Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Платформа масс-спектрометрии обмена водорода и дейтерия (HDX-MS) для изучения пептидных биосинтетических ферментов

Published: May 4, 2020 doi: 10.3791/61053
Automatic Translation
1, 1
1Department of Chemistry, McGill University

Summary

Лантипептидные синтезы катализует многоступенчатые реакции во время биосинтеза пептидных натуральных продуктов. Здесь мы описываем непрерывный, снизу вверх, серо-дейтерий обмена масс-спектрометрии (HDX-MS) рабочий процесс, который может быть использован для изучения конформации динамики lanthipeptide синтезетаз, а также других аналогичных ферментов, участвующих в пептид природного продукта биосинтеза.

Abstract

Масс-спектрометрия обмена водородом дейтерия (HDX-MS) является мощным методом биофизической характеристики ферментно-конформативных изменений и ферментно-субстратных взаимодействий. Среди его многочисленных преимуществ, HDX-MS потребляет только небольшое количество материала, может быть выполнена в почти родных условиях без необходимости фермента / субстрата маркировки, и может обеспечить пространственно решенную информацию о ферментной конформации динамики даже для крупных ферментов и мультипротеин комплексов. Метод инициируется путем разбавления фермента интереса в буфер, подготовленный в D2O. Это вызывает обмен протия в пептидных аминах (N-H) с дейтерия (N-D). В желаемых точках обмена, реакция aliquots утоляются, фермент протеолизирован в пептиды, пептиды разделены ультра-производительной жидкой хроматографии (UPLC), и изменение массы каждого пептида (из-за обмена водорода на дейтерий) регистрируется MS. Количество поглощения дейтерия каждым пептидом сильно зависит от местной среды склеивания водорода этого пептида. Пептиды, присутствующие в очень динамичных регионах дейтерия ферментного обмена очень быстро, в то время как пептиды, полученные из хорошо упорядоченных регионов, проходят обмен гораздо медленнее. Таким образом, скорость HDX сообщает о местной конформациальной динамике ферментов. Возмущения к уровням поглощения дейтерия в присутствии различных лигандов могут быть использованы для карты лигандовых связывающих участков, выявления алостерических сетей и понимания роли конформациальной динамики в функции ферментов. Здесь мы проиллюстрировали, как мы использовали HDX-MS, чтобы лучше понять биосинтез типа пептидных натуральных продуктов, называемых лантипептидами. Лантипептиды – это генетически закодированные пептиды, которые пост-переводно модифицируются крупными, многофункциональными, конформно-динамическими ферментами, которые трудно изучать с помощью традиционных подходов структурной биологии. HDX-MS обеспечивает идеальную и адаптируемую платформу для изучения механистических свойств этих типов ферментов.

Introduction

Белки являются структурно динамические молекулы, которые образец различных конформаций на временных масштабах, начиная от фемтосекундного масштаба вибрации связи для перестановки целых белковых доменов, которые могут произойти в течениемногих секунд 1. Эти конформные колебания часто являются критическими аспектами функции фермента/белка. Например, конформациальные изменения, вызванные связыванием лигандов, часто критически важны для модуляции функции ферментов, либо путем организации активных остатков участка, необходимых для катализа, определения сайтов связывания субстрата в последовательных кинетических механизмах, защиты реактивных промежуточных веществ от окружающей среды, либо путем модуляции функции ферментов через алостерические сети. Недавние исследования также показали, что конформативная динамика может быть сохранена на протяжении всей эволюции и что возмущения к сохраненным молекулярным движениям могут быть коррелированы с изменениями в специфичности субстрата и появлением новых функций фермента2,3.

В последние годы масс-спектрометрия обмена водородом-дейтерия (HDX-MS) быстро стала мощным методом для зондированиятого,как конформациальные ландшафты белка реагируют на возмущения, такие как связывание лиганда или мутагенез4,5,6,7. В типичном эксперименте HDX-MS(рисунок 1),протеин интереса помещен в буфер подготовленный в D2O, который вызывает замену растворителя-обменяемых протонов с deuteria. Скорость обмена амиде moiety пептидных связей сильно зависит от рН, местной аминокислотной последовательности, а также от местной структурнойсреды амиде 8. Амидес, которые занимаются водородными взаимодействиями связи (например, присутствующих в α-хеликах и β-листах), обмениваются медленнее, чем амида в неструктурированных регионах белка, которые подвергаются воздействию растворителя. Таким образом, степень поглощения дейтерия является отражением структуры фермента. Ферменты, которые являются конформациально динамическими, или которые проходят структурные переходы на связывание лиганда, как ожидается, даст измеримый ответ HDX.

Механистическая основа медленного обменного курса структурированного амеда показана на рисунке 25,8,9. Для того, чтобы пройти HDX, структурированная область должна сначала временно попробовать развернутую конформацию, так что молекулы растворителя, которые катализингировать обмен HDX через определенный кислотный/базовый химический механизм, имеют доступ к обмениваемому амиду. В конечном счете, относительные величины химического обменного курса(kchem)и скорость складывания и складывания(kopen и kclose)определяют курс HDX, измеренный вэксперименте 5,8. Из этой простой кинетической модели ясно, что степень поглощения дейтерия будет отражать лежащую в основе конформацию динамики (определяемую kopen и kclose). Большинство экспериментов HDX-MS проводятся в рабочем процессе снизу вверх, где, после реакции обмена, белок интереса переваривается в пептиды и поглощение дейтерия каждым пептидом измеряется как увеличениемассы 7. Таким образом, HDX-MS позволяет сопоставить возмущения с ферментной конформациальной динамикой на локальном пространственном масштабе пептидов, что позволяет исследователю оценить, как возмущение изменяет динамику в различных областях фермента, представляющих интерес.

Преимущества подхода HDX-MS для выяснения структурной динамики белка многочисленны. Во-первых, метод может быть выполнен с небольшим количеством родного белка или на белковых комплексах в системах с четвертичных структур10. Это даже не обязательно для фермента препарат, используемый ванализе, чтобы быть высоко очищены 11,12, до тех пор, как снизу вверх HDX-MS рабочий процесс обеспечивает достаточное количество уверенно определены пептиды, которые охватывают белковую последовательность интереса. Кроме того, HDX-MS может предоставить информацию о конформации динамики в почти родных условиях без необходимости для сайта конкретных белковой маркировки, как будет использоваться в одной молекулыфлуоресценции исследований 13, и нет предела размера белка или белковогокомплекса,которые могут быть исследованы (что делает подходы, такие как ядерный магнитный резонанс "NMR" спектроскопиисложной) 7,14. Наконец, время решены HDX-MS методы могут быть использованы для изучения внутренне неупорядоченых белков, которые трудно изучить с рентгеновскойкристаллографии 15,16,17,18. Основным ограничением HDX-MS является то, что данные имеют низкое структурное разрешение. Данные HDX-MS полезны для указания на то, где меняется конформациальная динамика, и для выявления связанных конформных изменений, но они не часто дают большое представление о точном молекулярном механизме, обуговающем наблюдаемое изменение. Недавние достижения в сочетании методов диссоциации захвата электронов с данными белка HDX-MS показали обещание для картирования сайтов обмена на одиночныеаминокислотные остатки 19,но последующие биохимические и структурные исследования все еще часто необходимы, чтобы обеспечить ясность структурных моделей, переадресуемых данными HDX-MS.

Ниже представлен подробный протокол для разработки анализа HDX-MS20. Протоколы подготовки образца, представленные ниже, должны быть в целом применимы к любому белку, который демонстрирует хорошую жалкость в aqueous буферах. Более специализированные методы подготовки образца и HDX-MS рабочие процессы доступны длябелков,чем нужно провести анализ в присутствии моющего средства илифосфолипидов 21,22,23,24. Инструментальные настройки для сбора данных HDX-MS описаны для четырехугольного масс-спектрометра высокого разрешения в сочетании с жидкой хроматографической системой. Данные аналогичной сложности и разрешения могут быть собраны на любой из ряда коммерчески доступных жидкой хроматографии-масс-спектрометрии (LC-MS) систем. Предоставляются также ключевые аспекты обработки данных с использованием коммерчески доступного пакета программного обеспечения. Мы также представляем руководящие принципы для сбора и анализа данных, которые соответствуют рекомендациям, сделанным более широким сообществом HDX-MS12. Описанный протокол используется для изучения динамических структурных свойств HalM2, лантипептид синтетазы, которая катализа multistep созревания антимикробного пептида натуральныйпродукт 20. Мы иллюстрировать, как HDX-MS может быть использован для выявление сайтов связывания субстрата и алостерических свойств, которые ускользали от предыдущей характеристики. Несколько других протоколов по белку HDX-MS были опубликованы в последниегоды 25,26. Вместе с настоящей работой, эти более предыдущие вклады должны обеспечить читателю некоторую гибкость в экспериментальном конструкции.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка дейтетерированных реагентов и растворов ферментного запаса

  1. Подготовка реагентов, необходимых для реакции HDX (включая любые буферы, соли, субстраты, лиганды и т.д.), как 100–200x концентрированные фондовые растворы в D2O (99,9% атомовая фракция D). Подготовь не менее 50 мл решения буферного запаса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для характеристики HalM2 были подготовлены следующие решения: 500 мМ MgCl2, 100 мМ трис (2-карбоксетил)фосфин (TCEP), 750 мМ АТФ (в буфере HEPES), 800 мМ HEPES pD 7.1, 500 МКМ Хала2 и 500 мМНП.
  2. Заморозить и лиофилизировать фондовые растворы до сухости.
  3. Повторное растворение в D2O, и повторить цикл лиофилизации по крайней мере еще одно время, чтобы заменить как многие из сменных протонов с дейтеронами, как это возможно.
  4. Отрегулируйте pD дейтетерированного буферного запаса HEPES до желаемого значения с концентрированным NaOD/DCl, имея в виду следующие отношения27:
    Equation 1
    ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость ХДХ сильно зависит от pL раствора (pL и pH или pD)5. Различные пакеты решений буферного запаса должны быть подготовлены, сохранены и использованы идентичным образом, чтобы избежать небольшого дрейфа pL между экспериментами.
  5. Рассчитайте количество каждого реагента, необходимого для анализа 300 МКЛ HDX, и храните в качестве одноразовых алицитов при -80 градусов по Цельсию.
  6. Подготовь концентрированный раствор ферментного запаса (100–200 мкм) в буфере хранения ферментов с помощью центробежного фильтра(Таблица материалов)или эквивалентного устройства.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Точный буфер и центробежный фильтр молекулярного веса отсечения будет зависеть от белка / фермента интереса. HalM2 хранится в 50 мМ HEPES, рН 7,5, 100 мМ ККл и 10% глицерол. Для приготовления концентрированного фермента использовались 10 фильтров kDa.
  7. Aliquot фермента в одноразовые порции использования и хранить при -80 градусов по Цельсию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это может быть остановкой. Все фондовые решения, описанные в разделе 1, могут быть подготовлены до реакции HDX. При хране при -80 градусов по Цельсию, большинство ферментов / дейтетерированных фондовых растворов будет стабильным в течение многих месяцев.

2. Калибровка объема утоления HDX

  1. Подготовь реакцию 300 МКЛ HDX в D2O с использованием дейтетерированных реагентов и концентрированных запасов ферментов, подготовленных в разделе 1.
    1. Используйте окончательную концентрацию фермента в 1–5 МКМ.
    2. Используйте окончательную дейтетерированную буферную концентрацию HEPES не менее 50–100 мМ.
    3. Убедитесь, что концентрации других компонентов достаточны для поддержания желаемой активности/функции ферментов.
  2. Приготовьте 1 л раствора для затухления HDX (100 мМ фосфат, 0,8 м гуанидина-HCl, рН 1,9). Заморозить и хранить как в 50 мл порций (для долгосрочного запаса) и 1 мл порций (для одноразовых aliquots).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Точный состав буфера утоления будет зависеть от фермента, который используется в этапе протеолиза рабочего процесса HDX-MS снизу вверх (шаг 3.3.3). Утоляемый буфер, данный здесь, совместим с пепсином, наиболее часто используемым протеазой для HDX-MS. Если используется другая протеаза, обратитесь к поставщику protease, чтобы обеспечить совместимость буфера.
  3. Калибруйте объем буфера утоления, необходимый для регулировки конечного pL закалынной реакционной смеси HDX до значения показания счетчика pH 2.3.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Растворитель H / D обменный курс пептида amide N-H облигаций рН-зависимый процесс, который подлежит как кислоты и базы катализа. Минимальный обменный курс происходит при значении рН 2,5 (показания рН-метра No 2,3 за смесь 50:50 H2O:D2O). Таким образом, окончательное значение pL около 2.5 сведет к минимуму обмен водородом назад, который происходит во время анализа снизу вверх LC-MS, тем самым сохраняя ярлык дейтерия в пептидах.
    1. Смешайте 50 МКЛ реакционной смеси HDX из шага 2.1 с 50 МКЛ буфера утоления и измерьте ЛП затухленной смеси с помощью микротипа электрода.
    2. Увеличьте объем раствора для утоления по мере необходимости для корректировки конечного показания счетчика рН до значения 2,3.
    3. После того, как будет определен соответствующий объем утоления, повторите процесс затухления несколько раз, используя свежие 50 алицитов из реакции HDX (шаг 2.1), чтобы гарантировать, что последовательный окончательный pL достигается при добавлении фиксированного количества буфера утоления.

3. Подготовка эталонных образцов и оптимизация рабочего процесса LC-MS снизу вверх

  1. Подготовка неопределёненных эталонных образцов для белка, представляющих интерес для трипликата в трубках 0,5 мл. Убедитесь, что условия окончательной смеси реакции идентичны условиям, используемым в подлинных реакциях HDX (шаг 2.1), за исключением того, что реакции готовятся в H2O с использованием реагентов, также подготовленных в H2O.
  2. Утолить образцы, как в шаге 2.3, добавив соответствующий объем буфера утоления для корректировки окончательного рН до 2,5. Вспышка заморозить образцы в жидком азоте и хранить при -80 градусов по Цельсию до готовности к анализу.
  3. Проанализируйте протеченные образцы ферментов с помощью рабочего процесса LC-MS снизу вверх.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед выполнением этих шагов система LC-MS, используемая для сбора данных, должна быть должным образом откалиброванной и готовой к использованию. Сроки и температура всех этапов рабочего процесса LC-MS снизу вверх должны строго контролироваться, чтобы свести к минимуму различия в обратном обмене между образцами. С MS приборов, используемых в этом протоколе (Таблица материалов и Вспомогательная информация), большинство шагов можно контролировать с помощью программного обеспечения инструмента. Для обеспечения сбора точных репликаций рекомендуется автоматизировать как можно больше этапов в рабочем процессе.
    1. Удалите индивидуальный эталонный образец фермента (подготовленный в шаге 3.2) из морозильной камеры и оттаивать при 37 градусов по Цельсию в течение 1 мин в водяной бане.
    2. Ровно через 2 минуты после удаления образца из морозильной камеры и оттаивания в колонку ультравысокой жидкой хроматографии (UPLC) (2,1 х 30 мм, 300, 5 МКМ), содержащую стационарную фазу, функционирующую с пепсином (кислотно-стабильная протеаза).
    3. Усваиваете образец со скоростью потока 100 мкл/мин в течение 3 мин при 15 градусов по Цельсию, используя 0,1% мякоть кислоты в H2O (рН 2,5) в качестве растворителя.
    4. Соберите пептические пептиды, как они elute от пепсиновой колонки на C18 ловушки колонке, состоявшейся на 0,4 градусов по Цельсию, чтобы свести к минимуму обратного обмена.
    5. Перейдите десальтированные пептитические пептиды из столбца ловушки в аналитическую колонку C18 (1 мм х 100 мм, 1,7 МКМ, 130 з) при 0,4 градуса цельсия для разделения септических пептидов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 3.3.3'3.3.5 могут быть автоматизированы определенными системами LC-MS, используемыми для получения данных HDX-MS. Кроме того, эти шаги могут быть выполнены независимо, имея в виду, что сроки и температура каждого шага должны быть тщательно проверены для достижения последовательно низкой обратной обмена.
    6. Elute колонка C18 с ацетонитрилом/водой/0,1% системы растворителя миновой кислоты. Оптимизация градиента LC для белка, представляющих интерес для того, чтобы максимизировать разделение и сохранить этикетку дейтерия в пептидах peptic.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Градиент elution подробности представлены в вспомогательной информации.
    7. Подвергаю пептическое пищеварение электроспрей-ионизации (ESI) масс-спектрометрии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Исходные условия, предусмотренные в вспомогательной информации, обеспечат достаточную ионизацию для большинства пептитических пептидов.
      1. После ионизации в инструменте MS, выполнить ионные разделения подвижности газовой фазы с использованием азота в качестве буферного газа для повышения пиковой мощности метода.
      2. После разделения ионные мобильности подвергните ионы прекурсора пептического пептида рабочему процессу MSE, включающему чередующиеся циклы низкой энергии столкновения (4 V) и высокую энергию столкновения (21–40 V).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Чередующиеся режимы низкого и высокого столкновения позволяют сбор данных MS (низкая энергия столкновения) одновременно с данными MSMS (высокая энергия столкновения). Это, в свою очередь, позволяет со временем соединять ионы-прекурсоры с их соответствующими ионами фрагментов. Эта корреляция необходима для уверенной идентификации пептида, описанной в разделе 4.
      3. Обнаружить пептидный прекурсор и фрагмент ионы с помощью масс-анализатора с разрешая силой не менее 20000.
      4. Одновременно с сбором данных приобретайте данные MS для внешнего стандарта «Glu-1»-fibrinopeptide B (GluFib).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочий процесс MS, описанный в шаге 3.3.7, называется протоколом MSE. Полные инструментальные настройки протокола MSE, который подходит для снизу вверх HDX-MS, представлены в вспомогательной информации.
    8. Оцените качество данных LC-MS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используя описанный выше протокол и инструментальные настройки, представленные в Вспомогательной информации,эталонные образцы должны производить полную ионную хроматограмму с максимальной интенсивностью сигнала приблизительно 1 x 108. Там должно быть много peptic пептидов eluting между 3'9 мин (Рисунок 3A q C).
    9. Ввимить 40 МКЛ пустых образцов (0,1% мимической кислоты в воде) для очистки пепсинов и аналитических столбцов С18.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В целом, 2'3 пробелов должно быть достаточно.
    10. Повторите шаги 3.3.1'3.3.9 для каждого из тройного эталонного образца белка.

4. Обработка справочных данных и определение пептидного списка

  1. Проанализируйтенеобработанные данные MS E (шаг 3.3.7) с помощью программного обеспечения протеомика(Таблица материалов). Используя программное обеспечение протеомика, перейдите в библиотеки | Белковая последовательность Databanks для определения базы данных белка путем импорта аминокислотной последовательности белка интереса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Цель этого шага заключается в поиске справочных данных MS для peptic пептидов, полученных из белка интереса, и использовать данные MSMS (приобретенные одновременно с данными MS) для проверки любых мнимых пептидных идентификаций.
  2. Назовите белковую последовательность интереса. Импорт белковой последовательности (в формате FASTA). Программное обеспечение будет выполнять в силико переваривания белка базы данных для создания списка пептидов, которые будут использоваться для поиска данных LC-MS.
  3. Определите параметры обработки (расположенные под меню Библиотеки). Выберите Electrospray MSE в качестве типа получения данных. В поле Lock Mass for Charge 2 введите 785.8426 для m/z для2 иона «Glu-1»-fibrinopeptide B (GluFib) и нажмите на финиш.
  4. Определите параметры рабочего процесса (расположенные под меню Библиотеки).
    1. Выберите Electrospray MSE для типа поиска. В соответствии с рабочим | Заголовок запроса поиска базы данных, выберите белок базы данных, созданный в шаге 4.2 в поле Databank.
    2. Измените реагент первичного дайджеста на неспецифический и очистите поле реагентов фиксированного модификатора, удерживая кнопку Ctrl при нажатии на карбамидометил C.
  5. Укажите каталог выходных данных, переориентаясь на | автоматизация настройки | Идентичность E. Проверьте коробки для Apex 3D и пептид 3D выход и ионный учет выход и указать желаемый каталог.
  6. Обработать данные эталонной выборки.
    1. На левой бар инструмент протеомической платформы рабочего пространства, создать новую пластину, право нажав на Microtiter плиты. Выделите три скважины в пластине микротитр (по одной для каждого эталонного образца, собранного в разделе 3). Левый нажмите в один колодец, удерживайте и перетащите на три колодца.
    2. Нажмите правой кнопкой мыши и выберите добавить необработанные данные. В окне, которое появляется, перейдите к каталогу, содержащем три справочных файла из раздела 3, и выберите их одновременно.
    3. Нажмите дальше и выберите параметры обработки, определенные в шаге 4.3. Нажмите на следующий и выберите параметры рабочего процесса, определенные в шаге 4.4. Затем нажмите на финиш.
  7. После того, как необработанные данные, параметры обработки и параметры рабочего процесса будут назначены каждой скважине на пластине, скважины будут казаться синими. Выберите скважины, нажмите правой кнопкой мыши и выберите процесс последних необработанных данных. Нажмите на правый нижний угол окна, чтобы отслеживать обработку данных. Как только сообщение Не отображается задание для запуска, обработка полностью завершена.
  8. После завершения обработки данных скважины в плите позеленеет. Нажмите правой кнопкой мыши на скважины и выберите результаты рабочего процесса представления. Для каждого файла справочных данных откроется отдельное окно.
  9. Осмотрите данные, чтобы убедиться, что большинство сигналов MS в данных эталонной выборки были успешно отображены на пептиды, предсказанные от пищеварения белка интереса. Соотвеные пептиды будут окрашены в синий цвет в спектре выходных данных(рисунок 4). Дважды нажмите на фильтр OK и убедитесь, что процентный охват превышает 99%.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При обработке выход данных будет автоматически сохранен с расширениемфайла (raw_data_file_name_IA_final_peptide) в каталоге, указанном в шаге 4.5.
  10. Импорт протеомического программного обеспечения в HDX-обработка программного обеспечения(Таблица материалов)для дополнительного порогового значения.
    1. Нажмите на данные в левом углу окна программного обеспечения для обработки HDX. Нажмите на результаты импорта PLGS и нажмите на значок добавления. Выберите обработанные файлы данных из шага 4.9, переместив их в соответствующий каталог.
    2. Нажмите на Далее и укажите следующие параметры: минимальные последовательные ионы ≥ 2, массовая ошибка - 5 промилле, и порог файла - 3. Нажмите на финише.
  11. Удовлетворив пороговые параметры, сохраните проект HDX. Все данные HDX будут импортированы в этот проект для анализа и отображения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обмен образцами дейтерия, описанными в следующем разделе, должен быть обработан идентичным рабочим процессом LC-MS. Поэтому, прежде чем приступить к анализу HDX (раздел 5), убедитесь, что подготовка образца (раздел 2), рабочий процесс снизу вверх LC-MS (раздел 3) и рабочие процессы обработки данных (раздел 4) обеспечивают желаемую воспроизводимость и последовательность охвата целевого белка. Если какой-либо из этих процессов необходимо изменить для улучшения охвата, рекомендуется вернуться к шагу 2.1, подготовить свежие справочные образцы в трипликате, а также повторить разделы 2'4 (при внесении необходимых корректировок в протокол), чтобы гарантировать, что каждый пептид может быть воспроизведен и обнаружен.

5. Проведение реакций HDX

  1. Подготовь рабочее пространство для реакций HDX.
    1. Предварительно алицит утолить буфер в правильно помечены 0,5 мл труб. Подготовьте различные трубки для каждой точки времени, каждой репликации, и каждое биохимическое состояние, которые будут проанализированы. Используйте соответствующий объем буфера утоления от шага 2.2, необходимого для корректировки окончательного показания счетчика рН 50 МКЛ части реакции HDX на значение 2,3.
    2. Кратко центрифуга 0,5 мл ванны для передачи всех утолить буфера на дно трубки. Поместите трубки на лед.
    3. Заполните небольшой Dewar с жидким азотом и держать рядом с рабочей области.
  2. Подготовь реакции HDX. Убедитесь, что имеется достаточный объем реакции для сбора нужного количества точек обменного времени (одна алицита 50 КЛ для каждой желаемой точки времени). Соберите по крайней мере 4–5 точек времени в масштабе времени от 3 до 4 порядков (например, время утоления 15 с, 60 с, 300 с (5 мин), 1800 с (30 мин) и 14 400 с (4 ч) обеспечивают адекватное покрытие динамики обмена для большинства ферментов).
    1. Предварительно смешайте все дейтетерированные компоненты (минус фермент) из шага 1.1 в D2O.
    2. Для каждого биохимического состояния, которые должны быть изучены (свободный фермент, фермент и лиганд, фермент и ингибитор и т.д.), подготовить HDX реакции, по крайней мере в три раза.
    3. Инкубировать реакционной смеси в контролируемой температурой водяной бане при температуре 25 градусов по Цельсию в течение 10 минут до добавления фермента.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фермент должен быть подготовлен в качестве концентрированного фондового раствора (100–200 МКМ, шаг 1,6), с тем чтобы свести к минимуму добавление протия в анализ HDX.
    4. После добавления фермента в окончательную концентрацию 1'5 МКМ, запустите таймер. Тщательно и быстро смешайте раствор с помощью пипетки из 200 мл, чтобы гарантировать равномерное равномерное равномерное распределение фермента в образце.
    5. При желаемом обмене времени точек, удалить 50 йл aliquots от реакции HDX и смешивать быстро и равномерно с предварительной aliquoted, ледяной утоления буфера в 0,5 мл трубки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объемы смешивания и смешивания должны быть как можно более точными и воспроизводимыми для обеспечения быстрого достижения желаемого окончательного утоления PL 2.3 во всех образцах. Сохранение затухания буферного льда холодной поможет свести к минимуму обратно обмен на денатурации фермента.
    6. Сразу же после закалки образца HDX, крышка трубки и вспышки заморозить в жидком азоте.
    7. Продолжайте собирать точки времени до тех пор, пока все анализы не будут завершены, а затем перенесите образцы в морозильную камеру -80 градусов по Цельсию для хранения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это может быть остановкой. После сбора всех точек времени HDX, образцы могут храниться при -80 градусов по Цельсию до готовности к анализу LC-MS. В идеале, тройной HDX реакции должны быть выполнены для всех биохимических состояний, представляющих интерес в тот же день. Как минимум, все репликации HDX реакций для данного биохимического состояния должны быть запущены параллельно в тот же день.
  3. После сбора всех утоленых точек времени HDX, подвергте образцы оптимизированному рабочему процессу LC-MS снизу вверх, разработанному, как описано в шаге 3.3. Ввисьт образцы HDX в рандомизированном порядке с соответствующим количеством пробелов между образцами, чтобы гарантировать, что любой пептид переноситься является минимальным.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Данные HDX не должны собираться в режиме MSE. Таким образом, сегмент энергии высокого столкновения (шаг 3.3.7.2) должен быть удален из цикла пошлины MS. Это должно быть единственное изменение, внесенное в рабочий процесс, описанный в шаге 3.3.
  4. Оцените качество собираемых данных HDX.
    1. Убедитесь, что хроматографические пики, присутствующие в общей иононограмме неутерированных эталонных образцов, появляются в то же время удержания в дейтетерированных образцах (как на рисунке 3Д'Ф).
    2. Убедитесь, что масс-спектры, суммированные в течение определенных промежутков времени из эталонных и дейтетерированных образцов, свидетельствуют о дейтетерации (т.е. сдвиг изотопной оболочки отдельных пептидов к более высоким значениям м/з в дейтетерированных образцах -рисунок 6).

6. Обработка данных HDX

  1. Импорт данных HDX в проект HDX, созданный в шаге 4.11, нажав на Data | MS Файлы в верхней бар инструментов.
    1. Нажмите на New State и New Exposure по мере необходимости для определения биохимических состояний (например, свободного фермента, фермента и лиганда и т.д.) и времени воздействия дейтерия, соответственно, которые имеют отношение к анализу.
    2. Нажмите на New Raw, чтобы выбрать файлы данных HDX для анализа. Назначьте соответствующее время обмена и биохимическое состояние каждому импортируемому файлу необработанных данных.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Данные могут быть импортированы и обработаны партиями, или все сразу. Добавление данных в проект не отменяет анализ, который ранее проводился в рамках этого проекта.
  2. Как только файлы данных были добавлены, нажмите закончить, чтобы начать обработку данных. После короткой задержки программное обеспечение спросит, хочет ли пользователь сохранить данные, прежде чем продолжить работу. Нажмите да.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Первоначальная обработка может занять до нескольких часов в зависимости от того, сколько образцов анализируется, сколько пептидов находится в окончательном пептидном списке (шаг 4.10), размер хроматографического окна, и частота спектрального приобретения.
  3. При желании измените параметры обработки в меню Configuration, чтобы изменить параметры поиска ионов. Убедитесь в том, чтобы использовать те же параметры поиска ионов для всех данных в данном проекте.

7. Анализ и визуализация данных HDX

ПРИМЕЧАНИЕ: После завершения первоначальной обработки необработанных данных (шаг 6.2) программное обеспечение для обработки HDX будет иметь обнаруженные пептиды из пептидного списка (сгенерированные в шаге 4.10) в каждом из исходных файлов данных, которые были проанализированы. После того, как распределение изотопов для пептида в списке находится в сыром файле данных, программное обеспечение для обработки HDX представляет каждый изотоп с «палкой» (как на рисунке 6C'E). Относительная итензия палочек для данного пептида затем используются для расчета поглощения дейтерия по отношению к эталонным спектрам. В то время как программное обеспечение для обработки HDX делает замечательную работу по правильному назначению "палочек" большинству пептидов, по-прежнему потребуется значительное ручное кураторирование значений поглощения дейтерия.

  1. Анализ значений поглощения пептидного дейтерия
    1. Выберите первый пептид в пептидном списке и откройте сложенный спектральный участок из меню Views. Прокрутите вверх и вниз в сложенном окне участка спектра, чтобы увидеть спектры массы выбранного пептида в качестве функции времени обмена дейтерия(рисунок 7D,E).
    2. Назначайте палочки и неприсоздайте палочки по мере необходимости с помощью щелчков мыши, чтобы убедиться, что правильное распределение изотопов было расположено в данных и что каждый пик изотопа был назначен (назначенные палочки будут отображаться синим цветом). Нажатие на любой из спектров в сложенном спектральном участке(рисунок 7D,E) позволит пользователю назначить / неподзначить палочки в окне активного просмотраданных (рисунок 7C).
    3. Проверьте назначения палки для каждого состояния заряда, свергая состояние заряда в верхней части сложенного спектрального окна участка.
    4. Повторите шаги 7.1.1-7.1.3 для каждого биохимического состояния интереса. Биохимическое состояние также можно переключать в верхней части сложенного спектрального окна участка. Для наиболее точных измерений разницы поглощения дейтерия убедитесь, что палочки назначаются для одного и того же набора состояний заряда для каждого биохимического состояния.
    5. Повторите шаги 7.1.1-7.1.4 для каждого пептида в пептидном списке.
    6. Проверьте стандартное отклонение значений поглощения пептидного дейтерия с помощью карты покрытия.
      1. Доступ к карте покрытия из меню Views, которое отображает каждый пептид в пептидном списке, отображенном вдоль аминокислотной последовательности белка интереса(рисунок 8C). Цвет пептидов в соответствии с относительным стандартным отклонением (единицы Da).
      2. Визуально ищите карту для выброса пептидов с высоким относительным стандартным отклонением. Нажмите на выброс пептидов на карте покрытия, чтобы заполнить сложенные спектральные участки(рисунок 8B) и окно просмотра данных(рисунок 8A) с целевым пептидом.
      3. Используя сложенный спектральный участок, тщательно проверяйте, что все состояния заряда и все время точки выброса пептида имеют надлежащим образом назначенные палочки.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Чаще всего пептиды с большими стандартными отклонениями (Nogt;0.3 Da) имеют изотопные пики, которые не были надлежащим образом назначены палочки программного обеспечения (как указано на рисунке 8B). Назначение любых недостающих палочек, как правило, позволяет относительно стандартное отклонение пептида быть сокращены до lt;0.3 Da.
      4. Скрыть пептид из списка, если относительно стандартное отклонение не может быть уменьшено до менее чем 0,3 Да.
  2. Данные о разнице экспорта HDX между двумя биохимическими состояниями для отображения на структурную модель белка интереса.
    1. Отображение разницы интересов на карте покрытия. Нажмите правой кнопкой мыши на карте покрытия, чтобы экспортировать данные о разнице в .csv файл. Экспорт государственных данных (в .csv формате) путем навигации по данным | Данные об экспортном состоянии в основной инструментарии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Соответствующее форматирование данных о разнице и файлов государственных данных предоставляется в вспомогательной информации.
    2. Импорт данных разницы, данные положения, и архив pdb протеина интереса в Deuteros28. Выберите 99% интервал доверия, выберите сумму включенияи обработать данные.
      ПРИМЕЧАНИЕ: MATLAB должны быть установлены на ПК для того, чтобы запустить Deuteros. Deuteros будет использовать измерения репликации в наборе данных для расчета стандартного отклонения данных поглощения для каждого пептида. Это стандартное отклонение будет использоваться для определения интервала доверия для значительного обмена, который будет отображаться на участках.
    3. В соответствии с PyMOL Options, выберите экспортное поглощение | экспорт для создания скрипта Pymol для карты регионов значительной курсовой разницы на структуру pdb белка интереса с помощью программного обеспечения PyMOL.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используя рабочий процесс, описанный в этом протоколе, 99% интервал доверия для значительной разницы поглощения дейтерия для данного пептида в одной точке времени, как правило, 0,3-0,5 Да. 99% интервал доверия к разнице, суммируются по всем пунктам обменного времени, как правило, 0,7-1,0 Da.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Необходимо оценить качество протеолитического пищеварения и воспроизводимость рабочего процесса для каждого набора выборочных инъекций. Таким образом, перед выполнением анализов HDX-MS необходимо создать эффективные условия для протеолиза белка интереса, для разделения пептидов с использованием обратной фазовой жидкой хроматографии и ионные подвижности газовой фазы, а также для обнаружения пептидов с использованием MS. Для этого следует сначала изукомить эталонные образцы белка интереса (собранные при отсутствии дейтерия) (раздел 3). Хроматографические данные на рисунке 3АКК показывают общую ионно-хроматограмму (ТИК) для трех эталонных образцов лантипептидной синтезазы HalM2. ТИК – это зависит от времени изменение суммы всех значений ионов на всех значениях м/з, включенных в масс-спектральное сканирование. Более близкие виды TICs между 3 и 8 мин показаны на рисунке 3Д'Ф. Спектры массы, показанные на рисунке 3ГЗА, представляют собой суммирование всех спектров массы в течение небольшого промежутка времени (от 5,0 до 5,1 мин) каждого ТИК. Особое внимание следует уделить следующим особенностям на рисунке 3.

Во-первых, большой пик около 9,3 мин в конце градиента представляет собой неполно переваренные (и, следовательно, большие и более гидрофобные) фрагменты HalM2(рисунок 3АКС). Пищеварение может быть более эффективным за счет снижения концентрации HalM2, но это позволит снизить интенсивность пептидного сигнала и коэффициент сигнала:шум. Пищеварение также может быть сделано более эффективным за счет увеличения времени контакта (с 3 мин, протокол шаг 3.3.3) с пепсином колонки. Тем не менее, увеличение времени контакта приведет к более обратно обмена. В конечном счете, эти параметры должны быть сбалансированы для белка интереса для того, чтобы обеспечить желаемый охват последовательности, интенсивность сигнала, и удержание дейтерия. Во-вторых, форма и интенсивность профилей ТИК должны быть аналогичными (как на рисунке 3Д'Ф). Это говорит о том, что протеолитическое пищеварение HalM2 воспроизводится и имеет аналогичную эффективность во всех трех эталонных образцах. Ожидается, что аналогичное переваривание образца, обмениваемого дейтериями, будет производить тот же набор пептидов с аналогичным временем удержания. В-третьих, спектры массы в течение данного промежутка времени также должны бытьаналогичными (рисунок 3Г.И.). Быстрое визуальное сравнение суммарных спектров массы в течение интервала времени 5,0-5,1 мин хроматографического разделения показывает, что массы спектральных сигналов в каждом образце действительно очень похожи, обеспечивая уверенность в том, что подобные пептиды присутствуют в каждом образце и eluting в то же время из колонки C18. Аналогичный быстрый визуальный осмотр должен быть выполнен в течение других промежутков времени через хроматограмму.

После визуальной проверки сходства в данных LC-MS эталонных образцов, протеомическое программное обеспечение используется для поиска данных MS для пептидов, полученных из аминокислотной последовательности белка интереса. После определения банка данных последовательности белка (аминокислотная последовательность белка интереса), обработки и параметров рабочего процесса, описанных в протокольных шагах 4.2'4.4, каждый отдельный эталонный образец обрабатывается для обнаружения петических пептидов, которые соответствуют прогнозируемым пептидам, полученным из белка интереса. На рисунке 4 показан пример вывода программного обеспечения протеомика для неутетерированного эталонного образца HalM2. Особое внимание следует уделить следующим особенностям. Во-первых, любой сигнал MS, который соответствует определенному пептиду в пределах белка интереса в соответствии с значениями, определенными в параметрах обработки и рабочего процесса, будет окрашен синим цветом в нижнем спектре. Если эталонный образец "успешно" обрабатывается, большинство сигналов будет выглядеть синим цветом (как и в случае данных на рисунке 4). Кроме того, в верхней левой панели убедитесь, что "OK Фильтр" переключается на зеленый штемпель. Когда это будет сделано, статистика в верхней панели верхней правой панели (выделены синим цветом на рисунке 4) будет отражать только те пептиды, которые дают высокие оценки доверия. Эти пептиды обладают низкой точностью массы ppm, несколькими ионами фрагментов и хорошей корреляцией между временем удержания фрагмента и родительского иона, и считаются уверенными идентификациями. Для показанного эталонного образца HalM2 было обнаружено 1421 пептид с высокими баллами, покрывающими 99,6% последовательности HalM2. Почти 100% охват последовательности должен быть достижим для большинства белков, использующих рабочий процесс снизу вверх LC-MS, описанный в разделе протокола 3. Кроме того, дополнительные полезные статистические данные для каждого пептида табулируются в верхней правой панели, включая массовую ошибку, время удержания прекурсоров, количество фрагментов (ионов продукта), полный список ионов фрагментов по имени и время дрейфа ионов подвижности. Эта информация полезна для интерпретации результатов, которые всегда должны быть ориентированы на наиболее уверенно идентифицированные пептиды.

Окончательный пептидный список должен определяться дополнительным пороговым значением в программном обеспечении для обработки HDX. После анализа справочных данных для создания пептидного списка (протокольный раздел 4) выход должен быть импортирован в программное обеспечение для обработки HDX для дополнительного порогового значения. Выходные файлы будут храниться в каталоге, как это определено в протоколе шаг 4.5 с расширением файла "..._IA_final_peptide.csv". После загрузки вывода в HDX-обработка программного обеспечения, полный список пептидов будет показан в "пептид предварительного просмотра" панели(рисунок 5), и количество пептидов, последовательность покрытия, и избыточность будет отображаться в правом нижнем углу окна. Эти значения будут меняться в режиме реального времени по мере применения дополнительных пороговых значений. После нажатия далее пороговыезначения могут быть установлены в указанных полях. Наиболее важными фильтрами являются «порог файлов», который требует, чтобы все пептиды были расположены в каждом из трех эталонных образцов, "максимальная ошибка MH (ppm)", которая должна быть установлена на значение lt;10 ppm, и "минимальные последовательные продукты", которая требует пептида для генерации по крайней мере двух последовательных ионов фрагментов во время MSMS (т.е. высокой энергии столкновения) фазы рабочего процесса MSE (протокол шаг 3.3.7.2).

Наиболее значительным техническим ограничением анализа HDX-MS является задний обмен дейтерия на протий, который возникает, как только образцы, обмениваемые дейтериями, затухаются (с засвоенным буфером). Обмен назад продолжается во время пищеварения протеазы и LC-MS части рабочего процесса. Обмен спиной неизбежен, но если рН, температура и сроки всех шагов после затухления тщательно контролируются, как описано в протоколе, 60%-70% дейтерия этикетки могут быть сохранены. По этой причине, важно, чтобы проверить на ранних стадиях развития анализа, что большинство пептидов сохраняют дейтерия. Этого можно быстро достичь, сравнив необработанные данные дейтетерированной выборки с данными эталонной выборки. Как это было сделано для обеспечения воспроизводимостиэталонных образцов (рисунок 3), сравните TICs дейтерия-обмененных и неутерированных эталонных образцов, гарантируя, что формы профилей похожи друг на друга. Кроме того, сумма спектров массы в течение одного и того же хроматографического интервала времени в обоих образцах. Большинство пептидов в образце, обмениваемом дейтериями, должны демонстрировали очевидные сдвиги в их изотопных распределениях в сторону более высоких значений м/з (как на рисунке 6). Эти данные свидетельствуют о том, что значительная часть этикетки дейтерия поддерживается на протяжении всего периода утоления кислоты, переваривания пепсинов и сбора данных LC-MS.

После проверки того, что рабочий процесс обеспечивает достаточное удержание дейтерия, поглощение дейтерия должно быть количественно. Таким образом, необработанные данные для образцов, обмениваемых дейтериями, импортируются в программное обеспечение для обработки HDX. Используя эталонные образцы и окончательный список пептидов, программное обеспечение для обработки HDX обнаружит пептиды из пептидного списка в каждом из необработанных файлов данных и назначит «палки» каждому из изотопных пиков. В репрезентативных данных для HalM2, показанных на рисунке 7,успешно назначенные палочки окрашены в синий цвет во всех спектрах. После назначения палочек значение центроида м/з для изотопного распределения будет определяться программным обеспечением и использоваться для расчета поглощения дейтерия по отношению к неутерированной эталонной выборке. Значение обмена дейтерия для каждого пептида должно быть проверено вручную. На рисунке 7,в настоящее время выбранный пептид (HIDKLTVGL, охватывающий остатки HalM2 110-118) показан в левой панели основного просмотра данных(рисунок 7A). Другие панели показывают данные HDX, связанные с этим пептидом. Нажатие на любой пептид в пептидном списке заселит другие панели данными HDX из этого пептида. На рисунке 7B показаны участки поглощения дейтерия для пептида 110–118. Этот набор данных содержит четыре точки времени обмена: 0,5, 5, 30 и 240 минут (собранные в три раза). Обменными данными были собраны для двух биохимических состояний: свободного фермента HalM2 (красный) и фермента HalM2, сложного для AMPPNP, и его субстратного пептида HalA2 (синий). Обратите внимание на значительную разницу в поглощении дейтерия в пептид 110–118 на протяжении всего периода времени и высокую точность измерений репликации (бары ошибок показаны на рисунке 7B). В целом аналогичная точность в измерении поглощения будет получена для большинства пептидов, что подчеркивает воспроизводимость рабочего процесса, представленного в этом протоколе. При связывании лиганда (голубая кривая на рисунке 7B),пептидные связи амида в области HalM2 110–118, по-видимому, подвергаются значительной защите от дейтерия, что свидетельствует о том, что аминокислоты в регионе 110–118 становятся все более стабилико структурированными на связывании лиганда. Последующий мутагенез этого региона указал на роль в связывании пептида-предшественника, HalA220. На рисунке 7 показаны сложенные спектральные участки для состояния HalM2(рисунок 7D)и состояние HalM2:AMPPNP:HalA2(рисунок 7E). На этих участках время обмена увеличивается снизу вверх. Увеличение массы пептида 110–118 при обмене дейтерия в более длительных точках времени видно из визуального осмотра. Также очевидно, что пептид 110–118 поглощения больше дейтерия в состоянии HalM2(рисунок 7D), чем в полностью liganded состоянии(рисунок 7E). При необходимости нажатие на любой из подсюжетов на рисунке 7D или рисунке 7Eпозволит пользователю вручную изменять назначение палочек в главном телезрителе данных(рисунок 7C). При назначении палочки/неприсогласовании программное обеспечение для обработки HDX будет пересчитывать значения поглощения дейтерия, и все участки будут обновляться в режиме реального времени. Аналогичным образом, нажатие на отдельные точки данных в панели B заселит зрителя данных в панели C для ручного назначения палки.

После того, как палочки были назначены для каждого пептида и точки времени обмена для всех биохимических состояний, стандартное отклонение измеренных значений поглощения должно быть проверено. Это проще всего выполнить с картой покрытия и сложенным спектральным сюжетом(рисунок 8). На карте покрытия(рисунок 8C),выберите состояние и время обмена интерес, а затем выбрать относительное отклонение стандарта поглощения. Пептиды на карте покрытия будут окрашены в соответствии со стандартным отклонением в измеренном значении поглощения дейтерия. Таким образом, это будет очень легко визуально определить пептиды, которые имеют изотоп палку неправильно назначений. Нажатие на пептид выброса (с высоким стандартным отклонением) на карте покрытия заселит основной зритель данных и сложенный спектральный участок данными HDX из пептида выброса. Назначения палки для каждой точки времени и состояния заряда могут быть изменены по мере необходимости для коррекции измеренного значения поглощения. Опять же, программное обеспечение для обработки HDX будет обновлять все дисплеи данных в режиме реального времени по мере изменения назначений палки.

После полного курирования набора данных HDX, значение измерения разницы поглощения дейтерия для каждого пептида должно быть рассмотрено до интерпретации данных. Используя подход, описанный Engen иколлегами 29, мы оценили среднее значение поглощения 0.1 ± 0.1 Da для белка HalM2, используя рабочий процесс, описанный в вышеупомянутомпротоколе 20. Это значение согласуется с ошибками, о которые сообщают другие для аналогичных рабочих процессов снизу вверх, непрерывного обмена HDX29,30. Недавно, Политис и сотрудники разработали Deuteros, полезный инструмент с открытым исходным кодом (реализован в MATLAB) для быстрого определения значительных различий в поглощении в наборах данных HDX28. В вспомогательную информацию включены репрезентативные State_Data_for_Deuteros входные файлы для Deuteros ("Difference_Data_for_Deuteros" и "Difference_Data_for_Deuteros"). При экспорте непосредственно из HDX-обработки программного обеспечения, описанного в этом протоколе(Таблица материалов), разница и файлы государственных данных будет иметь соответствующий формат для чтения файлов Deuteros. Если данные HDX генерируются в другой системе LC-MS, файлы данных, напоминающие те, которые содержатся в вспомогательной информации, должны быть построены вручную.

Рабочее пространство Dueteros отображается на рисунке 9. После того, как данные будут импортированы в Deuteros, пользователь выбирает желаемый предел доверия (рекомендуется 98%) и нажимает Импорт и Рассчитайте. Для сплющенной карты данных выберите покрытие для типа данных и абсолютное для цветовой шкалы. Нажмите участок. Для участков леса выберите бинарный фильтр в качестве типа данных, желаемого фильтра доверия и включите сумму. При нажатии сюжета,Deuteros будет участок всех пептидов в каждой точке времени обмена, как функция их положение в аминокислотной последовательности и их значения поглощения дейтерия. Пептиды, которые демонстрируют значительный обмен будут окрашены в красный или синий цвет, в зависимости от того, пептид занимает более или менее дейтерия, соответственно, в зависимости от разницы рассчитывается. Значение значения, зарегистрированное в каждом участке (от 0,39 до 0,72 Да в данных, на рисунке 9),рассчитывается на основе стандартных отклонений от различий в поглощении, измеренных для каждого пептида, определяемых на основе измерений репликации, присутствующих в наборе данных. Интервалы доверия отображаются как разбитые бары на каждом отдельном участке. Если включено, "Сумма" просто добавляет разницу поглощения измеряется в каждой точке времени для каждого пептида. Наконец, для визуализации данных поглощения трехмерной структуры белка интереса, выберите экспортное поглощение по опционам PyMOL, затем экспорт. Deuteros будет генерировать pyMOL скрипт, который может быть вытащил и упал в рабочее пространство PyMOL, содержащий открытый файл PDB белка интереса.

Рабочий процесс HDX-MS, представленный в этом протоколе, был использован для характеристики биохимических свойств фермента (HalM2), который катализует ряд пост-трансляционных модификаций на генетически закодированный пептид (HalA2)20. На рисунке 10показаны репрезентативные результаты HDX-MS для связывания пептида-предшественника HalA2 с комплексом HalM2:AMP-PNP. Панель А показывает карту покрытия HalM2, где цвет указывает на относительную разницу поглощения между биохимическим состоянием HalM2:AMPPNP и состоянием «HalM2:AMPPNP:HalA2». Deuteros был использован для карты этих различий поглощения на гомологической модели фермента HalM2(рисунок 10B,C). Пептиды, окрашенные в красный цвет, указывают на уменьшение поглощения дейтерия на связывании HalA2, предполагая, что эти области HalM2 могут быть непосредственно вовлечены в связывание пептида-предшественника. Для изучения этой гипотезы были мутированы регионы I-III и исследованы кинетические свойства ферментов варианта. Мутации в регионе I и III привели к значительным возмущениям в пептидной связывающей близости HalA2, предполагая, что эти области HalM2 либо взаимодействуют с пептидным субстратом напрямую, либо необходимы для формирования структур, которые позволяют связыванию HalA2. В отличие от этого, мутация региона II не повлияла на связывающее сродство HalA2, но этот мутант был почти лишен каталитической активности. Одно из объяснений этого вывода заключается в том, что организация региона II, наблюдаемая на связывании HalA2, вызывает конформацию изменения, которое активирует фермент. Следует отметить, что до настоящего исследования не было никакой информации о режиме связывания HalM2-HalA2 или о каталитически значимых конформациальных изменениях в системе, главным образом потому, что большой размер и гибкий характер как HalM2, так и HalA2 исключали структурные исследования. Таким образом, эти репрезентативные данные по синтетазе halM2 lanthipeptide иллюстрируют, как HDX-MS может быть использован для быстрого определения функционально соответствующих областей структурно динамических ферментных систем даже при отсутствии структурных данных высокого разрешения.

Figure 1
Рисунок 1: Непрерывный обмен, рабочий процесс HDX-MS снизу вверх. Для получения подробной информации можно посмотреть текст. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Ставка HDX зависит от конформациальной динамики белка(kopen и k close)и рН-зависимого курса химического обмена облигаций N-H в белковой основе для N-D облигаций (kchem). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Репрезентативные данные LC-MS для тройной выборки HalM2. Номер в правом верхнем углу каждой панели представляет общее количество ионов. В каждой строке показаны данные для другой эталонной выборки. В первойколонке (АКК)показаны общие ионные хроматограммы (ТИК). Большой пик в 9,3 мин представляет собой большие, непереваренные пептиды. Средняя колонка(D'F) показывает более близкий вид на TICs между 3 и 8 мин. Обратите внимание на хорошее согласие форм профилей, что указывает на аналогичную основную смесь пептидных сигналов в каждом эталонном образце по всей хроматограмме. В третьем столбце(G'I)показаны массовые спектры для каждого эталонного образца, генерируемые путем суммирования всех спектров массы, записанных между точкой времени 5,0 и 5,1 мин хроматографического запуска. Визуальный осмотр этих данных показывает, что многие из тех же пептидов обнаруживаются в каждом образце. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Выход программного обеспечения представителя proteomics для эталонного образца HalM2. В верхней левой панели показан полный список полученных из HalM2 пептитических пептидов, обнаруженных в данных MS. Обратите внимание, что "OK Filter" показывает зеленую галочку. Это фильтрует данные в соответствии с оценкой доверия и удаляет пептидные идентификации низкой уверенности. Верхняя панель правой панели (выделенная синим цветом) показывает кумулятивную статистику набора пептидов с высокими баллами. Наиболее важными статистическими данными являются количество обнаруженных пептидов (в данном случае 1421) и последовательность покрытия (в данном случае 99,6%). Дополнительные статистические данные по каждому пептиду также отображаются в правой верхней панели. Каждая колонка в этой таблице данных сортируема. В нижней панели показаны все сигналы MS, которые соответствовали прогнозируемому peptic пептиду HalM2. Обратите внимание, что большинство сигналов MS были назначены и окрашены в синий цвет. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: Дополнительное пороговое значение в программном обеспечении для обработки HDX. Выход протеомического программного обеспечения для каждого из трех эталонных образцов HalM2 импортируется в программное обеспечение для обработки HDX (левая панель). После импорта данных выполняется дополнительное пороговое значение (правая панель). Поле «минимальных последовательных продуктов» относится к ионов фрагментов, порожденных расщеплением смежных пептидных связей в пептиде. Параметр «минимальная ошибка MH» позволяет пользователю определить приемлемую точность массы, а «порог файла» позволяет пользователю ограничивать пептиды только теми пептидами, которые были обнаружены во всех трех справочных файлах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 6
Рисунок 6: Репрезентативные данные для эталонной выборки HalM2 (красный) и образца HalM2, инкубированногов буфереD 2 O в течение 5 минут (зеленый). Оба образца были подвергнуты рабочему процессу «снизу вверх» LC-MS, описанного в разделе 3 протокола. В левой колонке показаны масс-спектры, суммированная над окном времени 6,0-6,1 мин. Три правых столбца показывают более близкие виды одного и того же спектра массы, где переход к более высоким значениям м/з в дейтетерированном образце (зеленый, верхний) очевиден для большинства пептидных сигналов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 7
Рисунок 7: Скриншот рабочего пространства в программном обеспечении для обработки HDX. (A) Список пептидов, полученных из HalM2, полученных в результате анализа эталонных образцов HalM2 с протеомическим программным обеспечением(рисунок 3)и последующего порогового значения в программном обеспечении для обработки HDX(рисунок 4). Выбранный в настоящее время пептид (HIDKLTVGL, охватывающий остатки HalM2 110–118) выделен синим цветом. (B) Кривые поглощения дейтерия (в качестве функции времени обмена) для двух биохимических состояний, представляющих интерес: свободный фермент HalM2 и фермент HalM2, связанный с AMPPNP и предшественником лантипептида, HalA2. (C)Массовый спектр активно отобранной выборки (в данном случае одного из неопределёненных эталонных образцов HalM2). Синие палочки в панели C могут быть назначены вручную/неподписанными по мере необходимости, если они не были должным образом назначены программным обеспечением обработки HDX во время первоначальной обработки данных. (D,E) Сложенные спектральные участки для состояния HalM2(D)и состояния HalM2:AMPPNP:HalA2(E). Зависит от времени увеличение поглощения дейтерия легко видно, как и разница в поглощении между двумя биохимическими состояниями. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 8
Рисунок 8: Минимизация стандартного отклонения в измеренных значениях поглощения. Карта покрытия в программном обеспечении для обработки HDX (панель C) обеспечивает удобное средство для быстрого выявления пептидов с большими стандартными отклонениями в измеренных значениях поглощения дейтерия. В этом гипотетическом случае некоторые изотопные пики (голубые палочки) для полученного пептида HalM2, охватывающего остатки 110–118, не подписаны для точек обмена 5 минут (серые палочки в панели B). Это приводит к большому стандартному отклонению значения поглощения дейтерия, измеренного для точки времени обмена 5 минут. Большое стандартное отклонение легко очевидно из синего цвета пептида 110–118 на карте покрытия (панель C) и рассеяния тока данных и большой панели ошибок на участке поглощения (панель А). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 9
Рисунок 9: Рабочее пространство Deuteros. В этом примере значения разницы поглощения были рассчитаны в программном обеспечении для обработки HDX путем вычитания поглощения дейтерия в состоянии HalM2:AMPPNP:HalA2 из состояния HalM2:AMPPNP. Целью сравнения было визуализировать, как связывание пептида (HalA2) изменило структурную динамику комплекса HalM2:AMPPNP. Набор данных содержал 4 пункта обмена времени (0,5, 5, 30 и 240 мин). Разница в поглощении для каждого пептида в каждой точке времени обмена иллюстрируется на участках Вудса. Цветные пептиды на участках Вудса указывают на пептиды, которые демонстрируют значительную разницу в поглощении, определяемую стандартным отклонением измерений репликации, присутствующих в наборе данных, и определенными пользователем ограничениями доверия, выбранными в Deuteros. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 10
Рисунок 10: данные HDX-MS направляет функциональный анализ пептидной привязки и алостерической активации в лантипептидной синтезазе HalM2. Было исследовано изменение поглощения дейтерия при связывании пептида прекурсора HalA2 с лантипептидной синтезазой HalM2. Разница в поглощении для каждого пептида после 5-минутной реакции обмена построена (A). Этот сюжет был создан в hdX-обработки программного обеспечения. Пептиды красного и синего цвета проходят все меньше и больше поглощения дейтерия, соответственно, в присутствии пептида HalA2. Эти HDX "горячие точки" отображаются на модели гомологии HalM2 (B,C). Идентификация пептидов, претерпевших значительные обменные различия, была определена в Дейтеросе. Скрипт PyMOL, используемый для карты значений разницы на модели гомологии, был создан в Deuteros. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Рабочий процесс HDX-MS, представленный в этом протоколе, обеспечивает удивительно надежную платформу для картирования пространственного распределения структурно динамических элементов в белках и для изучения того, как эти динамики меняются в ответ на возмущение (связывание лиганда, фермент мутагенез и т.д.). HDX-MS имеет ряд явных преимуществ по сравнению с другими структурными подходами биологии, которые обычно используются для исследования конформации динамики. Примечательно, что требуется лишь небольшое количество белка. Используя рабочий процесс, описанный в настоящем, образец 1 мл белка 1 МК обеспечивает достаточно материала для тройной реакции HDX каждый, содержащий 5 точек обмена времени. Кроме того, практически нет ограничения по размеру белка интереса, а белковые комплексы в равной степени податливы подходу HDX-MS. Предельный размер ограничен только тем, в какой степени пептические пептиды могут быть решены хроматографически, а также в измерениях подвижности м/з и иона. Таким образом, для многих белков/белковых комплексов HDX-MS предоставит ценную информацию о интерфейсах взаимодействия белково-белков, лигандовых связывающих участках, конформной динамике и алостерических сетях. Наконец, реакция HDX выполняется в нежных, почти родных условиях без необходимости маркировки/инженерии белка, что должно помочь обеспечить защиту эндогенной активности. Основное ограничение подхода (с точки зрения механистической информации, которую он предоставляет о интересном белке) заключается в том, что данные пептидного уровня HDX по своей сути имеют низкое пространственное разрешение. Таким образом, данных достаточно для вывода о том, что происходит изменение вторичной структуры, но механистическое воздействие структурных возмущений требует более высокого разрешения (например, NMR, криоэм или рентгеновский кристалл) структур, вычислительных исследований и/или биохимических исследований для полной интерпретации.

Для обеспечения воспроизводимости и надежности результатов следует иметь в виду несколько важнейших аспектов протокола. Во-первых, степень дейтерия обмена во время реакции HDX и степень обратного обмена во время работы и анализа сильно зависят от рН, времени и температуры. Таким образом, процедуры подготовки буферов, HDX-реакций и методов LC-MS должны быть как можно более систематическими, чтобы свести к минимуму различия в этих физических параметрах в наборах данных. Всякий раз, когда это возможно, hdX реакции для биохимических состояний, которые будут сравниваться должны быть выполнены тем же исследователем в тот же день, и LC-MS данные для этих образцов должны быть собраны в течение нескольких дней подряд с той же партии растворителя. Со временем эффективность пищеварения пепсинов также будет снижаться, поэтому она оптимальна для образцов, которые будут сравниваться для переваривания и анализа в относительно узком времени, особенно если колонка пепсин используется для переваривания многих других типов образцов. Это хорошая практика, чтобы периодически проверять эффективность пищеварения пепсин колонки с использованием стандартного белка. Для достижения этой цели можно создать специальный проект программного обеспечения для обработки HDX, в рамках которого вновь переваренные образцы можно сравнить со старыми образцами, чтобы гарантировать, что тот же набор целевых пептидов обнаруживается с аналогичной итонией.

Хотя рабочий процесс, представленный в этом протоколе, должен предоставить адекватные данные для многих ферментных/белковых систем, существует несколько потенциальных точек оптимизации. Во-первых, шкала времени реакции HDX может быть изменена, чтобы захватить динамику, которая быстрее / медленнее. В частности, многие ферменты будут содержать высокодинамичные элементы, которые становятся полностью обменялись в течение нескольких секунд. Если эти чрезвычайно динамические элементы представляющи интерес, методы для предварительного стабильного состояния, непрерывного обмена HDX-MS были зарегистрированы в литературе31. Во-вторых, условия метода LC могут быть легко изменены, чтобы изменить эффективность пищеварения (которая в конечном итоге определяет охват последовательности) и удержание дейтерия (который в конечном итоге определяет чувствительность метода). Учитывая продолжительность и температуру пищеварения пепсин, более медленные темпы потока и более высокая температура будет способствовать более тщательному перевариванию белка. Концентрация белка в анализе HDX также может быть увеличена, если интенсивность сигнала слишком низка, или снижается, если пищеварение пепсин слишком неэффективно. Учитывая градиент ацетонитрила, используемый для размевания пептических пептидов на аналитической колонке C18, более быстрый градиент сохранит этикетку дейтерия, но за счет хроматографического разрешения пептических пептидов, присутствующих в переваренной реакционной смеси. Для небольших белков (200 аминокислот), где меньше пептитических пептидов присутствуют в дайджесте, более быстрый градиент LC может быть легче реализовать. Для более крупных белков, таких как HalM2 (1000 аминокислот), требуется более длительный градиент для решения дополнительной спектральной сложности, генерируемой большим количеством пептидов в смеси. В этом последнем сценарии включение разделения подвижности ионов газовой фазы может помочь значительно улучшить пиковую емкость анализа. Включение разделения ионные мобильности происходит за счет слегка сниженного соотношения сигнала к шуму. Наконец, следует отметить, что данные MS для образцов HDX не должны собираться в режиме MSE. Часть MSMS цикла обязанности MSE (т.е. сегмент энергии высокого столкновения, шаг 3.3.7.2) требуется только для эталонных образцов для определения пептидного списка (протокольный раздел 4). Таким образом, образцы HDX должны быть проанализированы только в режиме MS для увеличения соотношения сигнала:шума.

Если рабочий процесс, описанный в этом протоколе, работает должным образом, полностью обмен пептидов должен проявлять относительную стоимость поглощения дейтерия 60%-70%. Если поглощение дейтерия будет установлено, что значительно ниже, чем это (для растворителя подвергаются, незащищенные пептид), наиболее вероятное объяснение заключается в том, что рН образца меняется во время некоторой части workup / анализа. В этом сценарии, микротип электрод должен быть использован для тщательного мониторинга рН анализа HDX и затухать реакции aliquot. Следует также проверить рН растворителей LC-MS. Чтобы свести к минимуму возникновение этой проблемы, настоятельно рекомендуется подготовить и хранить концентрированные фондовые решения всех буферов и реагентов, необходимых для анализа (как указано в разделе протокола 1).

В последние годы HDX-MS стал мощным аналитическим инструментом для исследования структурной динамики белка. Разработка коммерчески доступных систем LC-MS, разработанных и оптимизированных для экспериментов HDX (таких как система, используемая в данном исследовании и указанная в материалах) в сочетании с мощными пакетами программного обеспечения, расширила подход HDX-MS во многие академические и промышленные лаборатории и превратила то, что когда-то было нишевым методом 15 лет назад, в более дружественную к пользователю аналитическую платформу. Несмотря на ограничения в пространственном разрешении, HDX-MS обеспечивает высококоличествие и воспроизводимые измерения движений белка и идеально подходит для изучения конформно динамических ферментов, которые трудно исследовать с другими подходами. Из-за этих характеристик, HDX-MS заполняет существенную нишу в структурной биологии неупорядоченные и динамические системы протеина которые имеют отношение в много основных областей биологии и микстуры. Таким образом, анализ HDX-MS, как ожидается, останется важным инструментом в арсенале структурного биолога в обозримом будущем.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Советом по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады, Фондом природы Квебека и технологией, Канадским фондом инноваций и фондами стартапов Университета Макгилла.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
[glu-1]-fibrinopeptide B (Glu-Fib) BioBasic NA
0.5 mL Amicon Ultracel 10k centrifugal filtration device (Millipore) Milipore Sigma UFC501096
acetonitrile Fisher A955-1
AMP-PNP SIGMA A2647-25MG
ATP SIGMA a2383-5G
D2O ALDRICH 435767-100G
formic acid Thermo Fisher 28905
guanidine-HCl VWR 97063-764
HEPES Fisher BP310-1
Magnesium chloride SiGMA-Aldrich 63068-250G
Potassium chloride BioBasic PB0440
potassium phosphate BioBasic PB0445
TCEP Hydrochloride TRC Canada T012500 peptide was synthesized upon request
Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
software
Deuteros Andy M C Lau, et al version 1.08
DynamX Waters version 3.0
MassLynx Waters version 4.1
Protein Lynx
Global Server (PLGS)		 Waters version 3.0.3
PyMOL Schrödinger version 2.2.2
Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Instrument and equipment
ACQUITY UPLC BEH C18 analytical Column Waters 186002346
ACQUITY UPLC BEH C8 VanGuard Pre-column Waters 186003978
ACQUITY UPLC M-Class HDX System Waters
HDX Manager Waters
microtip pH electrode Thermo Fisher 13-620-291
Waters Enzymate BEH column or Pepsin solumn Waters 186007233
Waters Synapt G2-Si Waters

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Karplus, M., McCammon, J. A. Molecular dynamics simulations of biomolecules. Nature Structural & Molecular Biology. 9 (9), 646-652 (2002).
  2. Campbell, E., et al. The role of protein dynamics in the evolution of new enzyme function. Nature Chemical Biology. 12 (11), 944-950 (2016).
  3. Tokuriki, N., Tawfik, D. S. Protein dynamism and evolvability. Science. 324 (5924), 203-207 (2009).
  4. Wales, T. E., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics. Mass Spectrometry Reviews. 25 (1), 158-170 (2006).
  5. Konermann, L., Pan, J., Liu, Y. H. Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics. Chemical Society Reviews. 40 (3), 1224 (2011).
  6. Katta, V., Chait, B. T. Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 5 (4), 214 (1991).
  7. Zhang, Z., Smith, D. L. Determination of amide hydrogen exchange by mass spectrometry: a new tool for protein structure elucidation. Protein Science. 2 (4), 522 (1993).
  8. Smith, D. L., Deng, Y., Zhang, Z. Probing the non-covalent structure of proteins by amide hydrogen exchange and mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 32 (2), 135-146 (1997).
  9. Bai, Y., Milne, J. S., Mayne, L., Englander, S. W. Primary structure effects on peptide group hydrogen exchange. Proteins. 17 (1), 75-86 (1993).
  10. Xiao, K., et al. Revealing the architecture of protein complexes by an orthogonal approach combining HDXMS, CXMS, and disulfide trapping. Nature Protocols. 13 (6), 1403-1428 (2018).
  11. Smith, D. L., Deng, Y., Zhang, Z. Probing the non-covalent structure of proteins by amide hydrogen exchange and mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 32 (2), 135-146 (1997).
  12. Masson, G. R., et al. Recommendations for performing, interpreting and reporting hydrogen deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) experiments. Nature Methods. 16 (7), 595-602 (2019).
  13. Liu, J., et al. An Efficient Site-Specific Method for Irreversible Covalent Labeling of Proteins with a Fluorophore. Scientific Reports. 5, 16883 (2015).
  14. Marion, D., et al. Overcoming the overlap problem in the assignment of proton NMR spectra of larger proteins by use of three-dimensional heteronuclear proton-nitrogen-15 Hartmann-Hahn-multiple quantum coherence and nuclear Overhauser-multiple quantum coherence spectroscopy: application to interleukin 1.beta. Biochemistry. 28 (15), 6150-6156 (1989).
  15. Balasubramaniam, D., Komives, E. A. Hydrogen-exchange mass spectrometry for the study of intrinsic disorder in proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1834 (6), 1202-1209 (2013).
  16. Goswami, D., et al. Time window expansion for HDX analysis of an intrinsically disordered protein. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (10), 1584-1592 (2013).
  17. Keppel, T. R., Howard, B. A., Weis, D. D. Mapping Unstructured Regions and Synergistic Folding in Intrinsically Disordered Proteins with Amide H/D Exchange Mass Spectrometry. Biochemistry. 50 (40), 8722-8732 (2011).
  18. Mitchell, J. L., et al. Functional Characterization and Conformational Analysis of the Herpesvirus saimiri Tip-C484 Protein. Journal of Molecular Biology. 366 (4), 1282-1293 (2007).
  19. Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry with top-down electron capture dissociation for characterizing structural transitions of a 17 kDa protein. Journal of the American Chemical Society. 131 (35), 12801-12808 (2009).
  20. Habibi, Y., Uggowitzer, K. A., Issak, H., Thibodeaux, C. J. Insights into the Dynamic Structural Properties of a Lanthipeptide Synthetase using Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry. Journal of the American Chemical Society. 141 (37), 14661-14672 (2019).
  21. Hebling, C. M., et al. Conformational analysis of membrane proteins in phospholipid bilayer nanodiscs by hydrogen exchange mass spectrometry. Analytical Chemistry. 82 (13), 5415-5419 (2010).
  22. Duc, N. M., et al. Effective application of bicelles for conformational analysis of G protein-coupled receptors by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (5), 808-817 (2015).
  23. Canul-Tec, J. C., et al. Structure and allosteric inhibition of excitatory amino acid transporter 1. Nature. 544 (7651), 446-451 (2017).
  24. Reading, E., et al. Interrogating Membrane Protein Conformational Dynamics within Native Lipid Compositions. Angewandte Chemie International Edition. 56 (49), 15654-15657 (2017).
  25. Hentze, N., Mayer, M. P. Analyzing protein dynamics using hydrogen exchange mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (81), e50839 (2013).
  26. Lento, C., et al. Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics. Journal of Visualized Experiments. (122), e55464 (2017).
  27. Schowen, K. B., Schowen, R. L. Solvent isotope effects on enzyme systems. Methods in Enzymology. 87, 551-606 (1982).
  28. Lau, A. M. C., Ahdash, Z., Martens, C., Politis, A. Deuteros: software for rapid analysis and visualization of data from differential hydrogen deuterium exchange-mass spectrometry. Bioinformatics. 35 (7), 3171-3173 (2019).
  29. Houde, D., Berkowitz, S. A., Engen, J. R. The utility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry in biopharmaceutical comparability studies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 100 (6), 2071 (2011).
  30. Burkitt, W., O'Connor, G. Assessment of the repeatability and reproducibility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry measurements. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 22 (23), 3893-3901 (2008).
  31. Rob, T., Gill, P. K., Golemi-Kotra, D., Wilson, D. J. An electrospray ms-coupled microfluidic device for sub-second hydrogen/deuterium exchange pulse-labelling reveals allosteric effects in enzyme inhibition. Lab on a Chip. 13, 2528-2532 (2013).

Tags

Биохимия выпуск 159 масс-спектрометрия обмена водорода биохимия энзимология биосинтез натуральные продукты пептиды
Платформа масс-спектрометрии обмена водорода и дейтерия (HDX-MS) для изучения пептидных биосинтетических ферментов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Habibi, Y., Thibodeaux, C. J. A… More

Habibi, Y., Thibodeaux, C. J. A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes. J. Vis. Exp. (159), e61053, doi:10.3791/61053 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter