Summary
Se ha notificado un método para la entrega de células madre neurales, adaptable para inyectar soluciones o suspensiones, a través de la arteria carótida común (ratón) o la arteria carótida externa (rata) después de un accidente cerebrovascular isquémico. Las células inyectadas se distribuyen ampliamente por todo el parénquima cerebral y se pueden detectar hasta 30 d después del parto.
Abstract
La terapia con células madre neurales (NSC) es un tratamiento innovador emergente para accidentes cerebrovasculares, lesiones cerebrales traumáticas y trastornos neurodegenerativos. En comparación con la administración intracraneal, la administración intraextesal de INE es menos invasiva y produce una distribución más difusa de las RSE dentro del parénquima cerebral. Además, la administración intra arterial permite el efecto de primer paso en la circulación cerebral, disminuyendo el potencial de captura de células en órganos periféricos, como el hígado y el bazo, una complicación asociada con las inyecciones periféricas. Aquí, detallamos la metodología, tanto en ratones como en ratas, para la entrega de INE a través de la arteria carótida común (ratón) o la arteria carótida externa (rata) al hemisferio ipsilateral después de un accidente cerebrovascular isquémico. Utilizando NSC con etiqueta GFP, ilustramos la distribución generalizada lograda en todo el hemisferio ipsilateral de roedores a 1 d, 1 semana y 4 semanas después del parto postestémico, con una mayor densidad en o cerca del sitio de lesiones isquémicas. Además de la supervivencia a largo plazo, mostramos evidencia de diferenciación de células etiquetadas por GFP a las 4 semanas. El enfoque de entrega intra arterial descrito aquí para las INE también se puede utilizar para la administración de compuestos terapéuticos, y por lo tanto tiene una amplia aplicabilidad a diversos modelos de lesiones y enfermedades del SNC en múltiples especies.
Introduction
La terapia con células madre (SC) tiene un enorme potencial como tratamiento para enfermedades neurológicas, incluyendo accidente cerebrovascular, traumatismo craneoencefálico y demencia1,2,3,4,5,6. Sin embargo, un método eficiente para entregar SCs exógenos al cerebro enfermo sigue siendo problemático2,6,7,8,9,10,11,12,13. Los CC que se administran a través de vías de administración periféricas, incluidas las inyecciones intravenosas (IV) o intraperitoneales (IP), están sujetas a filtrado de primer paso en la microcirculación, especialmente en el pulmón, el hígado, el bazo y el músculo8,,9,,13,,14,lo que aumenta las posibilidades de acumulación de células en zonas no objetivo. El método de inyección intracerebral invasivo da como resultado daños localizados en el tejido cerebral y una distribución muy restringida de SCs cerca del lugar de inyección2,6,8,14,15,16. Recientemente hemos establecido un método de inyección intra-arterial basado en catéter para entregar SCs neuronales exógenos (NSC), que se describe aquí en un modelo de roedores de accidente cerebrovascular isquémico focal. Inducimos una lesión transitoria (1 h) de isquemia-reperfusión en un hemisferio utilizando un filamento recubierto de caucho de silicona para ocluir la arteria cerebral media izquierda (MCA) en el ratón o la rata17,,18,,19. En este modelo hemos observado reproduciblemente aproximadamente 75-85% depresión del flujo sanguíneo cerebral (CBF) en hemisferio ipsilateral con imágenes de laser Doppler o laser speckle17,,19,produciendo déficits neurológicos consistentes17,,18,,19.
Para ahorrar tiempo, el vídeo está configurado para reproducirse al doble de la velocidad normal y no se presentan procedimientos quirúrgicos rutinarios, como la preparación de la piel y el cierre de la herida con sutura y el uso y la configuración de la bomba de jeringa motorizada. El método de administración intra arterial de las CEN se demuestra en el contexto del modelo de oclusión de la arteria cerebral media (MCAO) del accidente cerebrovascular experimental en roedores. Por lo tanto, incluimos el procedimiento de accidente cerebrovascular isquémico transitorio con el fin de demostrar más tarde cómo se realiza la segunda cirugía, la inyección intra-arterial, utilizando el sitio quirúrgico anterior en el mismo animal. La viabilidad de la administración intradesal de NSC en modelos de accidente cerebrovascular de roedores se demuestra mediante la evaluación de la distribución y supervivencia de las RSE exógenas. La eficacia del tratamiento con NSC para atenuar la patología cerebral y la disfunción neurológica se notificará por separado.
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Protocol
Todos los procedimientos en temas animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso animal (IACUC) de la Universidad de Kentucky, y se tomó el cuidado adecuado para minimizar el estrés o el dolor asociado con la cirugía.
1. Preparación del catéter de inyección y ganchos quirúrgicos
- Construir el catéter de inyección (Figura 1). Reúna los materiales necesarios, incluyendo: tubos MRE010, MRE025 y MRE050, agujas de inyección de 20 G, 26 G y 27 G(Figura 2A),papel de lija de grano 600, superpege y epoxi de dos componentes de 5 minutos.
- Cortar 20 G y 26 G agujas a 1 cm del cubo de la aguja y pulir el extremo en papel de lija (Figura 2B). Enjuague las agujas con 10 ml de agua doble destilada para limpiar el orificio de la aguja.
NOTA: Se utilizan dos diseños diferentes (Figura 1). El diseño 1 tiene un solo conector y se utiliza para la inyección de soluciones o suspensiones. El diseño 2 tiene conectores de bloqueo Luer de 20 G y 26 G para inyección de células (aguja de 20 G) y enjuague del volumen muerto (aguja de 26 G) para garantizar la entrega del volumen completo de la solución que contiene NSC.
- Cortar 20 G y 26 G agujas a 1 cm del cubo de la aguja y pulir el extremo en papel de lija (Figura 2B). Enjuague las agujas con 10 ml de agua doble destilada para limpiar el orificio de la aguja.
- Diseño 1: Inserte un catéter MRE010 de 3-4 cm de longitud en un catéter MRE025 de 15 cm de longitud y fije con superpegamento.
- Conecte el otro extremo del tubo MRE025 a un segmento del catéter MRE050 y asegúrelo con superpegamento. Inserte una aguja opaca de 20 G en el extremo restante del catéter MRE050 y asegúrela con superpegamento (Figura 1).
- Refuerce aún más los sitios de conexión con pegamento epoxi. Este diseño de catéter es óptimo para la inyección de reactivos (como soluciones químicas o farmacológicas u otros productos biológicos como citoquinas).
- Diseño 2: Inserte un catéter MRE010 de 3-4 cm de longitud en un catéter MRE025 de 15 cm de longitud y fije con superpegamento.
- Conecte el otro extremo del tubo MRE025 a un segmento del catéter MRE050 y asegúrelo con superpegamento. Inserte una aguja opaca de 20 G en el extremo restante del catéter MRE050 y asegúrela con el superpegamento.
- Inserte una aguja opaca de 26 G en el tubo MRE050 cerca de la punta de la primera aguja, siguiendo la dirección del flujo de inyección, y asegúrela con superpegamento(Figura 1 y Figura 2C). Refuerce tanto las agujas como el segmento del tubo MRE050 con epoxi transparente(Figura 2C). Este diseño permite la inyección de la solución del vehículo a través de la aguja 2 (26 G) después de la inyección NSC a través de la aguja 1 (20 G) para vaciar el volumen muerto en el catéter en la circulación cerebral, logrando un control más preciso de los volúmenes de inyección.
- Utilice una aguja de 20 G para la inyección de NSC con el fin de minimizar el daño a los NSC, lo que podría afectar negativamente a la viabilidad.
- Después de la construcción, lavar los catéteres con 10 ml de agua doble destilada, seguido de 70% de etanol, y luego remojarlos en 70% de etanol durante la noche.
- Antes de la cirugía, retire los catéteres de 70% de etanol y enjuague con 10 ml de PBS estéril, y colóquelos en una caja de herramientas quirúrgica autoclave para almacenamiento y transporte.
- Preparación de los ganchos quirúrgicos
- Corte un eje de aguja de 1,5 cm de largo de una aguja de 27 G, y pula ambos extremos en papel de lija hasta que estén apagados. A continuación, utilice una pequeña abrazadera hemostática para doblar el eje en un gancho en un extremo y una forma de anillo en el otro extremo.
- Inserte un catéter MRE025 de 10-15 cm de largo a través del anillo y asegúrelo con cinta quirúrgica transparente(Figura 2D). Haz 2 ganchos más usando el mismo método.
- Remoje todos los ganchos y sistemas de catéter en 70% etanol hasta su uso.
2. Preparación animal: Entrega, vivienda, adaptación al medio ambiente
- En este estudio se utilizaron ratones C57BL/6 machos y hembras (10-12 semanas, no10/punto de tiempo) y ratas Wistar (10-12 semanas, n.o 10).
- Alojarlos en un vivarium animal ambientalmente controlado con alimentos y agua ad libitum.
- Permita que se adapten al medio ambiente al menos 1 semana antes de la cirugía de accidente cerebrovascular.
NOTA: Un ratón y una rata murieron a 1 d después de la cirugía de accidente cerebrovascular y un ratón fue eutanizado a las 3 d después del accidente cerebrovascular antes de la inyección de NSC por razones humanas debido a una parálisis grave.
3. Cultivo de células madre neurales de ratón y rata (NSC)
NOTA: Los INE se aislaron y cultivaron siguiendo un protocolo establecido20.
- Ratón
- Aísle los NSC con etiqueta de tipo salvaje (WT) y GFP de la corteza embrionaria E18 de ratones C57BL/6 hembras de embarazo cronolagado acoplados con ratones machoS positivos en GFP (B6 ACTb-EGFP). Para identificar embriones GFP (+), observe los embriones cosechados en un microscopio de fluorescencia utilizando el canal FITC. Los embriones GFP (+) producen una señal de fluorescencia verde, mientras que los embriones WT muestran sólo una autofluorescencia débil(Figura 3A).
- Rata
- Aísle los ISN de la zona subventricular (SVZ) de ratas CON WT de adultos jóvenes. Etiquetarlos con DiI justo antes de la inyección siguiendo las instrucciones del fabricante21.
- Cultivo de ratón o rata NSCs hasta que se convierten en neuroesferas, y pasarlos cuando el diámetro de la esfera alcanza alrededor de 100 m(Figura 3B). Utilice los NSC para la inyección entre los pasajes 3 y 5.
- Verifique sus propiedades de células madre utilizando un panel marcador de células madre embrionarias (Figura 3C).
- El día de la inyección, recoja las esferas NSC y disocia con la solución de desprendimiento celular, suspenda en PBS libre de calcio y magnesio a una concentración de 107 células/ml, y colóquelo sobre hielo húmedo hasta la inyección.
4. Preparación quirúrgica
- Antes de la cirugía, marque un punto en la sutura comercial MCAO con un rotulador de plata a 9 mm (para ratón) o 15 mm (para rata) desde la punta para la referencia en cirugía de la longitud de inserción. Autoclave las herramientas quirúrgicas (tijeras, fórceps) y los instrumentos antes de cada cirugía, y esterilizar térmicamente en un esterilizador de cuentas de vidrio entre operaciones.
- Inducir la anestesia en animales con 5% de isoflurano por inhalación y mantener la anestesia con 1-2% de isoflurano. Evaluar la profundidad de la anestesia a través de la observación de las condiciones generales (patrón de respiración, movimiento del bigote, y postura de corrección espontánea del cuerpo), reflejo corneal y respuesta a la pellizca del dedo del dedo del final.
- Poner el animal supino en una almohadilla de calentamiento, y preparar el sitio quirúrgico en el animal mediante el recorte y lavado con solución de betadina seguido de 70% etanol. Proteja los ojos del animal del secado aplicando pomada oftalmológica (por ejemplo, pomada de lágrima artificial) durante la cirugía.
- Pida a los cirujanos que se froten bien las manos con un exfoliante bacteriocida y usen una máscara, guantes estériles y una capa de laboratorio limpia.
5. Cirugía de accidente cerebrovascular de oclusión de la arteria cerebral media (MCAO)
NOTA: Las cirugías para inducir un accidente cerebrovascular isquémico en un hemisferio de ratón o rata son similares en que se introduce una sutura en la arteria carótida interna (ICA) para ocluir el flujo sanguíneo (Figura 4)17,18,19,22. Sin embargo, la arteria seleccionada para la inserción de sutura difiere en función del espacio de operación disponible necesario para la posterior inyección de células madre. La rata tiene un amplio espacio en el segmento de la arteria carótida externa (ECA) para permitir dos cirugías secuenciales separadas (inyección de accidente cerebrovascular y NSC), pero el ratón no, que requiere un enfoque alternativo. Se han notificado cambios en el flujo sanguíneo cerebral inducido por accidente cerebrovascular, tamaño del infarto cerebral y déficits neurológicos como en los informes anteriores de los autores17,,18,,19.
- Para inducir un accidente cerebrovascular isquémico, comiencen las cirugías de ratón y de rata con una incisión de línea media en la zona cervical, y el aislamiento de la arteria carótida común izquierda (CCA), ECA e ICA (Figura 4). Tenga cuidado de no estirar, desplazar o apretar el nervio CCA o vago. Dado que la selección de la arteria y los pasos quirúrgicos son diferentes a partir de entonces, la cirugía de MCAO en el ratón y la rata se describirá por separado.
- Cirugía MCAO en el ratón (Figura 4A)
- Colocar tres suturas trenzadas de nylon 6-0 bajo la CCA(Figura 4A, paso 1), y hacer un nudo quirúrgico apretado para ocluir el recipiente lo más lejos posible de la bifurcación utilizando la cuerda proximal(Figura 4A, paso 2). Recorta los extremos de la sutura.
- Haga un slipknot en el lado distal de CCA (precaución: no apriete demasiado, ya que se liberará en el paso 6) y un slipknot suelto entre los dos nudos apretados(Figura 4A, paso 2).
- Cortar una pequeña incisión (1/4 - 1/3 de la circunferencia) cerca del nudo proximal en la CCA con microscisores(Figura 4A, paso 3), e insertar cuidadosamente la sutura maciza de nylon de caucho de silicona comercial recubierta 7-0 (Figura 4A,paso 4). Asegure esta sutura con la cuerda media, apretando lo suficiente(Figura 4A, paso 5) para asegurar que no haya fugas de sangre de la incisión y sin movimiento del filamento de nylon recubierto de caucho de silicona por el contraflujo de ICA, mientras que todavía permite el avance de la sutura hacia el ECA con un suave empuje por las pinzas.
- Suelte el dendo superior (distal)(Figura 4A, paso 6) y avance la sutura de nylon en el ICA hasta que su punta pase la bifurcación durante 9 mm (utilizando el marcador de plata en la sutura como referencia). Apriete los dos trozos superiores para asegurar la sutura y evitar el flujo sanguíneo.
- Retirar el filamento 1 h más tarde(Figura 4A, paso 7) y ligar el CCA usando el nudo medio para prevenir el sangrado (Figura 4A, pasos 5-7 en orden inverso, resultados finales como se ve en el paso 8). Suelte el nudo superior. Cierre la herida con una sutura quirúrgica 4-0.
- Cirugía MCAO en rata(Figura 4B)
- Coloque dos suturas trenzadas de nylon 6-0 bajo el ECA(Figura 4B, paso 1), y haga un nudo apretado en el extremo distal lo más lejos posible(Figura 4B, paso 2).
- Coloque los clips de los vasos en el ICA y CCA para ocluir el flujo sanguíneo arterial(Figura 4B,paso 3). Un slipknot se puede utilizar como alternativa para un clip de recipiente.
- Haga una pequeña incisión en el TCE con microscisores(Figura 4B, pasos 3-4), inserte un filamento de nylon de goma de silicona comercial recubierto de 6-0(Figura 4B, paso 5), y asegure correctamente con un slipknot en el ECA.
- Suelte el clip del recipiente en el ICA, avance el filamento en el ICA hasta que el marcador de plata (15 mm) alcance la bifurcación(Figura 4B, paso 6), y luego fije la sutura con el2o nudo en el ECA (Figura 4B, paso 6).
- Después de 1 h de isquemia, retire este filamento y ligar la incisión para evitar el sangrado(Figura 4B, paso 7), retire el clip del vaso de CCA (resultado final como en el paso 8), y cierre la herida con 4-0 sutura quirúrgica.
6. Recuperación
- Después de la cirugía de accidente cerebrovascular, coloque los animales en una almohadilla de calentamiento hasta que recuperen completamente la conciencia.
- Proporcionar analgesia mediante inyección subcutánea. Devuelva a los animales a sus jaulas de origen con acceso al agua y a los alimentos ad libitum.
7. Inyección intra-arterial
- Lave todo el catéter con 70% de etanol y remoje durante la noche hasta su uso. Justo antes de la inyección, conecte el bloqueo Luer de la aguja con una jeringa estéril y lave todo el lado lumen del sistema de catéter con 10 ml de PBS estéril.
- Ventana de tiempo y preparación para la inyección de NSC
NOTA: Basado en la experiencia y los informes de otros equipos de investigación, el momento de la inyección de NSC es crucial para la supervivencia de ambos sujetos y los INEógenos exógenos. En nuestro estudio piloto, la inyección de NSC en los primeros puntos de tiempo (dentro de las primeras 6 h después de la reperfusión) condujo a una mayor mortalidad. Por lo tanto, probamos puntos de tiempo de inyección posteriores y determinamos la ventana de tiempo entre 2 d (48 h) a 3 d (72 h) después de un accidente cerebrovascular es seguro y tolerable para los animales, y es eficiente en lograr la distribución intraparenquimal de las NIC NSC.- Ajuste la velocidad de inyección de la bomba de jeringa a 20 ml/min para ratones y 50 l/min para ratas. La velocidad excesiva o la duración de la inyección pueden dar lugar a una sobrecarga de volumen sistémica, a la que los ratones son más vulnerables que las ratas.
- En resumen, a las 3 d después de la cirugía de accidente cerebrovascular, anestesiar a los animales con isoflurano y ponerlos supinos sobre una almohadilla de calentamiento.
- Vuelva a abrir la herida cervical y exponga de nuevo la ECA, la ICA y la CCA(Figura 5, paso 1). Al igual que en las cirugías de accidente cerebrovascular, determinar la ruta de inyección en función de la especie. Utilice el CCA para la inyección NSC en el ratón, y el ECA para la rata23.
- Inyección intra-arterial a través de la CCA en el ratón
- Coloque dos suturas de nylon trenzadas 6-0 debajo de la CCA. Cree un slipknot suelto con cada uno de ellos entre la bifurcación y los nudos inferiores de la cirugía de accidente cerebrovascular anterior(Figura 5, paso 2).
- Apriete el dendo superior y luego haga una pequeña incisión por encima del nudo inferior(Figura 5, paso 3). Inserte un catéter MRE010 a través de la incisión(Figura 5, paso 4) y fije con el nudo medio sin bloquear el flujo de inyección(Figura 5, paso 5). El flujo de sangre debe ser visible en el catéter al liberar el nudo superior y ajustar la posición del catéter.
- Coloque un clip de recipiente en el TCE, inyecte 1 x 106 GFP-NSC a través de este catéter a 20 l/min durante 5 min con una bomba de jeringa, seguido de un lavado con 50-100 l de PBS a la misma velocidad.
- Después de la inyección, ligar el CCA por encima de la incisión con el nudo de deslizamiento superior y retirar el catéter MRE010(Figura 5, paso 6). Apriete y recorte el nudo medio y el nudo superior. Retire el clip del recipiente del TCE. Refiera a la imagen final en el cuadro 5,paso 7.
- Cierre la herida con una sutura quirúrgica 4-0.
- Después de proporcionar una recuperación adecuada en una almohadilla de calentamiento y la inyección analgésica subcutánea, devolver a los animales a su jaula de origen.
- Inyección intras arterial a través del TCE en rata
- Ocluir temporalmente el ECA y el CCA con clips de recipiente(Figura 5, paso 2).
- Haga una pequeña incisión en el lado proximal de ECA(Figura 5, paso 3), inserte el catéter MRE010 y asegure con un nudo(Figura 5, paso 4).
- Retire ambos clips de recipiente, inyecte 5 x10 6 NSCs en 100 l de PBS a 50 l/min durante 2 min, seguido de un vaciado con 50-100 l de PBS(Figura 5, paso 5) a la misma velocidad, utilizando una bomba de jeringa motorizada.
- Después de la inyección, ocluir de nuevo la CCA y la ECA con clips de recipiente y ligar el TCE en el lado proximal de la segunda incisión después de la retirada del catéter de inyección(Figura 5, paso 6).
- Retire los dos clips del recipiente(Figura 5, paso 7) y cierre la herida con una sutura quirúrgica 4-0.
- Después de proporcionar una recuperación adecuada en una almohadilla de calentamiento y la inyección analgésica subcutánea, devolver a los animales a su jaula de origen.
- Ensayo histológico
- Recoger cerebros de ratones y ratas que recibieron accidente cerebrovascular isquémico seguido de inyección de NSC o solución del vehículo después de la eutanasia y perfusión intracardiaca con 4% de paraformaldehído a 1 d (ratón y rata), 7 d (ratón) y 30 d (ratón) después de la inyección. Cada uno de estos cuatro grupos consistía en 5 NSC y 5 animales inyectados en vehículos.
- Arreglar cerebros durante la noche y criopreservar en 30% sacarosa para 3 d.
- Incrustar los cerebros en el OCT, cortar a 40 m de espesor, y examinar la distribución de las NSC después de la inmunosumanidad con marcadores específicos de la célula, incluyendo proteína ácida fibribrillaria glial (GFAP, astrocitos), Tuj1 (neuronas maduras) y doblecortina (DCX, neuronas inmaduras).
NOTA: Debido a la falta de una cepa de rata que expresa la GFP, utilizamos DiI, una etiqueta fluorescente transitoria, para los NSC de ratas, que sólo permite la observación relativamente a corto plazo. Por lo tanto, la distribución de NSC sólo se examinó a 1 d después del accidente cerebrovascular en ratas.
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Representative Results
Los ISC etiquetados por la GFP se detectaron fácilmente en el cerebro isquémico, principalmente en el hemisferio ipsilateral, especialmente en la penumbra y a lo largo del borde de la lesión (Figura 6). El examinador fue ciego durante la toma de imágenes y el análisis.
Por ejemplo, a 1 d después de la inyección, se detectaron NSC dentro del hipocampo del ratón. Un subconjunto de NSC mostró coexpresión del marcador de neurona inmaduro DCX en el giro dentado incluso en este punto de tiempo temprano (Figura 6A).
A 10 d después de la carrera (7 d después de la inyección de NSC), se observaron GFP-NSC exógenos con la densidad más alta en el borde de la lesión (área de la cuenca hidrográfica) en el estriado y la corteza (Figura 6B). Es notable que por 7 d después de la inyección muchos de los GFP-NSCs también expresaron DCX (mostrado por círculos azules), indicando su destino neuronal. En comparación con los animales que recibieron inyección de solución de vehículo, la inyección de NSC también aumentó la tinción de DCX (rojo) en el hemisferio ipsilateral.
A 30 d después de la inyección, todavía se detectaron NSC en la corteza lesionada, y una parte de ellos mostró expresión de marcador glial GFAP (Figura 6C) o marcador neuronal maduro Tuj1 (Figura 6D), lo que indica el potencial de las RSE exógenas para diferenciarse en un destino glial o neuronal, y sobrevivir hasta 1 mes en el cerebro lesionado.
Figura 1: Diseños esquemáticos de catéteres de inyección. Presentamos dos diseños, Diseño 1 para inyección de solución compuesta y Diseño 2 para inyección celular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Preparación del catéter para la inyección de NSC y de ganchos quirúrgicos. (A) Materiales para la construcción de catéteres: catéteres MRE010, MRE025 y MRE050 a 3 cm, 10-15 cm y 3 cm de longitud, respectivamente. (B) Corte las puntas de las agujas y pula hasta que estén apagadas. (C) Conecte cada segmento y fije con superpegamento, y luego inserte tanto las cerraduras Luer de aguja como el segmento MRE050 en epoxi para mejorar. (D) Haga gancho quirúrgico utilizando el eje de la aguja 27 G y el catéter MRE025. Barra de escala: 5 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Cultivo de células madre neuronales GFP (+). (A) Identificar embriones GFP (+) con microscopio de fluorescencia utilizando el canal FITC. (B) Aislar y cultivar las ISC corticales hasta que formen neuroesferas. Barra de escala: 100 m. (C) Examinar las propiedades de la neurosfera utilizando un panel marcador de células madre. Barra de escala: 50 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Imágenes esquemáticas de la cirugía de accidente cerebrovascular de oclusión de la arteria cerebral media (MCAO) paso a paso en el ratón o la rata. Consulte el vídeo para obtener una operación quirúrgica detallada. ICA, arteria carótida interna; TCE, arteria carótida externa; CCA, arteria carótida común. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Imágenes esquemáticas de la inyección de células madre neurales intraestacionales (NSC) en ratón o rata. Consulte el vídeo para obtener una operación quirúrgica detallada. ICA, arteria carótida interna; TCE, arteria carótida externa; CCA, arteria carótida común. La flecha verde indica la dirección del flujo durante la inyección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Distribución, supervivencia y diferenciación de las células madre neurales (NSC) en el cerebro isquémico. (A) Detección de los INE(SV) de GFP (+) dentro del giro del dennato del hipocampo a 1 d después de la inyección. Células madre fluoresce verde; inmunostainma de doblecortina (DCX) que se muestra en rojo. La flecha blanca indica un GFP (+) NSC con expresión DCX. (B) Mapa esquemático de celdas GFP (+) y células etiquetadas DCX a 10 d después de Isquemia-Reperfusión (I-R) en controles falsos (sin inyección) y vehículo (I-R) o NSC (I-R + NSC) inyectados ratones. La topografía del insulto isquémico se representa en el último esquema, donde el naranja más claro y oscuro representa el área objeto de desafío isquémico y el núcleo necrótico, respectivamente. La cinta azul indica el área de "cuenca hidrográfica". Los rectángulos grises representan las ubicaciones donde se tomaron las imágenes para (C) y (D). (C,D) Los INEógenos exógenos pueden diferenciarse en un destino glial (GFAP, C) o un destino neuronal (Tuj1, D) por 30 d después de la entrega. No se observaron señales significativas en el canal FITC (GFP) en los animales de carrera que recibieron inyección de vehículo (vehículo en C y D),mientras que en ratones inyectados por NSC, se visualizaron y colocaron los CSN GFP supervivientes con tinción GFAP (C) o Tuj1 (D). Las flechas indican superposición de 2 canales. Barra de escala: 20 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La terapia con células madre para enfermedades neurológicas todavía se encuentra en una etapa exploratoria temprana. Un problema importante es que no existe un método establecido para la entrega suficiente de SCs o NSC en el cerebro.
Aunque se pueden detectar CCS/NSC exógenos en el cerebro después de la inyección intravenosa (IV), intraperitoneal (IP) o intraparenquimal/intracerebral, cada enfoque de administración tiene inconvenientes. Se estima que la población detectable dentro del cerebro es muy baja con inyección periférica (IV o IP), lo que representa sólo una pequeña fracción de las células inyectadas o infundidas. La inyección intracerebral produce una distribución muy focal, y puede inducir directamente lesión cerebral2,6,7,8,9,10,11,12,13. Por lo tanto, probamos la viabilidad de la inyección intra arterial como un método alternativo para la administración de NSC después de accidente cerebrovascular isquémico. Este método proporciona nSCs a través de la perfusión cerebral ipsilateral después de un insulto de accidente cerebrovascular. Si se inyecta temprano después del accidente cerebrovascular, los ISV exógenos pueden cruzar la barrera hematoencefálica alterada (BBB), logrando una amplia distribución en todo el cerebro. Una ventaja de la inyección intraarte arterial es que utiliza un efecto de primer paso dentro del SNC, maximizando el potencial de las INE exógenas para asentarse en el cerebro, en contraste con las rutas de administración periféricas en las que las células pasan primero a través de la rica microcirculación de órganos filtrantes como el pulmón y el hígado.
El enfoque intra-arterial descrito aquí es versátil, y se puede adaptar para adaptarse a diferentes tipos de paradigmas de parto y modelos de lesiones o enfermedades. Aunque en el estudio actual sólo se realiza una inyección intraarte arterial, el catéter MRE025 se puede conectar a una micropuerta que se incrusta por vía subcutánea, a través de la cual los animales pueden recibir inyecciones intraarte arteriales repetitivas12. Además, con el diseño más simple de un solo lumen, este método de inyección se puede utilizar para la entrega de reactivos en la solución12,23. Si se requiere la entrega de múltiples terapias, el diseño de doble lumen podría ser utilizado para entregar una solución inicial simultáneamente o secuencialmente con un segundo fármaco o compuesto. Para aplicaciones en modelos de roedores de neurodegeneración o lesión cerebral traumática, donde no hay necesidad de la primera cirugía de accidente cerebrovascular, la cirugía para la instalación del catéter de inyección en el ratón se puede realizar en el ECA (mismo protocolo que el de la rata, ajustando adecuadamente el volumen de inyección y la tasa en el paso 7.4 para ratones), para evitar posibles alteraciones del flujo sanguíneo cerebral a través de la CCA.
Se deben considerar varias desventajas y posibles consecuencias adversas de esta inyección intra arterial. Los animales reciben una segunda cirugía, que conlleva la posibilidad de complicaciones relacionadas con la anestesia o la cirugía. El flujo sanguíneo cerebral a través de la CCA ipsilateral se altera, aunque de forma transitoria (menos de unos minutos), lo que puede inducir otro episodio transitorio de depresión leve de la CBF. Además, la perturbación o apertura de la BBB es fundamental para el parto intraeste arterial de la NSC, lo que limita la ventana terapéutica. En el estudio piloto, casi no se detectaron NISG de GFP (+) en el cerebro ingenuo después de la inyección intra-arterial. Sin embargo, si el sujeto puede tolerar medicamentos que pueden abrir transitoriamente BBB, como manitol de alta osmolalidad o solución salina, esto podría utilizarse para crear una ventana transitoria de apertura de BBB para la inyección de NSC en puntos posteriores. En estudios preliminares, encontramos que la inyección intra arterial dentro de las primeras 6 h después del accidente cerebrovascular dio lugar a una mortalidad mayor que la observada con accidente cerebrovascular solo. Esto puede estar relacionado con una segunda cirugía invasiva después de un período relativamente corto de recuperación después de la primera cirugía. Alternativamente, después del insulto isquémico, la cerebrovasculatura lesionada puede tener una mayor tendencia a constriñerse en respuesta a cualquier estímulo adicional, como la introducción del catéter, la carga adicional de líquido o la unión de las NIC exógenas a la pared luminal después de la inyección. Otra preocupación razonable con respecto a la entrega de NSC después de accidente cerebrovascular es que los NSC podrían formar émbolos que ocluyen o molesten los microvajillones. De acuerdo con los informes anteriores8,16,24, no encontramos evidencia significativa de GFP (+) embolia en la microvasculatura, aunque encontramos GFP (+) NSCs en el espacio perivascular (espacio Virchow-Robin) en los primeros días después de la inyección. Después de optimizar la ventana de tiempo para la inyección, no hubo diferencia en la complicación o la tasa de mortalidad entre los grupos de accidentes cerebrovasculares que recibieron el vehículo o la inyección de NSC en el estudio actual. Por lo tanto, la inyección intraesc arterial NSC adecuadamente diseñada es un método seguro y eficiente de tratamiento NSC dirigido a enfermedades neurológicas.
Para lograr una inyección exitosa de NSC y mejorar los resultados en animales, se deben manejar varios aspectos con precaución durante la cirugía de accidente cerebrovascular o la inyección de NSC. Se debe practicar el apoyo y la atención quirúrgico general, como la protección de la córnea y el mantenimiento de la temperatura del núcleo. Aquí presentamos algunas complicaciones potenciales de esta cirugía específica y orientación para minimizar su aparición.
Puede haber estrés en el nervio vago. Durante la cirugía, el nervio vago no debe estirarse, aplastarse, ligarse ni estimularse. La estimulación incidental del nervio vago puede inducir arritmia como bradicardia, paro cardíaco o incluso la muerte.
La colocación o apriete inadecuado de la sutura, o el extravío o deslizamiento de un clip del vaso pueden resultar en sangrado arterial desde el extremo proximal de la CCA (de la salida cardíaca) o del extremo distal a través del Círculo de Willis. En cada paso, asegúrese de que el clip o los nudos del vaso se colocan correctamente para ocluir el flujo sanguíneo. Si se produce sangrado, intente restaurar la colocación correcta de los clips de nudo o vaso. Si el campo visual está borroso con sangre, coloque la punta de un hisopo de algodón estéril en la CCA y sostenga con presión para detener el flujo sanguíneo. La hemoglobina por sangrado facilitará el cierre de la incisión en la arteria. Después de que el sangrado se detenga, apriete el nudo o coloque el clip del vaso en la ubicación correcta, limpie la sangre en el campo visual y continúe con la cirugía.
Puede haber lesiones o complicaciones por la inserción del catéter. Recorte la punta MRE010 en un ángulo de 45o, para que pueda entrar en la pequeña incisión en la arteria fácilmente, sin inducir ninguna lesión en el vaso. En raras ocasiones, una punta sobreafilada puede penetrar en la arteria o entrar en el espacio entre la membrana del sótano y la túnica externa. Para evitar estas lesiones, haga una incisión de tamaño adecuado en la arteria. Recomendamos un tamaño de 1/4-1/3 la circunferencia de la arteria, que es lo suficientemente grande como para permitir la entrada de la punta del catéter, pero conserva suficiente fuerza en la pared del vaso para envolver fuera del catéter. Una incisión demasiado grande puede provocar el desgarro de la arteria en el lugar de la incisión. Guíe suavemente la punta del catéter MRE010 para entrar en la incisión. No fuerce la entrada de la punta del catéter ni el avance del catéter. Si es necesario, se pueden utilizar fórceps afilados para levantar el borde de la incisión. Avance el catéter con un ángulo bajo en relación con la arteria para que el catéter y la arteria sean casi paralelos.
También hay posibles complicaciones relacionadas con la inyección. Una complicación común de la inyección intra arterial es la carga excesiva de volumen, que puede conducir a una sobrecarga cardíaca aguda y edema pulmonar. Las tasas de inyección rápidas pueden amplificar estos riesgos y causar daños en la pared del recipiente8. Por lo tanto, tanto la tasa como el volumen total deben controlarse cuidadosamente. Recomendamos 20 l/min como generalmente seguro para ratones cuando se utiliza durante un período corto, como 5 minutos. Si se observan síntomas de sobrecarga de volumen, como respiración rápida y poco profunda, burbujas rosadas de narinas o movimiento aberrante similar a la disforia, la inyección debe detenerse o abortarse, y se permite que los animales se recuperen. Otra posible complicación es la formación de émbolos NSC en el sistema cerebrovascular. La solución de suspensión no debe contener calcio o magnesio, que se sabe que promueven la agregación celular. Para reducir las posibilidades de inducir émbolos, las suspensiones de una sola célula de las RSE deben examinarse bajo microscopio justo antes de la inyección para confirmar la ausencia de racimos celulares. Si hay racimos celulares, valore con una pipeta estéril de 1 ml hasta que se logre la suspensión de una sola célula.
Este estudio establece la viabilidad del enfoque de administración intra arterial para ratones y ratas, y revela varias características importantes de esta inyección intra arterial de LAS RSE en el contexto del accidente cerebrovascular isquémico. En comparación con la distribución relativamente focal de las RSE que sobreviven en el parénquima cerebral típicamente reportado con inyección intra-cerebral1,7,9,11,15,16, observamos una distribución difusa a través del hemisferio ipsilateral, incluyendo la corteza, el hipocampo y el estriado. Por lo tanto, la administración intra-arterial es muy adecuada no sólo para accidente cerebrovascular, sino también para múltiples tipos de lesiones o enfermedades que implican daño cerebral difuso. En el entorno de MCAO, se encontró la mayor concentración de NSC a lo largo del borde del sitio de lesiones. El aumento de la densidad de las ISV exógenas en la zona del penumbra puede deberse al aumento de la entrega a esta región a través del flujo colateral de la perfusión sanguínea restablecida y la apertura de la BBB, así como la migración de las CEN hacia la zona dañada. Aunque la entrega intravenosa de CCS puede dar lugar a una distribución difusa, el número de células que llegan al cerebro se estima que es una pequeña fracción del total entregado, en parte debido a la filtración por los órganos periféricos8,,13. Sobre la base de un estudio previo sobre metástasis cerebral12,las células tumorales D122 inyectadas por luciferasa inyectadas aprovecharon el efecto de primer paso para establecerse en la vasculatura cerebral y desarrollar sitios metastásicos en el cerebro en lugar de en los órganos periféricos. Los sitios metastásicos cerebrales debido a células tumorales exógenas se detectaron en el ipsilateral cerebral a la inyección ya en 1 semana después de la inyección utilizando un sistema de imágenes IVIS para detectar la señal bioluminiscente a través del cráneo y el cuero cabelludo intactos. Por el contrario, las señales luminiscentes (que indican la carga tumoral asociada a las células tumorales exógenas) de los órganos periféricos, como el hígado, el pulmón y el músculo, no se detectaron hasta 3-4 semanas después de la inyección intracuarcional. Por lo tanto, esperamos, en un escenario similar, la administración intra-arterial de NSC también se beneficiará del efecto de primer paso en la circulación cerebral para aumentar en gran medida la localización en el cerebro en comparación con los órganos periféricos.
Aunque la inyección directa de intracerebral se puede utilizar para suministrar un gran número de células al cerebro lesionado, el enfoque resulta en daño celular o hemorragia debido a la penetración de la aguja del parénquima que desencadena la neuroinflamación localizada, lo que potencialmente compromete la supervivencia y la integración de las células recién entregadas14,15,16,25,26. El enfoque intra-arterial para el parto de NSC es ventajoso en el que evita este daño cerebral localizado y neuroinflamación, y apoya la supervivencia a largo plazo de las NIC3,,8,,9,,14,,24. Observamos la supervivencia y diferenciación de los GPF-NSC inyectados en el cerebro lesionado en puntos de tiempo hasta 30 d después de la inyección. Aunque encontramos NSCs que se habían diferenciado en neuronas maduras y astrocitos, se requieren estudios detallados para determinar la distribución relativa de varios tipos de células generadas a partir de GFP-NSCs y las proporciones que sobreviven en el período crónico postjuro. Más importante aún, si los INE supervivientes y exógenos pueden interactuar con las células cerebrales constitutivas para reconstruir la red cerebral y alterar la función neurológica aún no está claro y deben ser explorados.
En conjunto, introducimos un método de administración intra arterial para entregar NSC en el cerebro isquémico, demostrando la supervivencia a largo plazo en el hemisferio isquémico y la diferenciación en los tipos de células neuronales y gliales. El enfoque de entrega intra arterial es adaptable para numerosas especies y múltiples modelos de lesión y enfermedad del SNC y se puede utilizar para la entrega de otros tipos celulares o compuestos terapéuticos o biológicos individuales o múltiples, proporcionando una amplia utilidad para la comunidad de neurociencia.
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Disclosures
Ninguno.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por lo siguiente: Premio AHA 14SDG20480186 para LC, equipo de innovación de asignaturas de la Universidad De Shanxi de Medicina China 2019-QN07 para BZ, y Kentucky Spinal Cord and Head Injury Research Trust subvención 14-12A para KES y LC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20 G needle | Becton & Dickinson | BD PrecisionGlide 305175 | preparation of injection catheter |
| 26 G needle | Becton & Dickinson | BD PrecisionGlide 305111 | preparation of injection catheter |
| 27 G needle | Becton & Dickinson | BD PrecisionGlide 305136 | preparation of injection catheter |
| 4-0 NFS-2 suture with needle | Henry Schein Animal Health | 56905 | surgery |
| 6-0 nylon suture | Teleflex/Braintree Scientific | 104-s | surgery |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7922 | cell detachment solution |
| blade | Bard-Parker | 10 | surgery |
| Buprenorphine-SR Lab | ZooPharm | Buprenorphine-SR Lab® | analgesia (0.6-1 mg/kg over 3 d) |
| Calcium/magnisum free PBS | VWR | 02-0119-0500 | NSC dissociation |
| DCX antibody | Millipore | AB2253 | immunostaining |
| GFAP antibody | Invitrogen | 180063 | immunostaining |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 50562-1 | surgery |
| MCAO filament for mouse | Doccol | 702223PK5Re | surgery |
| MCAO filament for rat | Doccol | 503334PK5Re | surgery |
| MRE010 catheter | Braintree Scientific | MRE010 | preparation of injection catheter |
| MRE025 catheter | Braintree Scientific | MRE025 | preparation of injection catheter |
| MRE050 catheter | Braintree Scientific | MRE050 | preparation of injection catheter |
| Nu-Tears Ointment | NuLife Pharmaceuticals | Nu-Tears Ointment | eye care during surgery |
| S&T Forceps - SuperGrip Tips JF-5TC Angled | Fine Science Tools | 00649-11 | surgery |
| S&T Forceps - SuperGrip Tips JF-5TC Straight | Fine Science Tools | 00632-11 | surgery |
| Superglue | Pacer Technology | 15187 | preparation of injection catheter |
| syringe pump | Kent Scientific | GenieTouch | surgery |
| Tuj1 antibody | Millipore | MAb1637 | immunostaining |
| two-component 5 minute epoxy | Devcon | 20445 | preparation of injection catheter |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | surgery |
| vascular clamps | Fine Science Tools | 00400-03 | surgery |
| Zeiss microscope | Zeiss | Axio Imager 2 | microscopy |
References
- Wang, Y. Stroke research in 2017: surgical progress and stem-cell advances. The Lancet. Neurology. 17, 2-3 (2018).
- Bliss, T., Guzman, R., Daadi, M., Steinberg, G. K. Cell transplantation therapy for stroke. Stroke. 38, 817-826 (2007).
- Boese, A. C., Le, Q. E., Pham, D., Hamblin, M. H., Lee, J. P. Neural stem cell therapy for subacute and chronic ischemic stroke. Stem Cell Research & Therapy. 9, 154 (2018).
- Kokaia, Z., Llorente, I. L., Carmichael, S. T. Customized Brain Cells for Stroke Patients Using Pluripotent Stem Cells. Stroke. 49, 1091-1098 (2018).
- Savitz, S. I. Are Stem Cells the Next Generation of Stroke Therapeutics. Stroke. 49, 1056-1057 (2018).
- Wechsler, L. R., Bates, D., Stroemer, P., Andrews-Zwilling, Y. S., Aizman, I. Cell Therapy for Chronic Stroke. Stroke. 49, 1066-1074 (2018).
- Muir, K. W. Clinical trial design for stem cell therapies in stroke: What have we learned. Neurochemistry International. 106, 108-113 (2017).
- Guzman, R., Janowski, M., Walczak, P. Intra-Arterial Delivery of Cell Therapies for Stroke. Stroke. 49, 1075-1082 (2018).
- Misra, V., Lal, A., El Khoury, R., Chen, P. R., Savitz, S. I. Intra-arterial delivery of cell therapies for stroke. Stem Cells and Development. 21, 1007-1015 (2012).
- Argibay, B., et al. Intraarterial route increases the risk of cerebral lesions after mesenchymal cell administration in animal model of ischemia. Scientific Reports. 7, 40758 (2017).
- Kelly, S., et al. Transplanted human fetal neural stem cells survive, migrate, and differentiate in ischemic rat cerebral cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 11839-11844 (2004).
- Chen, L., Swartz, K. R., Toborek, M. Vessel microport technique for applications in cerebrovascular research. Journal of Neuroscience Research. 87, 1718-1727 (2009).
- Fischer, U. M., et al. Pulmonary passage is a major obstacle for intravenous stem cell delivery: the pulmonary first-pass effect. Stem Cells and Development. 18, 683-692 (2009).
- Misra, V., Ritchie, M. M., Stone, L. L., Low, W. C., Janardhan, V. Stem cell therapy in ischemic stroke: role of IV and intra-arterial therapy. Neurology. 79, 207-212 (2012).
- Muir, K. W., Sinden, J., Miljan, E., Dunn, L.
- Boltze, J., et al. The Dark Side of the Force - Constraints and Complications of Cell Therapies for Stroke. Frontiers in Neurology. 6, 155 (2015).
- Huang, C., et al. Noninvasive noncontact speckle contrast diffuse correlation tomography of cerebral blood flow in rats. Neuroimage. 198, 160-169 (2019).
- Wong, J. K., et al. Attenuation of Cerebral Ischemic Injury in Smad1 Deficient Mice. PLoS One. 10, 0136967 (2015).
- Zhang, B., et al. Deficiency of telomerase activity aggravates the blood-brain barrier disruption and neuroinflammatory responses in a model of experimental stroke. Journal of Neuroscience Research. 88, 2859-2868 (2010).
- Walker, T. L., Yasuda, T., Adams, D. J., Bartlett, P. F. The doublecortin-expressing population in the developing and adult brain contains multipotential precursors in addition to neuronal-lineage cells. The Journal of Neuroscience. 27, 3734-3742 (2007).
- Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3, 20130001 (2013).
- Bertrand, L., Dygert, L., Toborek, M. Induction of Ischemic Stroke and Ischemia-reperfusion in Mice Using the Middle Artery Occlusion Technique and Visualization of Infarct Area. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
- Leda, A. R., Dygert, L., Bertrand, L., Toborek, M. Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
- Chua, J. Y., et al. Intra-arterial injection of neural stem cells using a microneedle technique does not cause microembolic strokes. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31, 1263-1271 (2011).
- Potts, M. B., Silvestrini, M. T., Lim, D. A. Devices for cell transplantation into the central nervous system: Design considerations and emerging technologies. Surgical Neurology International. 4, 22-30 (2013).
- Duma, C., et al. Human intracerebroventricular (ICV) injection of autologous, non-engineered, adipose-derived stromal vascular fraction (ADSVF) for neurodegenerative disorders: results of a 3-year phase 1 study of 113 injections in 31 patients. Molecular Biology Reports. 46, 5257-5272 (2019).
