare rapporterats4 (Figur 1A). Efter 1 h värmechock vid 33 °C observerades robust fluorescens hos båda reportrarna. Uttrycksmönstret var dock tydligt beroende på vilken reporter som användes (figur 1B). HSP-70 reporter var starkast i tarmen och spermatheca, medan hsp-16,2 reporter var smartast i svalget. Dessutom hade hsp-16.2 reporter en hög grad av mask-till-mask variabilitet i mängden induktion som tidigare beskrivits, men hsp-70 reporter inte13.
En vanlig variant av avsnitt 2 är att utföra värmestöten i en torr inkubator i stället för ett cirkulerande vattenbad. Därför testades också skillnaden mellan de två metoderna. Det konstaterades att båda protokollen resulterade i robust induktion av de två fluorescerande reportrarna med våra villkor, även om ett cirkulerande vattenbad rekommenderas som bästa praxis (se Diskussion) (figur 1B).
För att testa oberoendet av reportrar på transkriptionsfaktor HSF-1, utfodring RNAi användes för att knockdown hsf-1 innan reporter induktion mättes. Det konstaterades att fluorescens av båda stammarna var kraftigt reducerad vid HSF-1 knockdown, vilket tyder på att dessa reportrar är HSF-1-beroende enligt beskrivningen i litteraturen4 (Figur 2). Emellertid, Det observerades också att faryngala fluorescens kvarstod i båda reportrar på hsf-1 knockdown, vilket är förenligt med tidigare rapporter om att faryngala muskeln är resistent mot RNAi genom utfodring14.
För att kvantifiera hela mask induktion av HSR på molekylär nivå, två endogena HSPs mättes med RT-qPCR med hjälp av avsnitt 3 i protokollet. Prover mättes i tre exemplar, en standardkurva genererades för var och en av grundfärgerna och en smältkurva analyserades för varje prov för kvalitetskontroll. Det konstaterades att en 33 °C värmechock för 1 h resulterade i mer än en 2000x ökning av relativa uttryck för två värmechockgener, HSP-70 och HSP-16.2 (Figur 3). Dessa resultat visar att båda endogena gener är lämpliga för mätning av HSR-induktion och att en 33 °C värmechock för 1 h är tillräcklig för att generera en betydande respons. Försiktighet bör dock iakttas vid tolkning av den absoluta graden av värmechockinduktion, eftersom mRNA-nivåerna i avsaknad av värmechock är mycket låga.
För att analysera en fysiologisk reaktion på värmechock testades en organism termoupptäcktanalys med hjälp av avsnitt 4 i protokollet. Det konstaterades att exponering av maskar till en 6 h värmechock vid 33 °C ledde till en 20% minskning av maskar med normal rörelse efter en 48 h återhämtning (figur 4A). Beroendet av denna analys på HSF-1 transkriptionsfaktorn testades med utfodring RNAi att knockdown hsf-1 innan utsätta maskar till stress. Det konstaterades att knockdown av hsf-1 orsakade en dramatisk minskning av normal rörelse, med >95% av maskar visar ryckig rörelse eller förlamning efter att prodded med en platina tråd plocka.
Vi jämförde denna thermorecovery analys till en allmänt använd alternativ organismal analys som vanligen kallas thermotolerance. I termotolerance analysen, maskar utsätts för en kontinuerlig 35 ° C temperatur med hjälp av en torr inkubator, och andelen maskar vid liv mäts vid olika tidpunkter. Med hjälp av denna analys konstaterades det att kontrollmaskar som kontinuerligt exponerades för 35 °C dog efter cirka 8 timmar exponering (figur 4B). Men när beroendet av denna analys på HSF-1 testades med RNAi knockdown, konstaterades det att hämning av hsf-1 inte orsakade en minskning av thermotolerance. Liknande resultat har tidigare visats med HSF-1 mutationer (se Diskussion). Därför rekommenderas inte användning av termotoleranceanalysen för att mäta HSR, och termorecovery är den bästa metoden för att undersöka HSR på organismnivå.
Figur 1: HSR-induktion mätt med fluorescerande reportrar. (A)Det basala och(B)värmeinducerbara uttrycket för hsp-70p::gfp och hsp-16.2p::gfp-reporterstammar efter 1 h värmechock vid 33 °C i ett vattenbad eller inkubator. Maskar höjdes på OP50 bakterier för 64 h, värme chockad, och sedan återhämtade sig vid 20 °C för 8 h före bildbehandling. Som referens renormaliserades inga värmechockmaskar i (A) i (B) för att matcha intervallet och mättnad av de värmechockade maskarna. Representativa bilder av två experimentella replikat visas. Skala bar = 250 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: HSR-induktion mätt med fluorescerande reportrar är beroende av HSF-1. Stammar som innehåller hsp-70p::gfp och hsp-16.2p::gfp reportrar höjdes vid kontroll (L4440 tom vektor) eller hsf-1 RNAi plattor för 64 h, utsätts för en 1 h värmechock vid 33 °C i ett vattenbad, och sedan återhämtat sig vid 20 °C för 8 h före avbildning. Representativa bilder av två experimentella replikat visas. Skala bar = 250 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: HSR-induktion mätt med RT-qPCR. N2 maskar höjdes på HT115 bakterier för 60 h och sedan värme chockad i 1 h i en 33 °C vattenbad. De relativa mRNA-nivåerna av hsp-70 (C12C8.1) och hsp-16.2 visas normaliserade till ingen värmechockkontroll. Värden som ritats är medelvärdet av fyra biologiska replikat och felstaplar representerar ± SEM. Statistisk signifikans beräknades med hjälp av en oparad students t-test. **p < 0,01. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 4: Termoskydd, men inte termotolerance, är beroende av HSF-1. N2 maskar höjdes vid kontroll (L4440) eller hsf-1 RNAi plattor för 60 h och sedan flyttas till antingen: (A) A 33 °C vattenbad för 6 h och återhämtade sig vid 20 °C för 48 h innan scoring för normal rörelse (termorecovery), eller (B) A 35 ° C torr inkubator och bort varje 2 h tills död (thermotolerance). Varje analys gjordes med n ≥ 30 individer på 2 oberoende dagar. Medelvärdet visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
I litteraturen har en mängd olika temperaturer, tider och utrustning använts för att analysera HSR, som har infört onödiga varningar och lett till svårigheter att jämföra resultat mellan laboratorier. Till exempel har temperaturer som sträcker sig från 32-37 °C och tider från 15 min till flera timmar använts för att inducera HSR15. Det rapporteras dock att dödlighet inträffar så tidigt som 3 h vid 37 °C för alla stadier och 1,5 h för dag 1 vuxna15. Dessutom visar vi att exponering av maskar till 35 °C orsakar dödlighet som inte är HSF-1-beroende, vilket gör dessa förhållanden dåligt lämpade för analys av HSR. Däremot är en värmechock på 33 °C för 1 h robust nog att framkalla stark induktion av värmechockgener, men mild nog att inte påverka maskens livskraft. Exponering för 33 °C så länge som 6 h orsakar bara 20% av maskarna för att visa onormal rörelse. Därför föreslår vi att du använder en temperatur på 33 °C och en tid på 1 h som ett standardiserat tillstånd för RT-qPCR och fluorescerande reporteranalyser.
Senaste experiment har visat att utvecklingsmässiga iscensättning av maskar för HSR experiment är särskilt viktigt. Det visades nyligen att i C. elegans minskar HSR:s oförmåga (dvs. kollapsar) med >50 % när hermafroditerna börjar lägga ägg5. Iscensätta maskarna korrekt är avgörande eftersom det ofta finns skillnader i utvecklingsmässiga timing i stammar som bär mutationer. Om temperaturkänsliga mutanter används kommer detta också att påverka resultaten om de inte synkroniseras med sin reproduktiva ålder. Därför rekommenderas att noggrant mäta uppkomsten av äggläggning för varje stam för att avgöra när kollapsen inträffar. Tidsfönstret efter L4-smältan och före initiering av reproduktiv mognad är smal; Därför måste försiktighet iakttas så att HSR-kollapsen inte oavsiktligt orsakar variationer i resultaten.
Förutom utvecklingsmässiga timing, förvånansvärt små temperaturförändringar, så lite som 1 °C, kan ha betydande effekter på HSR. Till exempel är termosensoriska nervceller i C. elegans känsliga för temperaturförändringar så små som ±0,05 °C16. Således är det absolut nödvändigt att använda en termometer som exakt kan mäta temperaturen. Därför föreslår vi som bästa praxis användning av en kalibrerad anordning för temperaturmätning som är tillräckligt exakt för att mäta temperaturer inom ±0,1 °C. Dessutom bör en termometer med dataloggningsfunktion användas för att mäta temperaturvariationer över tiden. Många inkubatorer uppges ha termiska variationer på mer än 1 °C i olika delar av inkubatorn och över tiden, vilket kan ha betydande effekter på HSR-experiment. Som bästa praxis föreslår vi att du använder inkubatorer som har tillräcklig isolering och cirkulation för att minimera temperaturfluktuationer. För att genomföra experiment värmechock föreslår vi en bästa praxis för ett cirkulerande vattenbad. Den tid det tar för en agar platta för att nå en önskad temperatur är ca 6-7 min i ett vattenbad men mycket längre i en torr inkubator15,17. Men om det inte finns något cirkulerande vattenbad har vi visat att robust HSR-induktion också förekommer i en torr inkubator med våra förhållanden. Om en torr inkubator används bör inkubatorns öppning under stressens längd minimeras.
Det är väl etablerat att induktion av värmechockgener är beroende av huvudregulatorn för HSR, HSF-1. Här presenterar vi bevis för att de två mer indirekta analyser, fluorescerande reportrar och thermorecovery, är också beroende av HSF-1. Signifikant fann vi att en vanligen använd alternativ organismanalys, termotolerance, inte är HSF-1 beroende med hsf-1 RNAi (figur 4). Liknande resultat har tidigare rapporterats med hjälp av en hsf-1 mutant eller en ttx-3 mutant, som blockerar HSR18,19,20. Tillsammans indikerar dessa resultat att termotoleranceanalysen inte bör användas för HSR-forskning. Detta tyder dessutom på att bästa praxis är att testa beroendet av HSF-1 för alla analyser som används för att mäta HSR.
Sammantaget presenterar vi en rad standardiserade protokoll och bästa praxis för robust och reproducerbar mätning av HSR-induktion i C. elegans. Vi hoppas att dessa metoder kommer att minska variationen i HSR-experiment och öka reproducerbarheten. Att underlätta direkta jämförelser av HSR-forskning mellan laboratorier kommer att bidra till att påskynda forskningen inom HSR-området. Vidare kommer standardisering gynna forskning om åldrande och neurodegenerativa sjukdomar som HSR är intimt förknippad.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av en donation från Frank Leslie. Vissa stammar tillhandahölls av CGC, som finansieras av NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18S-forward primer | TTGCGTCAACTGTGGTCGTG | ||
| 18S-reverse primer | CCAACAAAAAGAACCGAAGT CCTG |
||
| AM446 rmIs223[phsp70::gfp; pRF4(rol-6(su1006))] | Morimoto lab | http://groups.molbiosci.northwestern.edu/morimoto/ | |
| C12C8.1-forward primer | GTACTACGTACTCATGTGTCG GTATTT |
||
| C12C8.1-reverse primer | ACGGGCTTTCCTTGTTTTCC | ||
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | Bio Rad | 1855200 | |
| CL2070 dvIs70 [hsp-16.2p::GFP + rol-6(su1006)] | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/ | |
| EasyLog Thermistor Probe Data Logger with LCD | Lascar | EL-USB-TP-LCD | |
| Greenough Stereo Microscope S9i Series | Leica | ||
| Hard Shell 96 Well PCR Plates | Bio Rad | HSS9601 | |
| hsp-16.2-forward primer | ACTTTACCACTATTTCCGTCC AGC |
||
| hsp-16.2-reverse primer | CCTTGAACCGCTTCTTTCTTTG | ||
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio Rad | 1708891 | |
| iTaq Universal Sybr Green Super Mix | Bio Rad | 1725121 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | Nikon | Eclipse 90i | |
| MultiGene OptiMax Thermo Cycler | Labnet | TC9610 | |
| N2 (WT) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/ | |
| Nanodrop Lite Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-LITE | |
| Parafilm M Roll | Bemis | 5259-04LC | |
| RapidOut DNA Removal Kit | Thermo Scientific | K2981 | |
| Recirculating Heated Water Bath | Lauda Brinkmann | RE-206 | |
| Traceable Platinum Ultra-Accurate Digital Thermometer | Fisher Scientific | 15-081-103 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | RNA isolation reagent |
| TurboMix Attachment | Scientific Industries | SI-0564 | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 |
References
- Guisbert, E., Morimoto, R. I. The regulation and function of the heat shock response. Protein Quality Control in Neurodegenerative Diseases. , 1-18 (2013).
- Li, J., Chauve, L., Phelps, G., Brielmann, R. M., Morimoto, R. I. E2F coregulates an essential HSF developmental program that is distinct from the heat-shock response. Genes and Development. 30 (18), 2062-2075 (2016).
- Hsu, A. L., Murphy, C. T., Kenyon, C. Regulation of aging and age-related disease by DAF-16 and heat-shock factor. Science. 300 (5622), 1142-1145 (2003).
- Morley, J. F., Morimoto, R. I. Regulation of longevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones. Molecular Biology of the Cell. 15 (2), 657-664 (2004).
- Labbadia, J., Morimoto, R. I. Repression of the Heat Shock Response Is a Programmed Event at the Onset of Reproduction. Molecular Cell. 59 (4), 639-650 (2015).
- Link, C. D., Cypser, J. R., Johnson, C. J., Johnson, T. E. Direct observation of stress response in Caenorhabditis elegans using a reporter transgene. Cell Stress & Chaperones. 4 (4), 235 (1999).
- Guisbert, E., Czyz, D. M., Richter, K., McMullen, P. D., Morimoto, R. I. Identification of a Tissue-Selective Heat Shock Response Regulatory Network. PLoS Genetics. 9 (4), 1-12 (2013).
- Ma, J., et al. Cellular Proteomes Drive Tissue-Specific Regulation of the Heat Shock Response. G3: Genes, Genomes, Genetics. 7 (3), 1011-1018 (2017).
- Mendenhall, A. R., et al. Expression of a single-copy hsp-16.2 reporter predicts life span. Journals of Gerontology - Series A Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (7), 726-733 (2012).
- Stiernagle, T.
- Avery, L., You, Y. J.
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Rea, S. L., Wu, D., Cypser, J. R., Vaupel, J. W., Johnson, T. E. A stress-sensitive reporter predicts longevity in isogenic populations of Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 37 (8), 894-898 (2005).
- Shiu, P. K., Hunter, C. P. Early Developmental Exposure to dsRNA Is Critical for Initiating Efficient Nuclear RNAi in C. elegans. Cell Reports. 18 (12), 2969-2978 (2017).
- Zevian, S. C., Yanowitz, J. L. Methodological considerations for heat shock of the nematode Caenorhabditis elegans. Methods. 68 (3), 450-457 (2014).
- Clark, D. A., Biron, D., Sengupta, P., Samuel, A. D. T. The AFD sensory neurons encode multiple functions underlying thermotactic behavior in Caenorhabditis elegans. Journal of Neuroscience. 26 (28), 7444-7451 (2006).
- Prahlad, V., Cornelius, T., Morimoto, R. I. Regulation of the cellular heat shock response in Caenorhabditis elegans by thermosensory neurons. Science. 320 (5877), 811-814 (2008).
- McColl, G., et al. Insulin-like signaling determines survival during stress via posttranscriptional mechanisms in C. elegans. Cell Metabolism. 12 (3), 260-272 (2010).
- Douglas, P. M., et al. Heterotypic Signals from Neural HSF-1 Separate Thermotolerance from Longevity. Cell Reports. 12 (7), 1196-1204 (2015).
- Kourtis, N., Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. Small heat-shock proteins protect from heat-stroke-associated neurodegeneration. Nature. 490 (7419), 213-218 (2012).
