Summary
هنا هو بروتوكول يصف رصد دورة الحياة الكاملة للبكتيريا المفترسة Bdellovibrio bacteriovorus باستخدام المجهر الفلوري الفاصل الزمني في تركيبة مع وسادة agarose وأطباق التصوير الخلوي.
Abstract
Bdellovibrio bacteriovorus هي بكتيريا صغيرة سالبة الغرام ، ملزمة المفترسة التي تقتل البكتيريا الأخرى سلبية الغرام ، بما في ذلك مسببات الأمراض الضارة. ولذلك، فإنه يعتبر مضاد حيوي حي. لتطبيق B. bacteriovorus كمضاد حيوي حي ، من الضروري أولاً فهم المراحل الرئيسية لدورة حياتها المعقدة ، ولا سيما انتشارها داخل الفريسة. وحتى الآن، كان من الصعب رصد المراحل المتعاقبة من دورة الحياة المفترسة في الوقت الحقيقي. هنا هو بروتوكول شامل للتصوير في الوقت الحقيقي من دورة حياة كاملة من bacteriovorus B.، وخصوصا خلال نموها داخل المضيف. لهذا الغرض، يتم استخدام نظام يتكون من وسادة agarose في تركيبة مع أطباق التصوير الخلوي، والتي يمكن للخلايا المفترسة التحرك بحرية تحت لوحة agarose بينما خلايا فريسة مشلّمة قادرة على تشكيل bdelloplasts. تطبيق سلالة إنتاج الفلورسنت الموسومة β-الوحدة الفرعية من الحمض النووي بوليميراز الثالث يسمح كذلك تكرار كروموسوم ليتم رصدها خلال مرحلة التكاثر من دورة حياة B. bacteriovorus.
Introduction
Bdellovibrio bacteriovorus هي بكتيريا صغيرة (0.3-0.5 ميكرومتر من 0.5-1.4 ميكرومتر) بكتيريا سلبية الغرام التي تفترس البكتيريا الأخرى السالبة للجرام ، بما في ذلك مسببات الأمراض الضارة مثل Klebsiella pneumoniae ، Pseudomonas aeruginosa ، وSingella flexneri1،2،3. وبما أن ب. البكتيريا تقتل مسببات الأمراض، فإنه يعتبر مضاد حيوي حي محتمل يمكن تطبيقه لمكافحة العدوى البكتيرية، وخاصة تلك الناجمة عن سلالات مقاومة للأدوية المتعددة.
B. bacteriovorus يعرض دورة حياة غريبة تتكون من مرحلتين: مرحلة الهجوم غير تكراري العيش الحر ومرحلة الإنجاب داخل الخلايا(الشكل 1). في مرحلة العيش الحر ، تبحث هذه البكتيريا المتحركة العالية ، التي تتحرك بسرعة تصل إلى 160 ميكرومترًا في الثانية ، عن فريستها. بعد ربطها بالغشاء الخارجي للفريسة ، تدخل periplasm4،5. خلال مرحلة الإنجاب بين الحولية، يستخدم B. bacteriovorus مجموعة كبيرة من الإنزيمات الهيدرولوجية لإنزيمات الجزيئات الكبيرة للمضيف وإعادة استخدامها لنموها الخاص. بعد وقت قصير من غزو periplasm ، تموت الخلية المضيفة وتنتفخ في بنية كروية تسمى bdelloplast ، داخلها تتكاثر الخلية المفترسة وتستنسخ كروموسوماتها. تبدأ عملية النسخ المتماثل في أصل النسخ المتماثل (oriC)6 و تستمر حتى يتم تصنيع عدة نسخ من الكروموسوم بشكل كامل7. ومن المثير للاهتمام، لا يتبع تكرار كل كروموسوم من قبل انقسام الخلايا. بدلا من ذلك، يطول المفترس لتشكيل خلية طويلة ومتعددة النوى والخيوط. عند استنفاد المغذيات ، يخضع الخيط لزنزانة متزامنة ويتم تحرير الخلايا النسلية من bdelloplast8.
قبل أن يمكن استخدام البكتيريا البكتيرية كمضادات حيوية حية ضد العدوى البكتيرية ، من المهم فهم المراحل الرئيسية لدورة حياتها ، لا سيما تلك المتعلقة بانتشارها داخل الفريسة. وقد تم تصوير الخلايا الحية من B. bacteriovorus تحديا، وذلك بسبب الأشكال المورفولوجية المختلفة للمفترس وفريسته خلال دورة الحياة المعقدة. حتى الآن، تمت دراسة التفاعلات بين B. bacteriovorus وخليتها المضيفة بشكل رئيسي عن طريق المجهر الإلكتروني وتحليل snap-shot2،9،10، وكلاهما له قيود ، خاصة عندما يتم استخدامها لرصد المراحل المتعاقبة من دورة الحياة المفترسة. توفر هذه الطرق صورًا عالية الدقة لخلايا البكتيريا B. وتمكن من مراقبة مفترس صغير أثناء مرحلة الهجوم أو النمو. ومع ذلك، فإنها لا تسمح لتتبع واحد B. bacteriovorus الخلايا خلال كل من مراحل دورة الحياة.
هنا هو بروتوكول شامل لاستخدام الوقت الفاصل المجهر fluorescence (TLFM) لرصد دورة الحياة الكاملة من B. bacteriovorus. ويستخدم نظام يتكون من وسادة agarose في تركيبة مع طبق التصوير الخلوي، والتي يمكن أن تتحرك الخلايا المفترسة بحرية تحت لوحة agarose بينما خلايا فريسة شلت قادرة على تشكيل bdelloplasts (الشكل 2). يتم إعداد هذا الإعداد على أساس سلالات محددة من كل من الإشريكية القولونية وB. bacteriovorus، ولكن يمكن تغيير البروتوكول بسهولة لتناسب سلالات المستخدم الفردية (على سبيل المثال ، تحمل علامات اختيار مختلفة ، والبروتينات التي تنصهر مع الفلوروفورس المختلفة ، وما إلى ذلك).
في هذه الحالة، لتصور B. bacteriovorus خلال مرحلة الهجوم، سلالة محددة (HD100 DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry) التي تعبر عن نسخة الفلورسنت الموسومة من البروتين السيتوبلازمي، بيلز (المتاحة في مختبرنا عند الطلب)7. وتنتج هذه السلالة بالإضافة إلى ذلك DnaN (المشبك β الانزلاق)، وهي وحدة فرعية من الحمض النووي البوليمر الثالث هولوينزيم، تنصهر مع بروتين الفلورسنت. وهذا يتيح إمكانية رصد تكرار الحمض النووي المستمر داخل الخلايا المفترسة أثناء نموها داخل البلاستات.
على الرغم من أن البروتوكول والبرامج المذكورة المستخدمة للحصول على الصور تشير إلى مجهر مقلوب المقدمة من قبل شركة تصنيع محددة (انظر جدول المواد)، يمكن تعديل هذه التقنية لأي مجهر مقلوب مجهز بغرفة بيئية أو حامل تدفئة خارجي آخر وقادر على التصوير الفاصل الزمني. لتحليل البيانات، يمكن للمستخدمين اختيار أي برنامج متاح متوافق مع تنسيقات الإخراج الفردية.
الشكل 1: دورة حياة ب. bacteriovorus في الإشريكية القولونية كخلية مضيفة. خلال مرحلة الهجوم، خلية سباحة حرة B. bacteriovorus تبحث عن وتعلق على خلية الإشريكية القولونية المضيف. بعد الغزو، تصبح الخلية المفترسة موضعية في periplasm الفريسة، وتغيير شكل الخلية المضيفة وتشكيل bdelloplast. تبدأ المرحلة الإنجابية بتكوين البلاست. الخلية المفترسة يهضم الخلية الفريسة ويعيد استخدام المركبات البسيطة لبناء هياكلها الخاصة. B. bacteriovorus ينمو كما خيوط واحدة طويلة داخل periplasm المضيف. عندما تستنفد موارد الخلية الفريسة ، فإن خيوط B. bacteriovorus تتزامن وتشكل الخلايا النسل. بعد الخلايا ذرية تطوير flagella بهم، أنها lyse bdelloplast. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد B. bacteriovorus lysate للتحليل المجهري
- في قارورة 250 مل، إعداد تربية الأحياء من خلال الجمع بين 1 مل من 24 ح الطازجة البكتيريا ثقافة (على سبيل المثال، HD100 DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry) و 3 مل من ثقافة فريسة بين عشية وضحاها (على سبيل المثال، E. القولونية S17-1 pZMR100) مع 50 مل من Ca-HEPES العازلة (25 مل هبس، 2 mM CaCl2 [pH = 7.6]) تكملها المضادات الحيوية عند الحاجة (هنا، 50 ميكروغرام / مل kanamycin).
- احتضان تربية 24 ساعة في 30 درجة مئوية مع اهتزاز في 200 دورة في الدقيقة.
- تحقق من أن خلايا الفريسة يتم lysed تماما من قبل السائل محمولة على المجهر على النقيض من المرحلة. عند هذه النقطة، ينبغي أن تكون العديد من الهجوم على الضخامة المرحلة B. bacteriovorus الخلايا موجودة، وينبغي أن تكون مرئية أي خلية القولونية أو bdelloplast.
- تصفية ثقافة B. bacteriovorus من خلال مرشح حجم المسام 0.45 ميكرومتر لإزالة أي خلايا المضيف المتبقية. تخترق الخلايا المفترسة (0.3-0.5 ميكرومتر × 0.5-1.4 ميكرومتر) بحرية 0.45 ميكرومتر المسام، في حين يتم الاحتفاظ بالخلايا المضيفة على سطح المرشح.
- تدور أسفل الترشيح لمدة 20 دقيقة في 2469 × ز و 30 درجة مئوية في أنبوب مخروطي 50 مل لجمع الخلايا المفترسة. Resuspend بيليه B. bacteriovorus في 3 مل من Ca-HEPES العازلة (إلى ODالنهائي 600 من حوالي 0.2) واحتضان في 30 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة.
2. إعداد الخلايا المضيفة لغزو B. bacteriovorus
- استخدام مستعمرة واحدة من سلالة المضيف(E. القولونية S17-1 pZMR100 ينصح بسبب أحجام الخلايا المختلفة مما أدى إلى تشكيل bdelloplasts غير متساو الحجم) لتطعيم 10 مل من YT المتوسطة (0.8٪ Bacto tryptone، 0.5٪ استخراج الخميرة، 0.5٪ NaCl [pH = 7.5]) التي تم استكمالها بالمضادات الحيوية، إذا لزم الأمر (هنا، 50 ميكروغرام / مل kanamycin). الخلايا الثقافية بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية و 180 دورة في الدقيقة.
- نقل 2 مل من ثقافة الإشريكية القولونية بين عشية وضحاها (OD600 من ~3.0) إلى أنبوب اختبار 2 مل والطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة (RT) و 2469 × ز لمدة 5 دقائق. Resuspend بيليه في 200 μL من Ca-HEPES العازلة.
3. إعداد المجهر (انظر جدول المواد)
- قبل تدفئة غرفة مجهرية مع هدف غمر الزيت 100x إلى 30 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل قبل الاستخدام. هذه الخطوة مطلوبة لمنع الأخطاء في الحفاظ على التركيز أثناء التجربة.
- قم بتشغيل كل من المجهر والميكون الآلي. تهيئة برامج التحكم واختيار المرشحات المناسبة للحصول على الصور brightfield / DIC / الطور التباين وفلوريسنس ، حسب الحاجة (هنا : BF الصور ، GFP / mCherry مرشح polychromic ، والانبعاث / الإثارة ل mCherry وGFP).
4. تجميع تخطيطات للمجهر الفلورية الفاصلة بين الوقت
- مزيج 200 ملغ من الفلورسنت منخفضة الفلورسنت الاجروز الجزيئية مع 20 مل من Ca-HEPES العازلة (1٪ تركيز agarose النهائي) وحل agarose في الميكروويف. يمكن إعادة استخدام الدفعة عدة مرات بعد أن يقوي، لذلك ببساطة كرر خطوة التدفئة.
- صب 3 مل من agarose ذاب في طبق 35 مم الزجاج القاع (جدول المواد). السماح لأغاروز لترسيخ.
- باستخدام ملعقة صغيرة مختبرية، قم بإزالة لوحة agarose بعناية من طبق 35 مم دون إزعاج القطب المركزي للوحة agarose. الوجه لوحة الجانب السفلي التي تواجه لأعلى ووضعها في غطاء طبق بيتري(الشكل 2).
- وضع 5 ميكرولتر من تعليق الإشريكية القولونية المركزة على رأس لوحة منقلبة والخلايا انتشار في القطب المركزي باستخدام حلقة تلقيح. إضافة 5 ميكرولتر من نظام التعليق B. bacteriovorus المركز (OD600 من ~0.2) على سطح E. القولونيةالمغلفة. لا تنشر الخلايا.
- سرعان ما يعود جل agarose إلى طبق القاع الزجاجي 35 مم (الجانب العلوي المواجه لأسفل) ، ثم غطيه بغطاء. إذا لزم الأمر، إزالة أي فقاعات الهواء عن طريق الضغط بلطف أسفل أجار ضد لوحة.
الشكل 2: تصوير تخطيطي لسير العمل التجريبي. تتم إزالة لوحة agarose من الطبق 35 مم وانقلبت بحيث يواجه الجانب السفلي صعودا. يتم وضع تعليق جديد للخلايا المفترسة وثقافة بين عشية وضحاها من الخلايا الفريسة على لوحة انقلبت لمعطف الجانب "أسفل". ثم يتم قلب لوحة agarose إلى اتجاهها الأصلي ووضعها مرة أخرى في طبق 35 ملم ، والتي يتم تركيبها على مرحلة المجهر المقلوب في غرفة المجهر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
5. إجراء المجهر الفلورية الفاصلة بين الوقت
- ضع الطبق 35 مم في حامل طبق بيتري بحيث لن يتحرك أثناء التجربة. ضع قطرة واحدة من زيت الغمر (1.518 مؤشر انكسار) على الهدف وكذلك الجزء السفلي من طبق 35 ملم.
- جبل حامل على خشبة المسرح من المجهر المقلوب في غرفة المجهر.
- قم بإعداد الخيارات في برنامج التحكم بالمجهر لجمع صور متعددة في مواقع متعددة المراحل بمرور الوقت.
- تعيين التكبير (100x) وعدسة البوليكروميك (GFP / mCherry). باستخدام قطعة العين و brightfield (BF) ، والعثور على الطائرة البؤرية وفتح مدير قائمة نقطة.
- حدد 10 مواقع على الأقل ذات أهمية عن طريق تحريك المرحلة وتخزين الإحداثيات لكل موضع في برنامج المجهر بالنقر على زر علامة نقطة. تجنب المواقف الموجودة بالقرب من بعضها البعض لمنع الضوبلاخات وضوئية. قم بتشغيل صمام الكاميرا من العدسة إلى الشاشة ومعايرة كل نقطة عن طريق ضبط المستوى البؤري والنقر على زر استبدال النقطة في مدير قائمة النقاط.
- افتح مصمم التجربة واضبط كل المعلمات التجريبية في كل علامة تبويب على النحو التالي:
- إلغاء تحديد مربع ترصّد Z.
- اختر قنوات الفلورسنت واضبط إعدادات الإضاءة المثالية. هنا، تم استخدام الإعدادات التالية: لقناة mCherry، مجموعات مرشح mCherry (EX575/25؛ و 25/1000). EM625/45)، 50٪ كثافة، و 200 مللي وقت التعرض؛ بالنسبة لقناة GFP، مجموعة عوامل التصفية GFP (EX475/28؛ EM525/48)، 50٪ كثافة، و 80 مللي ثانية؛ وبالنسبة للصور BF، قناة POL، 5٪ كثافة، و 50 مللي ثانية.
- حدد الفواصل الزمنية بين الحصول على الصور والوقت الإجمالي للتجربة. هنا، تم تنفيذ فترات 5 دقائق على مدى فترة 10 ساعة من التجربة.
- تمكين صيانة التركيز البؤري للمواقع المختارة (للنظام المستخدم هنا، عن طريق وضع علامة على خانة الاختيار الاحتفاظ بالتركيز مع UltimateFocus).
- حدد مجلد البيانات الذي يجب حفظ ملفات الصور فيه تلقائيًا.
- إعادة فحص كافة الإعدادات في التحكم في برنامج المجهر، ثم بدء تجربة الفاصل الزمني.
- بعد الساعة الأولى من التجربة، تحقق من أن جميع مواضع المرحلة لا تزال في التركيز. ضبط التركيز خلال الفواصل الزمنية بين الحصول على الصورة، إذا لزم الأمر.
- عند الانتهاء من تجربة الفاصل الزمني، قم بإزالة طبق بيتري واستخدم طبق 35 مم مع لوحة agarose وفقًا لبروتوكول السلامة البيولوجية.
ملاحظة: كافة substeps بعد الخطوة 5.2 محددة للمستخدمين Elite DeltaVision. يحتاج الباحثون الذين يستخدمون أنظمة أخرى إلى ضبط الإعدادات وفقًا للأنظمة الفردية.
6- تجهيز الصور التي تُستعمل في فترة زمنية، وتوليد الأفلام باستخدام برامجيات فيجي
- نقل البيانات التجريبية إلى حاسوب محمل ببرنامج فيجي. إطلاق برنامج فيجي وفتح صورة باستخدام ملف | افتح ملف الصورة أو ببساطة عن طريق سحبه وإفلاته إلى فيجي.
- في خيارات استيراد تنسيقات حيوية، اختر عرض المكدس مع Hyperstack في خيارات عرض التكديس، انقر فوق وضع اللون المركب في خيارات الألوان، ووضع علامة على المقياس التلقائي.
- عن طريق التمرير من خلال أكوام الصورة، وتقييم ما إذا كانت الخلايا وbdelloplasts ظلت في التركيز على مدى التجربة. تحقق مما إذا كانت البقع الفلورية الخضراء من DnaN-mNeonGreen موجودة داخل خلايا B. bacteriovorus داخل bdelloplasts طوال مرحلة النمو ، وتأكد من أن جميع مراحل دورة الحياة المفترسة يمكن تصورها.
- لتحليل خلية B. bacteriovorus /bdelloplast، ضع علامة عليها باستخدام أدوات التحديد في قائمة فيجي(مستطيلأو بيضاويأو مضلع أو حر). تكرار المنطقة المختارة باستخدام صورة | تكرار أو باستخدام Ctrl + Shift + D.
- ضبط السطوع والتباين لكل قناة من قنوات الفلوريسانس كما يلي:
- لاختيار قناة واحدة، افتح أدوات القناة بالنقر على صورة | لون | أدوات القنوات أو Ctrl + Shift + Z ، وحدد قناة الاهتمام (القناة 1: mCherry ، القناة 2: mNeonGreen ، القناة 3: brightfield).
- ضبط سطوع وتباين الصور في قناة الفلوريسنس من خلال فتح القائمة B&C في صورة | ضبط | السطوع / التباين أو عن طريق النقر على Ctrl + Shift + C.
- إضافة شريط مقياس باستخدام تحليل | أدوات | شريط المقاييس. إضافة ختم الوقت إلى الصور عن طريق النقر على الصور | مداخن | الوقت ستامبر.
- لحفظ الصور المعدلة، انتقل إلى ملف | حفظ باسم واختيار TIFF لحفظ كتسلسل صورة، AVI لإنتاج فيلم، أو بابوا نيو غينيا لحفظ صورة واحدة من الإطار الحالي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نظام TLFM الموصوفة يسمح بتعقب الخلايا الفردية من B. bacteriovorus في الوقت المناسب (الشكل 3, فيلم 1) ويوفر معلومات قيمة حول كل مرحلة من مراحل دورة الحياة المفترسة المعقدة. الانصهار PilZ-mCherry تمكن الخلية المفترسة بأكملها أن تكون وصفت في مرحلة الهجوم وكذلك في مرحلة مبكرة من مرحلة النمو (الشكل 3). تم تصور الانتقال من مرحلة الهجوم إلى مرحلة النسخ المتماثل ليس فقط من قبل تشكيل bdelloplast المضيف ولكن أيضا من خلال ظهور replisome (آلات النسخ المتماثل) ، والتي تميزت DnaN - mNeonGreen الفلورسنت foci (الشكل 3).
كما أظهرت سابقا، تم تجميعها replisome في القطب الخلية الغازية (بيلي القطب)7، وأكثر من واحد لوحظ replisome داخل خيط B. bacteriovorus المتنامية كما تقدم مرحلة التكاثر (الشكل 3). بعد أن تم تصنيع عدة نسخ من الكروموسوم، تم إنهاء النسخ المتماثل (تصور كاختفاء dnaN-mNeonGreen بؤر). وأخيراً، خضعت خيوط الخيوط المتعددة النيات للرابط، وتم تحرير الخلايا الذرية من البلاست (الشكل 3).
ويقدم البروتوكول المقدم الذي يصف معالجة الصور باستخدام برنامج فيجي شرحاً خطوة بخطوة لكيفية إنتاج فيلم للنشر من سلسلة الفاصل الزمني المكتسبة (فيلم 1).
الشكل 3: دورة حياة ب. bacteriovorus متبوعة بالمجهر الوميروس الوميروس. (أ)الحر- الحياة المفترسة(B. bacteriovorus DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry) ومضيف(الإشريكية القولونية)الخلايا. (ب) مرفق ب. bacteriovorus إلى الإشريكية القولونية. (C) تشكيل Bdelloplast. (D, E) النمو الخيطي وتكرار الكروموسوم. (F) إنهاء النسخ المتماثل الكروموسوم. (G) بدء خيط متزامن. (H) Bdelloplast تحلل والإفراج عن الخلايا الذرية. تظهر اللوحات العلوية صور brightfield، واللوحات السفلية تمثل قنوات الحقول الساطعة وفلورانس المدمجة. شريط مقياس = 1 μm، الوقت = hh:min. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
فيلم 1: التصوير الفاصل الزمني لدورة حياة B. bacteriovorus في E. coli كخلية مضيفة. دون الخلية توطين من DnaN-mNeonGreen (الأخضر) في سلالة HD100 DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry. تشير القناة الحمراء إلى وضع علامات على الخلايا المفترسة باستخدام PilZ-mCherry السيتوبلازمي. رمادي يشير إلى حقل مشرق. تم جمع الصور كل 5 دقائق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بسبب زيادة الاهتمام باستخدام B. bacteriovorus كمضاد حيوي حي ، هناك حاجة إلى أدوات جديدة لمراقبة دورة الحياة المفترسة ، ولا سيما التفاعلات بين الحيوانات المفترسة والمسببات. يتم استخدام البروتوكول المقدم لتتبع دورة حياة B. bacteriovorus بأكملها ، خاصة أثناء نموها داخل المضيف ، في الوقت الفعلي. وعلاوة على ذلك، فإن تطبيق سلالة إنتاج الفلورسنت الموسومة بيتا المشبك من الحمض النووي البوليميراز الثالث هولوينزيم تمكين رصد تطور النسخ المتماثل كروموسوم في جميع أنحاء مرحلة التكاثر من B. bacteriovorus.
خطوة حاسمة في هذا الأسلوب هو إعداد صحيح من تخطيطات في طبق 35 ملم. وهناك تحد في مراقبة دورة حياة B. bacteriovorus تحت المجهر هو وضع الظروف التي تدعم النمو المفترس (التي تنطوي على الخلايا البكتيرية الأخرى سلبية الغرام كخلايا مضيفة) وتوفير لحركية الخلايا المفترسة. أحد الجوانب الحاسمة في الملاحظات المجهرية الفعالة هو الحاجة إلى توزيع منتظم للفريسة على وسادة agarose ، والذي يتحقق عن طريق نشر الخلايا مع حلقة تلقيح. لا يمكن أن تكون كثافة الخلية المضيفة عالية جداً، ويجب أن تحتوي نقاط الملاحظة المختارة على عدد كافٍ من خلايا المضيف المنفصلة. وفي الوقت نفسه، يجب أن تكون خلايا Bdellovibrio motile بما فيه الكفاية للبحث بنشاط عن فريستها. وهكذا، لا ينبغي أن تنتشر أو الهواء المجففة قبل أن يتم قلب لوحة مرة أخرى ووضعها في الطبق. في بعض الأحيان هناك حاجة إلى كميات أكبر من تعليق المفترس لتوفير حركة كافية في طبقة رقيقة من السوائل بين agarose وسطح الزجاج.
ويستخدم μ-طبق هنا; ومع ذلك، هذا غير الضرورية للبروتوكول. ويمكن استخدام أي طبق الزجاج القاع. ميزة من μ-Dish هو الارتفاع الأمثل وحجم مسار agarose، الذي يتيح لزراعة الحيوانات المفترسة والمضيف أن توضع على الجانب السفلي من لوحة agarose. من المهم أيضا استخدام الخلايا البكتيريا B. جديدة في التجارب، كما تفقد الخلايا حركتها أثناء التخزين لفترات طويلة. ومن القيود التي يفرضها هذا البروتوكول أنه في مجال الرؤية الواحد، يمكن للمستخدمين حساب ما يقرب من 100 خلية مفترس و100 خلية مضيفة، ولكن يمكن تقدير وزارة الداخلية بنسبة 50% إلى 60%.
تعتمد المعرفة الحالية حول دورة الخلية Bdellovibrio إلى حد كبير على الدراسات التي استخدمت E. coli أو P. aeruginosa. هذا النظام يسمح رصد ب. bacteriovorus تفترس مجموعة متنوعة من مسببات الأمراض البكتيرية، بما في ذلك السالمونيلا spp.، S. flexneri، بروتيوس mirabilis، أو K. الالتهاب الرئوي. وعلاوة على ذلك، قد تكون هذه المنصة مفيدة في التجارب التي تشمل مسببات الأمراض المقاومة للأدوية المتعددة. وهكذا، قد يساعد على تسهيل التحسينات في الهندسة الوراثية للبكتيريا B. bacteriovorus كمضاد حيوي حي في الطب البشري والطب البيطري، وخاصة لمكافحة مسببات الأمراض المقاومة للأدوية المتعددة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذه الدراسة من قبل المركز الوطني للعلوم منحة أوبوس 2018/29/B/NZ6/00539 إلى J.Z.C.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | MPW MED. INSTRUMENTS | MPW-260R | Rotor ref. 12183 |
| CertifiedMolecular Biology Agarose | BIO-RAD | 161-3100 | low fluorescence agarose for agarose pad |
| Fiji | ImageJ | https://imagej.net/Fiji | Open source image processing package |
| Glass Bottom Dish 35 mm | ibidi | 81218-200 | uncoated glass |
| Microscope | GE | DeltaVision Elite | Microtiter Stage, ultimate focus laser module, DV Elite CoolSnap HQ2 Camera, SSI assembly FP DV, kit obj. Oly 100x oil 1.4 NA, prism Nomarski 100x LWD DIC, ENV ctrl IX71 uTiter opaQ 240 V |
| Minisart Filter 0.45 µm | Sartorius | 16555----------K | Cellulose Acetate, Sterile, Luer Lock Outlet |
| Start SoftWoRx | GE | Manufacturer-supplied imaging software |
References
- Shatzkes, K., et al. Predatory Bacteria Attenuate Klebsiella pneumoniae Burden in Rat Lungs. mBio. 7 (6), (2016).
- Iebba, V., et al. Bdellovibrio bacteriovorus directly attacks Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus Cystic fibrosis isolates. Frontiers in Microbiology. 5, (2014).
- Willis, A. R., et al. Injections of Predatory Bacteria Work Alongside Host Immune Cells to Treat Shigella Infection in Zebrafish Larvae. Current biology: CB. 26 (24), 3343-3351 (2016).
- Lambert, C., et al. Characterizing the flagellar filament and the role of motility in bacterial prey-penetration by Bdellovibrio bacteriovorus. Molecular Microbiology. 60 (2), 274-286 (2006).
- Lambert, C., et al. A Predatory Patchwork: Membrane and Surface Structures of Bdellovibrio bacteriovorus. Advances in Microbial Physiology. 54, 313-361 (2008).
- Makowski, Ł, et al. Initiation of Chromosomal Replication in Predatory Bacterium Bdellovibrio bacteriovorus. Frontiers in Microbiology. 7, 1898 (2016).
- Makowski, Ł, et al. Dynamics of Chromosome Replication and Its Relationship to Predatory Attack Lifestyles in Bdellovibrio bacteriovorus. Applied and Environmental Microbiology. 85 (14), (2019).
- Fenton, A. K., Kanna, M., Woods, R. D., Aizawa, S. I., Sockett, R. E. Shadowing the actions of a predator: backlit fluorescent microscopy reveals synchronous nonbinary septation of predatory Bdellovibrio inside prey and exit through discrete bdelloplast pores. Journal of Bacteriology. 192 (24), 6329-6335 (2010).
- Kuru, E., et al. Fluorescent D-amino-acids reveal bi-cellular cell wall modifications important for Bdellovibrio bacteriovorus predation. Nature Microbiology. 2 (12), 1648-1657 (2017).
- Dashiff, A., Junka, R. A., Libera, M., Kadouri, D. E. Predation of human pathogens by the predatory bacteria Micavibrio aeruginosavorus and Bdellovibrio bacteriovorus. Journal of Applied Microbiology. 110 (2), 431-444 (2011).
