Summary
Bu protokol, in vivo koşullarına benzeyen bir in vitro insan hipertrofik skar dokusu modeli oluşturmak için makromoleküler kalabalık kullanımını açıklar. Kalabalık bir makromoleküler ortamda ekili zaman, insan deri fibroblastlar fenotipleri, biyokimya, fizyoloji ve skar dokusu andıran fonksiyonel özellikleri sergiler.
Abstract
İnvivo dokuların proteinler, nükleik asitler, ribonükleoproteinler, polisakkaritler vb. ile çok kalabalık olduğu gösterilmiştir. Aşağıdaki protokol, nötr polimerlerin (crowders) hücre kültürlerine in vitro eklenmesi yle bu fizyolojik kalabalığı taklit etmek için makromoleküler bir kalabalık (MMC) tekniğini uygular. Ficoll veya dextran'ı crowder olarak kullanan önceki çalışmalar, WI38 ve WS-1 hücre hatlarında kollajen I ve fibronektin ekspresyonunun MMC tekniği kullanılarak önemli ölçüde geliştirildigini göstermektedir. Ancak, bu teknik primer hipertrofik skar kaynaklı insan deri fibroblastlarında (hHSFs) doğrulanmamıştır. Hipertrofik yara kollajenaşırı birikimi ortaya çıktığından, bu protokol hHSFs ile MMC tekniği uygulanarak kollajen açısından zengin in vitro hipertrofik skar modeli oluşturmayı amaçlamaktadır. Bu optimize MMC modeli geleneksel 2 boyutlu (2-B) hücre kültür sistemleri ile karşılaştırıldığında in vivo skar dokusu ile daha fazla benzerlikler sahip olduğu gösterilmiştir. Buna ek olarak, hayvan modellerine göre uygun maliyetli, zaman-etkin ve etik olarak arzu edilir. Bu nedenle, burada bildirilen optimize edilmiş model hipertrofik skar ile ilgili çalışmalar için gelişmiş bir "in vivo benzeri" modeli sunuyor.
Introduction
Yara dokusu doku onarımının bitiş noktasını temsil eder. Ancak, birçok kişide, özellikle yanık veyatravma1 muzdarip olanlar, yara izi aşırı olabilir ve morfolojisi ve iyileşmiş cildin işleyişi üzerinde istenmeyen etkileri empoze. Patolojik (hipertrofik yara izleri ve keloidler) skar oluşumunun tam mekanizmaları tam olarak anlaşılamamasına rağmen, yara iyileşmesi sırasında kollajenin aşırı birikiminin önemli bir katkı olduğu gösterilmiştir2.
Transforming büyüme faktörü beta 1 (TGF-β1) ve alfa düz kas aktininin (αSMA) hipertrofik yaraların oluşumunda kilit rol oynadığı iyi belirlenmiştir. Kanıtlar, yüksek TGF-β1'in SMAD sinyal yolu3'üdüzenleyerek kollajenin aşırı birikimini doğrudan uyardığını göstermektedir. Buna ek olarak αSMA'nın yara iyileşme sürecinde hücre daralması ve reepitelizasyonunu düzenleyerek hipertrofik skar oluşumuna katkıda bulunduğu bulunmuştur4. Uygun in vitro ve in vivo modellerin in eksikliği, yara izi İyileştirme için müdahalelerin ve tedavilerin geliştirilmesi ve değerlendirilmesi açısından önemli bir engeldir. Bu çalışmanın amacı, yeni ve ortaya çıkan yara ile ilgili müdahaleleri değerlendirmek için uygun olan "in vivo benzeri" hipertrofik skar modeli oluşturmak için mevcut MMC tekniğini kullanmaktır.
Canlı dokuların vücut dışında üretilmesi bilim camiasında yıllardır bir hedef olmuştur. Yirminci yüzyılın başlarında in vitro tekniklerinin geliştirilmesi kısmen bu hedefe ulaşıldı. Mevcut in vitro teknikleri biraz Roux orijinal gösteri embriyonik hücrelerin sıcak tuzlu5birkaç gün için ex vivo hayatta olabilir gelişti . Ancak in vitro metodolojiler çoğunlukla 2-B'de yetiştirilen tek hücreli tiplerle sınırlıdır ve in vivo dokuları doğru bir şekilde özetlemez. Hücre biyokimyası, fizyolojisi ve genetiğinin incelenmesinde yararlı olmakla birlikte, yerli dokular 3-B'dir ve birden fazla hücre tipini içerir. Basit 2-D in vitro sistemler memeli hücrelerini doğal dokuya özgü mimarinin6'sınıkaybettiği son derece yapay ortamlara tabi tutar. Buna karşılık, bu anormal hücre morfolojisi, fizyolojisi ve davranış7sonuçlanan, hücre içi ve hücre dışı olayları etkiler.
Bu protokolün arkasındaki ilgi hipertrofik yara ve keloidlerin gelişimi ve klinik yönetiminde yatsın. Dermal fibroblastların skar dokusunda bulunan kollajenlerin bol miktarda üretilmesinden büyük ölçüde sorumlu olduğu iyi saptanmış olsa da, 2-D in vitro sistemleri kullanılarak dermal fibroblastların yetiştirilmesi in vivo8'degözlenen kollajenin cirosunu yeniden üretememektedir. Çağdaş in vitro yöntemleri hala aslında "sıcak tuzlu" kullanmak, bir ortamda tamamen canlı dokularda farklı. Vivo'daki dokular proteinler, nükleik asitler, ribonükleoproteinler ve polisakkaritlerle son derece kalabalıktır ve toplam hacmin %5-40'ını kaplarlar. Hiçbir iki molekül aynı anda aynı alanı işgal edebilirsiniz gibi, çok az boş alan mevcut ve serbest su neredeyse tam yokluğu9.
MMC tekniği, sitosol ve interstisyel sıvıların termodinamik özelliklerini etkileyen kısıtlamalar uygular. Moleküler etkileşimler, reseptör-ligand sinyal kompleksleri, enzimler ve organeller serbestçe etkileşime girerler 9. Perisellüler ortam (yani interstitium) içindeki etkileşimler de kısıtlanır. Son kanıtlar, kalabalık çözeltilerde yüksek oranda inert makromoleküllerin perturb difüzyon, fiziksel ilişki, viskozite ve hidrodinamik özellikleri10olduğunu doğrulamaktadır.
İlginçtir, çeşitli popüler kalabalık ajanlar (yani, Ficoll, dextran, polivinylpyridone [PVP], ve sodyum 4-stirensülfonat [PSS]) farklı hücre tipleri ve farklı ortamlarda uygulandığında eşdeğer değildir. Bir önceki çalışmada, Ficoll PVP ile karşılaştırıldığında mezenkimal kök hücreler için daha az sitotoksik olduğu bildirilmiştir. Bu sonuçlar nötr yükü ve nispeten küçük hidrodinamik yarıçapı11sonucu olarak yorumlandı. Buna karşılık, ikinci bir çalışmada dextran ficoll12ile karşılaştırıldığında insan akciğer fibroblastları tarafından kollajen I birikimi uyarıcı daha etkili olduğunu bulundu . Kendi çalışmamızdan elde edilen veriler Ficoll hipertrofik skar kaynaklı fibroblastlar tarafından kollajen birikimini artırır düşündürmektedir, PVP bu hücreler için toksik ise13.
Bu kollajen için prokollajen dönüşüm ü vivo ortamda son derece kalabalık bir ortamda daha hızlı olduğu gösterilmiştir14, biyolojik reaksiyonların oranı seyreltilmiş 2-B kültür sisteminde gecikilir iken15. Biz burada in vitro protokolü optimize var, dermal fibroblastlar dermal fibrozis ve skar oluşumu için daha "in vivo gibi" bir model olarak hizmet veren ekimi göstermek için MMC içeren. Ortak 2-B kültür sisteminin aksine, MMC ile hHSFs yetiştirmek önemli ölçüde13kollajen biyosentez ve birikimi ni uyarır. Özellikle, fibrozis diğer özellikleri (yani, matris metalloproteinazların artan ekspresyonu [MDP] ve proinflamatuar sitokinler) ayrıca bu optimize MMC protokolü13altında belirgindir . Bu yöntemle ekili olduğunda, dermal hücrelerin in vivo ölçülen fizyolojik, biyokimyasal ve fonksiyonel parametreleri yeniden kapitalizettiği gösterilmiştir.
Optimize edilmiş MMC in vitro protokolü, hipertrofik skar dermisi ve ilgisiz komşu dermisten izole edilen dermal fibroblastlar tarafından kollajen ve diğer ECM proteinlerinin ekspresyonunu değerlendirmek için kullanılmıştır. MMC ortamlarında in vitro olarak yetiştirildiğinde, HHSF'lerin dermal hipertrofik skar dokusuna benzer belirli özellikleri (yani mRNA, biyokimya, fizyoloji ve fenotip) ifade ettiği gözlenmiştir. Kanıtlar, crowders seçerken ve in vitro ekimi için MMC koşullarını optimize ederken fiziksel ve kimyasal özelliklerin önemli noktalar olduğunu göstermektedir.
Prensip kanıtı için, MMC protokolü burada Nitel ve nicel olarak Shikonin ve analoglarının apoptoza neden olma yeteneğini değerlendirmek için uygulanır. Bu dermal yara izi yönetmek için bu doğal kaynaklı Geleneksel Çin Tıbbı (TCM) bileşiklerin potansiyel uygulamalarının değerlendirilmesi sağlar13. Buna rağmen, bu in vitro MMC protokolünün basitliği, maliyet etkinliği ve güncelliği, ab direktifi 2010/63/EU ve ABD Çevre Koruma Ajansı (EPA) tarafından memelilerde yapılan deneyleri ortadan kaldırmak için yapılan son düzenlemeleri de karşılar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hücre kültürü
- Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamında (DMEM) patolojik olmayan dokudan (hNSFs) elde edilen hHSF'leri ve normal dermal fibroblastları %10 fetal baldır serumu (FCS) ve %1 v/v penisilin/streptomisin çözeltisi (P/S) içeren %5 CO2/95hava ile bir kuvözde 37°C'de muhafaza edin.
- Ficoll 70, Ficoll 400 ve uygun şirketlerden askorbik asit satın alın.
2. MMC hipertrofik skar modelinin yapımı
- HHSF'leri veya hNSF'leri (50.000/iyi) her kuyuda 1 mL ortam içeren 24 kuyu plakasına yerleştirin.
- %5 CO2'de 37°C'lik bir kuluçka makinesine yerleştirin ve gece boyunca bırakın.
- MMC ortamını hazırlayın. Deney için gereken toplam hacme göre Ficoll 70 (18,75 mg/mL), Ficoll 400 (12,5 mg/mL) ve askorbik asit (100 μM) karıştırılarak %10 FCS/DMEM ortam üretin.
- Karışımı 37°C'lik bir su banyosuna yerleştirin ve crowders'ı çözeltiye dağıtın ve ardından 0,2 m filtre kullanarak MMC ortamını sterilize edin.
- Harcanan ortamı aspire edin ve yeni yapılmış MMC ortamıile değiştirin.
- Hücreleri 37°C'de 6 gün ve %5 CO2'dekuluçkaya yatırın ve her 3 günde bir ortam değiştirin.
3. Kollajen toplam miktarının ifadesi
- Sirius kırmızı çözeltisi hazırlayın (%0.1 w/v). 200 mL distile deiyonize su (ddH2O) ve 1 mL asetik asit ile Doğrudan Kırmızı 80 tozunun 0,2 g'ını çözün.
- MMC ortamını aspire edin ve her kuyuya 300 μL Sirius Red çözeltisi ekleyin. 90 dk için 37 °C'de kuluçka.
- Sirius Red çözeltisini musluk suyuyla hafifçe durulayın ve plakanın bir gecede hava kurmasını bekleyin.
- Her kuyuya 200 μL sodyum hidroksit (0,1 M) ekleyerek Sirius Red lekesini ayıklayın. Sirius Kırmızı lekesini tamamen çıkarmak için plakayı 5-10 dakika boyunca orbital shaker üzerine yerleştirin.
- Çıkarılan Sirius Red lekesinin 100 μL'sini 96 iyi saydam bir plakaya aktarın ve mikroplaka okuyucu kullanarak 620 nm'de emiciliği ölçün.
4. Kollajen I ekspresyonu (immünboyama)
- 200 μL fosfat tamponlu salin (PBS, pH = 7,35) kullanarak kuyuları yıkayın.
- Hücreleri 4 °C'de 10 dakika boyunca metanol (500 μL/iyi) kullanarak düzeltin.
- Oda sıcaklığında (RT) 30 dakika boyunca %3 büyükbaş serum albumini ile nonspesifik etkileşimleri engelleyin.
- Engelleme çözeltisini aspire edin ve RT'de 90 dk boyunca 200 μL anti-kollajen I antikor (10 μg/mL) ile inkübat.
- Birincil antikor aspire ve 5 dakika her pbs ile 3x yıkayın.
- 200 μL Keçi anti-Rabbit-FITC ikincil antikor (1:400 seyreltme) ve 4 ',6-diamidino-2-fenilindole (DAPI; 1: 2000 seyreltme) ile inkübat 30 dakika RT. Alüminyum folyo ile plaka kapağı.’
- Hem ikincil antikor ve DAPI atın ve 5 dakika her pbs ile 3x yıkayın.
- Floresan boyamasını doğrudan mikroskop altında görselleştirin.
5. Batı lekeleme
- Hücreleri 2 kat PBS ile yıkayın.
- Her kuyuya 40 μL likte arabellek ekleyin ve bir pipet ucu ile hücre tabakasıkazıyın. Lysis tamponripa tampon, proteaz inhibitörü kokteyl (PIC), 2 mM sodyum vanadate ve 10 mM sodyum florür içerir.
- Protein lisatını mikrosentrifuge tüplere aktarın ve üreticinin talimatlarına göre protein tonu kullanarak protein konsantrasyonu ölçün16.
- Her grubun 10 μg proteinini %4-12 Oranında Bis-Tris protein jellerinin kuyularına yükleyin. Sodyum dodecyl sülfat poliakrilamid jel elektroforez (SDS-PAGE) 200 V 30 dakika için gerçekleştirin.
- 90 dk için 90 V'de batı lekesini çalıştırarak proteini nitroselüloz membrana aktarın.
- Membranı 10 mL blokaj tamponu ile kapatın.
- Bir gecede 4°C'de primer antikorlarla kuluçkaya yatırın. Primer antikorlar şunlardır: anti-kollajen I, anti-kollajen III, anti-kollajen IV, anti-αSMA, anti-MMP-1, anti-MMP-2, anti-MMP-9, anti-MMP-13, ve anti-gliserinaldehit 3-fosfat dehidrogenaz (GAPDH).
- Membranı %0,1 TBS-Tween 20 (her biri 5 dk için 5 x) ile yıkayın. TBS/Tween 20 (1 L) aşağıdakileri içerir: 50 mL 1 M Tris (pH = 7.4), 30 mL 5 M sodyum klorür, 1 mL Tween 20 ve 920 mL ddH2O içerir.
- 1 saat için RT uygun ikincil antikor ile kuluçka.
- Adım 5.8'i tekrarlayın ve bir görüntüleme sistemi kullanarak floresan'ı görselleştirin.
6. RT-PCR
- RNA ekstraksiyon sayıcı kitinde yer alan 2-mercaptoetanol ile karıştırılmış lysis tamponu kullanarak toplam RNA'yı toplayın.
- Üreticinin talimatları na göre RNA arındırın17.
- Mikro hacimsi spektrofotometre kullanarak RNA konsantrasyonu ölçün.
- Üreticinin talimatlarına göre cDNA sentez kiti kullanarak ilk iplikçik cDNA sentezini gerçekleştirin.
- RT-PCR oligonükleotid astarlar özel 96 kuyu plakaları (precoated) sağlanır. CDNA numunelerinin 100 ng'sini 10 μL SYBR yeşil supermix ile özelleştirilmiş plakaya karıştırın.
- DDH2O kullanarak toplam hacmi 20°L/iyiye yükseltin.
- RT-PCR'ı üreticinin talimatlarına uygun bir termal döngü kullanarak çalıştırın: 98°C'de 15 s için 40 devir denaturing ve 60 s için 60 °C'de tavlama/uzatma. RT-PCR'de test edilen genler şunlardır: COL1A1, COL3A1, ACTA2, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD7, IL1A, IL1B, IL6, IL8, MMP1, MMP2, MMP3, TGFB1, ve VEGF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her deneyde üçerlik örnekler uygulandı ve her deney üç hastanın hücreleri kullanılarak 3x tekrarlandı. Veriler kontrol grubunun yüzdeleri olarak ifade edilir. İstatistiksel farklılıkları analiz etmek için tek yönlü ANOVA ve Tukey'in post-hoc testi uygulandı (*p 0.05).
MMC% 9 FVO (fraksiyonel hacim doluluk) de Ficoll kullanarak hHSF13kollajen ve kollajen I birikimi nin toplam miktarını artırır. Şekil 1A'dagösterildiği gibi, Ficoll ile birlikte plütsonra hHSF'lerin hücre yoğunluğu %9 ve %18 FVO'da PVP kullanılarak kontrol ve MMC ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde artmıştır. Şekil 1B,C, Ficoll'un (%9 FVO) diğer MMC formülasyonlarına göre kollajen birikimini (kollajen I dahil) önemli ölçüde artırdığını göstermektedir. Kantitatif analiz(Şekil 1D,E)ayrıca Ficoll'un (%9 FVO) kollajen birikimini en etkili şekilde iyileştirdiğini göstermiştir.
HHSFs ve HNSFs MMC ortamlarda ekili kollajen13ek olarak ECM türlerinin ekspresyonunu düzenleyen bulundu. Şekil 2'de bildirilen veriler, HHSF'ler ve hNSF'ler MMC ile ekildiğinde kollajen IV ekspresyonunun da önemli ölçüde arttığını göstermektedir. Matriks metalloproteinazlar (MDP'ler) yara iyileşmesi ve yara oluşumu nda,18ECM montajını düzenleyen ve 18.yamada önemli bir rol oynar. MDP'ler hücre çoğalmasına, hücre göçüne, anjiyogenez ve apoptoza da katkıdabulunur19. Özellikle, MDP'lerin yüksek bir ekspresyonu yerli dokulara göre hipertrofik skar dokularında birikmeye saplanmış20. MMC ortamlarında yetiştirilen hNSF ve hHSF kültürlerinde MMP-2, -9 ve -13 ekspresyonunun önemli ölçüde güncellendiği gözlenmiştir.
Ayrıca interlökin-6 (IL-6) ve vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) sentezini araştırdık; ancak, bu bir batı leke tespit edilemez edildi. Buna karşılık, RT-PCR analizi(Şekil 3) IL6 ekspresyonunun önemli ölçüde güncelolduğunu, VEGF ekspresyonunun ise MMC koşullarında ekili hNSF'lerde ve hHSF'lerde indirgendiğini ortaya koymuştur. IL-6'nın artmış ekspresyonu hipertrofik skar oluşumuna katkıda bulunduğu gösterilmiştir21. Paradoksal olarak, hipertrofik yaraların oluşumunun VEGF22'ninyüksek bir ekspresyonu ile ilişkili olduğu da bildirilmiştir. Burada yapılan RT-PCR analizi, VEGF ekspresyonunun MMC koşullarında yetiştirilen hNSF ve hHSF'lerde büyük ölçüde zayıflatıldığını göstermiştir.
Son olarak, sonuçlar hem 1) kollajen, kollajen I, kollajen IV, MMP-2, MMP-9 ve MMP-13 de novo ve 2) hHSFs ve hNSFs IL6 mRNA artan ekspresyonu artmış sentezleri gösterdi. Birlikte ele alındığında, bu veriler, primer hHSF'lerin ve hNSF'lerin media formülasyonlarında, mmc sonuçlarının, doğal hipertrofik skar dokusunda gözlenen karakteristik gen ekspresyonu, biyokimya ve fenotiplerin in vivo olarak tutulmasını içeren ve sağlam bir "kavanozdaki yara izi" modeline yol açan bir çalışma olduğunu göstermektedir.
Şekil 1: MMC, hHSF'lerde kollajen ve kollajen I birikiminin toplam miktarını artırır. (A) Hücre morfolojisi, (B) toplam kollajenler, Sirius Red ile boyanmış, (C) kollajen I ekspresyonu, immünfloresans ile gösterilmiştir, (D) total kollajen kantitatif analizi, ve (E) kollajen I birikiminin kantitatif analizi. hHSF'ler 6 gün boyunca Ficoll (%9 ve %18 FVO), PVP40 (%18 FVO) veya PVP360 (%54 ve %72 FVO) ile desteklenen medyada kültüre alındı. Temsili görüntüler seçildi. Görüntü nicelliği ImageJ kullanılarak gerçekleştirildi ve denetimin ortalama yüzdesi olarak ifade edilir. Tüm deneyler, ilgisiz üç donörden izole edilmiş hücreler kullanılarak 3x tekrarlandı. İstatistiksel analiz, Tukey'in test sonrası (*p < 0.05 vs. kontrol grubu, hata çubukları SEM'i gösterir) tek yönlü ANOVA kullanılarak yapıldı. Ölçek çubukları = (A) 0,5 mm, (B) 2 mm ve (C) 0,5 mm. Bu rakam bir öncekiçalışma13değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: MMC'nin hücre proteini ekspresyonuna etkileri. hHSF'ler ve hNSF'ler MMC koşullarında 6 gün boyunca kültürlendi. Proteaz inhibitörü kokteyli, sodyum vanatat ve sodyum florür içeren RIPA tamponu ile tüm hücre lisatları hazırlandı. Protein konsantrasyonu protein tsay kullanılarak ölçüldü. Temsili görüntüler sunulur. Kantitatif analiz için, bireysel protein bantlarının yoğunlukları densitometri ile ölçüldü, GAPDH'ye normalleştirildi ve ImageJ yazılımı kullanılarak normal ortamda hNSF'nin yüzdesine dönüştürüldü. Tüm deneyler 3x üç ilgisiz donör hücreleri kullanılarak yapıldı. İstatistiksel analiz, Tukey'in test sonrası (*p < 0.05, hata çubukları SEM'i gösterir) tek yönlü ANOVA kullanılarak yapıldı. Bu rakam bir öncekiçalışma13değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: MMC'nin hücre geni ekspresyonuna etkileri. hHSF'ler ve hNSF'ler MMC koşullarında 6 gün süreyle yetiştirildi. Total RNA bir elektkiti kullanılarak hasat edildi ve ilk iplikçik cDNA cDNA sentez kiti kullanılarak sentezlendi. Hedef gen ekspresyonu GAPDH'ye normalleştirildi ve normal ortamda hNSF yüzdesine dönüştürüldü. Tüm deneyler 3x üç ilgisiz donör hücreleri kullanılarak tekrarlandı. İstatistiksel analiz, Tukey'in test sonrası (*p < 0.05, hata çubukları SEM'i gösterir) tek yönlü ANOVA kullanılarak yapıldı. Bu rakam bir öncekiçalışma13değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, insan kutanöz skar dokusu için geliştirilmiş bir "scar-in-a-jar" in vitro modelini optimize etmeyi ve doğrulamasını amaçlamaktadır. Önceki çalışmalarda insan akciğer fibroblastları için MMC tekniğinin uygulama bildirilmiştir12, insan kemik iliği mezenkimal kök hücreler23, ve insan dermal fibroblastlar23 dekstran kullanarak12, Ficoll12, ve PVP23 crowders olarak. Burada bildirilen çalışmada, hipertrofik skar kaynaklı insan derisi fibroblastları için daha önce yayınlanmış protokol ficoll veya PVP ile crowders olarak optimize edilmiştir.
Makromoleküler crowder'ların seçimi ve konsantrasyonu, eşdeğer sonuçlar elde etmedikleri için kritik parametrelerdir. Bir önceki çalışmada PVP40 (%18 FVO) ve PVP360 (%54 FVO) dermal fibroblastlarda kollajen birikimini ve hücre proliferasyonunu önemli ölçüde artırdığı bildirilmiştir23 (FVOs'ta PVP'nin etkileri >%54 test edilmemiştir). Ancak, bu iki koşul bu protokolü kullanan HHSF'ler için tutarlı bir şekilde çalışmaz.
Şekil 1'degösterildiği gibi, Ficoll kontrole göre kollajen I birikimini önemli ölçüde artırırken, PVP'nin önemli bir etkisi yoktur. % 9 FVO de Ficoll önemli ölçüde kollajen ve kollajen tip I toplam miktarını artırır Ficoll ile karşılaştırıldığında 18% FVO. Buna ek olarak, birincil dermal fibroblastlar kültür24sınırlı bir ömrü olduğu gibi, düşük bir geçiş hücreleri kullanmak önemlidir. Bu in vivo fenotip korumak için sadece taze izole hHSFs kullanmak için seçildi. Uzun süreli ekimden sonra, primer hHSF'ler alışılmadık morfoloji ve atipik fonksiyonel yanıtlar sergilerler. Ayrıca MMC orta askorbik asit ile takviye edilmesi tavsiye edilir, hHSF kollajen sentezinin önemli bir indükleyici25. Ayrıca, diğer araştırmacılar tarafından HHSF ile ilgili çalışmalar için Malzeme Tablosu'nda listelenen aynı antikorların kullanılması önerilmektedir; ancak, bu protokolü diğer hücre tiplerine uygularken antikorların doğrulanması gerekir.
Temsili sonuçlarda bildirildiği gibi, klasik MMC dışı koşullar kullanılarak yetiştirilen hHSF'lere kıyasla hHSF'lerde kollajen (yani kollajen I, kollajen IV, MDP ve IL6) ekspresyonunu uyaran makromoleküler crowder'ların dahil edilmesi bulunmuştur. Optimize edilmiş MMC modelinin hHSF'lerin in vivo fenotip yönlerini koruduğu, karakteristik morfolojisi, biyokimyası, fizyolojisi ve vivo kutanöz skar dokusunun bol hücre dışı matriksini (mevcut 2-B kültür yaklaşımlarının aksine) yeniden kapitalizettiği ileri sürülmelidir. Benzer "in vivo benzeri" özellikleri yeniden özetleyebilen benzer in vitro modeltanımlarını tanımlayabiliyoruz. Mevcut hayvan modelleri ile karşılaştırıldığında, bu MMC protokolü daha hızlı olduğu kadar daha kullanıcı dostu, uygun maliyetli ve zaman açısından da etkilidir. Cuttle ve ark. termal yaralanma kullanarak bir domuz hipertrofik yara modeli kurdu, hangi insan hipertrofik izleri benzer özelliklere sahip gibi görünüyor26. Ancak, maliyetleri ve zaman hayvanları korumak için gerekli ek olarak, deney26tamamlamak için 3 aydan fazla gerektirir. Bu optimize Edilmiş MMC modeli kullanıma hazır olmadan önce yaklaşık 1 haftalık hazırlık gerektirir.
Protokol yeni anti-yara izi tedavilerin incelenmesi için gelişmiş bir in vitro model sunuyor. MMC modeli Shikonin değerlendirmek için kullanılmıştır, daha önce de novo yara ların oluşumunu inhibe ettiği bildirilen bir molekül, olgun hipertrofik yaraların düzeltilmesi için27,28. Uyuşturucu keşfi ve kavram kanıtı için klasik yaklaşımlar kullanılarak yeni bileşiklerin ve müdahalelerin benzer şekilde değerlendirilmesi için önemli kaynaklar, fonlar ve zaman gerekir. Bu çalışma asgari mali gerekli ve birkaç ay içinde tamamlanabilir. Protokol esnektir ve hayvan çalışmaları öncesinde yeni hipertrofik skar tedavilerin geliştirilmesi ve değerlendirilmesinde uygulamalar için kolayca uyarlanabilir.
Buna ek olarak, bu protokol daha fazla "in vivo benzeri" özellikleri geliştirmek için daha da değiştirilebilir. Örneğin, aşırı tgf-β1 varlığı hipertrofik skar dokularında tutarlı bir bulgudur, kollajen sentezini ve birikimini uyararak yara oluşumuna aracılık28. TGF-β1, MMC protokolüne kolayca dahil edilebilir ve in vivo patolojinin yeniden kapitülasyonlarını daha da iyileştirebilir. Modelin diğer kollajen ve ECM ile ilgili patolojiler (yani skleroderma, pulmoner fibrozis, endomiyokardiyal fibrozis, vb.) için yararlı olabilecek tam potansiyelini henüz keşfetmedik. Ayrıca, 2 veya 3 hafta gibi daha uzun bir kültür dönemi boyunca hücreler üzerinde MMC etkilerini gözlemlemek ilginç olacaktır. Bu karakterizasyonlar in vivo skar dokusu oluşumu için gerekli olduğundan, MMC'nin hücre ve ECM hiyerarşik mimarisi ve dizilişi, özellikle kollajen yönelimi üzerindeki etkilerini daha fazla değerlendirmek de faydalıdır.
Bu protokolün en önemli sınırlamalarından biri hücre türlerinin kısıtlanmasıdır. Hipertrofik skar oluşumu çeşitli hücre popülasyonlarının katılımını içerir ve farklı hücre tipleri arasındaki etkileşimler skar oluşumunda önemli bir rol oynar. Örneğin, keratinositler de kutanöz yara iyileşmesi ve yaraoluşumundaönemli bir rol oynamaktadır 29 . Bu modele ek hücre popülasyonları dahil büyük ölçüde gelecekteki araştırmalarda önemini artıracaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların çıkar çatışması yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Singapur Bilim, Teknoloji ve Araştırma Ajansı "SPF 2013/004: Skin Biology Basic Research" ve "Tropics için Yara Bakımı İnovasyonu" IAF-PP/2017 (HBMS) H17/01/a0/009 tarafından desteklendi. Yazarlar minnetle tavsiye ve Dr Paula Benny ve Dr Michael Raghunath yardım kabul.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm filter | Sartorius | 16534 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | P36962 | |
| Alexa Fluor 680 | Thermo Fisher Scientific | A-21076 | |
| Alexa Fluor 800 | Thermo Fisher Scientific | A-11371 | |
| alpha smooth muscle actin (αSMA) primary antibody | Abcam | ab5694 | |
| Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (thermal cycler ) | Thermo Fisher Scientific | 4351106 | |
| Ascorbic acid | Wako | #013-12061 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | #A2153 | |
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 500-0006 | |
| Collagen I primary antibody (for immunostaining) | Abcam | 6308 | |
| Collagen I primary antibody (for western blot) | Abcam | ab21286 | |
| Collagen III primary antibody | Abcam | ab7778 | |
| Collagen IV primary antibody | Abcam | ab6586 | |
| Direct Red 80 | Sigma-Aldrich | 2610108 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | 11996-065 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Life Technologies | 6000-044 | |
| Ficoll 400 | GE HealthCare | #17-0300-10 | |
| Ficoll 70 | GE HealthCare | #17-0310-10 | |
| GAPDH primary antibody | Sigma-Aldrich | G8795 | |
| Goat Anti-Rabbit secondary antibody | Abcam | ab97050 | |
| Human hypertrophic scar/normal fibroblasts (hHSF/hNSF) | Cell Research Corporation | 106, 107, 108 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | #1708890 | |
| MMP-1 primary antibody | Abcam | ab38929 | |
| MMP-13 primary antibody | Abcam | ab39012 | |
| MMP-2 primary antibody | Abcam | ab37150 | |
| MMP-9 primary antibody | Abcam | ab38898 | |
| NanoDrop Microvolume Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 10484060 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | NP0321BOX | |
| Odyssey blocking buffer | LI-COR Biosciences | 927–40000 | |
| Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biosciences | N/A | |
| Olympus IX-81 HCS microscope (for immunostaining) | Olympus | N/A | |
| Penicillin/streptomycin solution (P/S) | Life Technologies | 15140-122 | |
| PrimePCR Assays | Bio-Rad | Customized primers pre-coated in 96-well plates based on requirement | |
| Protease inhibitor cocktail (PIC) | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| PVP 360 | Sigma | #PVP360 | |
| PVP 40 | Sigma | #PVP40 | |
| RIPA buffer | Merck | R0278 | |
| RNeasy Plus Mini Kit | QIAGEN | #74134 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 450022 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 450243 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode microplate reader | Molecular Devices | N/A | |
| SsoAdvanced universal SYBR green supermix | Bio-Rad | #172-5270 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
References
- vander Veer, W. M., et al. Potential cellular and molecular causes of hypertrophic scar formation. Burns. 35 (1), 15-29 (2009).
- Linge, C., et al. Hypertrophic Scar Cells Fail to Undergo a Form of Apoptosis Specific to Contractile Collagen[mdash]The Role of Tissue Transglutaminase. Journal of Investigative Dermatology. 125 (1), 72-82 (2005).
- Penn, J. W., Grobbelaar, A. O., Rolfe, K. J. The role of the TGF-beta family in wound healing, burns and scarring: a review. International Journal of Burns and Trauma. 2 (1), 18-28 (2012).
- Wang, X. Q., Kravchuk, O., Winterford, C., Kimble, R. M. The correlation of in vivo burn scar contraction with the level of alpha-smooth muscle actin expression. Burns. 37 (8), 1367-1377 (2011).
- Eitan, E., Zhang, S., Witwer, K. W., Mattson, M. P. Extracellular vesicle-depleted fetal bovine and human sera have reduced capacity to support cell growth. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 26373 (2015).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Kapalczynska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
- Lareu, R. R., Arsianti, I., Subramhanya, H. K., Yanxian, P., Raghunath, M. In vitro enhancement of collagen matrix formation and crosslinking for applications in tissue engineering: a preliminary study. Tissue Engineering. 13 (2), 385-391 (2007).
- Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K., Uversky, V. N. What macromolecular crowding can do to a protein. International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 23090-23140 (2014).
- Chen, C., Loe, F., Blocki, A., Peng, Y., Raghunath, M. Applying macromolecular crowding to enhance extracellular matrix deposition and its remodeling in vitro for tissue engineering and cell-based therapies. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 277-290 (2011).
- Zeiger, A. S., Loe, F. C., Li, R., Raghunath, M., Van Vliet, K. J. Macromolecular Crowding Directs Extracellular Matrix Organization and Mesenchymal Stem Cell Behavior. PloS one. 7 (5), 37904 (2012).
- Chen, C. Z., et al. The Scar-in-a-Jar: studying potential antifibrotic compounds from the epigenetic to extracellular level in a single well. British Journal of Pharmacology. 158 (5), 1196-1209 (2009).
- Fan, C., et al. Application of "macromolecular crowding" in vitro to investigate the naphthoquinones shikonin, naphthazarin and related analogues for the treatment of dermal scars. Chemico-Biological Interactions. 310, 108747 (2019).
- Canty, E. G., Kadler, K. E. Procollagen trafficking, processing and fibrillogenesis. Journal of Cell Science. 118, Pt 7 1341-1353 (2005).
- Minton, A. P. Models for Excluded Volume Interaction between an Unfolded Protein and Rigid Macromolecular Cosolutes: Macromolecular Crowding and Protein Stability Revisited. Biophysical Journal. 88 (2), 971-985 (2005).
- Ernst, O., Zor, T.
- Beltrame, C. O., Cortes, M. F., Bandeira, P. T., Figueiredo, A. M. Optimization of the RNeasy Mini Kit to obtain high-quality total RNA from sessile cells of Staphylococcus aureus. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 48 (12), 1071-1076 (2015).
- Xue, M., Jackson, C. J. Extracellular Matrix Reorganization During Wound Healing and Its Impact on Abnormal Scarring. Advances in wound care (New Rochelle). 4 (3), 119-136 (2015).
- Rohani, M. G., Parks, W. C. Matrix remodeling by MMPs during wound repair. Matrix Biology. 44-46, 113-121 (2015).
- Ulrich, D., Ulrich, F., Unglaub, F., Piatkowski, A., Pallua, N. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in patients with different types of scars and keloids. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 63 (6), 1015-1021 (2010).
- Ghazizadeh, M., Tosa, M., Shimizu, H., Hyakusoku, H., Kawanami, O. Functional Implications of the IL-6 Signaling Pathway in Keloid Pathogenesis. Journal of Investigative Dermatology. 127 (1), 98-105 (2007).
- Wilgus, T. A., Ferreira, A. M., Oberyszyn, T. M., Bergdall, V. K., Dipietro, L. A. Regulation of scar formation by vascular endothelial growth factor. Laboratory Investigation. 88 (6), 579-590 (2008).
- Rashid, R., et al. Novel use for polyvinylpyrrolidone as a macromolecular crowder for enhanced extracellular matrix deposition and cell proliferation. Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (12), 994-1002 (2014).
- Lago, J. C., Puzzi, M. B. The effect of aging in primary human dermal fibroblasts. PloS one. 14 (7), 0219165 (2019).
- Cigognini, D., et al. Macromolecular crowding meets oxygen tension in human mesenchymal stem cell culture - A step closer to physiologically relevant in vitro organogenesis. Scientific Reports. 6, 30746 (2016).
- Cuttle, L., et al. A porcine deep dermal partial thickness burn model with hypertrophic scarring. Burns. 32 (7), 806-820 (2006).
- Fan, C., Xie, Y., Dong, Y., Su, Y., Upton, Z. Investigating the potential of Shikonin as a novel hypertrophic scar treatment. Journal of Biomedical Science. 22, 70 (2015).
- Fan, C., et al. Shikonin reduces TGF-beta1-induced collagen production and contraction in hypertrophic scar-derived human skin fibroblasts. International Journal of Molecular Medicine. 36 (4), 985-991 (2015).
- Werner, S., Krieg, T., Smola, H.
