Summary
Biz atomik kuvvet mikroskobu (AFM) kullanarak eklem kıkırdağı hücresel düzeyde erken osteoartritik değişiklikleri araştırmak için bir yöntem saklıt.
Abstract
Hücrelerin ve dokuların biyomekanik özellikleri sadece şekil ve işlevlerini düzenlemekle kalmamış, aynı zamanda canlılıklarını korumak için de çok önemlidir. Elastikiyet değişiklikleri yaymak veya kanser veya osteoartrit gibi büyük hastalıkların başlangıcı tetikleyebilir (OA). Atomik kuvvet mikroskobu (AFM), belirli biyolojik hedef yapıların biyomekanik özelliklerini mikroskobik ölçekte nitel ve nicel olarak karakterize etmek için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmış ve pikonewton'dan mikronewtona kadar olan bir aralıktaki kuvvetleri ölçmüştür. Biyomekanik özellikler, yüksek düzeyde gerilmeye maruz kalan kas-iskelet dokularında özel öneme sahiptir. Kıkırdağın dejeneratif bir hastalığı olarak OA perisellüler matriks bozulması na neden olur (PCM) ve kondrositlerin uzaysal yeniden düzenlenmesi onların ekstrasellüler matriks gömülü (ECM). PCM ve ECM'deki bozulma, kıkırdağın biyomekanik özelliklerindeki değişikliklerle ilişkilendirilmiştir. Bu çalışmada kondrositlerin spesifik uzamsal desen değişiklikleri ile ilgili olarak bu değişiklikleri ölçmek için AFM kullanılır. Her desen değişiminde hem PCM hem de ECM için elastikiyette önemli değişiklikler gözlendi. Böylece yerel elastikiyetin ölçülmesi, OA'daki lokal doku dejenerasyonunun derecesi hakkında doğrudan sonuçlar alabına olanak sağlar.
Introduction
Eklem kıkırdağı avasküler, aneural dokudur. Seyrek dağınık kondrositler, gömülü oldukları geniş bir hücre dışı matris (ECM) üretir, düzenler ve korur. ECM'nin farklı ve özel bir parçası olarak kondrositler perisellüler matriks (PCM) olarak bilinen ince bir özel matris tabakası ile çevrilidir. PCM kondrositler korur bir mekanosensitive hücre-matris arayüzü1 olarak görür2 ve biyosentetik tepki modüle3. Daha önce açıklandığı gibi4, sağlıklı kıkırdak, kondrositler her doku tabakası ve eklemiçinözel olan belirli, farklı mekansal desenler düzenlenmiştir4 ,5 ve eklem özgü mekanik yükleme mekanizmaları bağlıdır6. Bu desenler osteoartrit başlangıcı ile çift dizeleri sağlıklı kıkırdak çiftleri ve dizeleri değiştirmek (OA). Hastalığın daha da ilerlemesi ile kondrositler küçük kümeler oluştururlar, boyutu giderek artan büyük OA. Son evre OA'da herhangi bir organizasyon yapısının tamamen kaybedilmesi ve apoptozin indüksiyonu gözlenmektedir. Böylece, kondrosit hücresel düzenleme OA ilerlemesi için görüntü tabanlı biyomarker olarak kullanılabilir4.
Hücrelerin ve dokuların biyomekanik özellikleri sadece şekil ve işlevlerini düzenlemekle kalmamış, aynı zamanda canlılıklarını korumak için de çok önemlidir. Elastikiyet değişiklikleri yaymak veya kanser veya OA gibi büyük hastalıkların başlangıcı tetikleyebilir. Atomik kuvvet mikroskobu (AFM), pikonewton'dan mikronewton'a kadar çok çeşitli kuvvetleri ölçen, belirli biyolojik hedef yapıların biyomekanik özelliklerini mikroskobik ölçekte niteliksel ve nicel olarak karakterize eden güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. AFM'nin en önemli uygulaması, numunelerin yüzey topografyasını ve mekanik özelliklerini nanometre çözünürlüğünde ölçmektir7. Ölçüm cihazı üç ana bileşenden oluşur: 1) Bir kantilin üzerine monte edilmiş keskin bir uç olan ve numunenin yüzeyi ile doğrudan etkileşim için kullanılan bir AFM probu. Kantile kuvvet uygulandığında, ölçülen dokunun özelliklerine göre ikincisinin deformasyonu oluşur. 2) Bir optik sistem daha sonra bir dedektör ünitesine yansıtılır cantilever üzerine bir lazer ışını projeleri. 3) Kantilden sapmış ışığı yakalayan bir fotodiyot dedektörü. Kantilever tarafından lazer sapması ile ilgili alınan bilgileri analiz edilebilen bir kuvvet eğrisine dönüştürür.
Bu nedenle, AFM'nin temel prensibi, AFM sondası ile numunenin hedef yapısı arasında hareket eden kuvvetin saptanmasıdır. Elde edilen kuvvet eğrileri elastikiyet, şarj dağılımı, manyetizasyon, verim gerilimi ve elastik plastik8deformasyon dinamiği 8 gibi örnek yüzeyinde hedef yapıların mekanik özelliklerini tanımlar. AFM'nin diğer görüntüleme tekniklerine göre önemli bir avantajı, AFM'nin dokuya zarar vermeden ortam veya dokularda yaşayan hücrelerin mekanik özelliklerini ölçmek için kullanılabilmedir. AFM hem sıvı hem de kuru koşullarda çalışabilir. Numune hazırlama için bir gereklilik yoktur. AFM, fizyolojik koşullara yakın numunelerde bir numunenin görüntülenebilme ve mekanik özelliklerini aynı anda ölçme olanağı sağlar. Bu çalışmada, yerli eklem kıkırdağında PCM ve ECM'nin elastikiyetini ölçerek OA ilerlemesini değerlendirmek için yeni bir yaklaşım açıklanmıştır. Kondrositlerin mekansal organizasyonunun lokal doku dejenerasyonu derecesi ile korelasyonoa erken teşhisi için tamamen yeni bir bakış açısı sağlar. Ancak bu desenlerin işlevsel önemi şimdiye kadar değerlendirilmemiştir. Eklem kıkırdağının en önemli işlevi düşük sürtünmede yük taşıma olduğundan, doku elastik özelliklere sahip olmalıdır. AFM, sadece ECM'nin elastikiyetinin değil, pcm'lerine gömülü uzamsal hücresel desenlerin de ölçülmesine olanak tanır. Elastikiyetin kondrositlerin mekansal desen değişimi ile gözlenen korelasyon o kadar güçlüdür ki, elastikiyetin tek başına ölçülmesi yerel doku dejenerasyonunun tabakalaşmasına izin verebilir.
PCM ve ECM'nin elastik modüllü leri, kıkırdak örneğinin eşzamanlı olarak görüntülenmesine olanak sağlayan ters faz kontrast mikroskobuna entegre edilmiş bir AFM sistemi kullanılarak 35 m inceliğindeki bölümlerde değerlendirildi. Bu protokol zaten bizim laboratuvar9 yayınlanan bir çalışma dayanmaktadır ve özellikle nasıl kondrositlerin mekansal düzenleme karakterize ve nasıl ilişkili PCM ve ECM elastikiyetini ölçmek için açıklar. Kondrositlerin her desen değişikliği ile, elastikiyet önemli değişiklikler de PCM ve ECM için görülebilir, bu teknik doğrudan kıkırdak dejenerasyon usahneyi ölçmek için kullanılmak üzere izin.
Bu doğrulanmış yaklaşım makroskopik doku bozulması aslında görünmeye başlamadan önce erken aşamalarında OA ilerleme ve terapötik etkileri değerlendirmek için yeni bir yol açılır. AFM ölçümlerini tutarlı bir şekilde gerçekleştirmek zorlu bir işlemdir. Aşağıdaki protokolde, AFM ile ölçülecek numunenin nasıl hazırlanacağı, cantilever'in hazırlanmasından başlayarak gerçek AFM ölçümlerinin nasıl yapılacılırılacılamının yapılabildiği, AFM' nin nasıl kalibre edilen ve ölçümlerin nasıl yapılacıla Adım adım talimatlar, güvenilir veriler elde etmek ve işleme ve yorumlama için temel stratejiler sağlamak için açık ve öz bir yaklaşım sağlar. Tartışma bölümü ayrıca bu titiz yöntemin en yaygın tuzaklarını açıklar ve yararlı sorun giderme ipuçları sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Almanya'nın Tuebingen Üniversitesi Hastanesi Ortopedik Cerrahi Anabilim Dalı'nda total diz artroplastisi uygulanan hastalardan ve Almanya'daki Winghofer hastanesi Rottenburg a.N.'den diz son evre oa'sı için insan kıkırdağı örnekleri alındı. Çalışmaya başlamadan önce tam bölüm, kurumsal ve yerel etik kurul onayı alındı (proje numarası 674/2016BO2). Katılımdan önce tüm hastalardan yazılı bilgilendirilmiş onam alındı. Yöntemler onaylanan yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Örnek hazırlama
- Kriyotom kesiti için kıkırdağın hazırlanması
- Diz eklemindeki dejeneratif değişiklikleri değerlendirmek için, hastalardan doku rezeksiyonu sonrası femoral kondillerin yük taşıma bölgesinden alınan eklem kıkırdağı örneklerini alın.
NOT: İncelenmiş örnekler, iç ve dış yüzeye göre doku yöneliminin net bir şekilde tanımlanmasına olanak sağlamak için en az ince bir subkondral kemik tabakası içermeli ve böylece en üstteki kıkırdak tabakasının standartlaştırılmış doku hasatını da mümkün kılmalıdır. Kıkırdak ameliyat tan sonra 24 saate kadar AFM ölçümleri için kullanılabilir. Doku, kullanmadan önce serumsuz Dulbecco'nun modifiye Eagle'ın (DMEM) %2 (v/v) penisilin-streptomisin ve %1.2 (v/v) amphotericin B ile saklanabilir. Ancak numunelerin 24 saatten fazla saklanması, doku şişmesi nedeniyle AFM ölçümlerinde objelere neden olabilir. - Neşter yardımıyla subkondral kemikten eklem kıkırdağı kesin ve daha sonra kıkırdak örneğini kriyotom cihazında düşük sıcaklık altında donan kriyotom topuğa suda çözünen katıştırma ortamına yerleştirin.
NOT: Donmuş ortam, saran dokuyu stabilize eder. Ayrıca kıkırdak örneğinin dondurulması ve gömme ortamının dondurulması ile sonuçlanır. Kıkırdağı kemikten keserken, dokunun yönünü takip edin. Kriyokesitler için gömülü doku, kıkırdağın üst tabakasının (yani eklem yüzeyinin) bıçakla karşı karşıya olduğu şekilde yerleştirilmelidir. Dokunun gömme ortamı ile tamamen kaplanması gerektiğini unutmayın.
- Diz eklemindeki dejeneratif değişiklikleri değerlendirmek için, hastalardan doku rezeksiyonu sonrası femoral kondillerin yük taşıma bölgesinden alınan eklem kıkırdağı örneklerini alın.
- Kıkırdağın kriyotom kesiti
- Standart bir kriyotom kullanarak, dondurulmuş suda çözünen katıştırma ortamına gömülü olan eklem kıkırdağının en üst tabakasından (yani eklem yüzeyinden) 35 μm kalınlığında doku kesin.
NOT: Toplamda 300 m'ye kadar (yaklaşık dokuz bölüme karşılık gelen) kesitlenebilir ve analizler için kullanılabilir. Önerilen 300 μm sınırı, eklem kıkırdağı gibi hyaline kıkırdakta genellikle floresan mikroskobu ile elde edilebilen görsel penetrasyon derinliğine karşılık gelmektedir. Böylece kıkırdakların baskın yerel mekansal desenine göre sıralanıp bu desenleri ilgili bölümlerde ölçmek mümkündür. - Cam bir slayt üzerinde bölümleri toplamak ve suda çözünen katıştırma ortamı kaldırmak için fosfat tamponlu salin (PBS) ile bölümleri 3x durulayın.
- Standart bir kriyotom kullanarak, dondurulmuş suda çözünen katıştırma ortamına gömülü olan eklem kıkırdağının en üst tabakasından (yani eklem yüzeyinden) 35 μm kalınlığında doku kesin.
- Kıkırdak bölümlerinin AFM uyumlu Petri kabına yapıştırması
NOT: AFM numuneüzerindeki mekanik girintinle veri topladığı için, hassas ölçümleriçin bölümlerin yerinde sabitedilmesi gerekir.- 35 μm kalınlığındaki bölümleri biyouyumlu numune tutkalile afm cihazıyla uyumlu doku kültürü yemeklerine hafifçe yapıştırın. Bunu yapmak için, tutkal 2−3 damla almak ve bölümün kenarı sona erecek yerde doku kültürü çanak üzerine koyun. Şimdi tutkal üzerine kıkırdak bölümü koymak ve doku kültürü çanak yüzeyine sıkıca yapışmasını bekleyin.
NOT: Yaylain eklem kıkırdağının 35 μm kalınlığında bölümleri kıvırmaya pek yatkın değildir. Ancak, örnekleri arabellek ortamından çıkarırken kıvrılma oluşursa, mümkün olduğunca az sıvının numunelere yapıştığından emin olun. En kısa sürede aşırı su kurudu, doğrudan tutkal dağınık noktalar üzerinde böylece hücre kültürü çanak yüzeyine sabitlenir doku yayıldı. Tutkal, tüm bölüme değil, yalnızca numunenin kenarlarına ince bir tabaka halinde uygulanır. Yapıştırıcının ölçümlere müdahale etme olasılığını ortadan kaldırmak için, yapıştırılmış alandan uzakta ki numunenin yalnızca o kısmını ölçün. - Tutkal ve doku düzgün bağ sağlamak için oda sıcaklığında (RT) 2 dakika için bölümleri kuluçka. Daha sonra leibovitz'in L-glutaminsiz ve Sodyum bikarbonatsız l-15 ortamı ile bölümleri kaplayın, böylece tamamen batırılmış olurlar.
NOT: Fiksasyon sırasında numunenin ani hareketleri veya yetersiz tutkal uygulaması, dokunun kültür çanamından ayrılmasına neden olan yaygın hatalardır. Ayrıca, Leibowitz ortamının uygulanması, orta nın yarattığı "dalgalar" nedeniyle numuneyi yüzeyden ayırmamak için nazik bir şekilde yapılmalıdır. - Petri kabını yapıştırılmış kesitli standart hücre kültürü kuluçka makinesine 37 °C'de ölçümler yapılana kadar yerleştirin.
NOT: Doku bölümlerinin stabil olduğundan ve her adımı yavaş yavaş gerçekleştirerek doku kültürü çanağının yüzeyinden kopmadığından emin olun.
- 35 μm kalınlığındaki bölümleri biyouyumlu numune tutkalile afm cihazıyla uyumlu doku kültürü yemeklerine hafifçe yapıştırın. Bunu yapmak için, tutkal 2−3 damla almak ve bölümün kenarı sona erecek yerde doku kültürü çanak üzerine koyun. Şimdi tutkal üzerine kıkırdak bölümü koymak ve doku kültürü çanak yüzeyine sıkıca yapışmasını bekleyin.
2. Cantilever hazırlanması (mikrokürelerin yapıştırma)
- AFM cihazının hazırlanması ve mikrokürelerin seyreltilmesi
- Kantili hava ölçümleri için belirtilen cam blota yerleştirin, yayile düzeltin ve cam bloğu AFM kafasına monte edin.
- Mikroküreleri %100 etanol (100 partikül/10 μL) olarak seyreltin ve mikrokürelerin ayrılması ve bir araya kümelenmemesi için 10 s'lik ultrasonicate yapın.
- Yapıştırma için kurulum hazırlama
- Cam bir kaydırağı %70 etanolle temizleyin ve AFM cihazındaki numune tutucuya takın.
NOT: Kaydıraktan arınması, yapıştırma işleminin slayt yüzeyinde birikmesini engelleyebilecek toz lekelerini önler. - Mikrosfer süspansiyonunun 2 μL'sini kaydıranın ortasına ve 2 μL'lik tutkalı mikrosfer süspansiyonuna yakın bir yere yerleştirin.
NOT: Tutkal ile mikroküreler arasında hızlı bir geçiş sağlamak için mikrosfer süspansiyonve tutkal birbirine yakın yerleştirerek tavsiye edilir. Eğer kandağını tutkaliçine batırMak ile mikrosferle temas etmek arasındaki geçiş çok uzunsa, tutkal sonunda sertleşir ve yapışkan özelliklerini kaybeder. - Mikrosferdeki etanol sıvısının hava kurmasına izin verin, mikroküreleri yerinde bırakın.
- Cam bir kaydırağı %70 etanolle temizleyin ve AFM cihazındaki numune tutucuya takın.
- Mikrokürelerin kantilever ucuna yapıştırma
- Ucu tutkal la kapalana kadar 10 μm adımlarda step motor yardımı ile tutkal içine elle kantilever daldırma. Tutkal hızlı kurur gibi, hızlı bir şekilde bu adımı gerçekleştirin.
- Ktilever'i tekrar 100 m geri çek, mikrokürelere doğru hareket ettir in ve kantilever ucunu doğrudan tek bir mikrosferin üzerine yerleştirin.
- Kantilever ucunu Tablo 1'degösterilen parametrelerle seçilen mikrosfere batırmak için kuvvet spektroskopisi ölçümü yapın.
NOT: Bu adımı uygulayarak, mikrosfer yüzeyinin ölçümü, kantilever ucu ile mikrosfer arasında temas kurmak için kullanılır. Tablo 1'de gösterilen nispeten uzun temas süresi, tutkal ve mikrosfer arasında geniş bir bağlanma süresi sağlar. Bu adımda elde edilen kuvvet-uzaklık eğrisi, mikrosferin kantilever ucuna yapıştırılma sının bir yan ürünü olarak oluşturulur ve daha fazla analiz için işlenmez. - Bir mikrosfer kantile bağlandıktan sonra, cam bloğu üzerine monte edilmiş cam bloğu geri çekin ve afm kafasını mikroskoptan çıkarın. Son olarak, Cam blok ve cantilever AFM kafadan unmount.
- Kantili 65 °C'de 2 saat kuluçkaya yatırın ve ölçümlere başlamadan önce RT'de bir gece kurutun.
NOT: Kantilin inkübasyonu yapıştırıcının yapışkan özelliklerini geliştirerek kantil-mikrosfer kompleksini daha kararlı hale getirir.
3. AFM cihazının ölçümler için hazırlanması
- Üst yüzeyin AFM tutucuya düz ve paralel olması için AFM tutucuüzerinde sıvı bir ortamda ölçüm yapmak için belirtilen cam bloğu ayarlayın.
- Cımbız yardımıyla, seçilen kantili cam bloğun yüzeyine dikkatlice monte edin, böylece mikrosferli AFM ucu cilalı optik düzlemüzerinde çıkıntı sağlar.
NOT: AFM'nin lazerini fotodedektöre yansıtabilmek için cantilever'in ucunun cilalı düzlem üzerinde çıkıntı yapması gerekir. Cam bloğun cilalı optik yüzeyini çizmemek için kantili AFM'ye yerleştirirken çok dikkatli olun. Cam bloğun çizilmesi lazer hizalamanın ayarlanmasında zorluklara neden olabilir ve sonraki ölçümleri etkileyebilir. - Kantil, mekanik basınca tabi olacağı için yerinde sabitolması gerekir. Metalik yay'ı bloğun oluğuna kaydırarak ve cımbız yardımıyla yayı yayı sıkıştırarak cam bloktaki kantili stabilize edin.
- Cam bloğu afm kafasına dikkatlice yerleştirin ve entegre kilitleme mekanizması yla sabitleyin. Yay sol tarafa dönük olduğundan emin olun, böylece kantilever doğru yönde yerleştirilir. Ardından AFM kafasını afm cihazına kantilever ile takın.
4. Numunenin yüklenmesi ve cantilever'in kalibrasyonu
NOT: Burada, cihazın kalibrasyonu, leibovitz'in orta sıyla dolu Petri kabının temiz yüzeyinde herhangi bir örnek dokusu olmadan bir kuvvet eğrisi çalıştırılarak gerçekleştirilir. Kalibrasyon, numune olmadan sadece AFM ortamı ile doldurulmuş ayrı bir kontrol AFM çanak kullanılarak da yapılabilir.
- Numuneyi AFM cihazına monte etmek
- Adım 1.3.3'te hazırlanan Petri kabını AFM numune tutucunun üzerine yerleştirin.
- Petri kabı ısıtıcısını açın ve 37 °C'ye ayarlayın. Doku kültürü çanak optimum sıcaklığa ulaşmak için izin ver (yani, 20 dk).
- AFM kafada ortamın yoğuşmasını önlemek için cantilever tertibatının tabanına bir koruma folyosu yerleştirin.
- Cihazın kalibrasyonu
- Yazılımı(Malzeme Tablosu)açın ve ardından lazer hizalama penceresi ve yaklaşma parametre ayarlarını gösteren pencereyi açın. Sonra step motor, lazer ışığı ve CCD kamera açın.
- Ktilever'i görselleştirmek ve tanımlamak için mikroskoptaki CCD kamerayı kullanın. Step motor fonksiyonunu kullanarak, ktilever tamamen orta batırılmış kadar 100 μm adımlarla kantilever düşürün.
NOT: Kantilin sıvıya batırış kısmı CCD-kamera ile görsel olarak tanımlanabilir. Suyun yüzeyini kırdığında, kantilever ucu suda kolayca fark edilebilir dairesel yansımalar oluşturur. - Ayar vidalarını kullanarak lazeri cantilever'in üzerine doğru yönlendirin.
NOT: Bu lazer hizalama mekanizması zarar verecek gibi vidalar, aşırı sarma etmeyin. Kantilever aşağıdan bakıldığında ve lazer ışını yukarıdan geliyor. - Lazer kantilever üzerine konumlandırıldıktan sonra, yansıyan ışının fotodedektörün ortasına düşmesi için Lazer ışınıNı AFM cihazındaki vidalar yardımıyla ayarlayın. Lazer hizalama işlevini kullanarak lazer ışınının konumunu izlemeye devam edin.
NOT: Dedektör, lazer ışınının kantilinin yansıttığı sapmayı alır ve elektrik sinyaline dönüştürür. - Lazer-cantilever ayarı sonra, Toplam sinyali 1 V veya üzerinde, yanal ve dikey sapmalar 0'a yakın olmalıdır. Bu değerler elde edilmezse, fotodedektörü ayarlayın.
- Kalibrasyon kuvveti eğrisinin elde edilmesi
- Ölçümleri başlatmak için AFM çanak yüzeyine ulaşmak için, Tablo 2'deverilen yaklaşım parametreleri ile bir tarayıcı Yaklaşım çalıştırın. Doku kültürü çanak altına ulaşıldıktan sonra, 100 μm tarafından kantilever geri çekmek.
NOT: Bu noktada sonda doku kültürü çanak altından tam olarak 100 μm yukarıdadır. - RUN parametrelerini ayarlayın ve Tablo 3'tegörüntülenen parametreleri ayarlayın. Bir ölçüm başlatmak ve kalibrasyon kuvvet-mesafe eğrisi elde etmek için RUN düğmesini tıklatın.
NOT: Burada elde edilen kuvvet eğrisi Şekil 1'degösterilmiştir. - Kalibrasyon kuvvet-uzaklık eğrisinde, yazılımdaki geri çekilen eğrinin doğrusal sığdırışını için bölgeyi seçin.
NOT: Doğrusal uyum, cantilever'in hassasiyetini ölçmek için yapılır. Doğrusal uyum yerine oturtülduktan sonra, değerler yazılım tarafından kaydedilir. Yay sabiti ölçümü veya kantilever termal gürültü sonra yazılım tarafından hesaplanır. - Ölçümler 37 °C sıcaklıkta orta düzeyde yapıldığından, fizyolojik koşulları mümkün olduğunca yakından taklit etmek için yazılımdaki sıcaklık değişkenini 37 °C olarak ayarlayın.
NOT: Kalibrasyon un sonunda dikey sapma kaydedilir ve fotodiyot dedektörü ile orijinal kaydın birimi olan volt (V) yerine newton (N) kuvvet biriminde görüntülenir.
- Ölçümleri başlatmak için AFM çanak yüzeyine ulaşmak için, Tablo 2'deverilen yaklaşım parametreleri ile bir tarayıcı Yaklaşım çalıştırın. Doku kültürü çanak altına ulaşıldıktan sonra, 100 μm tarafından kantilever geri çekmek.
5. Elastikiyet ölçümleri AFM ile gerçekleştirilerek ECM ve PCM'nin biyomekanik karakterizasyonu
- Kıkırdak bölümünde kondrosit desenleri belirlenmesi
- AFM sistemine entegre edilmiş bir faz kontrast mikroskobu altında kıkırdak bölümünü gözlemleyin ve osteoartritik diz eklem kıkırdağının belirli hücreseldesenleri 10 belirlemek: tek dizeleri (sağlıklı doku alanları), çift dizeleri (başlangıç doku dejenerasyonu), küçük ve büyük kümeler (her ikisi de gelişmiş doku dejenerasyonu). Bkz. Şekil 2A–D.
- İstenilen belirli desen tanımlandıktan sonra, matris türü başına seçilen desen başına iki site (PCM veya ECM) ölçün ve her ölçüm alanında dokuz ölçüm tekrarı gerçekleştirin(Şekil 2E,F). Olası yanlışlıklar için hesap verecek kadar büyük bir örnek boyutu sağlayın.
NOT: PCM ölçümleri için, kantilever'i hücrelere yakın bir yere yerleştirin (Şekil 2E,F'dekikırmızı dairelerin gösterdiği gibi). ECM ölçümlerini yapmak için, hücresi olmayan bir bölge seçin (Şekil 2E,F'dekimavi alantarafından gösterilmiştir) ve adım 5.2'de açıklandığı gibi girintiyi gerçekleştirin.
- Hedeflenen sitenin girintisi
- Bir yaklaşım gerçekleştirin ve ardından bir geri çekme gerçekleştirin, böylece kantilin dokudan 100 μm yukarıda konumlandırılması, sonraki ölçümler için başlangıç pozisyonu olacaktır.
- Ölçülecek desenin PCM veya ECM'sine odaklanın ve bu noktada bilgisayar faresini düzeltin.
NOT: Fare girintinin hedef alanı için görsel bir işaretçi olarak hizmet verecektir. Bir kez odak kantilever ucuna kaydırır, doku yapıları ayırt edilemez veya bulanık hale gelecektir. - Şimdi sondaya odaklanın ve sondanın ucunu daha önce bilgisayar oku tarafından sabitlenmiş noktaya taşıyın. Daha sonra, kantilever kalibrasyonu ile elde edilen ayar noktası parametresini kullanarak RUNile ölçümleri başlatın.
NOT: Tek bir dizenin PCM'sini ölçerek elde edilen örnek bir kuvvet eğrisi Ek Şekil 1'degösterilmiştir.
6. Veri işleme
NOT: Elastik modülün veri analizi veya tayini daha önce açıklandığı gibi Hertz modeli kullanılarak yapılır11,12. Indenter şekli uç mikrokürelerin kullanımı nedeniyle küresel ve Poisson oranı öncekiliteratür13,14,,15dayalı 0,5 olarak tutuldu .
- AFM cihazından elde edilen verilerle uyumlu veri işleme yazılımını(Malzeme Tablosu)açın.
- Kuvvet-mesafe eğrilerini işlemek için yazılımdaki Hertz modelini seçin. Poisson oranını 0,5 olarak ayarlayın ve uç şeklini küresel ve 12,5 μm'lik bir uç yarıçapı olarak seçin.
- Tüm parametreler ayarlandıktan sonra sonuçlar takılır ve Young modülü hesaplanır ve yazılım tarafından görüntülenir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dizelerden çift dizele, küçük ve son olarak büyük kümelere kadar olan fizyopatolojik model boyunca, hem ECM(Şekil 3A)hem de PCM(Şekil 3B)elastik modülerlik her desen değişimi arasında önemli ölçüde azalmıştır. Bunun tek istisnası dizeleri ve çift dizeleri (p = 0,072) arasındaki ECM farkı oldu. Sonuçlar, ECM/PCM oranının(Şekil 4B)önemli ölçüde değişmediğini, ECM ile PCM arasındaki mutlak elastikiyet farklılıklarında belirgin bir azalma gözlendiğini göstermektedir(Şekil 4A). Ayrıca, sonuçlar ECM/PCM oranı veya ilişkili hücresel uzamsal değişiklikler (r = -0.099, p = 0.281) ile ilgili önemli bir ilişki göstermez.
Şekil 1: AFM temas modunda bir kuvvet-mesafe eğrisinin şematik gösterimi. Sonda yüzeye yaklaştıkça, kuvvetler ilk başta ucun ölçülebilir bir şekilde sapmasını sağlamak için çok küçüktür ve böylece ucu bozulmamış konumunda bırakırlar (1). Daha sonra, kantilever numuneye çok yakın olduğunda, uç ve sonda arasında aktif olan yapışkan kuvvetler nedeniyle, kantil aslında hızlı bir şekilde örneğe doğru yapışır (2). Prob numuneye daha fazla yaklaşırken, itici sapma daha sonra dikey sapma göreli ayar noktası değerine ulaşana kadar neredeyse doğrusal bir yükseklik ve sapma işlevi ile yön hareketine karşı karşıya kalır (3). Geri çekilirken (4), alçaltıcı sapma kuvvetlerine ek olarak, yapışma kuvvetleri de bulunurken, kantilever numuneden Z ekseninde geri çekilir. AFM sondası örnekle temas tan çekildiğinde, arayüzdeki yapışmadan gevşemeden önce önce "sıkışmış" olur, hatta sondaile temas etmeden önce kantilin kısa bir negatif sapmasına yol açabilir,. Sapmanın derecesi nanonewtonlarda ifade edilen kantilüzerinde çalışan kuvvette ifade edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Koldrositlerin ve hücre dışı matriks (ECM) ve perisellüler matriks (PCM) AFM ölçümlerinin temsili mekansal karakterizasyonu. (A-D) Hücresel desenlerin karakterizasyonu: dizeleri (A), çift dizeleri (B), küçük kümeler (C), ve büyük kümeler (D). PCM (kırmızı daireler) ve ECM (mavi alan)(E/F)elastik modüle osteoartritik kıkırdak farklı hücresel desenler için değerlendirildi. ECM ve PCM ölçüm alanları deneyci tarafından seçilmiş ve siyah haçlarla grafiksel olarak belirtilmiştir. Ölçümler için kullanılan kantilever ucu beyaz bir yıldız ile işaretlenir. Ölçek çubukları 10 μm(A-D) ve 100 μm(E/F)temsil eder. Şekil uyarlanmış ve Danalache ve ark.9değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Sayısallaştırılmış Young'ın hücre dışı matriks (ECM) ve perisellüler matriks (PCM) modülerinin mekansal kondrosit organizasyonunun bir fonksiyonu olarak karşılaştırılması. Progresif patolojik uzamsal kondrosit organizasyonu ile hem ECM(A)hem de PCM(B)(*p < 0.05, ***p < 0.001) için kutu çizimlerinde elastikiyette kademeli bir azalma kaydedildi. Kısaltmalar: SS: tek dizeleri, DS: çift dizeleri, SC: küçük kümeler, BC: büyük kümeler. Rakamlar Danalache ve ark.9alınır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Genç lerin hücre dışı matriks (ECM) ve perisellüler matriks (PCM) modülerlerinin hücresel uzamsal organizasyonun bir fonksiyonu olarak ilişkisi. Giderek daha patolojik uzamsal kondrosit organizasyonu Hem ECM hem de PCM(A)için Young'ın modülerinin azalması ile ilişkilendirilmiştir. Bu mekansal değişiklikler gerçekleşirken, ECM ve PCM elastikiyeti oranı sabit kaldı, önemli bir değişiklik göstermeden(B). Veriler ortalama ± standart hata (A) ve boxplots (B)ile bir çizgi diyagramı olarak sunulur. Kısaltmalar: SS: tek dizeleri, DS: çift dizeleri, SC: küçük kümeler, BC: büyük kümeler. Rakamlar Danalache ve ark.9alınır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: Uygun sonuçları (turuncu ok) ve artık kök ortalama karesini (artık RMS; siyah ok) gösteren tek bir dize deseninin perisellüler matris (PCM) girintisi ile elde edilen temsili kuvvet eğrisi. Uygunluk sonuçları örnek ve uç arasındaki iletişim noktasını, Young's Modülü'nü ve taban çizgisini içerir. Aşağıda görüntülenen artık RMS, uyum ve kuvvet verileri arasındaki farkı açıklar ve bu nedenle bir kuvvet eğrisinin uygun kalitesini temsil emerek. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
| Tablo 1. AFM-probuüzerinde mikrosfer yapıştırma parametreleri | |
| Parametre | Değer |
| Setpoint | 5.0 V |
| Taban çizgisini ayarlama | 1 |
| Çekme uzunluğu | 90,0 μm |
| Z hareketi | Sabit hız |
| Hızı artırın | 5.0 μm/s |
| Süreyi uzatın | 18.0 s |
| İletişim süresi | 90.0 s |
| Gecikme modu | Sabit kuvvet |
| Örnek oranı | 2000 Hz |
Tablo 1. AFM-probuna mikrosfer yapıştırma parametreleri.
| Tablo 2. Yaklaşım parametreleri | |
| Yaklaşım Parametreleri | Değer |
| Yaklaşım IGain | 5.0 Hz |
| Yaklaşım PGain | 0.0002 |
| Yaklaşma hedef yüksekliği | 10,0 μm |
| Yaklaşma ayar noktası | 5.00 V |
| Yaklaşma taban çizgisi | 0.00 V |
Tablo 2. Yaklaşma parametreleri.
| Tablo 3. Çalışma parametreleri | |
| Parametre | Değer |
| Setpoint | 1.0 V |
| Taban çizgisini ayarlama | 1 |
| Çekme uzunluğu | 90,0 μm |
| Z hareketi | Sabit hız |
| Hızı artırın | 5.0 μm/s |
| Süreyi uzatın | 18.0 s |
| İletişim süresi | 0,0 s |
| Gecikme modu | Sabit kuvvet |
| Örnek oranı | 2000 Hz |
Tablo 3. Parametreleri çalıştırın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biyolojik malzemelerin biyomekanik özelliklerini nano ölçekte ölçmek için yeni ve güçlü bir teknik olarak AFM'yi kullanarak, insan osteoartritik eklem kıkırdağındaki ECM ve PCM'nin elastik özelliklerini ölçtük. Kıkırdak örnekleri kondrosit organizasyonunun baskın uzamsal desenine göre yerel doku dejenerasyonu için görüntü tabanlı biyomarker olarak seçilmiştir. Beklendiği gibi, mekansal kondrosit yeniden düzenlenmesi boyunca hem ECM hem de PCM elastikiyet değerlerinde güçlü bir düşüş gözlendi. Bu gözlemler, kondrositlerin mekansal düzenlemesindeki sapmaların sadece hücresel mikroortamın (PCM) elastik özelliklerindeki değişikliklerle değil, aynı zamanda tüm kıkırdak (ECM) değişikliklerle de ilişkili olduğunu açıkça vurgulamaktadır. Ayrıca, ECM/PCM oranı, OA sırasında PCM ve ECM'nin elastik modüllülerinde yapılan sağlam değişikliklere rağmen önemli bir değişiklik göstermedi. Bu bulgular, ECM ve PCM'nin mekanik özelliklerindeki değişikliklerin tek yönlü ve aynı zamanda meydana geldiğini, bu da progresif imhanın doğasının hem PCM hem de ECM için benzer olduğu anlamına gelebileceğini göstermektedir. OA inisiyasyon ve ilerleme böylece önemli PCM ve ECM bozulması ve sonuçta imha tetikler. Her iki kayıp da bu çalışmada gösterildiği gibi eklem kıkırdağının elastikiyeti gibi biyomekanik özelliklerinin önemli ölçüde kaybı ile ilişkilendirildi. Bu biyomekanik özellikleri için bir belirteç olarak kondrositlerin mekansal organizasyonun fonksiyonel alaka vurgulamaktadır. Tersine, yerel olarak baskın uzamsal desenler ve böylece kıkırdak yerel doku dejenerasyonu hakkında sonuçlar alabilirsiniz yerel elastikiyet ölçümleri kullanmanızı sağlar.
Atomik kuvvet mikroskobu (AFM) dokuları tahribatsız bir şekilde incelemek için yüksek çözünürlüklü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Bir fotodiyot üzerine bir lazer yansıtan hassas ve esnek bir cantilever ile fiziksel olarak sondalama örnekleri ile çalışır. Bu yansımadaki herhangi bir değişiklik kaydedilir ve elektrik sinyaline dönüştürülür. AFM nanoölçekli ölçümler yapmak için güçlü bir araç olsa da, sınırlamaları ve tuzakları olmadan gelmez. Özellikle kritik mikroküreler yapıştırma tarafından cantilever hazırlanmasıdır. Bu yöntem bağlamında, mikroküreler ölçümler sırasında girintinasyon derinliği ni ve lokal basıncı değiştirmek için kullanılır. Sondanın ucuna bağlı küçük mikroküreler kullanarak tek bir lif tek başına kullanırken tek lif elastikiyeti yerine bir lif ağının biyomekanik özelliklerinin ölçülmesine olanak sağlar. Ayrıca ölçüm işlemi sırasında doku hasarını önler. Kantilatör sensörlerinin hassas yapısı nedeniyle, tutarlı ve doğru ölçümler elde etmek için dikkatli ve dikkatli bir hazırlık modu oluşturulmalıdır. Mikrokürelerin sensörün ucundan ayrılmasını önlemek için, bir haftadan daha eski olmayan taze karışık tutkal öneririz. Ayrıca, mikrosfer eki lateral sapma kolayca tutarsız ölçümler sonuçları olarak sensör işlevselliği için ucun merkezinde mikroküre yerleştirmek için hayati önem taşımaktadır.
Cam blok üzerine kantilever yerleştirerek ve uygun bir yay ile sabitleme titiz dikkat ve sabit eller gerektiren hassas ve hataya yatkın bir süreçtir. Cantilevers çok eğitimsiz operatörler tarafından imha olma olasılığı çok yüksek olduğundan, biz rahat AFM's kolayca kırılabilir bileşenleri işlemek için çeşitli test çalışır ve uygulama yapma öneririz.
Temiz bir cam blok düzgün cihaz kalibre etmek ve güvenilir ölçümler elde etmek için zorunludur. Bloğun optik yüzeyindeki kir veya toz, fotodedektörün uygun lazer hizalanmasını engelleyebilir. Bu nedenle, lazer hizalama sırasında sorunlarla karşılaşılırsa, cam bloğun etanol ile ikinci kez yıkanması gerekebilir.
Veri analizi veya elastik modülün belirlenmesi daha önce açıklandığı gibi Hertz modeli kullanılarak yapılabilir11,12. Kısacası, girintinasyon tarafından oluşturulan veriler, kantilever ucunun hareketi üzerinde kuvvet çizimleridir. Ölçümler sırasında, kantilever örnek yönünde hareket ettirilir. Bu, cantilever'in örnekle temas kurmasını ve daha sonra ilk hareket ettiği yöne doğru bükülmesine yol açar. Aynı anda, belirli bir miktar tarafından örnek bir girintisi oluşur. Hertz-fit modelini kullanabilmek için, numunenin girintisi hesaplanmalı ve kantilever bükme parametresini izole etmek için ayarlanmalıdır. Örneği açıklayan parametre, araştırılan malzemeye bağlı olarak Poisson'un oranıdır. Yumuşak biyolojik numuneler için Poisson'un oranı genellikle 0,515olarak belirlenmiştir. Yukarıda belirtildiği gibi, kullanılan indenter şekli Young modülünün hesaplanması ile ilgilidir, orijinal Hertz denklemine yapılması gereken uzantıları dikte eder. Açıklanan deney durumunda, mikrokürelerin kullanımı nedeniyle küresel bir indenter şekli varsayılır.
AFM yeni ve ilginç veri toplama olanakları sunsa da, elde edilen verilerin tutarlılığı ve güvenilirliği ilgili operatörün deneyimine bağlıdır. Yukarıda özetlenen adımlardan bazıları insan hatasına yatkındır ve bunları düzgün bir şekilde yürütmek için sabır ve titizlik gerektirir.
Ölçüm sonuçlarını etkileyebilecek birçok hassas değişken nedeniyle, bu çalışmada bildirilen mutlak kuvvet değerleri genelleştirilemez, ancak deneysel kurulumumuz için oldukça spesifiktir. Kıkırdağın doku dejenerasyonu değerlendirmek için bu tekniği kullanırken, sonuçları mevcut özel deneysel ölçüm ayarlarına ölçeklendirmek için öncelikle farklı uzamsal desenler üzerinde bazı normalleştirme ölçümleri yapılması gerekir. Farklı elastikiyet moduli ve mekansal desenler ilişkisi, ancak, etkilenmez.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Biz yardım ve destek için orijinal yayın bizim co-yazarlar teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Merck | A2942 | |
| Atomic Force Microscope (AFM) | CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany | JPK00518 | |
| AFM head | (CellHesion 200) JPK | JPK00518 | |
| Biocompatible sample glue | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | H000033 | |
| Cantilever | tip C, k ¼ 7.4 N/m, All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria | AIO-TL-10 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany | 41966052 | |
| Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM) | AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany | L201306_03 | |
| Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine | (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) | F1315 | |
| Microspheres | Polysciences | 07313-5 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Petri dish heater associated with AFM | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | T-05-0117 | |
| Scalpel | Feather | 2023-01 | |
| Tissue culture dishes | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland | TPP93040 | |
| Tissue-tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | SA6255012 |
References
- Guilak, F., et al. The pericellular matrix as a transducer of biomechanical and biochemical signals in articular cartilage. Annals of the New York Academy of Sciences. 1068, 498-512 (2006).
- Peters, H. C., et al. The protective role of the pericellular matrix in chondrocyte apoptosis. Tissue Engineering Part A. 17 (15-16), 2017-2024 (2011).
- Larson, C. M., Kelley, S. S., Blackwood, A. D., Banes, A. J., Lee, G. M. Retention of the native chondrocyte pericellular matrix results in significantly improved matrix production. Matrix Biology. 21 (4), 349-359 (2002).
- Rolauffs, B., Williams, J. M., Grodzinsky, A. J., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Distinct horizontal patterns in the spatial organization of superficial zone chondrocytes of human joints. Journal of Structural Biology. 162 (2), 335-344 (2008).
- Schumacher, B. L., Su, J. L., Lindley, K. M., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Horizontally oriented clusters of multiple chondrons in the superficial zone of ankle, but not knee articular cartilage. The Anatomical Record. 266 (4), 241-248 (2002).
- Rolauffs, B., et al. Onset of preclinical osteoarthritis: the angular spatial organization permits early diagnosis. Arthritis Rheumatology. 63 (6), 1637-1647 (2011).
- Maver, U., Velnar, T., Gaberšček, M., Planinšek, O., Finšgar, M. Recent progressive use of atomic force microscopy in biomedical applications. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 80, 96-111 (2016).
- Polini, A., Yang, F. Physicochemical characterization of nanofiber composites. Nanofiber Composites for Biomedical Applications. Ramalingam, M., Ramakrishna, S. , Woodhead Publishing. Cambridge, UK. 97-115 (2017).
- Danalache, M., Jacobi, L. F., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Assessment of biomechanical properties of the extracellular and pericellular matrix and their interconnection throughout the course of osteoarthritis. Journal of Biomechanics. 97, 109409 (2019).
- Danalache, M., et al. Changes in stiffness and biochemical composition of the pericellular matrix as a function of spatial chondrocyte organisation in osteoarthritic cartilage. Osteoarthritis Cartilage. 27 (5), 823-832 (2019).
- Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. Robust strategies for automated AFM force curve analysis--I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials. Journal of Biomechanical Engineering. 129 (3), 430-440 (2007).
- Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes. Journal of Biomechanics. 41 (2), 454-464 (2008).
- Thambyah, A., Nather, A., Goh, J. Mechanical properties of articular cartilage covered by the meniscus. Osteoarthritis Cartilage. 14 (6), 580-588 (2006).
- Choi, A. P., Zheng, Y. P. Estimation of Young's modulus and Poisson's ratio of soft tissue from indentation using two different-sized indentors: finite element analysis of the finite deformation effect. Medical Biological Engineering Computing. 43 (2), 258-264 (2005).
- Jin, H., Lewis, J. L. Determination of Poisson's ratio of articular cartilage by indentation using different-sized indenters. Journal of Biomechanical Engineering. 126 (2), 138-145 (2004).
