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Biochemistry

पेप्टाइड बायोसिंथेटिक एंजाइमों की जांच के लिए एक हाइड्रोजन-ड्यूटेरियम एक्सचेंज मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एचडीएक्स-एमएस) मंच

Published: May 4, 2020 doi: 10.3791/61053
Automatic Translation
1, 1
1Department of Chemistry, McGill University

Summary

लैंथिपेप्टाइड संश्लेषण पेप्टाइड प्राकृतिक उत्पादों के बायोसिंथेसिस के दौरान मल्टीस्टेप प्रतिक्रियाओं को उत्प्रेरित करता है। यहां, हम एक सतत, नीचे-अप, हाइड्रोजन-ड्यूटेरियम एक्सचेंज मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एचडीएक्स-एमएस) वर्कफ़्लो का वर्णन करते हैं जिसे लैंथिपेप्टाइड संश्लेषण की अनुरूप गतिशीलता के साथ-साथ पेप्टाइड प्राकृतिक उत्पाद बायोसिंथेसिस में शामिल अन्य समान एंजाइमों का अध्ययन करने के लिए नियोजित किया जा सकता है।

Abstract

हाइड्रोजन-ड्यूटेरियम एक्सचेंज मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एचडीएक्स-एमएस) एंजाइम अनुरूप परिवर्तन और एंजाइम-सब्सट्रेट इंटरैक्शन के जैव भौतिक लक्षण वर्णन के लिए एक शक्तिशाली तरीका है। इसके कई लाभों में, एचडीएक्स-एमएस केवल थोड़ी मात्रा में सामग्री का उपभोग करता है, एंजाइम/सब्सट्रेट लेबलिंग की आवश्यकता के बिना निकट देशी परिस्थितियों में किया जा सकता है, और बड़े एंजाइमों और मल्टीप्रोटीन परिसरों के लिए भी एंजाइम अनुरूप गतिशीलता पर स्थानिक रूप से हल की गई जानकारी प्रदान कर सकता है। विधि डी2ओ में तैयार बफर में ब्याज के एंजाइम को कमजोर करके शुरू की जाती है। यह ड्यूटेरियम (एन-डी) के साथ पेप्टाइड बॉन्ड अमेज (एन-एच) में प्रोटियम के आदान-प्रदान को ट्रिगर करता है। वांछित विनिमय समय बिंदुओं पर, प्रतिक्रिया एलिकोट्स को बुझाया जाता है, एंजाइम को पेप्टाइड्स में प्रोटियोलिज किया जाता है, पेप्टाइड्स को अल्ट्रा-प्रदर्शन तरल क्रोमेटोग्राफी (यूपीएलसी) द्वारा अलग किया जाता है, और प्रत्येक पेप्टाइड (ड्यूटेरियम के लिए हाइड्रोजन के आदान-प्रदान के कारण) के द्रव्यमान में परिवर्तन एमएस द्वारा दर्ज किया जाता है। प्रत्येक पेप्टाइड द्वारा ड्यूटेरियम तेज की मात्रा दृढ़ता से उस पेप्टाइड के स्थानीय हाइड्रोजन संबंध वातावरण पर निर्भर है। एंजाइम एक्सचेंज ड्यूटेरियम के बहुत गतिशील क्षेत्रों में बहुत तेजी से मौजूद पेप्टाइड्स, जबकि अच्छी तरह से आदेश दिए गए क्षेत्रों से प्राप्त पेप्टाइड्स बहुत अधिक धीरे-धीरे विनिमय से गुजरते हैं। इस तरह से, एचडीएक्स दर स्थानीय एंजाइम अनुरूप गतिशीलता पर रिपोर्ट करती है। विभिन्न लिगामेंट्स की उपस्थिति में ड्यूटेरियम तेज स्तर के लिए क्षोभ का उपयोग तब लिगांड बाध्यकारी साइटों को मैप करने, एलोस्टेरिक नेटवर्क की पहचान करने और एंजाइम फ़ंक्शन में अनुरूप गतिशीलता की भूमिका को समझने के लिए किया जा सकता है। यहां, हम बताते हैं कि हमने एक प्रकार के पेप्टाइड प्राकृतिक उत्पादों के बायोसिंथेसिस को बेहतर ढंग से समझने के लिए एचडीएक्स-एमएस का उपयोग कैसे किया है जिसे लैंथिपेप्टाइड कहा जाता है। लैंथिपेप्टाइड्स आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड पेप्टाइड्स होते हैं जो बड़े, बहुआयामी, अनुरूप गतिशील एंजाइमों द्वारा संशोधित किए जाते हैं जो पारंपरिक संरचनात्मक जीव विज्ञान दृष्टिकोणों के साथ अध्ययन करना मुश्किल होते हैं। एचडीएक्स-एमएस इस प्रकार के एंजाइमों के मशीनी गुणों की जांच के लिए एक आदर्श और अनुकूलनीय मंच प्रदान करता है।

Introduction

प्रोटीन संरचनात्मक रूप से गतिशील अणु होते हैं जो फेमटोसेकंड-स्केल बॉन्ड कंपन से लेकर संपूर्ण प्रोटीन डोमेन की पुनर्व्यवस्थाओं तक समय तराजू पर विभिन्न संरचनाओं का नमूना लेते हैं जो कई सेकंड से अधिक हो सकते हैं1। ये अनुरूप उतार-चढ़ाव अक्सर एंजाइम/प्रोटीन कार्य के महत्वपूर्ण पहलू होते हैं । उदाहरण के लिए, लिगांड बाइंडिंग द्वारा प्रेरित अनुरूप परिवर्तन अक्सर एंजाइम फ़ंक्शन को मॉडुलेट करने के लिए गंभीर रूप से महत्वपूर्ण होते हैं, या तो उत्प्रेरक के लिए आवश्यक सक्रिय साइट अवशेषों का आयोजन करके, अनुक्रमिक गतिज तंत्र में सब्सट्रेट बाध्यकारी साइटों को परिभाषित करके, पर्यावरण से प्रतिक्रियाशील मध्यवर्ती को बचाना, या एलोस्टेरिक नेटवर्क के माध्यम से एंजाइम फ़ंक्शन को ढालकर। हाल के अध्ययनों से यह भी पता चला है कि पूरे विकास में संरचना की गतिशीलता को संरक्षित किया जा सकता है और आणविक गति को संरक्षित करने के लिए क्षोभ को सब्सट्रेट विशिष्टता में परिवर्तन और नए एंजाइम कार्यों के उद्भव के साथ सहसंबद्ध किया जा सकता है2,3।

हाल के वर्षों में, हाइड्रोजन-ड्यूटेरियम एक्सचेंज मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एचडीएक्स-एमएस) तेजी से एक शक्तिशाली तकनीक के रूप में उभरा है ताकि यह जांच की जा सके कि प्रोटीन अनुरूप परिदृश्य लिगांड बाइंडिंगया म्यूटेनेसिस4, 5,6,7जैसे क्षोभ का जवाब कैसे देते हैं। एक ठेठ एचडीएक्स-एमएस प्रयोग(चित्रा 1)में, ब्याज का एक प्रोटीन डी 2 ओ में तैयार बफर में रखा जाता है, जो ड्यूटेरिया के साथ सॉल्वेंट-एक्सचेंजेबल प्रोटॉन केप्रतिस्थापनको ट्रिगर करता है। पेप्टाइड बांड की अमिट मोदित्य की विनिमय दर पीएच, स्थानीय अमीनो एसिड अनुक्रम और एमिड8के स्थानीय संरचनात्मक वातावरण पर दृढ़ता से निर्भर करती है। अमीड्स जो हाइड्रोजन बॉन्डिंग इंटरैक्शन (जैसे α-हेलीक और β-शीट्स में मौजूद हैं) प्रोटीन के असंरचित क्षेत्रों में अमेदियों की तुलना में अधिक धीरे-धीरे आदान-प्रदान करते हैं जो थोक विलायक के संपर्क में हैं। इस प्रकार, ड्यूटेरियम तेज की सीमा एंजाइम की संरचना का एक प्रतिबिंब है। एंजाइम जो अनुरूप रूप से गतिशील हैं, या जो लिगांड बाइंडिंग पर संरचनात्मक संक्रमण से गुजरते हैं, से एक औसत दर्जे का एचडीएक्स प्रतिक्रिया प्राप्त होने की उम्मीद होगी।

संरचित अमीड की धीमी विनिमय दर का मशीनी आधार चित्र 2 5,8,9में दर्शाया गया है . HDX से गुजरने के लिए, संरचित क्षेत्र को पहले क्षणिक रूप से एक सामने आई संरचना का नमूना लेना चाहिए, जैसे कि सॉल्वेंट अणु जो एक विशिष्ट एसिड/बेस रासायनिक तंत्र के माध्यम से एचडीएक्स एक्सचेंज को उत्प्रेरित करते हैं, विनिमय योग्य एमिड तक पहुंच होते हैं । अंततः, रासायनिक विनिमय दर(कश्मीरकेम)के सापेक्ष परिमाण और तह और पुनर्गुना विनिमय दर(कश्मीरखुले और कश्मीरकरीब)प्रयोग5, 8में मापा HDX दर निर्धारित करते हैं । इस सरल गतिज मॉडल से, यह स्पष्ट है कि ड्यूटेरियम तेज की सीमा अंतर्निहित अनुरूप गतिशीलता को प्रतिबिंबित करेगी (जैसा कि कश्मीरओपन और केक्लोजद्वारा परिभाषित किया गया है)। अधिकांश एचडीएक्स-एमएस प्रयोग एक बॉटम-अप वर्कफ़्लो में किए जाते हैं, जहां एक्सचेंज रिएक्शन के बाद, ब्याज के प्रोटीन को पेप्टाइड्स में पचाया जाता है और प्रत्येक पेप्टाइड द्वारा ड्यूटेरियम तेज को द्रव्यमान 7 में वृद्धि के रूप में मापाजाताहै। इस तरह, एचडीएक्स-एमएस एंजाइम संरचना गतिशीलता को क्षोभ की अनुमति देता है, जिसे पेप्टाइड्स के स्थानीय स्थानिक पैमाने पर मैप किया जाता है, जिससे शोधकर्ता यह आकलन कर सकता है कि क्षोभ रुचि के एंजाइम के विभिन्न क्षेत्रों में गतिशीलता को कैसे बदल देता है।

प्रोटीन संरचनात्मक गतिशीलता को स्पष्ट करने के लिए एचडीएक्स-एमएस दृष्टिकोण के फायदे कई हैं। सबसे पहले, विधि देशी प्रोटीन की छोटी मात्रा के साथ या क्वाटर्चरी संरचना10के साथ सिस्टम में प्रोटीन परिसरों पर किया जा सकता है। परख में उपयोग की जाने वाली एंजाइम तैयारी के लिए यह भी आवश्यक नहीं हैकि 11,12,जब तक कि बॉटम-अप एचडीएक्स-एमएस वर्कफ्लो पर्याप्त संख्या में आत्मविश्वास से पहचाने गए पेप्टाइड्स प्रदान करता है जो प्रोटीन अनुक्रम को कवर करता है। इसके अलावा, एचडीएक्स-एमएस साइट-विशिष्ट प्रोटीन लेबलिंग की आवश्यकता के बिना निकट देशी परिस्थितियों में अनुरूप गतिशीलता के बारे में जानकारी प्रदान कर सकता है जैसा कि एकल अणु फ्लोरेसेंस अध्ययन13में उपयोग किया जाएगा, और प्रोटीन या प्रोटीन परिसर की कोई आकार सीमा नहीं है जिसकी जांच की जा सकती है (जो परमाणु चुंबकीय अनुनाद [एनएमआर] स्पेक्ट्रोस्कोपी चैलेंजिंग जैसे दृष्टिकोण बनाता है)7,14। अंत में, आंतरिक रूप से अव्यवस्थित प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए समय-हल किए गए एचडीएक्स-एमएस विधियों को नियोजित किया जा सकता है, जिन्हेंएक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी15, 16,17,18के साथ अध्ययन करना मुश्किल है। एचडीएक्स-एमएस की मुख्य सीमा यह है कि डेटा कम संरचनात्मक संकल्प का है। एचडीएक्स-एमएस डेटा इस ओर इशारा करने के लिए उपयोगी हैं कि कहां अनुरूप गतिशीलता बदल रही है और युग्मित अनुरूप परिवर्तनों का खुलासा करने के लिए, लेकिन वे अक्सर देखे गए परिवर्तन को चलाने वाले सटीक आणविक तंत्र में अधिक अंतर्दृष्टि प्रदान नहीं करते हैं। प्रोटीन एचडीएक्स-एमएस डेटा के साथ इलेक्ट्रॉन कैप्चर वियोजन विधियों के संयोजन में हाल की प्रगति ने एकल अमीनो एसिड अवशेषों19के लिए एक्सचेंज साइटों के मानचित्रण के लिए वादा दिखाया है, लेकिन एचडीएक्स-एमएस डेटा द्वारा अग्रेषित संरचनात्मक मॉडलों को स्पष्टता प्रदान करने के लिए बायोकेमिकल और संरचनात्मक अध्ययनों का पालन करना अभी भी अक्सर आवश्यक है।

नीचे, एचडीएक्स-एमएस परख के विकास के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल20प्रस्तुत किया गया है। नीचे प्रस्तुत नमूना तैयारी प्रोटोकॉल आम तौर पर किसी भी प्रोटीन पर लागू होना चाहिए जो जलीय बफ़र्स में अच्छी घुलनशीलता प्रदर्शित करता है। डिटर्जेंट या फॉस्फोलिपिड्स21 , 22, 23, 24की उपस्थिति में परख की आवश्यकता से अधिक विशेष नमूना तैयार करने के तरीके और एचडीएक्स-एमएस वर्कफ्लो प्रोटीन के लिए उपलब्ध हैं। एचडीएक्स-एमएस डेटा संग्रह के लिए इंस्ट्रूमेंटल सेटिंग्स को तरल क्रोमेटोग्राफी सिस्टम के साथ-साथ एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन क्वाड्रपोल टाइम-ऑफ-फ्लाइट मास स्पेक्ट्रोमीटर के लिए वर्णित किया गया है। इसी तरह की जटिलता और संकल्प के डेटा व्यावसायिक रूप से उपलब्ध तरल क्रोमेटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस) प्रणालियों के एक नंबर के किसी भी एक पर एकत्र किया जा सकता है । व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर पैकेज का उपयोग करके डेटा प्रोसेसिंग के प्रमुख पहलू भी प्रदान किए जाते हैं। हम डेटा संग्रह और विश्लेषण के लिए दिशानिर्देश भी पेश करते हैं जो व्यापक एचडीएक्स-एमएस समुदाय12द्वारा की गई सिफारिशों के अनुरूप हैं। वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग हाल्म 2 के गतिशील संरचनात्मक गुणों का अध्ययन करने के लिए किया जाता है, एक लैंथिपेप्टाइड संश्लेषण जो एंटीमाइक्रोबियल पेप्टाइड प्राकृतिक उत्पाद20के बहुस्टेप परिपक्वता को उत्प्रेरित करता है। हम बताते हैं कि कैसे एचडीएक्स-एमएस का उपयोग बाध्यकारी साइटों और एलोस्टेरिक गुणों को प्रकट करने के लिए किया जा सकता है जिन्होंने पिछले लक्षण वर्णन को नहीं किया है। प्रोटीन एचडीएक्स-एमएस पर कई अन्य प्रोटोकॉल हाल के वर्षों में25,26प्रकाशित किए गए हैं। वर्तमान कार्य के साथ, इन पहले के योगदान पाठक को प्रायोगिक डिजाइन में कुछ लचीलापन प्रदान करना चाहिए।

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Protocol

1. ड्यूटेरेटेड रिएजेंट्स और एंजाइम स्टॉक समाधानों की तैयारी

  1. डी2ओ (99.9% एटम अंश डी) में 100−200x केंद्रित स्टॉक समाधान के रूप में एचडीएक्स प्रतिक्रियाओं (किसी भी बफ़र्स, साल्ट, सब्सट्रेट्स, लिगांड, आदि सहित) के लिए आवश्यक अभिकर्मक तैयार करें। बफर स्टॉक सॉल्यूशन का कम से कम 50 एमएल तैयार करें।
    नोट: HalM2 के लक्षण वर्णन के लिए, निम्नलिखित समाधान तैयार किए गए थे: 500 m MgCl2,100 mm tris (2-carboxyethyl) फॉस्फिन (TCEP), 750 mM एटीपी (HEPES बफर में), 800 mM HEPES पीडी 7.1, 500 μM HalA2, और 500 m AMPM
  2. सूखापन के लिए स्टॉक समाधानों को फ्रीज और ल्योफिलाइज करें।
  3. डी2ओ में फिर से भंग करें, और कम से कम एक अतिरिक्त समय दोहराएं ताकि यथासंभव ड्यूटेरॉन के साथ कई एक्सचेंजेबल प्रोटॉन को प्रतिस्थापित किया जा सके।
  4. निम्नलिखित संबंध27को ध्यान में रखते हुए, केंद्रित एनएओडी/डीसीएल के साथ वांछित मूल्य के लिए deuterated HEPES बफर स्टॉक के पीएडी को समायोजित करें:
    Equation 1
    नोट: अमीड एचडीएक्स दर समाधान के पीएल (पीएल = पीएच या पीडी)5पर दृढ़ता से निर्भर है। बफर स्टॉक समाधानों के विभिन्न बैचों को प्रयोगों के बीच मामूली पीएल बहाव से बचने के लिए एक समान तरीके से तैयार, संग्रहीत और उपयोग करने की आवश्यकता है।
  5. 300 माइक्रोन एचडीएक्स परख के लिए आवश्यक प्रत्येक अभिवाख की मात्रा की गणना करें और -80 डिग्री सेल्सियस पर एकल उपयोग एलिकोट के रूप में स्टोर करें।
  6. एक अपकेंद्रित्र फिल्टर(सामग्रीकी तालिका) या समकक्ष डिवाइस का उपयोग करके प्रोटेटेड एंजाइम स्टोरेज बफर में एक केंद्रित एंजाइम स्टॉक समाधान (~ 100−200 माइक्रोन) तैयार करें।
    नोट: सटीक बफर और अपकेंद्रित्र फिल्टर आणविक वजन कटऑफ ब्याज के प्रोटीन/एंजाइम पर निर्भर करेगा । हालम2 50 एमएम एचईपीई, पीएच 7.5, 100 एमएमएम केसीएल और 10% ग्लिसरोल में संग्रहीत किया जाता है। केंद्रित एंजाइम तैयार करने के लिए 10 केडीए फिल्टर का इस्तेमाल किया गया।
  7. एंजाइम को एकल उपयोग भागों में अलीकोट करें और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: यह एक रोक बिंदु हो सकता है । धारा 1 में वर्णित सभी स्टॉक समाधान एचडीएक्स प्रतिक्रियाओं के अग्रिम में तैयार किए जा सकते हैं। यदि -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है, तो अधिकांश एंजाइम/ड्यूटेरेटेड स्टॉक समाधान कई महीनों तक स्थिर रहेंगे।

2. एचडीएक्स शमन मात्रा का अंशांकन

  1. धारा 1 में तैयार ड्यूटेरेटेड रिएजेंट्स और केंद्रित एंजाइम स्टॉक का उपयोग करके डी2ओ में 300 माइक्रोन एचडीएक्स प्रतिक्रिया तैयार करें।
    1. 1−5 माइक्रोनएम की अंतिम एंजाइम एकाग्रता का उपयोग करें।
    2. कम से कम 50−100 mM की अंतिम ड्यूटेरेटेड एचईपीई बफर एकाग्रता का उपयोग करें।
    3. यह सुनिश्चित करें कि वांछित एंजाइम गतिविधि/कार्य को बनाए रखने के लिए अन्य घटकों की सांद्रता पर्याप्त है।
  2. एचडीएक्स शमन समाधान (100 mm फॉस्फेट, 0.8 एम ग्वानिडीन-एचसीएल, पीएच 1.9) के 1 एल तैयार करें। फ्रीज और दोनों 50 मिलीएल भागों में स्टोर (लंबी अवधि के शेयर के लिए) और 1 एमएल भागों (एकल उपयोग aliquots के लिए) ।
    नोट: शमन बफर की सटीक संरचना एंजाइम पर निर्भर करेगी जिसका उपयोग बॉटम-अप एचडीएक्स-एमएस वर्कफ्लो (चरण 3.3.3) के प्रोटेओलिसिस चरण में किया जाता है। यहां दिया गया शमन बफर पेप्सिन के साथ संगत है, जो एचडीएक्स-एमएस के लिए सबसे अधिक उपयोग किया जाने वाला प्रोटीज है। यदि एक अलग प्रोटीज का उपयोग किया जाता है, तो बफर अनुकूलता सुनिश्चित करने के लिए प्रोटीज आपूर्तिकर्ता से जांच करें।
  3. शमन एचडीएक्स प्रतिक्रिया मिश्रण के अंतिम पीएल को 2.3 के पीएच मीटर रीडिंग मूल्य में समायोजित करने के लिए आवश्यक शमन बफर की मात्रा को कैलिब्रेट करें।
    नोट: पेप्टाइड अमेज एन-एच बॉन्ड की सॉल्वेंट एच/डी विनिमय दर एक पीएच-निर्भर प्रक्रिया है जो एसिड और बेस-उत्प्रेरक दोनों के अधीन है । न्यूनतम विनिमय दर पीएच 2.5 (पीएच मीटर रीडिंग = 2.3 के लिए 50:50 एच 2 O:D2O मिश्रण) के मूल्य पर होती है। इस प्रकार, 2.5 के पास एक अंतिम पीएल मूल्य हाइड्रोजन बैक एक्सचेंज को कम करेगा जो बॉटम-अप एलसी-एमएस विश्लेषण के दौरान होता है, जिससे पेप्टाइड्स में ड्यूटेरियम लेबल का संरक्षण होता है।
    1. 50 माइक्रोन बफर के साथ चरण 2.1 से एचडीएक्स प्रतिक्रिया मिश्रण के 50 μL मिलाएं और एक माइक्रोटिप इलेक्ट्रोड के साथ शमन मिश्रण के पीएल को मापें।
    2. अंतिम पीएच मीटर रीडिंग को 2.3 के मूल्य में समायोजित करने के लिए आवश्यक समाधान की मात्रा बढ़ाएं।
    3. एक बार उपयुक्त शमन मात्रा निर्धारित हो जाने के बाद, यह सुनिश्चित करने के लिए कि एक निश्चित मात्रा में शमन बफर के अलावा एक सुसंगत अंतिम पीएल प्राप्त किया जाता है, एचडीएक्स प्रतिक्रिया (चरण 2.1) से ताजा 50 माइक्रोन एलिकोट का उपयोग करके कई बार शमन प्रक्रिया दोहराएं।

3. संदर्भ नमूनों की तैयारी और बॉटम-अप एलसी-एमएस कार्यप्रवाह का अनुकूलन

  1. 0.5 एमएल ट्यूब में ट्रिपलीकेट में रुचि के प्रोटीन के लिए अप्रेरित संदर्भ नमूने तैयार करें। सुनिश्चित करें कि अंतिम प्रतिक्रिया मिश्रण की स्थिति प्रामाणिक एचडीएक्स प्रतिक्रियाओं (चरण 2.1) में उपयोग की जाने वाली स्थितियों के समान है, सिवाय इसके कि प्रतिक्रियाएं एच 2 ओ में तैयार की जाती हैं, जो एच2ओ में तैयार किए गए रिएजेंट स्टॉक समाधानों का उपयोग करके वी2ओ में भी तैयार की जाती हैं।
  2. अंतिम पीएच को 2.5 में समायोजित करने के लिए टोच बफर की उचित मात्रा जोड़कर चरण 2.3 में नमूनों को बुझाें। फ्लैश तरल नाइट्रोजन में नमूनों को फ्रीज करें और विश्लेषण के लिए तैयार होने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. बॉटम-अप एलसी-एमएस वर्कफ्लो का उपयोग करके प्रोटेटेड एंजाइम संदर्भ नमूनों का विश्लेषण करें।
    नोट: इन चरणों को निष्पादित करने से पहले, डेटा अधिग्रहण के लिए उपयोग की जाने वाली एलसी-एमएस प्रणाली को ठीक से कैलिब्रेट किया जाना चाहिए और उपयोग के लिए तैयार होना चाहिए। नमूनों के बीच बैक एक्सचेंज में अंतर को कम करने के लिए बॉटम-अप एलसी-एमएस वर्कफ्लो में सभी चरणों के समय और तापमान को कड़ाई से नियंत्रित किया जाना चाहिए। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले एमएस इंस्ट्रूमेंटेशन के साथ (सामग्री की तालिका और सहायक जानकारी), उपकरण सॉफ्टवेयर के माध्यम से अधिकांश चरणों को नियंत्रित किया जा सकता है। सटीक प्रतिकृति के संग्रह को सुनिश्चित करने के लिए, कार्यप्रवाह में कई चरणों को यथासंभव स्वचालित करने की सिफारिश की जाती है।
    1. फ्रीजर से एक व्यक्तिगत एंजाइम संदर्भ नमूना (चरण 3.2 में तैयार) निकालें और पानी के स्नान में 1 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर गल लें।
    2. फ्रीजर और विगलन से नमूना हटाने के ठीक 2 मिनट पर, शमन संदर्भ नमूने के 40 μL हिस्से को अल्ट्रा-प्रदर्शन तरल क्रोमेटोग्राफी (यूपीएलसी) कॉलम (2.1 x 30 मिमी, 300 Å, 5 माइक्रोन) में इंजेक्ट करें जिसमें पेप्सिन (एक एसिड-स्थिर प्रोटेसी) के साथ कार्यात्मक एक स्थिर चरण होता है।
    3. हलाने के रूप में एच 2 ओ (पीएच = 2.5) में 0.1% फोर्मिक एसिड का उपयोग करके 15 डिग्री सेल्सियस पर3मिनट के लिए 100 माइक्रोन/मिनट की प्रवाह दर पर नमूना पचाएं।
    4. पेप्टिक पेप्टाइड्स को इकट्ठा करें क्योंकि वे पेप्सिन कॉलम से 0.4 डिग्री सेल्सियस पर आयोजित C18 ट्रैप कॉलम पर वापस एक्सचेंज को कम करने के लिए एल्यूट करते हैं।
    5. ट्रैप कॉलम से डेसाल्टेड पेप्टिक पेप्टाइड्स को C18 विश्लेषणात्मक कॉलम (1 मिमी x 100 मिमी, 1.7 माइक्रोन, 130 Å) में आयोजित किया जाता है और पेप्टिक पेप्टाइड्स के पृथक्करण के लिए 0.4 डिग्री सेल्सियस पर संचालित किया जाता है।
      नोट: कदम 3.3.3−3.3.5 HDX-MS डेटा अधिग्रहण के लिए उपयोग किए जाने वाले कुछ एलसी-एमएस सिस्टम द्वारा स्वचालित किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, इन चरणों को स्वतंत्र रूप से किया जा सकता है, यह ध्यान में रखते हुए कि प्रत्येक चरण के समय और तापमान को लगातार कम बैक एक्सचेंज प्राप्त करने के लिए सावधानीपूर्वक नियंत्रित करने की आवश्यकता है।
    6. एक एसीटोनीट्रील/पानी/०.१% फोर्मिक एसिड सॉल्वेंट सिस्टम के साथ C18 कॉलम एल्यूट । पेप्टिक पेप्टाइड्स में ड्यूटेरियम लेबल को अधिकतम करने और संरक्षित करने के लिए ब्याज के प्रोटीन के लिए एलसी ढाल को अनुकूलित करें।
      नोट: रेडिएंट एल्यूशन विवरण सहायक जानकारीमें प्रदान किए गए हैं ।
    7. पेप्टिक डाइजेस्ट को इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (ईएसआई) मास स्पेक्ट्रोमेट्री के अधीन करें।
      नोट: सहायक जानकारी में प्रदान की गई स्रोत शर्तें अधिकांश पेप्टिक पेप्टाइड्स के लिए पर्याप्त आयनीकरण प्रदान करेंगी।
      1. एक बार एमएस उपकरण में आयनित होने के बाद, विधि की अधिकतम क्षमता को बढ़ाने के लिए बफर गैस के रूप में नाइट्रोजन का उपयोग करके गैस चरण आयन गतिशीलता पृथक्करण करें।
      2. आयन गतिशीलता जुदाई के बाद, पेप्टिक पेप्टाइड अग्रदूत आयनों को एमएसई वर्कफ़्लो के अधीन करता है जिसमें कम टकराव ऊर्जा (4 वी) और उच्च टकराव ऊर्जा (21−40 वी) के वैकल्पिक चक्र शामिल हैं।
        नोट: बारी कम और उच्च टकराव ऊर्जा व्यवस्था एमएसएमएस डेटा (उच्च टकराव ऊर्जा) के साथ एक साथ एमएस डेटा (कम टकराव ऊर्जा) के संग्रह के लिए अनुमति देते हैं । यह, बदले में, अपने संबंधित खंड आयनों के साथ अग्रदूत आयनों के समय-सहसंबंध के लिए अनुमति देता है। धारा 4 में वर्णित आत्मविश्वास पेप्टाइड पहचान के लिए यह सहसंबंध आवश्यक है।
      3. कम से कम 20,000 की समाधान शक्ति के साथ एक मास एनालाइजर का उपयोग करके पेप्टाइड अग्रदूत और खंड आयनों का पता लगाएं।
      4. डेटा अधिग्रहण के साथ, [ग्लू-1]-फिब्रिनोपेप्टाइड बी (ग्लूफिब) बाहरी मानक के लिए एमएस डेटा प्राप्त करें।
        नोट: एमएस कार्यप्रवाह चरण 3.3.7 में वर्णित एक एमएसई प्रोटोकॉल के रूप में संदर्भित किया जाता है। एक एमएसई प्रोटोकॉल के लिए पूर्ण वाद्य सेटिंग्स जो बॉटम-अप एचडीएक्स-एमएस के लिए उपयुक्त है, सहायक जानकारी में प्रदान की जाती हैं।
    8. एलसी-एमएस डेटा की गुणवत्ता का आकलन करें।
      नोट: ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल और सहायक सूचनामें प्रदान की गई वाद्य सेटिंग्स का उपयोग करते हुए, संदर्भ नमूनों को लगभग 1 x 108की अधिकतम सिग्नल तीव्रता के साथ कुल आयन क्रोमाटोग्राम का उत्पादन करना चाहिए। 3−9 मिनट(चित्रा3ए−सी)के बीच कई पेप्टिक पेप्टाइड्स होने चाहिए।
    9. पेप्सिन और विश्लेषणात्मक C18 कॉलम को साफ करने के लिए खाली नमूनों (पानी में 0.1% फोर्मिक एसिड) के 40 माइक्रोन इंजेक्ट करें।
      नोट: सामान्य तौर पर, 2−3 रिक्त स्थान पर्याप्त होने चाहिए।
    10. प्रत्येक ट्रिपलिकेट संदर्भ प्रोटीन नमूनों के लिए 3.3.1−3.3.9 चरण दोहराएं।

4. संदर्भ डेटा को संसाधित करना और पेप्टाइड सूची को परिभाषित करना

  1. प्रोटेओमिक्स सॉफ्टवेयर(सामग्री की तालिका)का उपयोग करके कच्चे एमएसई डेटा (चरण 3.3.7) का विश्लेषण करें। प्रोटेओमिक्स सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, पुस्तकालयों के लिए नेविगेट | प्रोटीन अनुक्रम डेटाबैंक ब्याज के प्रोटीन के अमीनो एसिड अनुक्रम का आयात करके प्रोटीन डेटाबेस को परिभाषित करने के लिए।
    नोट: इस कदम का लक्ष्य ब्याज के प्रोटीन से प्राप्त पेप्टिक पेप्टाइड्स के लिए संदर्भ एमएस डेटा खोजना है, और किसी भी ख्यात पेप्टाइड पहचान को मान्य करने के लिए एमएसएमएस डेटा (एमएस डेटा के साथ एक साथ अधिग्रहीत) का उपयोग करना है।
  2. ब्याज के प्रोटीन अनुक्रम को एक नाम दें। प्रोटीन अनुक्रम (FASTA प्रारूप में) आयात करें। सॉफ्टवेयर पेप्टाइड्स की एक सूची उत्पन्न करने के लिए डेटाबेस प्रोटीन के सिलिको पाचन में प्रदर्शन करेगा जिसका उपयोग एलसी-एमएस डेटा को खोजने के लिए किया जाएगा।
  3. प्रसंस्करण मापदंडों को परिभाषित करें (लाइब्रेरी मेनू के तहत स्थित)। डेटा अधिग्रहण प्रकार के रूप में इलेक्ट्रोस्प्रे एमएसई का चयन करें। लॉक मास फॉर चार्ज 2 फील्ड में, [ग्लू-1]-फिब्रिनोपेप्टाइड बी (ग्लूफिब) के 2+ आयन के लिए एम/जेड के लिए 785.8426 दर्ज करें और फिनिशपर क्लिक करें।
  4. वर्कफ़्लो मापदंडों (लाइब्रेरी मेनू के तहत स्थित) को परिभाषित करें।
    1. खोज प्रकार के लिए इलेक्ट्रोस्प्रे एमएसई का चयन करें। वर्कफ़्लो | के तहत डेटाबेस खोज क्वेरी शीर्षक, डेटाबैंक क्षेत्र में चरण 4.2 में बनाए गए डेटाबेस प्रोटीन का चयन करें।
    2. प्राइमरी डाइजेस्ट रिएजेंट को गैर-विशिष्ट में बदलें, और कार्बामिडोमेथिल सीपर क्लिक करते समय सीटीआरएल बटन पकड़कर फिक्स्ड मोडिफायर रीएजेंट फील्ड को साफ करें।
  5. विकल्पों पर नेविगेट करके आउटपुट निर्देशिका निर्दिष्ट करें | ऑटोमेशन सेटअप | पहचान ई. एपेक्स 3डी और पेप्टाइड 3डी आउटपुट और आयन अकाउंटिंग आउटपुट के लिए बॉक्स देखें और वांछित निर्देशिका निर्दिष्ट करें।
  6. संदर्भ नमूना डेटा की प्रक्रिया करें।
    1. प्रोटेओमिक्स प्लेटफॉर्म वर्कस्पेस के बाएं टूल बार पर, माइक्रोटिटरप्लेट पर सही क्लिक करके एक नई प्लेट बनाएं। माइक्रोटिटर प्लेट में तीन कुओं को हाइलाइट करें (धारा 3 में एकत्र प्रत्येक संदर्भ नमूने के लिए एक)। एक कुएं में बाएं क्लिक करें, पकड़ो और तीन कुओं को खींचें।
    2. सही क्लिक करें और कच्चे डेटा जोड़ेंचुनें। जो विंडो दिखाई देती है, उसमें सेक्शन 3 से तीन रेफरेंस फाइल्स वाली निर्देशिका पर नेविगेट करें और उन्हें एक ही समय में चुनें।
    3. आगे क्लिक करें और चरण 4.3 में परिभाषित प्रसंस्करण मापदंडों का चयन करें। आगे क्लिक करें और चरण 4.4 में परिभाषित कार्यप्रवाह मापदंडों का चयन करें। फिर फिनिशपर क्लिक करें ।
  7. एक बार कच्चे डेटा, प्रसंस्करण मापदंडों, और कार्यप्रवाह मापदंडों थाली पर प्रत्येक अच्छी तरह से सौंपा गया है, कुओं नीले दिखाई देगा । कुओं का चयन करें, सही क्लिक करें और प्रक्रिया नवीनतम कच्चे डेटाका चयन करें । डेटा की प्रोसेसिंग को ट्रैक करने के लिए विंडो के दाएं नीचे के कोने पर क्लिक करें। एक बार संदेश चलाने के लिए कोई काम नहीं दिखाई देता है, प्रसंस्करण पूरी तरह से किया जाता है ।
  8. डाटा प्रोसेसिंग पूरी होने के बाद प्लेट में लगने वाले कुएं हरे रंग के हो जाएंगे। कुओं पर सही क्लिक करें और देखें कार्यप्रवाह परिणामोंका चयन करें । प्रत्येक संदर्भ डेटा फ़ाइल के लिए एक अलग विंडो खुलेगी।
  9. यह सुनिश्चित करने के लिए डेटा का निरीक्षण करें कि संदर्भ नमूना डेटा में अधिकांश एमएस संकेतों को सफलतापूर्वक ब्याज के प्रोटीन के इन-सिलिको पाचन से भविष्यवाणी की गई पेप्टाइड्स के लिए मैप किया गया था। मिलान पेप्टाइड्स आउटपुट स्पेक्ट्रम(चित्रा 4)में नीले रंग का होगा। ओके फ़िल्टर पर डबल-क्लिक करें और जांच करें कि प्रतिशत कवरेज 99% से अधिक है।
    नोट: प्रोसेसिंग पर, डेटा आउटपुट चरण 4.5 में निर्दिष्ट निर्देशिका में फ़ाइल एक्सटेंशन(raw_data_file_name_IA_final_peptide) के साथ स्वचालित रूप से सहेजा जाएगा।
  10. अतिरिक्त थ्रेसिंग के लिए प्रोटेओमिक्स सॉफ्टवेयर आउटपुट को एचडीएक्स-प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर(सामग्री की तालिका)में आयात करें।
    1. HDX-प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर विंडो के बाएं कोने में डेटा पर क्लिक करें। आयात PLGS परिणामों पर क्लिक करें और ऐड आइकन पर क्लिक करें। उचित निर्देशिका में नेविगेट करके चरण 4.9 से प्रसंस्कृत डेटा फ़ाइलों का चयन करें।
    2. अगले पर क्लिक करें और निम्नलिखित मापदंडों को निर्दिष्ट करें: न्यूनतम लगातार आयन 2 ≥, मास एरर = 5 पीपीएम, और फ़ाइल सीमा = 3। खत्मपर क्लिक करें ।
  11. एक बार दहलीज मापदंडों से संतुष्ट होने के बाद, एचडीएक्स परियोजना को बचाएं। विश्लेषण और प्रदर्शन के लिए इस परियोजना में सभी एचडीएक्स डेटा का आयात किया जाएगा।
    नोट: अगले खंड में वर्णित ड्यूटेरियम आदान-प्रदान नमूनों को एक समान एलसी-एमएस वर्कफ्लो के साथ संसाधित करने की आवश्यकता होगी। इसलिए, एचडीएक्स परख (धारा 5) के साथ आगे बढ़ने से पहले, यह सुनिश्चित करें कि नमूना तैयारी (धारा 2), बॉटम-अप एलसी-एमएस वर्कफ्लो (सेक्शन 3) और डेटा प्रोसेसिंग वर्कफ्लो (सेक्शन 4) लक्षित प्रोटीन की वांछित प्रजनन क्षमता और अनुक्रम कवरेज प्रदान कर रहे हैं। यदि कवरेज में सुधार के लिए इनमें से किसी भी प्रक्रिया को बदलने की आवश्यकता है, तो यह सुनिश्चित करने के लिए कि प्रत्येक पेप्टाइड को पुन: उत्पन्न और पता लगाने के लिए चरण 2.1 पर लौटने, ट्रिपलीकेट में नए संदर्भ नमूने तैयार करने और धारा2−4 (प्रोटोकॉल में आवश्यक समायोजन करते समय) दोहराने की सलाह दी जाती है।

5. एचडीएक्स प्रतिक्रियाओं का आयोजन

  1. एचडीएक्स प्रतिक्रियाओं के लिए कार्यक्षेत्र तैयार करें।
    1. प्री-एलिकोट बफर को ठीक से लेबल 0.5 एमएल ट्यूब में बुझाएं। हर बार बिंदु, हर दोहराने, और हर जैव रासायनिक राज्य का विश्लेषण करने के लिए एक अलग ट्यूब तैयार करें। 2.3 के मूल्य के लिए एचडीएक्स प्रतिक्रिया के 50 μL हिस्से के अंतिम पीएच मीटर रीडिंग को समायोजित करने के लिए आवश्यक चरण 2.2 से टोंच बफर की उचित मात्रा का उपयोग करें।
    2. संक्षेप में ट्यूब के नीचे करने के लिए बुझाने बफर के सभी हस्तांतरण करने के लिए 0.5 एमएल टब अपकेंद्रित्र। ट्यूबों को बर्फ पर रखें।
    3. एक छोटे से देवर को तरल नाइट्रोजन से भरें और कार्यक्षेत्र से सटे रहें।
  2. एचडीएक्स प्रतिक्रियाएं तैयार करें। सुनिश्चित करें कि विनिमय समय अंक (प्रत्येक वांछित समय बिंदु के लिए एक 50 μL aliquot) की वांछित संख्या एकत्र करने के लिए पर्याप्त प्रतिक्रिया मात्रा है। समय पैमाने में परिमाण के 3−4 आदेशों पर कम से कम 4−5 समय अंक एकत्र करें (उदाहरण के लिए, 15 एस, 60 एस, 300 एस [5 मिनट], 1,800 एस [30 मिनट] का समय बुझाएं, और 14,400 एस [4 एच] अधिकांश एंजाइमों के लिए गतिशील विनिमय का पर्याप्त कवरेज प्रदान करते हैं)।
    1. डी2ओ में चरण 1.1 से सभी ड्यूटेरेटेड घटकों (माइनस एंजाइम) को प्री-मिक्स करें।
    2. प्रत्येक जैव रासायनिक राज्य की जांच के लिए (मुफ्त एंजाइम, एंजाइम + लिगांड, एंजाइम + अवरोधक, आदि), कम से कम ट्रिपलिकेट में एचडीएक्स प्रतिक्रियाएं तैयार करें।
    3. एंजाइम के अलावा 10 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर तापमान नियंत्रित पानी स्नान में प्रतिक्रिया मिश्रण को इनक्यूबेट करें।
      नोट: एंजाइम को एक केंद्रित स्टॉक समाधान (~ 100−200 माइक्रोन, चरण 1.6) के रूप में तैयार किया जाना चाहिए ताकि एचडीएक्स परख में प्रोटियम के अलावा को कम किया जा सके।
    4. एंजाइम को 1−5 माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता में जोड़ने पर, टाइमर शुरू करें। ध्यान से और जल्दी से एक 200 μL पिपेट का उपयोग कर समाधान मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए कि एंजाइम समान रूप से नमूने में वितरित किया जाता है।
    5. वांछित विनिमय समय बिंदुओं पर, एचडीएक्स प्रतिक्रिया से 50 माइक्रोन एलिकोट्स निकालें और 0.5 एमएल ट्यूब में पूर्व-aliquoted, बर्फ ठंड बुझाने बफर के साथ जल्दी और समान रूप से मिलाएं।
      नोट: मिश्रण की मात्रा और मिश्रण प्रक्रिया के रूप में सटीक और प्रजनन योग्य के रूप में संभव के रूप में सुनिश्चित करें कि २.३ के वांछित अंतिम बुझाने पीएल सभी नमूनों में तेजी से प्राप्त किया जाता है होना चाहिए । बुझाने बफर बर्फ ठंडा रखने से एंजाइम के विकृति पर वापस विनिमय को कम करने में मदद मिलेगी।
    6. एचडीएक्स सैंपल को बुझाने के तुरंत बाद, लिक्विड नाइट्रोजन में ट्यूब और फ्लैश फ्रीज को कैप करें।
    7. जब तक सभी परखें पूरी न हो जाएं, तब तक समय अंक एकत्र करना जारी रखें, फिर भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में नमूने स्थानांतरित करें।
      नोट: यह एक रोक बिंदु हो सकता है । सभी एचडीएक्स समय बिंदुओं को इकट्ठा करने के बाद, नमूनों को एलसी-एमएस विश्लेषण के लिए तैयार होने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। आदर्श रूप से, एक ही दिन ब्याज के सभी जैव रासायनिक राज्यों के लिए ट्रिपलीकेट एचडीएक्स प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन किया जाना चाहिए। कम से कम, किसी दिए गए जैव रासायनिक राज्य के लिए सभी एन्किंग एचडीएक्स प्रतिक्रियाओं को एक ही दिन समानांतर रूप से चलाया जाना चाहिए।
  3. सभी शमन एचडीएक्स समय बिंदुओं को एकत्र करने के बाद, नमूनों को अनुकूलित बॉटम-अप एलसी-एमएस वर्कफ्लो के अधीन करें जैसा कि चरण 3.3 में वर्णित है। यह सुनिश्चित करने के लिए कि कोई भी पेप्टाइड ले जाता है, कम से कम है, नमूनों के बीच खाली स्थानों की एक उचित संख्या के साथ एक यादृच्छिक क्रम में एचडीएक्स नमूनों को इंजेक्ट करें।
    नोट: एचडीएक्स डेटा को एमएसई मोड में एकत्र करने की आवश्यकता नहीं है। इस प्रकार, उच्च टकराव ऊर्जा खंड (चरण 3.3.7.2) एमएस ड्यूटी चक्र से हटा दिया जाना चाहिए। यह केवल चरण 3.3 में वर्णित कार्यप्रवाह में किया गया परिवर्तन होना चाहिए।
  4. एचडीएक्स डेटा की गुणवत्ता का आकलन करें क्योंकि इसे एकत्र किया जा रहा है।
    1. सुनिश्चित करें कि अदूत संदर्भ नमूनों के कुल आयन क्रोमाटोग्राम में मौजूद क्रोमेटोग्राफिक चोटियां ड्यूटेटेड नमूनों (जैसा कि चित्र 3डी−एफमें) में एक ही प्रतिधारण समय पर दिखाई देती हैं।
    2. सुनिश्चित करें कि संदर्भ और deuterated नमूनों से विशिष्ट समय अंतराल पर अभिव्यक्त बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रा deuteration के लिए सबूत दिखाता है (यानी, व्यक्तिगत पेप्टाइड्स के आइसोटोपिक लिफाफे में एक बदलाव deuterated नमूनों में उच्च m/z मूल्यों के लिए[चित्र 6])।

6. एचडीएक्स डेटा को प्रोसेस करना

  1. डेटा | पर क्लिक करके चरण 4.11 में बनाए गए एचडीएक्स परियोजना में एचडीएक्स डेटा का आयात करें शीर्ष टूल बार में एमएस फ़ाइलें।
    1. जैव रासायनिक राज्यों (जैसे, मुफ्त एंजाइम, एंजाइम + लिगांड, आदि) और ड्यूटेरियम एक्सपोजर समय को परिभाषित करने के लिए आवश्यक नए राज्य और नए एक्सपोजर पर क्लिक करें, जो विश्लेषण के लिए प्रासंगिक हैं।
    2. विश्लेषण किए जाने वाले एचडीएक्स डेटा फ़ाइलों का चयन करने के लिए न्यू रॉ पर क्लिक करें। आयात की जाने वाली प्रत्येक कच्चे डेटा फ़ाइल को उपयुक्त विनिमय समय और जैव रासायनिक स्थिति आवंटित करें।
      नोट: डेटा का आयात किया जा सकता है और बैचों में संसाधित किया जा सकता है, या सभी एक बार में । परियोजना में डेटा जोड़ने से उस परियोजना के भीतर पहले किए गए किसी भी विश्लेषण को पूर्ववत नहीं किया जाएगा।
  2. एक बार डेटा फ़ाइलों को जोड़ दिए जाने के बाद, डेटा प्रोसेसिंग शुरू करने के लिए फिनिश पर क्लिक करें। थोड़ी देरी के बाद सॉफ्टवेयर पूछेगा कि क्या यूजर जारी रखने से पहले डेटा को सेव करना चाहता है । हांपर क्लिक करें ।
    नोट: प्रारंभिक प्रसंस्करण में कितने नमूनों का विश्लेषण किया जा रहा है, अंतिम पेप्टाइड सूची (चरण 4.10), क्रोमेग्राफिक विंडो का आकार, और स्पेक्ट्रल अधिग्रहण की आवृत्ति में कितने पेप्टाइड्स हैं, इसके आधार पर कई घंटे तक का समय लग सकता है।
  3. यदि वांछित है, तो आयन खोज मापदंडों को बदलने के लिए कॉन्फ़िगरेशन मेनू में प्रसंस्करण मापदंडों को बदल दें। किसी दिए गए प्रोजेक्ट में सभी डेटा के लिए एक ही आयन खोज मापदंडों को नियोजित करना सुनिश्चित करें।

7. एचडीएक्स डेटा का विश्लेषण और दृश्य

नोट: एक बार कच्चे डेटा की प्रारंभिक प्रसंस्करण (चरण 6.2) पूरी हो जाने के बाद, एचडीएक्स-प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर का विश्लेषण किए गए कच्चे डेटा फ़ाइलों में से प्रत्येक में पेप्टाइड सूची (चरण 4.10 में उत्पन्न) से पेप्टाइड्स स्थित होंगे। एक बार सूची में पेप्टाइड के लिए आइसोटोप वितरण एक कच्चे डेटा फ़ाइल में स्थित है, HDX-प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर एक "छड़ी" के साथ प्रत्येक आइसोटोप का प्रतिनिधित्व करता है (जैसा कि चित्र 6सी−ईमें)। दिए गए पेप्टाइड के लिए छड़ की सापेक्ष तीव्रता का उपयोग संदर्भ स्पेक्ट्रा के सापेक्ष ड्यूटेरियम तेज की गणना करने के लिए किया जाता है। जबकि एचडीएक्स-प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर अधिकांश पेप्टाइड्स को "चिपक जाती है" को ठीक से निर्दिष्ट करने का एक सराहनीय काम करता है, ड्यूटेरियम तेज मूल्यों के महत्वपूर्ण मैनुअल क्यूरेशन की अभी भी आवश्यकता होगी।

  1. पेप्टाइड ड्यूटेरियम तेज मूल्यों का विश्लेषण
    1. पेप्टाइड सूची में पहले पेप्टाइड का चयन करें और दृश्य मेनू से खड़ी स्पेक्ट्रल प्लॉट खोलें। ड्यूटेरियम एक्सचेंज समय(चित्रा 7डी, ई)के कार्य के रूप में चयनित पेप्टाइड के लिए द्रव्यमान स्पेक्ट्रा देखने के लिए खड़ी स्पेक्ट्रा प्लॉट विंडो में ऊपर और नीचे स्क्रॉल करें।
    2. असाइन और असाइन स्टिक्स को यह सुनिश्चित करने के लिए माउस क्लिक का उपयोग करके आवश्यक रूप से कि डेटा में उचित आइसोटोप वितरण स्थित किया गया है और प्रत्येक आइसोटोप चोटियों को सौंपा गया है (सौंपा गया छड़ें नीली दिखाई देंगी)। खड़ी स्पेक्ट्रल प्लॉट(चित्रा 7डी, ई)में किसी भी स्पेक्ट्रा पर क्लिक करने से उपयोगकर्ता को सक्रिय डेटा व्यूअर विंडो(चित्रा 7सी)में असाइन/अनसाइन स्टिक्स की अनुमति मिलेगी ।
    3. खड़ी स्पेक्ट्रल प्लॉट विंडो के शीर्ष पर प्रभारी राज्य को गलकर प्रत्येक प्रभारी राज्य के लिए स्टिक असाइनमेंट की जांच करें।
    4. प्रत्येक जैव रासायनिक रुचि की स्थिति के लिए कदम 7.1.1−7.1.3 दोहराएं। बायोकेमिकल राज्य भी खड़ी स्पेक्ट्रल प्लॉट खिड़की के शीर्ष पर toggled किया जा सकता है । सबसे सटीक ड्यूटेरियम तेज अंतर माप के लिए, यह सुनिश्चित करें कि प्रत्येक जैव रासायनिक राज्य के लिए चार्ज राज्यों के एक ही सेट के लिए छड़ें सौंपा जाता है।
    5. पेप्टाइड सूची में प्रत्येक पेप्टाइड के लिए 7.1.1−7.1.4 चरण दोहराएं।
    6. कवरेज मानचित्र का उपयोग करके पेप्टाइड ड्यूटेरियम तेज मूल्यों के मानक विचलन की जांच करें।
      1. व्यू मेनू से कवरेज मानचित्र तक पहुंचें, जो प्रत्येक पेप्टाइड सूची में प्रत्येक पेप्टाइड को प्रदर्शित करता है जो ब्याज के प्रोटीन(चित्रा 8C)के अमीनो एसिड अनुक्रम के साथ मैप किया गया है। सापेक्ष मानक विचलन (दा की इकाइयों) के अनुसार पेप्टाइड्स को रंग दें।
      2. नेत्रहीन उच्च सापेक्ष मानक विचलन के साथ आउटलियर पेप्टाइड्स के लिए मानचित्र खोजें। लक्ष्य पेप्टाइड के साथ खड़ी स्पेक्ट्रल भूखंडों(चित्रा 8B)और डेटा दर्शक खिड़की(चित्रा 8A)को पॉप्युलेट करने के लिए कवरेज मैप में आउटलियर पेप्टाइड्स पर क्लिक करें ।
      3. खड़ी स्पेक्ट्रल साजिश का उपयोग करना, ध्यान से जांच करें कि सभी चार्ज राज्यों और आउटलियर पेप्टाइड के सभी समय बिंदुओं ने उचित रूप से लाठी सौंपी है।
        नोट: अक्सर, बड़े मानक विचलन (>0.3 दा) के साथ पेप्टाइड्स में आइसोटोपिक चोटियां होती हैं जिन्हें सॉफ्टवेयर द्वारा उचित रूप से स्टिक नहीं सौंपी जाती थी (जैसा कि चित्र 8बीमें इंगित किया गया है)। किसी भी लापता छड़ें निर्दिष्ट आम तौर पर एक पेप्टाइड के सापेक्ष मानक विचलन को कम करने के लिए सक्षम हो जाएगा <0.3 डीए ।
      4. यदि सापेक्ष मानक विचलन को 0.3 डीए से कम नहीं किया जा सकता है तो पेप्टाइड को सूची से छिपाएं।
  2. ब्याज के प्रोटीन के एक संरचनात्मक मॉडल पर मानचित्रण के लिए दो जैव रासायनिक राज्यों के बीच HDX अंतर डेटा निर्यात करें।
    1. कवरेज मानचित्र में रुचि के अंतर को प्रदर्शित करें। .csv फ़ाइल को अंतर डेटा निर्यात करने के लिए कवरेज मानचित्र पर सही क्लिक करें। डेटा | पर नेविगेट करके राज्य डेटा (.csv प्रारूप में) का निर्यात करें मुख्य टूल बार में राज्य डेटा निर्यात करें।
      नोट: अंतर डेटा और राज्य डेटा फ़ाइलों की उचित स्वरूपण सहायक जानकारीमें प्रदान की जाती है ।
    2. अंतर डेटा, राज्य के आंकड़ों, और ब्याज के प्रोटीन की पीडीबी फाइल को ड्यूटेरोस28में आयात करें। 99% आत्मविश्वास अंतराल चुनें, सक्षम राशि का चयन करें,और डेटा को संसाधित करें।
      नोट: Deuteros चलाने के लिए MATLAB पीसी पर स्थापित किया जाना चाहिए। Deuteros प्रत्येक पेप्टाइड के लिए तेज डेटा के मानक विचलन की गणना करने के लिए सेट डेटा में दोहराने माप का उपयोग करेगा । इस मानक विचलन का उपयोग महत्वपूर्ण विनिमय के लिए विश्वास अंतराल को परिभाषित करने के लिए किया जाएगा, जो भूखंडों पर प्रदर्शित किया जाएगा।
    3. PyMOL विकल्पों के तहत, निर्यात तेज | का चयन करें PyMOL सॉफ्टवेयर का उपयोग कर ब्याज के प्रोटीन की पीडीबी संरचना पर महत्वपूर्ण विनिमय अंतर के क्षेत्रों को मैप करने के लिए एक Pymol स्क्रिप्ट उत्पन्न करने के लिए निर्यात।
      नोट: इस प्रोटोकॉल में वर्णित कार्यप्रवाह का उपयोग करके, एक ही समय बिंदु पर दिए गए पेप्टाइड के लिए महत्वपूर्ण ड्यूटेरियम तेज अंतर के लिए 99% आत्मविश्वास अंतराल आमतौर पर 0.3−0.5 डीए होता है। सभी विनिमय समय बिंदुओं पर अभिव्यक्त अंतर के लिए 99% आत्मविश्वास अंतराल आमतौर पर 0.7−1.0 डीए होता है।

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Representative Results

प्रत्येक सेट के लिए प्रोटियोलिटिक पाचन की गुणवत्ता और कार्यप्रवाह की पुनरुत्पाणि का आकलन करना आवश्यक है। इस प्रकार, एचडीएक्स-एमएस परख करने से पहले, रिवर्स चरण तरल क्रोमेटोग्राफी और गैस चरण आयन गतिशीलता का उपयोग करके पेप्टाइड्स के पृथक्करण के लिए, और एमएस का उपयोग करके पेप्टाइड्स का पता लगाने के लिए, ब्याज के प्रोटीन के प्रोटेओलिसिस के लिए प्रभावी स्थितियां स्थापित करना आवश्यक है। इस उद्देश्य के लिए, ब्याज के प्रोटीन के लिए संदर्भ नमूनों (deuterium के अभाव में एकत्र) पहले जांच की जानी चाहिए (धारा 3) । चित्रा 3ए−सी में क्रोमेटोग्राफिक डेटा हलएम 2 लैंथिपेप्टाइड संश्लेषण के तीन संदर्भ नमूनों के लिए कुल आयन क्रोमेटोग्राम (TICs) दिखाते हैं। TIC सभी आयन के योग में समय निर्भर परिवर्तन सभी m/z मूल्यों पर बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रल स्कैन में शामिल है । चित्रा3डी−एफमें 3 से 8 मिनट के बीच टीआईसी के करीब विचार दिखाए गए हैं। चित्रा 3जी−I में दिखाया गया द्रव्यमान स्पेक्ट्रा प्रत्येक TIC के एक छोटे से समय अंतराल (5.0 से 5.1 मिनट तक) पर सभी द्रव्यमान स्पेक्ट्रा के एक योग का प्रतिनिधित्व करता है। चित्र 3में निम्नलिखित विशेषताओं पर विशेष ध्यान दिया जाना चाहिए .

सबसे पहले, ढाल के अंत में 9.3 मिनट के पास बड़ी चोटी अधूरा पचा (और इसलिए, बड़े और अधिक हाइड्रोफोबिक) HalM2(चित्रा 3A−C)के टुकड़े का प्रतिनिधित्व करता है । हाल्म 2 एकाग्रता को कम करके पाचन को और अधिक कुशल बनाया जा सकता है, लेकिन इससे पेप्टाइड सिग्नल तीव्रता और सिग्नल: शोर अनुपात कम हो जाएगा। पेप्सिन कॉलम के साथ संपर्क समय (3 मिनट, प्रोटोकॉल चरण 3.3.3 से) बढ़ाकर पाचन को और अधिक कुशल बनाया जा सकता है। हालांकि, संपर्क समय में वृद्धि के परिणामस्वरूप अधिक बैक एक्सचेंज होगा। अंततः, इन मापदंडों को वांछित अनुक्रम कवरेज, संकेत तीव्रता, और deuterium प्रतिधारण प्रदान करने के लिए ब्याज की प्रोटीन के लिए संतुलित करने की जरूरत है । दूसरा, आईसीसी प्रोफाइल का आकार और तीव्रता समान होनी चाहिए (जैसा कि चित्र 3डी−एफमें)। इससे पता चलता है कि HalM2 का प्रोटियोलिटिक पाचन प्रजनन योग्य है और सभी तीन संदर्भ नमूनों में समान दक्षता का है। उम्मीद यह है कि एक ड्यूटेरियम-एक्सचेंज किए गए नमूने का एक समान पाचन समान प्रतिधारण समय के साथ पेप्टाइड्स का एक ही सेट का उत्पादन करेगा। तीसरा, एक दिए गए समय अंतराल पर द्रव्यमान स्पेक्ट्रा भी समान होना चाहिए(चित्र 3जी−I)। क्रोमेग्राफिक पृथक्करण के 5.0−5.1 मिनट के समय अंतराल पर अभिव्यक्त द्रव्यमान स्पेक्ट्रा की एक त्वरित दृश्य तुलना से पता चलता है कि प्रत्येक नमूने में बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रल सिग्नल वास्तव में बहुत समान हैं, जो विश्वास प्रदान करते हैं कि प्रत्येक नमूने में समान पेप्टाइड्स मौजूद हैं और सी 18 कॉलम से समान समय पर इल्यूटिंग कर रहे हैं। क्रोमेटोग्राम में अन्य समय अंतराल पर इसी तरह का त्वरित दृश्य निरीक्षण किया जाना चाहिए।

संदर्भ नमूनों के एलसी-एमएस डेटा में समानता की पुष्टि करने के बाद, प्रोटेओमिक्स सॉफ्टवेयर का उपयोग ब्याज के प्रोटीन के अमीनो एसिड अनुक्रम से प्राप्त पेप्टाइड्स के लिए एमएस डेटा खोजने के लिए किया जाता है। प्रोटीन अनुक्रम डेटाबैंक (ब्याज के प्रोटीन का अमीनो एसिड अनुक्रम) को परिभाषित करने के बाद, प्रसंस्करण और कार्यप्रवाह पैरामीटर जैसा कि प्रोटोकॉल चरण 4.2−4.4 में वर्णित है, प्रत्येक व्यक्तिगत संदर्भ नमूने को पेप्टिक पेप्टाइड्स का पता लगाने के लिए संसाधित किया जाता है जो ब्याज के प्रोटीन से प्राप्त पेप्टाइड्स से मेल खाते हैं। एक अप्रेरित HalM2 संदर्भ नमूने के लिए प्रोटेओमिक्स सॉफ्टवेयर आउटपुट का एक उदाहरण चित्र 4में दिखाया गया है । निम्नलिखित विशेषताओं पर विशेष ध्यान दिया जाना चाहिए। सबसे पहले, प्रसंस्करण और वर्कफ़्लो मापदंडों में परिभाषित मूल्यों के अनुसार ब्याज के प्रोटीन के भीतर एक विशिष्ट पेप्टाइड से मेल खाने वाला कोई भी एमएस सिग्नल नीचे स्पेक्ट्रम में नीले रंग का होगा। यदि एक संदर्भ नमूना "सफलतापूर्वक" संसाधित किया जाता है, तो अधिकांश संकेत नीले दिखाई देंगे (जैसा कि चित्र 4में डेटा के लिए मामला है)। इसके अलावा, शीर्ष बाएं पैनल में, यह सुनिश्चित करें कि "ओके फ़िल्टर" हरे चेकमार्क पर टॉग्लेड है। जब ऐसा किया जाता है, तो शीर्ष दाएं पैनल के शीर्ष बार में आंकड़े (चित्रा 4में नीले रंग में हाइलाइट किए गए) केवल उन पेप्टाइड्स को प्रतिबिंबित करेंगे जो उच्च आत्मविश्वास स्कोर देते हैं। ये पेप्टाइड्स कम पीपीएम मास सटीकता, कई टुकड़े आयनों, और टुकड़ा और माता पिता आयन प्रतिधारण समय के बीच अच्छा संबंध प्रदर्शन, और विश्वास पहचान माना जाता है । हाल्म 2 संदर्भ नमूने के लिए, उच्च स्कोर के साथ 1,421 पेप्टाइड्स का पता लगाया गया था, जिसमें 99.6% HalM2 अनुक्रम शामिल था। प्रोटोकॉल सेक्शन 3 में वर्णित बॉटम-अप एलसी-एमएस वर्कफ्लो का उपयोग करके अधिकांश प्रोटीन के लिए लगभग 100% अनुक्रम कवरेज प्राप्य होना चाहिए। इसके अलावा, प्रत्येक पेप्टाइड के लिए अतिरिक्त उपयोगी आंकड़े शीर्ष दाएं पैनल में सारणीबद्ध किए जाते हैं, जिनमें बड़े पैमाने पर त्रुटि, अग्रदूत प्रतिधारण समय, टुकड़े की संख्या (उत्पाद आयन), नाम से टुकड़ा आयनों की पूरी सूची, और आयन गतिशीलता बहाव समय शामिल है। यह जानकारी परिणामों की व्याख्या के लिए उपयोगी है, जिसे हमेशा सबसे आत्मविश्वास से पहचाने गए पेप्टाइड्स पर केंद्रित किया जाना चाहिए।

अंतिम पेप्टाइड सूची एचडीएक्स-प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर में अतिरिक्त थ्रेसिंग द्वारा निर्धारित की जानी चाहिए। पेप्टाइड सूची (प्रोटोकॉल धारा 4) उत्पन्न करने के लिए संदर्भ डेटा का विश्लेषण करने के बाद, अतिरिक्त थ्रेसिंग के लिए आउटपुट को एचडीएक्स-प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर में आयात किया जाना चाहिए। आउटपुट फ़ाइलों को एक निर्देशिका में संग्रहीत किया जाएगा जैसा कि प्रोटोकॉल चरण 4.5 में परिभाषित किया गया है जिसमें फ़ाइल एक्सटेंशन "..._IA_final_peptide.csv" है। एचडीएक्स-प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर में आउटपुट अपलोड करने पर, पेप्टाइड्स की पूरी सूची "पेप्टाइड पूर्वावलोकन" पैनल(चित्रा 5)में दिखाई जाएगी, और पेप्टाइड्स, अनुक्रम कवरेज और अतिरेक की संख्या खिड़की के नीचे दाएं कोने में प्रदर्शित की जाएगी। अतिरिक्त थ्रेसिंग लागू होने के साथ ही ये मान वास्तविक समय में बदल जाएंगे। आगेक्लिक करने के बाद, इंगित फ़ील्ड में थ्रेसहोल्डिंग मान स्थापित किए जा सकते हैं. सबसे महत्वपूर्ण फ़िल्टर "फ़ाइल सीमा" हैं जिसके लिए सभी पेप्टाइड्स को तीन संदर्भ नमूनों में से प्रत्येक में स्थित होने की आवश्यकता होती है, "अधिकतम एमएच + त्रुटि (पीपीएम)" जिसे मूल्य और एलटी;10 पीपीएम और "न्यूनतम लगातार उत्पादों" के लिए सेट किया जाना चाहिए, जिसके लिए पेप्टाइड कोएमएस ई वर्कफ्लो (प्रोटोकॉल चरण 3.3.7.2) के एमएसएमएस (यानी, उच्च टकराव ऊर्जा) चरण के दौरान कम से कम दो लगातार खंड आयनों को उत्पन्न करने की आवश्यकता होती है।

एचडीएक्स-एमएस परख की सबसे महत्वपूर्ण तकनीकी सीमा प्रोटियम के लिए ड्यूटेरियम का बैक एक्सचेंज है जो जैसे ही ड्यूटेरियम-एक्सचेंज किए गए नमूनों को बुझाया जाता है (प्रोटेटेड बफर के साथ)। वर्कफ्लो के प्रोटीज पाचन और एलसी-एमएस भागों के दौरान बैक एक्सचेंज जारी रहता है। बैक एक्सचेंज अपरिहार्य है, लेकिन यदि सभी पोस्ट-शमन चरणों के पीएच, तापमान और समय को प्रोटोकॉल में वर्णित सावधानीपूर्वक नियंत्रित किया जाता है, तो ड्यूटेरियम लेबल का 60%−70% बनाए रखा जा सकता है। इस कारण से, परख विकास के शुरुआती चरणों के दौरान यह जांचना आवश्यक है कि अधिकांश पेप्टाइड्स ड्यूटेरियम को बनाए रख रहे हैं। यह एक संदर्भ नमूने के साथ एक deuterated नमूने के कच्चे डेटा की तुलना करके जल्दी से प्राप्त किया जा सकता है। जैसा कि संदर्भ नमूनों(चित्रा 3)की पुनरुत्पादनता सुनिश्चित करने के लिए किया गया था, ड्यूटेरियम-एक्सचेंज और अप्रेरित संदर्भ नमूनों के टीआईसी की तुलना करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि प्रोफाइल के आकार एक दूसरे के समान हैं। इसके अलावा, दोनों नमूनों में एक ही क्रोमेग्राफिक समय अंतराल पर बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रा राशि। ड्यूटेरियम एक्सचेंज किए गए नमूने में पेप्टाइड्स के अधिकांश उच्च एम/जेड मूल्यों (चित्र 6के रूप में) की ओर अपने आइसोटोपिक वितरण में स्पष्ट बदलाव प्रदर्शित करना चाहिए । इस डेटा से पता चलता है कि एसिड शमन, पेप्सिन पाचन, और एलसी-एमएस डेटा संग्रह के दौरान ड्यूटेरियम लेबल का एक बड़ा अंश बनाए रखा जा रहा है ।

यह सत्यापित करने के बाद कि कार्यप्रवाह पर्याप्त ड्यूटेरियम प्रतिधारण प्रदान कर रहा है, ड्यूटेरियम तेज को मात्रा निर्धारित करने की आवश्यकता है। इस प्रकार, ड्यूटेरियम-आदान-प्रदान किए गए नमूनों के लिए कच्चे डेटा को एचडीएक्स-प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर में आयात किया जाता है। संदर्भ नमूनों और अंतिम पेप्टाइड सूची का उपयोग करके, एचडीएक्स-प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर प्रत्येक कच्चे डेटा फ़ाइलों में पेप्टाइड सूची से पेप्टाइड का पता लगाएगा और प्रत्येक आइसोटोपिक चोटियों को "छड़ें" आवंटित करेगा। चित्रा 7में दिखाए गए HalM2 के प्रतिनिधि डेटा में, सफलतापूर्वक सौंपे गए छड़ें सभी स्पेक्ट्रा में नीले रंग की होती हैं। छड़ें निर्दिष्ट करने के बाद, आइसोटोपिक वितरण के लिए सेंट्रोइड एम/जेड मूल्य सॉफ्टवेयर द्वारा निर्धारित किया जाएगा और अप्रेरित संदर्भ नमूने के सापेक्ष ड्यूटेरियम तेज की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा । प्रत्येक पेप्टाइड के लिए ड्यूटेरियम विनिमय मूल्य की मैन्युअल रूप से जांच की जानी चाहिए। चित्रा 7में, वर्तमान में चयनित पेप्टाइड (HIDKLTVGL, HalM2 अवशेषों 110−118) फैले मुख्य डेटा दर्शक(चित्रा 7A)के बाएं पैनल में दिखाया गया है । अन्य पैनल इस पेप्टाइड से जुड़े एचडीएक्स डेटा दिखाते हैं। पेप्टाइड सूची में किसी भी पेप्टाइड पर क्लिक करने से उस पेप्टाइड से एचडीएक्स डेटा के साथ अन्य पैनल आबाद होंगे। चित्रा 7B पेप्टाइड 110−118 के लिए ड्यूटेरियम तेज भूखंडों को दिखाता है। इस डेटा सेट में चार एक्सचेंज टाइम पॉइंट होते हैं: 0.5, 5, 30, और 240 मिनट (ट्रिपलीकेट में एकत्र)। दो जैव रासायनिक राज्यों के लिए विनिमय डेटा एकत्र किए गए थे: मुफ्त HalM2 एंजाइम (लाल) और HalM2 एंजाइम AMPPNP और उसके सब्सट्रेट पेप्टाइड HalA2 (नीला) के लिए जटिल । पूरे समय के पाठ्यक्रम में पेप्टाइड 110−118 में महत्वपूर्ण ड्यूटेरियम तेज अंतर और दोहराने के माप की उच्च परिशुद्धता पर ध्यान दें (चित्रा 7 Bमें साजिश पर त्रुटि सलाखों को दिखाया गया है)। सामान्य तौर पर, इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत कार्यप्रवाह की पुनरुत्पादनता को रेखांकित करते हुए, अधिकांश पेप्टाइड्स के लिए तेज माप में इसी तरह की सटीकता प्राप्त की जाएगी। लिगांड बाइंडिंग (चित्रा 7 Bमें ब्लू कर्व) पर, हाल्मेम2 के 110−118 क्षेत्र में पेप्टाइड बॉन्ड एड्स जाहिरा तौर पर ड्यूटेरियम एक्सचेंज से महत्वपूर्ण सुरक्षा से गुजरते हैं, जिससे यह सुझाव दिया जाता है कि 110−118 क्षेत्र में अमीनो एसिड अधिक स्थिर रूप से संरचित होते जा रहे हैं। इस क्षेत्र के बाद के म्यूटाजेनेसिस ने अग्रदूत पेप्टाइड, हला 220के लिए बाध्यकारी में एक भूमिका का संकेत दिया। चित्रा 7 में भी दिखाया गया है HalM2 राज्य के लिए खड़ी स्पेक्ट्रल भूखंड(चित्रा 7D)और HalM2: AMPPNP: HalA2 राज्य(चित्रा 7E)। इन प्लॉट्स में एक्सचेंज टाइम नीचे से ऊपर तक बढ़ जाता है। लंबे समय के बिंदुओं पर ड्यूटेरियम एक्सचेंज पर पेप्टाइड 110−118 की बड़े पैमाने पर वृद्धि दृश्य निरीक्षण से स्पष्ट है। यह भी स्पष्ट है कि पेप्टाइड 110−118 पूरी तरह से लिगाइंड राज्य (चित्रा 7E) की तुलना में HalM2 राज्य(चित्रा 7D)में अधिक ड्यूटेरियमबढ़ाता है। यदि आवश्यक हो, तो चित्रा 7D या चित्रा 7E में किसी भी उपभूखंड पर क्लिक करने से उपयोगकर्ता को मुख्य डेटा व्यूअर(चित्रा 7सी)में लाठी के असाइनमेंट को मैन्युअल रूप से संशोधित करने की अनुमति मिलेगी। स्टिक असाइनमेंट/अनसाइनमेंट पर, एचडीएक्स-प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर ड्यूटेरियम तेज मूल्यों की पुनर्गणना करेगा, और सभी भूखंडों को वास्तविक समय में अपडेट किया जाएगा । इसी तरह, पैनल बी में व्यक्तिगत डेटा बिंदुओं पर क्लिक करने से मैनुअल स्टिक असाइनमेंट के लिए पैनल सी में डेटा व्यूअर आबाद हो जाएगा ।

सभी जैव रासायनिक राज्यों के लिए प्रत्येक पेप्टाइड और विनिमय समय बिंदु के लिए छड़ें सौंपे जाने के बाद, मापा तेज मूल्यों के मानक विचलन की जांच की जानी चाहिए । यह कवरेज मानचित्र और खड़ी स्पेक्ट्रल प्लॉट(चित्रा 8)के साथ प्रदर्शन करने के लिए सबसे आसान है। कवरेज मानचित्र(चित्रा 8C)में, राज्य का चयन करें और ब्याज के विनिमय समय, तो सापेक्ष तेज मानक विचलन का चयन करें । कवरेज मानचित्र में पेप्टाइड्स मापा ड्यूटेरियम तेज मूल्य में मानक विचलन के अनुसार रंग जाएगा। इस तरह, आइसोटोप स्टिक एमआईएस-असाइनमेंट वाले पेप्टाइड्स की पहचान करना बहुत आसान होगा। कवरेज मानचित्र में आउटलियर पेप्टाइड (उच्च मानक विचलन के साथ) पर क्लिक करने से मुख्य डेटा दर्शक और बाहरी पेप्टाइड से एचडीएक्स डेटा के साथ खड़ी स्पेक्ट्रा प्लॉट आबाद हो जाएगा। प्रत्येक बार बिंदु और प्रभारी राज्य के लिए छड़ी कार्य तो मापा तेज मूल्य को सही करने के लिए आवश्यक के रूप में संशोधित किया जा सकता है । फिर, HDX-प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर वास्तविक समय में सभी डेटा डिस्प्ले को अपडेट करेगा क्योंकि स्टिक असाइनमेंट बदल जाते हैं।

एचडीएक्स डेटा सेट को पूरी तरह से क्यूरेट करने के बाद, प्रत्येक पेप्टाइड के लिए ड्यूटेरियम तेज अंतर माप के महत्व पर डेटा व्याख्या से पहले विचार करने की आवश्यकता है। Engen और सह-कर्मियों द्वारा वर्णित दृष्टिकोण का उपयोग करतेहुए,हमने उपरोक्त प्रोटोकॉल 20 में वर्णित कार्यप्रवाह का उपयोग करके हल्म2 प्रोटीन के लिए 0.1 ±0.1डीए के औसत तेज मूल्य का अनुमान लगाया है। यह मान इसी तरह के बॉटम-अप, निरंतर एक्सचेंज एचडीएक्स वर्कफ्लो29,30के लिए दूसरों द्वारा रिपोर्ट की गई त्रुटियों के अनुरूप है। हाल ही में, पॉलिटिस और सह-कर्मियों ने एचडीएक्स डेटा सेट28में महत्वपूर्ण तेज अंतर का निर्धारण करने के लिए एक उपयोगी ओपन सोर्स टूल (मैटलैब में लागू) ड्यूटेरोस विकसित किया। ड्यूटेरोस ("State_Data_for_Deuteros" और "Difference_Data_for_Deuteros" के लिए प्रतिनिधि इनपुट फाइलें सहायक जानकारी में शामिल हैं। यदि इस प्रोटोकॉल(सामग्रीकी तालिका) में वर्णित एचडीएक्स-प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर से सीधे निर्यात किया जाता है, तो डियूटेरोस द्वारा फाइल रीडिंग के लिए अंतर और राज्य डेटा फ़ाइलों में उचित प्रारूप होगा। यदि एचडीएक्स डेटा एक अलग एलसी-एमएस सिस्टम पर उत्पन्न होता है, तो सहायक जानकारी में प्रदान की गई डेटा फ़ाइलों को मैन्युअल रूप से बनाया जाना होगा।

ड्यूटेरोस कार्यक्षेत्र को चित्र 9में दिखाया गया है । एक बार डेटा ड्यूटेरोस में आयात किए जाने के बाद, उपयोगकर्ता वांछित विश्वास सीमा (>98% अनुशंसित) का चयन करता है और आयात और गणनापर क्लिक करता है। चपटा डेटा मानचित्र के लिए, डेटा प्रकार के लिए कवरेज का चयन करें और रंग पैमाने के लिए निरपेक्ष। प्लॉटपर क्लिक करें । जंगल भूखंडों के लिए, डेटा प्रकार, वांछित आत्मविश्वास फिल्टर के रूप में बाइनरी फ़िल्टर का चयन करें और राशि को सक्षम करें। प्लॉटपर क्लिक करने पर, ड्यूटेरोस अमीनो एसिड अनुक्रम और उनके ड्यूटेरियम तेज मूल्यों में अपनी स्थिति के एक समारोह के रूप में प्रत्येक विनिमय समय बिंदु पर सभी पेप्टाइड्स की साजिश करेगा। पेप्टाइड्स जो महत्वपूर्ण एक्सचेंज प्रदर्शित करते हैं, या तो लाल या नीले रंग के रंग में होंगे, इस पर निर्भर करता है कि पेप्टाइड क्रमशः कम या ज्यादा ड्यूटेरियम लेता है, अंतर के अनुसार गणना की जा रही है। प्रत्येक प्लॉट में सूचित महत्व मूल्य (चित्रा 9 में प्लॉट किए गए डेटा में 0.39 से 0.72डीए तक) की गणना डेटा सेट के भीतर मौजूद दोहराने वाले मापों से निर्धारित हर पेप्टाइड के लिए मापा जाने वाले तेज मतभेदों के मानक विचलन से की जाती है। विश्वास अंतराल प्रत्येक व्यक्तिगत साजिश भर में धराशायी सलाखों के रूप में दिखाया गया है । यदि सक्षम है, तो "योग" बस हर पेप्टाइड के लिए हर समय बिंदु पर मापा तेज अंतर जोड़ता है। अंत में, ब्याज के प्रोटीन की त्रि-आयामी संरचना पर तेज डेटा के दृश्य के लिए, PyMOL विकल्पों के तहत निर्यात तेज का चयन करें, फिर निर्यातकरें। ड्यूटेरोस एक PyMOL स्क्रिप्ट उत्पन्न करेगा जिसे खींचा जा सकता है और ब्याज के प्रोटीन की खुली पीडीबी फ़ाइल वाले PyMOL कार्यक्षेत्र में गिराया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत एचडीएक्स-एमएस वर्कफ़्लो का उपयोग एंजाइम (HalM2) के जैव रासायनिक गुणों की विशेषता के लिए किया गया था जो आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड पेप्टाइड (HalA2)20पर पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों की एक श्रृंखला को उत्प्रेरित करता है। चित्रा 10में, प्रतिनिधि एचडीएक्स-एमएस परिणाम HalM2: AMP-PNP परिसर के लिए HalA2 अग्रदूत पेप्टाइड के बाध्यकारी के लिए दिखाए जाते हैं। पैनल ए HalM2 कवरेज मानचित्र दिखाता है, जहां रंग [HalM2:AMPPNP] जैव रासायनिक राज्य और [HalM2:AMPPNP: HalA2] राज्य के बीच सापेक्ष तेज अंतर इंगित करता है । Deuteros HalM2 एंजाइम(चित्रा 10बी, सी)के एक homology मॉडल पर इन तेज मतभेदों को मैप करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । पेप्टाइड्स जो लाल रंग के होते हैं, HalA2 बाध्यकारी पर ड्यूटेरियम तेज में कमी का संकेत देते हैं, यह सुझाव देते हुए कि HalM2 के इन क्षेत्रों को सीधे अग्रदूत पेप्टाइड के बाध्यकारी में शामिल किया जा सकता है। इस परिकल्पना की जांच करने के लिए, क्षेत्रों I-III उत्परिवर्तित किया गया और संस्करण एंजाइमों के गतिज गुणों की जांच की गई । क्षेत्र I और III में उत्परिवर्तन दोनों ने HalA2 पेप्टाइड बाध्यकारी आत्मीयता में महत्वपूर्ण क्षोभ का नेतृत्व किया, जिसमें यह सुझाव दिया गया है कि HalM2 के ये क्षेत्र या तो पेप्टाइड सब्सट्रेट के साथ सीधे बातचीत कर रहे हैं, या संरचनाओं को बनाने के लिए आवश्यक हैं जो HalA2 बाध्यकारी को सक्षम करते हैं। इसके विपरीत, क्षेत्र द्वितीय के उत्परिवर्तन HalA2 बाध्यकारी आत्मीयता पर कोई प्रभाव नहीं था, लेकिन इस उत्परिवर्ती लगभग उत्प्रेरक गतिविधि से रहित था । इस खोज के लिए एक स्पष्टीकरण यह है कि क्षेत्र द्वितीय के संगठन HalA2 बाध्यकारी पर मनाया एक अनुरूप परिवर्तन है कि एंजाइम को सक्रिय चलाता है । यह ध्यान दिया जाना चाहिए, कि इस अध्ययन से पहले, HalM2-HalA2 बाध्यकारी मोड पर या प्रणाली में उत्प्रेरक प्रासंगिक अनुरूप परिवर्तन पर कोई जानकारी उपलब्ध नहीं थी, मुख्य रूप से क्योंकि बड़े आकार और दोनों HalM2 और HalA2 की लचीली प्रकृति संरचनात्मक अध्ययन precluded है । इस प्रकार, HalM2 लैंथिपेप्टाइड संश्लेषण पर ये प्रतिनिधि डेटा यह दर्शाते हैं कि उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचनात्मक डेटा के अभाव में भी एचडीएक्स-एमएस का उपयोग संरचनात्मक रूप से गतिशील एंजाइम प्रणालियों के कार्यात्मक रूप से प्रासंगिक क्षेत्रों का तेजी से पता लगाने के लिए कैसे किया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: एक सतत विनिमय, बॉटम-अप एचडीएक्स-एमएस वर्कफ़्लो। विवरण के लिए पाठ देखें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2: एचडीएक्स दर प्रोटीन अनुरूप गतिशीलता (केओपन और केक्लोज)और एन-डी बांड(केम)के लिए प्रोटीन बैकबोन में एन-एच बांड के रासायनिक आदान-प्रदान की पीएच-निर्भर दर पर निर्भर करतीहै। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: ट्रिपलीकेट HalM2 संदर्भ नमूनों के लिए प्रतिनिधि एलसी-एमएस डेटा। प्रत्येक पैनल के शीर्ष दाएं कोने में संख्या कुल आयन मायने रखता है का प्रतिनिधित्व करता है । प्रत्येक पंक्ति एक अलग संदर्भ नमूने के लिए डेटा दिखाती है। पहला कॉलम(ए−सी)कुल आयन क्रोमाटोग्राम (टीआईसी) दिखाता है। 9.3 मिनट पर बड़ी चोटी बड़े, अपाच्य पेप्टाइड्स का प्रतिनिधित्व करता है। मध्य स्तंभ(डी−एफ)3 से 8 मिनट के बीच टीआईसी के करीब से दृश्य दिखाता है। प्रोफाइल के आकार के अच्छे समझौते पर ध्यान दें, जो पूरे क्रोमेटोग्राम में प्रत्येक संदर्भ नमूने में पेप्टाइड संकेतों के समान अंतर्निहित मिश्रण को इंगित करता है। तीसरा कॉलम(जी−I)क्रोमेग्राफिक रन के टाइम पॉइंट 5.0 और 5.1 मिनट के बीच दर्ज किए गए सभी द्रव्यमान स्पेक्ट्रा को संक्षेप में तैयार करके उत्पन्न प्रत्येक संदर्भ नमूने के लिए बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रा दिखाता है। इस डेटा का दृश्य निरीक्षण इंगित करता है कि प्रत्येक नमूने में कई समान पेप्टाइड्स का पता लगाया जा रहा है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: हाल्म 2 संदर्भ नमूने के लिए प्रतिनिधि प्रोटेओमिक्स सॉफ्टवेयर आउटपुट। शीर्ष बाएं पैनल एमएस डेटा में पता चला HalM2-व्युत्पन्न पेप्टिक पेप्टाइड्स की पूरी सूची से पता चलता है । ध्यान दें कि "ओके फ़िल्टर" हरे रंग का चेकमार्क दिखा रहा है। यह कॉन्फिडेंस स्कोर के हिसाब से डेटा को फिल्टर करता है और कम कॉन्फिडेंस की पेप्टाइड आइडेंटिफिकेशन को हटा देता है। सही पैनल के शीर्ष बार (नीले रंग में प्रकाश डाला) उच्च स्कोर के साथ पेप्टाइड्स के सेट के लिए संचयी आंकड़े दिखाता है । सबसे महत्वपूर्ण आंकड़े पेप्टाइड्स की संख्या (इस मामले में 1,421) और अनुक्रम कवरेज (इस मामले में 99.6%) प्रत्येक पेप्टाइड के लिए अतिरिक्त आंकड़े भी शीर्ष अधिकार पैनल में दिखाए जाते हैं। इस डेटा तालिका में प्रत्येक कॉलम सॉर्ट करने योग्य है। नीचे पैनल एमएस संकेतों के सभी से पता चलता है कि एक भविष्यवाणी HalM2-व्युत्पन्न पेप्टिक पेप्टाइड से मिलान किया गया । ध्यान दें कि अधिकांश एमएस सिग्नल सौंपे गए थे और नीले रंग के हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: एचडीएक्स-प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर में अतिरिक्त थ्रेसिंग। तीन HalM2 संदर्भ नमूनों में से प्रत्येक के लिए प्रोटेओमिक्स सॉफ्टवेयर आउटपुट एचडीएक्स-प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर (बाएं पैनल) में आयात किया जाता है। डेटा आयात करने के बाद, अतिरिक्त थ्रेसिंग (दाएं पैनल) की जाती है। "न्यूनतम लगातार उत्पाद" क्षेत्र पेप्टाइड में आसन्न पेप्टाइड बांड के दरार से उत्पन्न खंड आयनों को संदर्भित करता है। "न्यूनतम एमएच + त्रुटि" पैरामीटर उपयोगकर्ता को स्वीकार्य द्रव्यमान सटीकता को परिभाषित करने की अनुमति देता है, और "फ़ाइल सीमा" उपयोगकर्ता को पेप्टाइड्स को केवल उन पेप्टाइड्स तक सीमित करने की अनुमति देती है जो तीनों संदर्भ फ़ाइलों में पाए गए थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: एक HalM2 संदर्भ नमूना (लाल) और एक HalM2 नमूना 5 मिनट (हरे रंग) के लिए डी2ओ बफर में इनक्यूबेटेड के लिए प्रतिनिधि डेटा । दोनों नमूनों को प्रोटोकॉल सेक्शन 3 में वर्णित बॉटम-अप एलसी-एमएस वर्कफ्लो के अधीन किया गया था । बाएं कॉलम में 6.0−6.1 मिनट की समय खिड़की पर बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रा को अभिव्यक्त किया गया है। तीन सही कॉलम एक ही द्रव्यमान स्पेक्ट्रा के करीब विचार दिखाते हैं, जहां ड्यूटेरेटेड नमूने (ग्रीन, टॉप) में उच्च एम/जेड मूल्यों में बदलाव पेप्टाइड संकेतों के अधिकांश के लिए स्पष्ट है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: एचडीएक्स-प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर में कार्यक्षेत्र का स्क्रीनशॉट। (क)HalM2-व्युत्पन्न पेप्टाइड्स की सूची प्रोटेओमिक्स सॉफ्टवेयर(चित्रा 3)के साथ HalM2 संदर्भ नमूनों के विश्लेषण से प्राप्त की और बाद में HDX-प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर(चित्रा 4)में थ्रेसिंग । वर्तमान में चयनित पेप्टाइड (HIDKLTVGL, HalM2 अवशेषों 110−118 में फैले) नीले रंग में प्रकाश डाला गया है । (ख)रुचि के दो जैव रासायनिक राज्यों के लिए ड्यूटेरियम तेज घटता (विनिमय समय के एक समारोह के रूप में): मुक्त HalM2 एंजाइम, और HALM2 एंजाइम AMPPNP और अग्रदूत लैंथिपेप्टाइड, HalA2 से बंधे । (ग)सक्रिय रूप से चयनित नमूने का मास स्पेक्ट्रम (इस मामले में, अप्रेरित HalM2 संदर्भ नमूनों में से एक)। पैनल सी में नीली छड़ें मैन्युअल रूप से सौंपा जा सकता है/जरूरत के रूप में असाइन किया अगर वे ठीक से प्रारंभिक डेटा प्रसंस्करण के दौरान HDX प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर द्वारा आवंटित नहीं किया गया । (D,E) HalM2 राज्य(डी)और HalM2: AMPPNP: HalA2 राज्य(ई)के लिए खड़ी स्पेक्ट्रल भूखंडों । ड्यूटेरियम तेज में समय पर निर्भर वृद्धि आसानी से दिखाई देती है, जैसा कि दो जैव रासायनिक राज्यों के बीच तेज अंतर है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 8
चित्र 8: मापा तेज मूल्यों में मानक विचलन को कम करना। एचडीएक्स-प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर (पैनल सी) में कवरेज मानचित्र पेप्टाइड्स को उनके मापा ड्यूटेरियम तेज मूल्यों में बड़े मानक विचलन के साथ तेजी से पहचानने के लिए एक सुविधाजनक साधन प्रदान करता है। इस काल्पनिक मामले में, 110−118 अवशेषों में फैले हलएम2 व्युत्पन्न पेप्टाइड के लिए आइसोटोप चोटियों (नीली छड़ें) में से कुछ 5 मिनट के विनिमय समय बिंदुओं (पैनल बी में ग्रे स्टिक) के लिए असाइन किए गए हैं। यह 5 मिनट विनिमय समय बिंदु के लिए मापा deuterium तेज मूल्य में एक बड़े मानक विचलन के लिए अग्रणी है । बड़े मानक विचलन कवरेज मानचित्र (पैनल सी) में 110−118 पेप्टाइड के नीले रंग से और तेज प्लॉट (पैनल ए) में डेटा पॉइंट स्कैटर और बड़ी त्रुटि पट्टी से आसानी से स्पष्ट है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 9
चित्रा 9: ड्यूटेरोस कार्यक्षेत्र। इस उदाहरण में, हल्म 2: एएमपीएनपी: हाला2 राज्य से हाल्मम 2: एएमपीएनपी राज्य के ड्यूटेरियम तेज को घटाकर एचडीएक्स-प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर में तेज अंतर मूल्यों की गणना की गई थी। तुलना का लक्ष्य यह कल्पना करना था कि पेप्टाइड (HalA2) बाध्यकारी ने HalM2: AMPPNP परिसर की संरचनात्मक गतिशीलता को कैसे बदल दिया। डेटा सेट में 4 एक्सचेंज टाइम पॉइंट (0.5, 5, 30 और 240 मिनट) शामिल थे। प्रत्येक विनिमय समय बिंदु पर हर पेप्टाइड के लिए तेज अंतर जंगल भूखंडों में सचित्र है । वुड्स प्लॉट्स में रंगीन पेप्टाइड्स पेप्टाइड्स को इंगित करते हैं जो डेटा सेट में मौजूद दोहराने वाले मापों के मानक विचलन और ड्यूटेरोस में चयनित उपयोगकर्ता-परिभाषित आत्मविश्वास सीमाओं द्वारा परिभाषित एक महत्वपूर्ण तेज अंतर प्रदर्शित करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 10
चित्रा 10: एचडीएक्स-एमएस डेटा लैंथिपेप्टाइड सिंथेटेस हाल्म 2 में पेप्टाइड बाइंडिंग और एलोस्टेरिक एक्टिवेशन के कार्यात्मक विश्लेषण का मार्गदर्शन करता है। HalM2 लैंथिपेप्टाइड संश्लेषण के लिए HalA2 अग्रदूत पेप्टाइड के बाध्यकारी पर ड्यूटेरियम तेज परिवर्तन की जांच की गई थी। 5 मिनट की विनिमय प्रतिक्रिया के बाद प्रत्येक पेप्टाइड के लिए तेज अंतर(ए)प्लॉट किया जाता है। यह प्लॉट एचडीएक्स-प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर में जेनरेट किया गया था। पेप्टाइड्स रंगीन लाल और नीले रंग के हला 2 पेप्टाइड की उपस्थिति में क्रमशः कम और अधिक ड्यूटेरियम तेज से गुजरते हैं। इन HDX "हॉट स्पॉट" एक HalM2 homology मॉडल(बी, सी)पर मैप कर रहे हैं । महत्वपूर्ण विनिमय मतभेदों के दौर से गुजर पेप्टाइड्स की पहचान ड्यूटेरोस में निर्धारित की गई थी। होमोलॉजी मॉडल पर अंतर मूल्यों को मैप करने के लिए उपयोग की जाने वाली PyMOL स्क्रिप्ट ड्यूटेरोस में उत्पन्न हुई थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत एचडीएक्स-एमएस वर्कफ्लो प्रोटीन में संरचनात्मक रूप से गतिशील तत्वों के स्थानिक वितरण का मानचित्रण करने और यह जांच करने के लिए एक उल्लेखनीय मजबूत मंच प्रदान करता है कि ये गतिशीलता क्षोभ (लिगांड बाध्यकारी, एंजाइम म्यूटेनेसिस आदि) के जवाब में कैसे बदलती है। एचडीएक्स-एमएस अन्य संरचनात्मक जीव विज्ञान दृष्टिकोणों पर कई अलग-अलग फायदे रखता है जिनका उपयोग आमतौर पर अनुरूप गतिशीलता की जांच करने के लिए किया जाता है। सबसे विशेष रूप से, प्रोटीन की केवल कम मात्रा की जरूरत है । यहां वर्णित वर्कफ्लो का उपयोग करके, 1 माइक्रोन प्रोटीन का 1 एमएल नमूना 5 एक्सचेंज टाइम पॉइंट वाले प्रत्येक ट्रिपलीकेट एचडीएक्स प्रतिक्रियाओं के लिए पर्याप्त सामग्री प्रदान करता है। इसके अलावा, ब्याज के प्रोटीन पर लगभग कोई आकार सीमा नहीं है, और प्रोटीन परिसरों एचडीएक्स-एमएस दृष्टिकोण के लिए समान रूप से उत्तरदायी हैं। आकार सीमा केवल उस सीमा से प्रतिबंधित है जिस हद तक पेप्टिक पेप्टाइड्स को क्रोमेग्राफिक रूप से हल किया जा सकता है, और एम/जेड और आयन गतिशीलता आयामों में । इस प्रकार, कई प्रोटीन/प्रोटीन परिसरों के लिए, एचडीएक्स-एमएस प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन इंटरफेस, लिगांड बाध्यकारी साइटों, अनुरूप गतिशीलता और एलोस्टेरिक नेटवर्क के बारे में मूल्यवान जानकारी प्रदान करेगा । अंत में, HDX प्रतिक्रिया प्रोटीन की साइट-विशिष्ट लेबलिंग/इंजीनियरिंग की आवश्यकता के बिना कोमल, निकट-देशी परिस्थितियों में किया जाता है, जो यह सुनिश्चित करने में मदद करनी चाहिए कि अंतर्जात गतिविधि संरक्षित है । दृष्टिकोण की मुख्य सीमा (मशीनी जानकारी के संदर्भ में यह ब्याज के प्रोटीन पर प्रदान करता है) यह है कि पेप्टाइड स्तर HDX डेटा स्वाभाविक रूप से कम स्थानिक संकल्प का है । इस प्रकार, डेटा यह अनुमान लगाने के लिए पर्याप्त है कि माध्यमिक संरचना में परिवर्तन हो रहा है, लेकिन संरचनात्मक क्षोभ के मशीनी प्रभावों के लिए उच्च संकल्प (जैसे, एनएमआर, क्रायोईएम, या एक्स-रे क्रिस्टल) संरचनाओं, गणना अध्ययन, और/या जैव रासायनिक अध्ययनों की पूरी तरह से व्याख्या करने की आवश्यकता होती है ।

परिणामों की प्रजनन क्षमता और विश्वसनीयता सुनिश्चित करने के लिए, प्रोटोकॉल के कई महत्वपूर्ण पहलुओं को ध्यान में रखा जाना चाहिए। सबसे पहले, एचडीएक्स प्रतिक्रिया के दौरान ड्यूटेरियम एक्सचेंज की सीमा और वर्क-अप और विश्लेषण के दौरान बैक एक्सचेंज की सीमा पीएच, समय और तापमान पर दृढ़ता से निर्भर है। इस प्रकार, बफ़र्स, एचडीएक्स प्रतिक्रियाओं और एलसी-एमएस विधियों की तैयारी के लिए प्रक्रियाएं डेटा सेट में इन भौतिक मापदंडों में भिन्नता को कम करने के लिए यथासंभव व्यवस्थित होनी चाहिए। जब भी संभव हो, जैव रासायनिक राज्यों के लिए HDX प्रतिक्रियाओं की तुलना में एक ही दिन एक ही शोधकर्ता द्वारा किया जाना चाहिए, और इन नमूनों के लिए एलसी-एमएस डेटा विलायक के एक ही बैच के साथ लगातार दिनों में एकत्र किया जाना चाहिए । समय के साथ, पेप्सिन पाचन की दक्षता भी कम हो जाएगी, इसलिए यह उन नमूनों के लिए इष्टतम है जिन्हें अपेक्षाकृत संकीर्ण समय खिड़की के भीतर पचाने और विश्लेषण करने की तुलना की जाएगी − खासकर यदि पेप्सिन कॉलम का उपयोग कई अन्य प्रकार के नमूनों को पचाने के लिए किया जा रहा है। एक मानक प्रोटीन का उपयोग करके पेप्सिन कॉलम की पाचन दक्षता की समय-समय पर जांच करना अच्छा अभ्यास है। इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए, एक समर्पित एचडीएक्स-प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर परियोजना स्थापित की जा सकती है जहां नए पचाए गए नमूनों की तुलना पुराने नमूनों से की जा सकती है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि लक्ष्य पेप्टाइड्स के एक ही सेट को समान तीव्रता के साथ पाया जा रहा है।

जबकि इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत कार्यप्रवाह कई एंजाइम/प्रोटीन प्रणालियों के लिए पर्याप्त डेटा प्रदान करना चाहिए, अनुकूलन के कई संभावित बिंदु हैं । सबसे पहले, एचडीएक्स प्रतिक्रिया के समय पैमाने को गतिशीलता को कैप्चर करने के लिए संशोधित किया जा सकता है जो तेजी से/धीमी हैं । सबसे विशेष रूप से, कई एंजाइमों में अत्यधिक गतिशील तत्व होंगे जो कई सेकंड के भीतर पूरी तरह से आदान-प्रदान हो जाते हैं। यदि ये अत्यंत गतिशील तत्व रुचि के हैं, तो पूर्व-स्थिर स्थिति के तरीके, साहित्य31में निरंतर विनिमय एचडीएक्स-एमएस की सूचना दी गई है। दूसरा, एलसी विधि की स्थिति को पाचन दक्षता (जो अंततः अनुक्रम कवरेज निर्धारित करता है) और ड्यूटेरियम प्रतिधारण (जो अंततः विधि की संवेदनशीलता निर्धारित करता है) को बदलने के लिए आसानी से बदला जा सकता है। पेप्सिन पाचन की अवधि और तापमान को ध्यान में रखते हुए, धीमी प्रवाह दर और उच्च तापमान प्रोटीन के अधिक गहन पाचन के पक्ष में होगा। अगर सिग्नल की तीव्रता बहुत कम है, या अगर पेप्सिन पाचन बहुत अक्षम है तो एचडीएक्स परख में प्रोटीन एकाग्रता को भी बढ़ाया जा सकता है । विश्लेषणात्मक C18 कॉलम पर पेप्टिक पेप्टाइड्स को अलग करने के लिए उपयोग किए जाने वाले एसीटोनिट्रिल ग्रेडिएंट को ध्यान में रखते हुए, एक तेज ढाल ड्यूटेरियम लेबल को संरक्षित करेगा, लेकिन पचाए गए प्रतिक्रिया मिश्रण में मौजूद पेप्टिक पेप्टाइड्स के क्रोमेग्राफिक संकल्प की कीमत पर। छोटे प्रोटीन (~ 200 अमीनो एसिड) के लिए जहां डाइजेस्ट में कम पेप्टिक पेप्टाइड्स मौजूद होते हैं, एक तेज एलसी ढाल को लागू करना आसान हो सकता है। HalM2 (~ 1,000 अमीनो एसिड) जैसे बड़े प्रोटीन के लिए, मिश्रण में पेप्टाइड्स की बड़ी संख्या से उत्पन्न अतिरिक्त स्पेक्ट्रल जटिलता को हल करने के लिए एक लंबे ढाल की आवश्यकता होती है। इस बाद के परिदृश्य में, गैस चरण आयन गतिशीलता अलगाव को शामिल करने से विश्लेषण की चरम क्षमता में नाटकीय रूप से सुधार करने में मदद मिल सकती है। आयन गतिशीलता जुदाई के शामिल किए जाने शोर अनुपात के लिए एक थोड़ा कम संकेत की लागत पर आता है । अंत में, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि एचडीएक्स नमूनों के लिए एमएस डेटा को एमएसई मोड में एकत्र करने की आवश्यकता नहीं है। एमएसई ड्यूटी चक्र (यानी, उच्च टकराव ऊर्जा खंड, चरण 3.3.7.2) के एमएसएमएस भाग केवल पेप्टाइड सूची (प्रोटोकॉल धारा 4) को परिभाषित करने के लिए संदर्भ नमूनों के लिए आवश्यक है। इस प्रकार, सिग्नल: शोर अनुपात को बढ़ाने के लिए एमएस-केवल मोड में एचडीएक्स नमूनों का विश्लेषण किया जाना चाहिए।

यदि इस प्रोटोकॉल में वर्णित कार्यप्रवाह ठीक से काम कर रहा है, तो पूरी तरह से विनिमय पेप्टाइड्स को 60%−70% के सापेक्ष ड्यूटेरियम तेज मूल्य का प्रदर्शन करना चाहिए। यदि ड्यूटेरियम तेज इस से काफी कम पाया जाता है (एक विलायक उजागर, असुरक्षित पेप्टाइड के लिए), सबसे अधिक संभावना विवरण यह है कि नमूने के पीएच workup के कुछ हिस्से के दौरान बदल रहा है/ इस परिदृश्य में, एचडीएक्स परख के पीएच और शमन प्रतिक्रिया एलिकोट की सावधानीपूर्वक निगरानी करने के लिए एक माइक्रोटिप इलेक्ट्रोड का उपयोग किया जाना चाहिए। एलसी-एमएस सॉल्वैंट्स के पीएच की भी जांच होनी चाहिए। इस समस्या की घटना को कम करने के लिए, परख के लिए आवश्यक सभी बफ़र्स और अभिकर् ती के केंद्रित स्टॉक समाधानों को तैयार करने और स्टोर करने की दृढ़ता से सिफारिश की जाती है (जैसा कि प्रोटोकॉल धारा 1 में उल्लिखित है)।

हाल के वर्षों में, एचडीएक्स-एमएस प्रोटीन संरचनात्मक गतिशीलता की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली विश्लेषणात्मक उपकरण के रूप में उभरा है। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एलसी-एमएस प्रणालियों के विकास ने एचडीएक्स प्रयोगों के लिए डिजाइन और अनुकूलित (जैसे कि इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली प्रणाली और सामग्री में सूचीबद्ध) शक्तिशाली सॉफ्टवेयर पैकेजों के साथ मिलकर, एचडीएक्स-एमएस दृष्टिकोण को कई अकादमिक और औद्योगिक प्रयोगशालाओं में बढ़ाया है, और 15 साल पहले एक आला तकनीक को अधिक उपयोगकर्ता के अनुकूल विश्लेषणात्मक मंच में बदल दिया है। स्थानिक संकल्प में सीमाओं के बावजूद, एचडीएक्स-एमएस प्रोटीन गति पर अत्यधिक मात्रात्मक और प्रजनन योग्य माप प्रदान करता है और आदर्श रूप से अनुरूप गतिशील एंजाइमों का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है जो अन्य दृष्टिकोणों के साथ जांच करना मुश्किल है। इन विशेषताओं के कारण, एचडीएक्स-एमएस अव्यवस्थित और गतिशील प्रोटीन प्रणालियों के संरचनात्मक जीव विज्ञान में एक आवश्यक जगह भरता है जिसकी जीव विज्ञान और चिकित्सा के कई मौलिक क्षेत्रों में प्रासंगिकता होती है। इस प्रकार, एचडीएक्स-एमएस विश्लेषण निकट भविष्य के लिए संरचनात्मक जीवविज्ञानी के शस्त्रागार में एक महत्वपूर्ण उपकरण बने रहने की उम्मीद है।

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Disclosures

हमारे पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को कनाडा की नेचुरल साइंसेज एंड इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसिल, फॉर्स डी रेचेचे डु क्यूबेक नेचर एट टेक्नोलोजी, कैनेडियन फाउंडेशन फॉर इनोवेशन और मैकगिल यूनिवर्सिटी स्टार्ट-अप फंड्स ने सपोर्ट किया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
[glu-1]-fibrinopeptide B (Glu-Fib) BioBasic NA
0.5 mL Amicon Ultracel 10k centrifugal filtration device (Millipore) Milipore Sigma UFC501096
acetonitrile Fisher A955-1
AMP-PNP SIGMA A2647-25MG
ATP SIGMA a2383-5G
D2O ALDRICH 435767-100G
formic acid Thermo Fisher 28905
guanidine-HCl VWR 97063-764
HEPES Fisher BP310-1
Magnesium chloride SiGMA-Aldrich 63068-250G
Potassium chloride BioBasic PB0440
potassium phosphate BioBasic PB0445
TCEP Hydrochloride TRC Canada T012500 peptide was synthesized upon request
Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
software
Deuteros Andy M C Lau, et al version 1.08
DynamX Waters version 3.0
MassLynx Waters version 4.1
Protein Lynx
Global Server (PLGS)		 Waters version 3.0.3
PyMOL Schrödinger version 2.2.2
Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Instrument and equipment
ACQUITY UPLC BEH C18 analytical Column Waters 186002346
ACQUITY UPLC BEH C8 VanGuard Pre-column Waters 186003978
ACQUITY UPLC M-Class HDX System Waters
HDX Manager Waters
microtip pH electrode Thermo Fisher 13-620-291
Waters Enzymate BEH column or Pepsin solumn Waters 186007233
Waters Synapt G2-Si Waters

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References

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बायोकेमिस्ट्री अंक 159 हाइड्रोजन-ड्यूटेरियम एक्सचेंज मास स्पेक्ट्रोमेट्री बायोकेमिस्ट्री एंजिमोलॉजी बायोसिंथेसिस प्राकृतिक उत्पाद पेप्टाइड्स
पेप्टाइड बायोसिंथेटिक एंजाइमों की जांच के लिए एक हाइड्रोजन-ड्यूटेरियम एक्सचेंज मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एचडीएक्स-एमएस) मंच
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Habibi, Y., Thibodeaux, C. J. A… More

Habibi, Y., Thibodeaux, C. J. A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes. J. Vis. Exp. (159), e61053, doi:10.3791/61053 (2020).

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