Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

تقييم الإجهاد التأكسدي في العينات البيولوجية باستخدام اختبار المواد التفاعلية حمض ثيوباربيتريك

Published: May 12, 2020 doi: 10.3791/61122
Automatic Translation
1,
1School of Molecular Sciences, The Biodesign Institute - Center for Personalized Diagnostics, Arizona State University

Summary

الهدف من تقييم المواد التفاعلية حمض ثيوباربيتريك هو تقييم الإجهاد التأكسدي في العينات البيولوجية عن طريق قياس إنتاج منتجات البيروكسيد الدهون، في المقام الأول malondialdehyde، وذلك باستخدام قياس الطيف الطول الموجي مرئية في 532 نانومتر. يمكن تطبيق الطريقة الموصوفة هنا على المصل البشري ، وlysates الخلية ، والبروتينات الدهنية منخفضة الكثافة.

Abstract

على الرغم من خصوصية التحليل المحدودة ووعرة، تم استخدام الحمض thiobarbituric المواد التفاعلية (TBARS) على نطاق واسع كمقياس عام من البيروكسيد الدهون في السوائل البيولوجية. وغالبا ما يعتبر مؤشرا جيدا لمستويات الإجهاد التأكسدي داخل عينة بيولوجية، شريطة أن تكون العينة قد عولجت وخزنت على النحو الصحيح. ينطوي المقايسة على تفاعل منتجات البيروكسيد الدهون ، في المقام الأول malondialdehyde (MDA) ، مع حمض ثيوباربيتوريس (TBA) ، مما يؤدي إلى تشكيل إضافات MDA-TBA2 تسمى TBARS. TBARS ينتج اللون الأحمر والوردي التي يمكن قياسها الطيفيةصورية في 532 نانومتر. يتم إجراء فحص TBARS في ظل ظروف حمضية (درجة الحموضة = 4) وعند 95 درجة مئوية. نقية MDA غير مستقر، ولكن هذه الشروط تسمح الافراج عن MDA من MDA بيس (ثنائي ميثيل الأسيتال)، والذي يستخدم كمعيار تحليلي في هذه الطريقة. إن اختبار TBARS هو طريقة مباشرة يمكن إكمالها في حوالي 2 ساعة. يتم وصف إعداد الكواشف المقايسة بالتفصيل هنا. يمكن للباحثين المهتمين بالميزانية استخدام هذه الكواشف لإجراء تجارب متعددة بتكلفة منخفضة بدلا من شراء مجموعة مقايسة TBARS باهظة الثمن تسمح فقط ببناء منحنى قياسي واحد (وبالتالي لا يمكن استخدامها إلا لتجربة واحدة). ويظهر تطبيق هذا المقايسة TBARS في مصل الدم البشري, البروتينات الدهنية منخفضة الكثافة, وlysates الخلية. وينبغي أن يكون المقايسة متسقة وقابلة للتكرار، ويمكن بلوغ حدود الكشف عن 1.1 ميكرومتر. وتقدم توصيات لاستخدام وتفسير المقايسة الطيفية TBARS.

Introduction

البيروكسيد الدهني هو عملية تهاجم فيها الجذور الحرة، مثل أنواع الأكسجين التفاعلية وأنواع النيتروجين التفاعلية، الروابط المزدوجة بين الكربون والكربون في الدهون، وهي عملية تنطوي على تجريد الهيدروجين من الكربون وإدخال جزيء الأكسجين. هذه العملية تؤدي إلى خليط من المنتجات المعقدة بما في ذلك، الجذور البيروكسيدات الدهنية، والهيدروكسيدات والمنتجات الأولية، وكذلك malondialdehyde (MDA) و 4 هيدروكسينالونال كمنتجات ثانوية السائدة1.

وقد استخدمت على نطاق واسع MDA في البحوث الطبية الحيوية كعلامة على البيروكسيد الدهون بسبب رد فعل سهل مع حمض ثيوباربيتريك (TBA). رد الفعل يؤدي إلى تشكيل MDA-TBA2، وهو اقتران يمتص في الطيف المرئي في 532 نانومتر وتنتج اللون الأحمر والوردي2. الجزيئات الأخرى المستمدة من بيروكسيد الدهون إلى جانب MDA يمكن أن تتفاعل أيضا مع TBA وتمتص الضوء في 532 نانومتر، مما يساهم في إشارة الامتصاص الشاملة التي يتم قياسها. وبالمثل، يمكن أن تتفاعل MDA مع معظم الفئات الرئيسية الأخرى من الجزيئات الحيوية، مما قد يحد من إمكانية الوصول إليها للتفاعل مع TBA3،4. على هذا النحو، يعتبر هذا المقايسة التقليدية ببساطة لقياس "المواد التفاعلية حمض ثيوباربيتورك" أو TBARS5.

عند تطبيقها وتفسيرها بشكل صحيح، يعتبر فحص TBARS عموما مؤشرا جيدا للمستويات الإجمالية للإجهاد التأكسدي في عينة بيولوجية6. ولسوء الحظ، وكما وثقه شوبناساسبيفاري وآخرون، فإن المقايسة التي يجريها هذا النظام كثيرا ما تجرى وتفسر بطرق تيسر استخلاص استنتاجات مشكوك فيها(3)4،7،8،9،10،11. وتعود أسباب ذلك في المقام الأول إلى المتغيرات ما قبل التحليلية المتصلة بالعينة والافتقار إلى وعورة الفحص التي تحظر الاختلافات الطفيفة على ما يبدو في بروتوكول الفحص دون تغييرات جوهرية في نتائج الفحص 1,7,12,13.

المتغيرات قبل تحليلية المتعلقة بالمناولة البيولوجية وتخزين (على سبيل المثال، بلازما الدم أبقى مؤقتا في -20 درجة مئوية)14,15 يمكن أن يكون لها تأثير كبير على نتائج TBARS الفحص16,17; لدرجة أنه لا ينبغي مقارنة نتائج فحص TBARS عبر مختبرات مختلفة ما لم تبررها بيانات التحقق التحليلية الصريحة بين الطوابق. هذه التوصية هي أقرب إلى كيفية استخدام البقع الغربية وتفسيرها. ومقارنات كثافة النطاق صالحة للدراسات داخل البقع وربما داخل المختبر، ولكن مقارنة كثافات النطاق بين المختبرات تعتبر عموما ممارسة غير صالحة.

وقد اقترح بعض الباحثين أن MDA كما تقاس من قبل المقايسة TBARS ببساطة لا تفي بالمعايير التحليلية أو السريرية المطلوبة من علامة بيولوجية مقبولة3,9,10,18,19. والواقع أنه لو لم يتم تطوير المقايسة قبل أكثر من 50 عاما، لما اكتسبت على الأرجح الاستخدام الواسع النطاق والمقبولة الضمنية التي تتمتع بها اليوم. على الرغم من أن هناك مقايسات أخرى ذات حساسية تحليلية أكبر وخصوصية ووعرة تستخدم لتحديد الإجهاد التأكسدي ، إلا أن اختبار TBARS القائم على الامتصاص عند 532 نانومتر لا يزال إلى حد بعيد أحد المقايسات الأكثر شيوعا لتحديد peroxidation20 الدهون ، وبالتالي تقييم الإجهاد التأكسدي.

لا يمكن العثور على اختبار TBARS إلا كطقم باهظ الثمن (أكثر من 400 دولار أمريكي) ، حيث لا توفر التعليمات معلومات مفصلة عن معظم تركيزات الكواشف المستخدمة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام الكواشف المقدمة لتجربة واحدة فقط، لأنه يمكن إجراء منحنى قياسي لوني واحد فقط لكل مجموعة. وهذا يمكن أن يكون مشكلة للباحثين الذين يعتزمون تحديد مستويات الأكسدة في غضون بضع عينات في نقاط زمنية مختلفة، لأنه لا يمكن استخدام نفس المنحنى القياسي في عدة مرات. وبالتالي، يجب شراء مجموعات متعددة لإجراء تجارب متعددة. حاليا، ما لم يتم شراء مجموعة مكلفة، لا يوجد بروتوكول مفصل متاح لكيفية إجراء اختبار TBARS. وقد وصف بعض الباحثين في الماضي بشكل غامض كيفية إجراء تقييم TBARS21,22 ، ولكن لا يتوفر في الأدبيات بروتوكول مفصل تماما أو فيديو شامل حول كيفية إجراء فحص TBARS دون مجموعة مكلفة.

هنا نحن تقرير مفصلة، التحقق من صحة تحليليا منهجية لهذا الغرض حول كيفية تنفيذ TBARS المقايسة بطريقة بسيطة، استنساخها، وغير مكلفة. تظهر التغيرات في بيروكسيد الدهون في المصل البشري ، وlysates HepG2 ، والبروتينات الدهنية منخفضة الكثافة عند العلاج مع أيونات Cu(II) كالتطبيقات التوضيحية لمقايسة TBARS. تظهر النتائج أن هذا المقايسة TBARS متناسقة وقابلة للاستنساخ على أساس يومي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم الحصول على عينات مصل الإنسان من المتطوعين بالتراضي بموجب موافقة مجلس الهجرة والعقاقير ووفقا للمبادئ الواردة في إعلان هلسنكي. وتم ترميز العينات وإزالة تحديدها قبل نقلها إلى المختبر التحليلي.

1. إعداد العينة

  1. lysates الخلية HepG2
    1. البذور حوالي 10 × 106 خلايا HepG2 لكل قارورة في 16 قوارير T75 مع 14 مل من وسائل الإعلام EMEM تكملها 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS) وتنمو الخلايا لمدة 2 أيام.
    2. إعداد RIPA العازلة: في أنبوب 50 مل، إضافة 1.5 مل من 5 M NaCl، 2.5 مل من 1 M تريس-HCl (درجة الحموضة = 7)، 500 ميكرولتر من كاشف NP-40، ثم جلب الحجم النهائي إلى 50 مل مع مياه DI.
    3. إعداد العازلة تحلل: aliquot 20 مل من العازلة RIPA في أنبوب 50 مل وإضافة 200 ميكرولتر من محلول مثبط 100x بروتياز لمنع البروتين وتدهور الدهون. يخزن عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: Lysis المخزن المؤقت متوافق مع الكواشف TBARS ولا تتداخل مع امتصاص في 532 نانومتر. إذا التخطيط لاستخدام مخزن مؤقت تحلل مختلفة أو إضافة مكونات إضافية إلى المخزن المؤقت تحلل، يجب إجراء دراسات التحقق الأولية للتحقق من أن مكونات المخزن المؤقت تحلل متوافقة مع المقايسة TBARS.
    4. إزالة الوسائط التي تحتوي على 10٪ FBS وغسل الخلايا 2x مع 5 مل من البارد، عقيمة 1x برنامج تلفزيوني.
    5. أضف 1 مل من حاجز التحلل إلى قوارير T75 التي تحتوي على الخلايا واحتضانها لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT) مع دوامة مستمرة لضمان توزيع المخزن المؤقت بشكل جيد.
    6. جمع lysates في المسمى بشكل مناسب 2 مل المفاجئة كاب أنابيب البولي بروبلين واحتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة.
    7. تدور lysates في 5000 × ز لمدة 10 دقيقة في RT لجمع حطام الخلية ، واستنشق النابات في أنبوب واحد 15 مل.
    8. تركيز الخلية lysate supernatant أربعة أضعاف باستخدام سرعة فاك في 50 درجة مئوية و 3 مبار وجعل aliquots من 94 ميكرولتر لكل منهما في أنابيب البولي بروبلين المفاجئة 2 مل. تخزين العينات في -80 درجة مئوية حتى يتم استخدامها للأكسدة في المختبر و / أو TBARS المقايسة.
      ملاحظة: لتجنب تركيز supernatant lysate الخلية، يمكن أيضا فصل الخلايا باستخدام 3 مل من 1x تريبسين، تحييد مع 6 مل من وسائل الإعلام، وغسلها 2x مع 5 مل من برنامج تلفزيوني الباردة. ويمكن بعد ذلك إعادة تشكيل الكريات الخلية في 250 ميكرولتر من العازلة تحلل، ويمكن بعد ذلك تنفيذ الخطوات 1.1.6 و 1.1.7.
    9. إعداد محلول مخزون CuCl2 35 mM في حمض الخليك (درجة الحموضة = 4).
      1. إعداد محلول حمض الخليك (درجة الحموضة = 4): تمييع 1 ميكرولتر من حمض الخليك الجليدي في 100 مل من ماء DI (يجب أن يكون درجة الحموضة حوالي 4 ولكن تأكد من ذلك مع مقياس درجة الحموضة). أضف المزيد من الماء أو حمض الخليك لضبط درجة الحموضة إلى 4.
      2. الوزن من حوالي 0.1936 غرام من النحاس الثاني كلوريد وتذوب في 10 مل من محلول حمض الخليك (درجة الحموضة = 4) لجعل 144 MM CuCl2 الأسهم. Aliquot 490 ميكرولتر من هذا الحل وإضافة إلى 1510 ميكرولتر من حمض الخليك (درجة الحموضة = 4) لجعل محلول CuCl2 35 mM.
    10. Aliquot 6 ميكرولتر من محلول الأسهم CuCl2 35 mM وإضافته إلى ست عينات تحتوي على 94 ميكرولتر من lysate الخلية لجعل تركيز CuCl2 النهائي من حوالي 2 mM. إضافة 6 ميكرولتر من محلول حمض الخليك (درجة الحموضة = 4) التي ليس لديها CuCl2 إلى ست عينات تحتوي على 94 ميكرولتر من lysates الخلية لاستخدامها كعناصر تحكم. يجب أن يكون الحجم النهائي للخلية lysate 100 ميكرولتر، وهو ما سيتم استخدامه في اختبار TBARS.
      ملاحظة: جعل محلول المخزون CuCl2 35 mM في حمض الخليك (درجة الحموضة = 4) ضروري لمنع هطول الأمطار من هيدروكسيد النحاس.
    11. احتضان العينات في الفرن عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة وإجراء اختبار TBARS على كل عينة تحتوي على حجم نهائي قدره 100 ميكرولتر.
    12. كرر الخطوتين 1.1.9 و 1.1.11 2x في أيام منفصلة للتحقق من إمكانية إعادة إنتاج المقايسة TBARS ل lysates الخلية HepG2.
  2. البروتينات الدهنية منخفضة الكثافة
    ملاحظة: عادة ما يحتوي البروتين الدهني منخفض الكثافة (LDL) الذي يتم تنقيته مسبقا على كمية معينة من EDTA. تحتوي عينات LDL المستخدمة هنا على 0.01٪ EDTA. EDTA يمكن أن تمنع في المختبر Cu(II) بوساطة أكسدة LDL. وبالتالي، قد يكون من الضروري إزالة EDTA من عينات LDL قبل التجارب أو التحليل. تصف الخطوات 1.2.1-1.2.5 هذه العملية.
    تنبيه: هيدروكسيد الصوديوم هو تآكل ويسبب تهيج في الجلد والعينين. استخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة.
    1. Aliquot 24 μL من 5.51 ملغ / مل مخزون LDL (تركيز البروتين التي تحددها طريقة لوري المعدلة باستخدام BSA كمعيار) في المسمى بشكل مناسب 1 مل المفاجئة كاب أنابيب البولي بروبلين. جعل العديد من aliquots حسب الحاجة وتخزينها في 4 درجة مئوية حتى استخدامها في الأكسدة و / أو TBARS المقايسة.
    2. إعداد 10 MM HEPES العازلة في 0.15 M NaCl تعديلها إلى درجة الحموضة = 7 مع حبات NaOH: حل 4.39 غرام من NaCl في 0.49 لتر من الماء، ثم إضافة 1.19 غرام من HEPES. تذوب جيدا مع شريط ضجة. أضف حبات هيدروكسيد الصوديوم حتى يبلغ رقم الحموضة 7. تمييع إلى 0.5 لتر مع الماء. تخزين المخزن المؤقت عند 4 درجة مئوية واستخدامه في غضون 3 أشهر.
    3. أضف 476 ميكرولتر من المخزن المؤقت HEPES سعة 10 أمتار في 0.15 M NaCl (درجة الحموضة = 7) إلى عينات LDL التي تم اقتباسها من أجل رفع الحجم النهائي إلى 500 ميكرولتر. أضف عينة LDL المخففة إلى جهاز فلتر دوران طرد مركزي سعة 0.5 مل مع قطع الوزن الجزيئي 100K.
    4. تدور العينات في 14000 × ز لمدة 10 دقيقة في RT ، وترك حجم retentate النهائي من حوالي 30 ميكرولتر. إعادة تشكيل العينات في 480 ميكرولتر من المخزن المؤقت HEPES 10 mM في 0.15 M NaCl (pH = 7) وتدور مرة أخرى في 14000 × غرام لمدة 10 دقائق في RT. تنفيذ هذه الخطوة 2x لما مجموعه أربعة تدور من خلال.
    5. ضع جهاز التصفية رأسا على عقب في أنبوب جديد من البولي بروبلين سعة 2 مل ، وجهاز طرد مركزي عند 1000 × ز لمدة دقيقتين لجمع عينة LDL (الحجم النهائي = حوالي 30 ميكرولتر).
    6. عينة Aliquot في أنبوب 1 مل المسمى بشكل مناسب وإضافة 20 ميكرولتر من الماء إلى كل عينة لتحقيق حجم نهائي قدره 50 ميكرولتر.
    7. إعداد محلول مخزون 200 ميكرومتر CuCl2 في حمض الخليك (درجة الحموضة = 4)
      1. إعداد محلول حمض الخليك (درجة الحموضة = 4): انظر الخطوة 1.1.9.1.
      2. إعداد محلول الأسهم 144 mM CuCl2 (انظر الخطوة 1.1.9.2)، ثم aliquot 5.5 ميكرولتر من المخزون CuCl2 144 mM وتذوب في حجم نهائي من 4 مل من حمض الخليك (درجة الحموضة = 4) لجعل الحل 200 ميكرومتر.
    8. Aliquot 2.7 ميكرولتر من محلول المخزون 200 ميكرومتر CuCl2 وإضافته إلى ست عينات تحتوي على 50 ميكرولتر من LDL لتحقيق تركيز CuCl2 النهائي من ~ 10 ميكرومتر. إضافة 2.7 ميكرولتر من محلول حمض الخليك (درجة الحموضة = 4) التي لا تحتوي على CuCl2 إلى ست عينات تحتوي على 50 ميكرولتر من LDL لاستخدامها في عناصر التحكم.
    9. احتضان عينات LDL لمدة 2 ساعة في الفرن عند 37 درجة مئوية. بعد 2 ساعة، أحضر وحدة التخزين النهائية إلى 100 ميكرولتر لكل عينة مع 10 mM HEPES المخزن المؤقت في 0.15 M NaCl (درجة الحموضة = 7). إجراء على الفور اختبار TBARS.
    10. كرر الخطوات 1.2.3-1.2.9 2x في يومين مختلفين لاختبار استنساخ اختبار TBARS.
  3. مصل الإنسان
    1. من عينة مصل الإنسان، وجعل aliquots من 94 ميكرولتر لكل منهما في أنابيب البولي بروبلين المفاجئة 2 مل وتخزين العينات في -80 درجة مئوية.
    2. إعداد محلول الأسهم CuCl2 35 mM في حمض الخليك (درجة الحموضة = 4): انظر الخطوة 1.1.9.
    3. Aliquot 6 ميكرولتر من محلول المخزون CuCl2 وإضافته إلى ست عينات تحتوي على 94 ميكرولتر من المصل البشري لجعل تركيز CuCl2 النهائي من حوالي 2 mM. إضافة 6 ميكرولتر من محلول حمض الخليك (درجة الحموضة = 4) التي ليس لديها CuCl2 إلى ست عينات تحتوي على 94 ميكرولتر من المصل البشري لاستخدامها كضوابط.
    4. احتضان عينات مصل الإنسان لمدة 24 ساعة في الفرن عند 37 درجة مئوية وتحديد مستويات الأكسدة مع اختبار TBARS (القسم 4).
    5. كرر الخطوات 1.3.2-1.3.4 2x في يومين منفصلين لتحديد إمكانية إعادة إنتاج المقايسة TBARS.

2. إعداد الكاشف

تنبيه: حمض ثيوباربيتريك يسبب تهيج الجلد والعين وربما ضار عن طريق الاستنشاق أو امتصاص الجلد. حمض الخليك يمكن أن تلحق الضرر الأجهزة الداخلية إذا استنشقت. إعداد جميع المحاليل الحمضية في غطاء الدخان.

  1. إعداد محلول دودسيلسلفات الصوديوم بنسبة 8.1٪ (ث/v)
    1. الوزن من أصل 32.4 غرام من SDS وتذوب في 350 مل من المياه DI في كوب. استخدام شريط تحريك المغناطيسي لإذابة SDS بلطف وتجنب صنع فقاعات. جلب الحجم النهائي إلى 400 مل مع المياه DI وتخزين حل SDS في RT.
      ملاحظة: هنا، يتم إعداد حل SDS 8.1٪ الزائدة; ومع ذلك، بالنسبة لعينات 96، هناك حاجة فقط حوالي 20 مل من الحل SDS 8.1٪. إعداد هذا الحل وفقا لعدد العينات التي يجري تحليلها.
  2. إعداد 3.5 M خلات الصوديوم العازلة (pH = 4)
    1. تمييع 100 مل من حمض الخليك الجليدي في 350 مل من مياه DI في كوب. استخدام شريط تحريك المغناطيسي لإذابته بلطف.
    2. إعداد محلول NaOH 6.5 M باستخدام حبات هيدروكسيد الصوديوم في الماء. حل 13 غرام من حبات NaOH في 40 مل من مياه DI وبذلك إلى حجم نهائي من 50 مل مع مياه DI.
    3. أضف ببطء حوالي 46 مل من محلول NaOH 6.5 M إلى محلول حمض الخليك أثناء الاختلاط مع شريط التقليب (يجب أن يرفع هذا الرقم إلى 4 ، ولكن تأكد عن طريق إضافة محلول NaOH ببطء أثناء القياس باستخدام مقياس درجة الحموضة).
    4. جلب الحجم النهائي إلى 500 مل مع المياه DI وتخزين خلات الصوديوم العازلة في RT.
  3. إعداد محلول مائي بنسبة 0.8٪ من حمض ثيوباربيتوريس (معدلة إلى درجة الحموضة = 4)
    ملاحظة: في هذه الخطوة، إعداد حمض ثيوباربيتوريك هو الأمثل لكميات كبيرة، منذ عدد كبير من العينات سوف يتم تحليل (108 عينات، لا تشمل المعايير). إعداد هذا الحل اعتمادا على عدد العينات المخطط لتحليلها.
    1. إعداد محلول هيدروكسيد الصوديوم 5 M باستخدام حبات هيدروكسيد الصوديوم والماء: حل 4 غرام من حبات هيدروكسيد الصوديوم في حجم نهائي من 20 مل من الماء. تخزينها في وعاء من البلاستيك. يجب أن يكون هذا الحل جاهزا حديثا لكل دفعة.
    2. الوزن 4 غرام من حمض ثيوباربيتيوريك وإضافة 450 مل من مياه DI. استخدام شريط تحريك المغناطيسي لإذابته بلطف.
      ملاحظة: سيتم إحضار هذا الحل أخيرا إلى وحدة تخزين إجمالية 500 مل.
    3. أثناء إذابة حمض ثيوباربيتيوريك مع شريط تحريك، أضف (ببطء وبطريقة دروبية) حوالي 3 مل من محلول 5 M NaOH بزيادات 100 ميكرولتر. بعد إضافة محلول NaOH ، ستبدأ جزيئات حمض ثيوباربيتريك في الذوبان.
    4. إذا كانت جزيئات حمض ثيوباربيتيوريك لا تزال لم تذوب تماما، إضافة المزيد من محلول NaOH M 5 في زيادات 100 ميكرولتر حتى يتم حل جميع جزيئات حمض ثيوباربيتوريس بالكامل. لهذا الحجم الخاص من الحل، يتم إضافة ما مجموعه 4 مل من محلول NaOH M 5 لإذابة جزيئات حمض ثيوباربيتيوريك بشكل كامل.
      ملاحظة: عند هذا التركيز، لن يذوب حمض ثيوباربيتيوريك تماما ما لم يكن درجة الحموضة 4 تقريبا.
    5. التوقف عن إضافة NaOH بعد كل حمض ثيوباربيتيوريك قد حلت تماما. تجنب تجاوز رقم الحموضة 4. يمكن التحقق من درجة الحموضة النهائية عن طريق أخذ 1 ميكرولتر من محلول حمض thiobarbituric الخلط ووضعه على ورق درجة الحموضة.
    6. جلب الحجم النهائي إلى 500 مل مع المياه DI وتخزين مائي 0.8٪ محلول حمض ثيوباربيتيوريك في RT.

3. Malondialdehyde بيس (ثنائي ميثيل الأسيتال) إعداد عينة قياسية

ملاحظة: مالونديالدهيد (MDA) غير مستقرة وغير متوفرة تجاريا. ومع ذلك، هناك أشكال كيميائية مختلفة من MDA التي تتوفر تجاريا، مثل MDA رباعي البوتيلامونيوم الملح، MDA بيس (ثنائي ميثيل الأسيتال)، وMDA بيس (ديثيل الأسيتال). من هذه الأشكال الكيميائية الثلاثة، يستخدم MDA bis (ثنائي ميثيل الأسيتال) هنا، لأن غالبية الدراسات تستخدم هذا المعيار نفسه21،22. إذا اختار استخدام الشكلين الكيميائيين الآخرين من MDA ، يجب إجراء التحقق المسبق من مدى ملاءمتها.

  1. إعداد 550 ميكرومتر MDA بيس (ثنائي ميثيل الأسيتال) حل الأسهم عن طريق تمييع 92 ميكرولتر من نقية MDA بيس (ثنائي ميثيل الأسيتال) في 1 لتر من المياه DI. استخدم شريط تحريك مغناطيسي لخلط المحلول جيدا لمدة 10 دقائق. تخزين الحل في 4 درجة مئوية واستخدامها في غضون شهر واحد.
  2. إعداد 200 ميكرومتر MDA بيس (ثنائي ميثيل الأسيتال) عن طريق تمييع 726 ميكرولتر من 550 ميكرومتر MDA بيس (ثنائي ميثيل الأسيتال) الأسهم في 1274 ميكرولتر من المياه DI. يجب إعداد هذا الحل 200 ميكرومتر MDA bis(dimethyl acetal) طازجا في كل مرة يتم فيها إجراء فحص TBARS.
  3. إعداد منحنى القياسية: اتخاذ ثمانية أنابيب البولي بروبلين المفاجئة 2 مل وتسميتها مع الحروف A من خلال H. إضافة MDA بيس (ثنائي ميثيل الأسيتال) من المخزون 200 ميكرومتر وتمييع في الماء على النحو المبين في الجدول 1.
  4. خذ ثمانية أنابيب زجاجية (13 مم × 100 مم) وسمها A-H، ثم أضف 100 ميكرولتر من المعيار إلى الأنابيب المقابلة. إجراء ست نسخ متماثلة لمعيار فارغ (عينة A) لحساب حدود الكشف عن المقايسة TBARS.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا لمدة لا تزيد عن ساعة واحدة.

4. TBARS المقايسة

ملاحظة: بمجرد بدء اختبار TBARS يجب أن يتم الانتهاء دون إيقاف.

  1. خذ أكبر عدد ممكن من الأنابيب الزجاجية حسب الحاجة لتحليل عدد العينات وتسميتها بأسماء العينات. ثم، إضافة 100 ميكرولتر من كل عينة أعدت (كما هو موضح أعلاه) إلى كل أنبوب زجاجي.
  2. إضافة 200 ميكرولتر من 8.1٪ SDS إلى كل عينة ومعيار ودوامة بلطف أنبوب الزجاج في حركة دائرية لخلط العينة.
  3. أضف 1.5 مل من خلات الصوديوم العازلة 3.5 M (pH = 4) إلى كل عينة ومعيار.
  4. إضافة 1.5 مل من محلول حمض ثيوباربيتريك المائي 0.8٪ (درجة الحموضة = 4) إلى كل عينة ومعيار.
  5. رفع الحجم النهائي إلى 4 مل لكل عينة ومعيار بإضافة 700 ميكرولتر من مياه DI.
  6. قم بسقف كل أنبوب زجاجي بإحكام واحتضنه في كتلة تسخين تم ضبطها على 95 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. تغطية أنابيب الزجاج مع رقائق الألومنيوم لمنع التكثيف في قمم الأنابيب.
  7. إزالة الأنابيب الزجاجية من كتلة التدفئة واحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة.
  8. عينات أجهزة الطرد المركزي والمعايير في 1500 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية. بعد الطرد المركزي، احتفظ بالأنابيب الزجاجية التي تحتوي على العينات والمعايير في RT.
    ملاحظة: إن إبقاء العينات على الجليد أو عند درجة حرارة 4 مئوية سيؤدي إلى ترسب العينة بأكملها أو المعيار.
  9. مباشرة بعد الطرد المركزي، aliquot 150 ميكرولتر من supernatant من كل أنبوب ومكان في بئر منفصلة من لوحة بئر 96.
  10. إزالة أي فقاعات من كل بئر باستخدام تلميح ماصة.
    ملاحظة: سيؤدي وجود الفقاعات إلى قراءات امتصاص غير متناسقة ، مما يؤدي إلى عدم الدقة العالية.
  11. قراءة الامتصاصات في 532 نانومتر. طرح متوسط قراءة الامتصاص للعينات الفارغة من جميع قراءات الامتصاص الأخرى.
  12. إنشاء منحنى قياسي عن طريق رسم قراءات امتصاص فارغة طرح في 532 نانومتر مقابل تركيز معروف من كل معيار. احتواء نقاط البيانات باستخدام الانحدار الخطي. حساب تركيزات عينة غير معروف باستخدام معادلة خط الانحدار الخطي التي تم الحصول عليها من المنحنى القياسي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في ظل الظروف الحمضية (درجة الحموضة = 4) وعند 95 درجة مئوية، مالونديالدهيد (MDA) بيس (ثنائي ميثيل الأسيتال) غلة MDA23. MDA والمتجانسات الكيميائية ذات الصلة الوثيقة تتفاعل مع اثنين من جزيئات حمض ثيوباربيتيوريك (TBA) لإنتاج مركبات تسمى المواد التفاعلية حمض thiobarbituric (TBARS), التي تعطي اللون الأحمر والوردي ولها امتصاص λmax في 532 نانومتر (الشكل 1, الشكل 2). وباستخدام ثنائي الفينيل متعدد الدالات (ثنائي ميثيل الأسيتال) كمعيار، تم توليد منحنيات قياسية (الشكل 3، الجدول 1) لتحديد حدود الكشف عن المقايسة ومستويات الأكسدة ومستوياتها في ثلاث عينات بيولوجية مختلفة. تم إجراء ما مجموعه تسعة اختبارات TBARS لتحديد مستويات الأكسدة في العينات الثلاث المختلفة في أيام مختلفة. ومن ثم، تم توليد ما مجموعه تسعة منحنيات قياسية، كما هو مبين في الشكل 3. تم استخدام الإجراء المربعات الأقل24 لتحديد الانحرافات المعيارية للمنحدر واعتراض ص، والتي كانت 8.67 × 10-6 و 5.66 × 10-4، على التوالي.

وقد حددت حدود الكشف عن المقايسة TBARS وفقا للإجراءات التحليلية القياسية25 عن طريق قياس امتصاص العينات الفارغة (ستة تكرارات تجريبية مع تكرارين تقنيين لكل تكرار تجريبي) في ثلاثة أيام مختلفة. تم تحديد الحد الأدنى للإشارة التحليلية المميزة (SM) من خلال تلخيص متوسط الإشارة الفارغة (S'bl) بالإضافة إلى k متعددة من الانحراف المعياري للفراغ (ksbl) ، حيث k = 3. وهذا هو ، SM = S'bl + ksbl. باستخدام SM ومنحدر المنحنى القياسي (m)، تم حساب حد الكشف (cm) على أنه cm = (Sm - Ssbl) / م. وتبين البيانات الناتجة عن العينات الفارغة في ثلاثة أيام مختلفة أن الحد الأدنى لتركيز مادة TBARS اللازمة لإعطاء إشارة امتصاص غير ضوضاء يمكن اكتشافها هو 1.1 ميكرومتر (الجدول 2). تبلغ حساسية المقايسة TBARS حوالي 0.00160 وحدة امتصاص /ميكرومتر، وهي قدرة المقايسة على التمييز بين الاختلافات في تركيز التحليل (الجدول 2).

لتوضيح إمكانية تطبيق المقايسة TBARS في الكشف عن التغيرات في بيروكسيد الدهون في المصفوفات البيولوجية المختلفة ، تم استخدام CuCl2 للحث على أكسدة المختبر للمصل البشري ، وlysates الخلية HepG2 ، والبروتينات الدهنية منخفضة الكثافة. هذه العينات البيولوجية المستخدمة هنا هي نماذج من المصفوفات البيولوجية. على سبيل المثال، استنادا إلى النتائج المعروضة هنا ل lysates الخلية HepG2، فمن المعقول أن نتوقع أن هذا الفحص ستعمل مع أنواع أخرى من lysate الخلية؛ ومع ذلك، فإنه يحتاج إلى التحقق من صحة تحليل لهذا الغرض. أيضا، من المصفوفات البيولوجية الثلاثة المستخدمة هنا، فمن الشائع لأنواع معينة من العينات لإظهار تركيزات داخلية منخفضة من TBARS. على سبيل المثال، TBARS لlysates الخلية HepG2 التي لم تعالج مع CuCl2 كانت أعلى بقليل من الحد الأقصى للكشف عن المقايسة (حوالي 2 ميكرومتر; الشكل 4- الأرقام 4- الأرقام 4- وكما هو متوقع في وجود نسب منخفضة من الإشارة إلى الضوضاء، فإن الانحراف المعياري ومعامل الاختلاف لهذه العينة بالذات مرتفعان نسبيا (الجدول 3). ومع ذلك ، مع زيادة الإشارة نتيجة للأكسدة بوساطة Cu(II) ، يصبح معامل الاختلاف أقل. وبصفة عامة، ومع زيادة الامتصاص إلى ما بعد حد الكشف، تتحسن قابلية الاستنساخ للكشف (الجدول 3).

لأغراض هذا البروتوكول، لم تكن هناك رغبة في استخدام المواد المضادة للاكسدة لإخفاء الأكسدة في المختبر Cu(II) بوساطة من العينات البيولوجية. قد يحتوي البروتين الدهني منخفض الكثافة (LDL) المعد تجاريا على 0.01٪ من EDTA. سوف EDTA منع Cu(II) بوساطة أكسدة LDL ولكن ليس بالضرورة غيرها من التفاعلات الأكسدة بوساطة معدنية26,27. تم إجراء فحص TBARS على عينات LDL التي تحتوي على EDTA ، ولم تتغير مستويات TBARS بين عينات LDL المعالجة وغير المعالجة Cu(II) (الشكل 5A). ومع ذلك، بعد إزالة EDTA عن طريق ترشيح الدوران (انظر الخطوة 1.2.3-1.2.5)، خضع LDL للأكسدة بوساطة Cu(II)، كما تم اكتشافه من خلال فحص TBARS (الشكل 5B).

يتراوح المعدل الطبيعي لمنتجات البيروكسيد الدهون في مصل الدم البشري من المتبرعين الأصحاء المعبر عنه من حيث MDA بين 1.80-3.94 ميكرومتر28. لتوضيح النطاق الديناميكي لمقايسة TBARS في المصل البشري ، تم إضافة تركيز 2 mM Cu(II) أيونات إلى العينات ، تليها الحضانة لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية. وأدى ذلك إلى زيادة 6x-7x في TBARS (الشكل 6).

Figure 1
الشكل 1: تيوباربيتوريك حمض المواد التفاعلية المقايسة التخطيطي.
تضاف مائة ميكرولتر من العينة أو المعيار إلى أنبوب زجاجي 13 مم × 100 مم ، يليه إضافة مواد تفاعل حمض ثيوباربيتوريس (TBARS). بعد الحضانة عند 95 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة، يتم احتضان العينات والمعايير في الجليد لمدة 30 دقيقة، ثم يتم طردها في 1500 × غرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. يتم تحميل مائة وخمسين ميكرولتر من العينة أو الفائقة القياسية على لوحة بئر 96 ، ويتم قياس الامتصاص عند 532 نانومتر. يتم حساب تركيز العينة غير معروف باستخدام معادلة المنحنى القياسي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: رد فعل المواد التفاعلية حمض thiobarbituric من النوع الأصلي.
مالونديالديهيد بيس (ثنائي ميثيل الأسيتال) ينتج مالونديالديهيد تحت التحلل المائي الحمضي الحفاز1. صدر Malondialdehyde (MDA) ثم يتفاعل مع اثنين من جزيئات حمض 2-thiobarbituric (TBA) (درجة الحموضة = 4 و 95 درجة مئوية) لتشكيل MDA-TBA2 الحث التي تعطي اللون الأحمر والوردي ويمكن قياس الطيفية في 532 نانومتر. لأن الجزيئات الأخرى إلى جانب MDA المشتقة من الدهون المؤأكسدة يمكن أن تتفاعل أيضا مع TBA ، فإن قياس الامتصاص عند 532 نانومتر يشار إليه ببساطة كقياس للمواد التفاعلية لحمض ثيوباربيتوريك ، أو TBARS. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: المنحنيات القياسية اللونية Malondialdehyde bis (ثنائي ميثيل الأسيتال).
يظهر الشكل تسعة منحنيات قياسية كما تم إنشاؤها في أيام مختلفة. وتتداخل بعض النقاط ولا يمكن تمييزها عن بعضها البعض. تم تحصين مالونديالديهيد بيس (ثنائي ميثيل الأسيتال) في عينات معايرة في 0 و 2.5 و 5 و 10 و 20 و 40 و 80 و 160 ميكرومتر (كما هو موضح في الجدول 1؛ n = 1 لكل نقطة تركيز في اليوم). وقد قيست الامتصاص عند 532 نانومتر، مع طرح متوسط امتصاص العينات الفارغة من جميع القياسات في تلك الدفعة، بما في ذلك المجهولات. كل يوم، تم استخدام المعادلة الناتجة عن الانحدار الخطي الأقل مربعات لتحديد TBARS في العينات البيولوجية. وبالنسبة لجميع المنحنيات المعيارية التسعة مجتمعة، كان الانحراف المعياري للمنحدر 8.67 × 10-6، وكان الانحراف المعياري لاعتراض y 5.66 × 10-4. تم حساب الانحرافات المعيارية للمنحدر وتقاطع y باستخدام إجراء المربعات الأقل24. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: الأكسدة في lysates HepG2 التي كشفها TBARS.
تم احتضان ست عينات من lysate الخلية HepG2 مع 2 M M CuCl2 [HepG2 الخلية lysate + 2 mM Cu(II)] وتم احتضان ست عينات في حل دون CuCl2 (HepG2 خلية lysate) لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية. وبعد الحضانة، أجريت اختبارات TBARS على العينات الاثنتي عشرة. تكرر هذا الإجراء 2x لمدة ثلاثة أيام مختلفة. تمثل أشرطة الخطأ SD. تشير النجمة إلى اختلافات ذات دلالة إحصائية بين عنصر التحكم وlysates المعالجة Cu(II) (p < 0.001). تم تحديد الأهمية الإحصائية باستخدام اختبار مان ويتني يو في GraphPad. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: الأكسدة في البروتين الدهني منخفض الكثافة التي اكتشفها TBARS.
(أ) TBARS المقايسة التي أجريت في عينات LDL التي تحتوي على 0.01٪ EDTA. تم احتضان ست عينات LDL مع 10 μM CuCl2 [LDL + 10 ميكرومتر Cu(II)] ، وتم احتضان ست عينات مع محلول تحكم مع عدم إضافة CuCl2 (LDL الأصلي) لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية. ثم تم إجراء فحص TBARS على العينات ال 12. "ns" لا يمثل أي أهمية إحصائية. (ب) تم تصفية LDL باستخدام جهاز تصفية دوران الطرد المركزي لإزالة EDTA. ثم، الحضانة مع وبدون إضافة Cu(II) تم تنفيذها مرة أخرى كما هو موضح ل (A). تم إجراء فحص TBARS بعد ذلك مباشرة. تكرر هذا الإجراء نفسه 2x لمدة إجمالية قدرها 3 أيام. تمثل أشرطة الخطأ SD. تشير النجمة إلى اختلافات ذات دلالة إحصائية بين عينات ال LDL المعالجة من Cu(II) (p < 0.001). تم تحديد الأهمية الإحصائية باستخدام اختبار مان ويتني يو في GraphPad. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: بيروكسيد الدهون في عينات مصل الإنسان التي اكتشفتها TBARS.
تم احتضان ست عينات مصل بشري مع 2 mM CuCl2 [مصل + 2 mM Cu(II)]، وتم احتضان ست عينات بمحلول لم يكن لديه أي CuCl2 مضاف (مصل طبيعي) لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية. وبعد الحضانة، أجريت اختبارات TBARS على العينات الاثنتي عشرة. وقد تكرر هذا الإجراء في يومين إضافيين. تمثل أشرطة الخطأ SD. تشير النجمة إلى اختلافات ذات دلالة إحصائية بين عينات المصل المعالجة من Cu(II) (p < 0.001). تم تحديد الأهمية الإحصائية باستخدام اختبار مان ويتني يو في GraphPad. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

أنبوب زجاجي 200 ميكرومتر من MDA bis (ثنائي ميثيل الأسيتال) (μL) الماء (ميكرولتر) MDA بيس (ثنائي ميثيل الأسيتال) التركيز النهائي (μM)
Aa 0 1000 0
B 12.5 987.5 2.5
C 25 975 5
D 50 950 10
E 100 900 20
F 200 800 40
G 400 600 80
H 800 200 160

الجدول 1: إعداد العينة القياسية من Malondialdehyde bis (ثنائي ميثيل الأسيتال). من 200 ميكرومتر مالونديالدهيد بيس (ثنائي ميثيل الأسيتال)، aliquot الأحجام المقترحة للوصول إلى التركيز النهائي للمنحنى القياسية. من المستحسن إجراء ست نسخ متماثلة على الأقل من عينة فارغة (A) يوميا لتحديد حدود الكشف عن الأسلوب.

يوم ماصة سبلب Smc الحساسية (وحدات الامتصاص/μM)d cm (μM)e
1 (ن = 6) 0.0412 0.000612 0.0430 0.00160 1.14
2 (ن = 6) 0.0415 0.000632 0.0433 0.00160 1.18
3 (ن = 6) 0.0413 0.000605 0.0431 0.00160 1.13
كل ثلاثة أيام (ن = 18) 0.0413 0.000589 0.0431 0.00160 1.10
أ امتصاص العينات الفارغة في ثلاثة أيام مختلفة مع 6 تكرارات في اليوم الواحد.
bSbl = الانحراف المعياري لامتصاص العينات الفارغة.
cSm = الحد الأدنى من الإشارة التحليلية المميزة، والتي تم تحديدها من خلال تلخيص متوسط الإشارة الفارغة (S'bl) بالإضافة إلى k متعددة من الانحراف المعياري للفراغ (ksbl)، حيث k = 3. وهذا هو؛ SM = S'bl + ksbl.
د حساسية المقايسة TBARS، وهو منحدر المنحنى القياسي.
ecm = حدود الكشف، والتي تم حسابها على أنها cm = (Sm - Ssbl)/m، حيث m = ميل المنحنى القياسي.

الجدول 2: حدود الكشف عن المقايسة TBARS.

البروتين الدهني منخفض الكثافة مصل الإنسان HepG2 الخلية ليسات
يوم ٪ السيرة الذاتية يوم ٪ السيرة الذاتية يوم ٪ السيرة الذاتية
1 (ن = 6) 5.6 1 (ن = 6) 7.9 1 (ن = 6) 12.6
2 (ن = 6) 5.4 2 (ن = 6) 7.2 2 (ن = 6) 15.8
3 (ن = 6) 3.9 3 (ن = 6) 7.0 3 (ن = 6) 17.7
كل ثلاثة أيام (ن = 18)أ 7.4 كل ثلاثة أيام (ن = 18) 9.8 كل ثلاثة أيام (ن = 18) 15.5b
مع 10 ميكرومتر CuCl2 مع 2 متر CuCl2 مع 2 متر CuCl2
1 (ن = 6) 4.5 1 (ن = 6) 6.0 1 (ن = 6) 5.8
2 (ن = 6) 6.5 2 (ن = 6) 4.3 2 (ن = 6) 6.0
3 (ن = 6) 6.7 3 (ن = 6) 6.2 3 (ن = 6) 8.0
كل ثلاثة أيام (ن = 18) 6.1 كل ثلاثة أيام (ن = 18) 5.6 كل ثلاثة أيام (ن = 18) 7.3
أ تم حساب الدقة بين الأيام بتجميع البيانات من الأيام الثلاثة.
ب كانت الدقة محدودة بسبب النتائج التي كانت بالقرب من ال LOD المقايسة.

الجدول 3: قابلية استنساخ TBARS التحليلية في ثلاث عينات بيولوجية مختلفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

على الرغم من القيود1,3,4,7,8,9,10,12,13,14,15,19 وعدم ملاءمة المقارنة بين المختبرات, فإن اختبار TBARS هو واحد من أقدم 29,30 ولكن معظم المقايسات المستخدمة على نطاق واسع لقياس الإجهاد التأكسدي في العينات البيولوجية. إن المقايسة TBARS هي طريقة مباشرة لا تستغرق سوى حوالي 2 ساعة لأداء ، بمجرد إعداد جميع الكواشف المطلوبة. هنا ، وصفنا بالتفصيل كيف يمكن إجراء هذا المقايسة ، بما في ذلك منحنى قياسي ، عدة مرات بطريقة اقتصادية (حوالي 3.50 دولار أمريكي مقابل 96 عينة) ، دون الحاجة إلى شراء مجموعة مكلفة لكل دفعة من العينات.

جميع خطوات الفحص حاسمة، ولكن هناك بعض الخطوات التي تتطلب اهتماما إضافيا. على سبيل المثال، لا ينبغي أن يكون درجة الحموضة من حمض ثيوباربيتيوريك أعلى من 4. يجب اتخاذ الاحتياطات عند إضافة محلول هيدروكسيد الصوديوم إلى حمض ثيوباربيتوريس وتجنب الحصول على درجة الحموضة أكبر من 4. هناك حاجة إلى بيئة حمضية للتفاعل بين MDA و TBA أن يحدث، ويتم تحرير معيار MDA من MDA bis (ثنائي ميثيل الأسيتال) عن طريق التحلل المائي الحفاز بالأحماض. وبالتالي، قد يؤدي ارتفاع درجة الحموضة إلى نتائج غير متوقعة ومتغيرة للغاية31.

أيضا ، في حين أن هذا قد يكون واضحا لبعض القراء ، فمن الأهمية بمكان أيضا لإزالة أي فقاعات في لوحة بئر 96 قبل قياس الامتصاص. وسيؤدي وجود الفقاعات إلى قيم امتصاص عالية واختلافات بين التكرارات، مما يؤدي إلى نسبة عالية من السير الذاتية. بالإضافة إلى ذلك، بعد الحضانة 1 ساعة عند 95 درجة مئوية، لا ينبغي احتضان العينات لفترة أطول من 30 دقيقة على الجليد، لأن هذا سوف يعجل العينة بأكملها، وجمع supernatant خالية من الرواسب سيكون من الصعب تحقيقه. وتجدر الإشارة إلى أنه لا توجد نقاط توقف جيدة بمجرد بدء فحص TBARS. وينبغي استكماله بمجرد البدء فيه. وأخيرا، هناك العديد من الاختلافات المنهجية الممكنة التي يمكن تطبيقها على هذا المقايسة. يمكن زيادة تكييف البروتوكول العام الموصوف هنا (والتحقق منه) لتطبيقات محددة ، بما في ذلك تلك التي تتطلب إضافة زبالين جذريين أو أنواع أخرى من مضادات الأكسدة قبل التحليل.

في حين أن المقايسة TBARS تحظى بشعبية ، فمن المهم أن ندرك أنه ليس من المقايسة محددة جزيئيا. العديد من الجزيئات العضوية التفاعلية كيميائيا التي تحتوي على الكربونيل، بما في ذلك تلك المستمدة من الجزيئات الحيوية المؤأكسدة غير الدهون، يمكن أن تتفاعل مع TBA وبالتالي تحسب على أنها TBARS1،32،33،34. بالإضافة إلى ذلك ، فإن حدود الكشف عن المقايسة TBARS القائمة على الامتصاص لا تحصل على أفضل بكثير من حوالي 1.1 ميكرومتر ، كما تحددها هذه الطريقة. ومع ذلك، يمكن تحسين حدود الكشف باستخدام أساليب الكشف الأخرى. على سبيل المثال، الطيف مع الإثارة في 520 نانومتر والانبعاثات في 550 نانومتر توفر حساسية أعلى وحدود أفضل للكشف، كما اقترح سابقا جو وAhn35. يمكن للأساليب القائمة على قياس الطيف الكتلي أن تحسن بشكل كبير كل من خصوصية وحدود الكشف. على سبيل المثال، تم استخدام طريقة GC-MS/MS ذات التأين الكيميائي السالب الأيوني (ECNICI) لالتقاط الإلكترون للكشف عن مشتق الخماسيفلوروبينزيل من MDA في عينات المصل والبول البشرية، مع حدود للكشف عن 2 × 10-18 مول MDA على العمود36. هنا ، فإن الفصل الكروماتوغرافي ، جنبا إلى جنب مع قياس الطيف الكتلي جنبا إلى جنب ، يحسن بشكل كبير من خصوصية الجزيئية للمقايسة ، وكذلك.

ومع ذلك، وكما هو الحال مع القياسات الأخرى للعمليات التأكسدية داخل العينات البيولوجية37,38، فإن التعامل مع العينات قبل الإهتائية أمر بالغ الأهمية لنتيجة قياسات TBARS. على سبيل المثال، تخزين بلازما الدم في -20 درجة مئوية يؤدي إلى زيادات بطيئة ولكن مثيرة في تركيزات MDA39،40. وبالتالي، ينبغي افتراض أن تعرض العينات البيولوجية لظروف إذابة أو حتى إذابة جزئية لأي شيء سوى الحد الأدنى من الوقت يسبب ارتفاعا قطعيا لمستويات TBARS. وهذا يعني أنه يجب تجنب حتى التباين المتواضع في التعامل مع ما قبل التشبيه وتخزين البكيبامينات الحيوية التي يجب مقارنتها باستخدام المقايسة TBARS.

وبالنظر إلى هذه المحاذير المتصلة بالتباين قبل التحليل وكذلك الحساسية والتحديد المحدودين، يوصى باستخدام المقايسة TBARS القائمة على الامتصاص فقط للتقييم العام داخل المختبر أو تجارب البحث عن المدى. وتشمل هذه التطبيقات الدراسات التي يتم فيها مقارنة مستويات TBARS النسبية مباشرة بين مجموعة واحدة أو أكثر من العينات المماثلة بيولوجيا التي تتم معالجتها أو تخزينها معا وفصلها بمتغير واحد فقط يتم التحكم فيه بالكامل من قبل الباحثين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين مصالح مالية متنافسة أو تضارب مصالح آخر للكشف عنه.

Acknowledgments

وقد دعم البحث المبلغ عنه هنا جزئيا المعهد الوطني للسرطان التابع للمعاهد الوطنية للصحة بموجب الجائزة رقم 1000/2000. R33 CA217702 ومبادرة تعظيم تنمية الطلاب (IMSD) البرنامج. المحتوى هو فقط مسؤولية المؤلفين ولا يمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x Sterile PBS pH 7.4 1 L VWR, PA 101642--262 cell lysis reagent
50 mL self-standing centrifuge tube Corning, NY CLS430897 General material
96 well plate, Non-Treated, clear, with lid, Non-sterile Thermo Fisher Scientific, MA 280895 To measure absorbance
Amicon Ultra-0.5 100 kD centrifugal spin filter device Fisher Scientific, NH UFC510024 LDL purification
Caps for glass tubes Thermo Fisher Scientific, MA 14-930-15D for TBARS assay
Copper II Chloride SIGMA, MO 222011-250G to induce oxidation
Culture tubes, Disposable, with Screw-Cap Finish, Borosilicate Glass (13 x 100 mm) VWR, PA 53283-800 for TBARS assay
Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) ATCC, VA HB-8065 HepG2 cell media
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL eppendorf, NY 22363204 General material
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mL Genesee Sceitific, CA 22363352 General material
Fetal Bovine Serum US Source Omega Scientific, CA FB-11 for cell culture
Glacial Acetic Acid SIGMA, MO 27225-1L-R TBARS Reagent
Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x) Thermo Scientific, MA 87786 cell lysis reagent
HEPES SIGMA, MO H3375-250G LDL solvent
HepG2 Cells ATCC, VA HB-8065 Biological matrix prototype
Hydrocloric acid (HCl) Fisher Scientific, NH A144-212 cell lysis reagent
Legend Micro 17 Centrifuge Thermo Scientific, MA 75002431 General material
Low Density Lipoprotein, Human Plasma Athens Research & Technology, GA 12-16-120412 Biological matrix prototype
Magnetic Stir Bars, Octagon 6-Assortment VWR, PA 58948-025 General material
Malondialdehyde bis (dimethyl acetal) SIGMA, MO 8207560250 TBARS Standard
Multiskan Go Microplate Spectrophotometer Fisher Scientific, NH 51119200 To measure absorbance
NP-40 EMD Millipore Corp, MA 492016-100ML cell lysis reagent
Sodium Chloride SIGMA, MO S7653-1KG cell lysis reagent
Sodium dodecyl sulfate (SDS) SIGMA, MO 436143-100G TBARS Reagent
Sodium hydroxide SIGMA, MO 367176-2.5KG TBARS Reagent
SpeedVac Concentrator Thermo Scientific, MA SC250EXP For concentrating cell lysates
T-75 Flask, Tissue Culture Treated, 250 mL, w/filter cap USA Scientific, FL 658175 cell culture
Thiobarbituric Acid SIGMA, MO T5500-100G TBARS Reagent
TRIS base Fluka, GA 93362 cell lysis reagent
Trypsin (1x) VWR, PA 16777-166 To detach HepG2 cells

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tsikas, D. Assessment of lipid peroxidation by measuring malondialdehyde (MDA) and relatives in biological samples: Analytical and biological challenges. Analytical Biochemistry. 524, 13-30 (2017).
  2. Ohkawa, H., Ohishi, N., Yagi, K. Reaction of linoleic acid hydroperoxide with thiobarbituric acid. Journal of Lipid Research. 19 (8), 1053-1057 (1978).
  3. Khoubnasabjafari, M., Soleymani, J., Jouyban, A. Avoid Using Spectrophotometric Determination of Malondialdehyde as a Biomarker of Oxidative Stress. Biomarkers in Medicine. 12 (6), 551-554 (2018).
  4. Morales, M., Munné-Bosch, S. Malondialdehyde: Facts and artifacts. Plant Physiology. 180 (3), 1246-1250 (2019).
  5. Devasagayam, T. P. A., Boloor, K. K., Ramasarma, T. Methods for estimating lipid peroxidation: An analysis of merits and demerits. Indian Journal of Biochemistry and Biophysics. 40 (5), 300-308 (2003).
  6. Dasgupta, A., Klein, K. Methods for Measuring Oxidative Stress in the Laboratory. Antioxidants in Food, Vitamins and Supplements. , 19-40 (2014).
  7. Wade, C. R., van Rij, A. M. Plasma malondialdehyde, lipid peroxides, and the thiobarbituric acid reaction. Clinical Chemistry. 35 (2), 336-336 (1989).
  8. Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Reliability of malondialdehyde as a biomarker of oxidative stress in psychological disorders. BioImpacts. 5 (3), 123-127 (2015).
  9. Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Comments Concerning "Comparison of Airway and Systemic Malondialdehyde Levels for Assessment of Oxidative Stress in Cystic Fibrosis". Lung. 193 (5), 867-868 (2015).
  10. Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Vaez-Gharamaleki, J., Jouyban, A. Comments on "Salivary 8-hydroxy-2-deoxyguanosine, malondialdehyde, vitamin C, and vitamin E in oral pre-cancer and cancer: diagnostic value and free radical mechanism of action". Clinical Oral Investigations. 20 (2), 395-396 (2016).
  11. Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Comments on "An Investigation into the Serum Thioredoxin Superoxide Dismutase, Malondialdehyde, and Advanced Oxidation Protein Products in Patients with Breast Cancer". Annals of Surgical Oncology. 24, 573-576 (2017).
  12. Azizi, S., et al. Effects of analytical procedures on the repeatability of malondialdehyde determinations in biological samples. Pharmaceutical Sciences. 23 (3), 193-197 (2017).
  13. Azizi, S., et al. A possible reason for the low reproducibility of malondialdehyde determinations in biological samples. Bioanalysis. 8 (21), 2179-2181 (2016).
  14. Wasowicz, W., Neve, J., Peretz, A. Optimized steps in fluorometric determination of thiobarbituric acid- reactive substances in serum: Importance of extraction pH and influence of sample preservation and storage. Clinical Chemistry. 39 (12), 2522-2526 (1993).
  15. Jentzsch, A. M., Bachmann, H., Fürst, P., Biesalski, H. K. Improved analysis of malondialdehyde in human body fluids. Free Radical Biology and Medicine. 20 (2), 251-256 (1996).
  16. Buege, J. A., Aust, S. D. Microsomal lipid peroxidation. Methods in Enzymology. 52, 302-310 (1978).
  17. Gutteridge, J. M. C. Free-Radical Damage to Lipids, Amino-Acids, Carbohydrates and Nucleic-Acids Determined by Thiobarbituric Acid Reactivity. International Journal of Biochemistry. 14 (7), 649-653 (1982).
  18. Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Salivary malondialdehyde as an oxidative stress biomarker in oral and systemic diseases. J Dent Res Dent Clin Dent Prospects. 10 (2), 71-74 (2016).
  19. Halliwell, B., Whiteman, M. Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: How should you do it and what do the results mean. British Journal of Pharmacology. 142 (2), 231-255 (2004).
  20. Lee, R., et al. Evaluating oxidative stress in human cardiovascular disease: methodological aspects and considerations. Current medicinal chemistry. 19 (16), 2504-2520 (2012).
  21. Morel, D. W., Hessler, J. R., Chisolm, G. M. Low density lipoprotein cytotoxicity induced by free radical peroxidation of lipid. Journal of Lipid Research. 24 (8), 1070-1076 (1983).
  22. Guzmán-Chozas, M., Vicario-Romero, I. M., Guillén-Sans, R. 2-thiobarbituric acid test for lipid oxidation in food: Synthesis and spectroscopic study of 2-thiobarbituric acid-malonaldehyde adduct. Journal of the American Oil Chemists Society. 75 (12), 1711-1715 (1998).
  23. Shibata, T., et al. Identification of a lipid peroxidation product as a potential trigger of the p53 pathway. Journal of Biological Chemistry. 28 (2), 1196-1204 (2006).
  24. Skoog, D. A., West, D. M., Holler, F. J., Crouch, S. R. Sampling, standardization, and calibration. Fundamentals of Analytical Chemistry. 9th ed. , Cengage - Brooks/Cole. Belmont, CA. Ch. 7 153-196 (2014).
  25. Skoog, D. A., Holler, F. J., Crouch, S. R. Introduction. Principles of Instrumental Analysis. 6th ed. , Cengage - Brooks/Cole. Belmont, CA. Ch. 1 1-24 (2007).
  26. Seibig, S., Van Eldik, R. Kinetics of [FeII(edta)] Oxidation by Molecular Oxygen Revisited. New Evidence for a Multistep Mechanism. Inorganic Chemistry. 36 (18), 4115-4120 (1997).
  27. Jeffs, J. W., et al. Delta-S-Cys-Albumin: A Lab Test that Quantifies Cumulative Exposure of Archived Human Blood Plasma and Serum Samples to Thawed Conditions. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (10), 2121-2137 (2019).
  28. Yagi, K. Simple Assay for the Level of Total Lipid Peroxides in Serum or Plasma. Free Radical and Antioxidant Protocols. Methods in Molecular Biology. Armstrong, D. , Humana Press. Totowa, NJ. 101-106 (1998).
  29. Bernheim, F., Bernheim, M. L. C., Wilbur, K. M. The reaction between thiobarbituric acid and the oxidation products of certain lipides. Journal of Biological Chemistry. 174 (1), 257-264 (1948).
  30. Wilbur, K. M., Bernheim, F., Shapiro, O. W. The thiobarbituric acid reagent as a test for the oxidation of unsaturated fatty acids by various agents. Archives of Biochemistry. 24 (2), 305-313 (1949).
  31. Kwon, T. W., Watts, B. M. Determination of malonaldehyde by ultraviolet spectrophotometry. Journal of Food Science. 28 (6), 627-630 (1963).
  32. Esterbauer, H., Schaur, F. J., Zollner, H. Chemistry and biochemistry of 4-hydroxynonenal, malonaldehyde and related aldehydes. Free Radical Biology & Medicine. 11 (1), 81-128 (1991).
  33. Dalle-Donne, I., Rossi, R., Colombo, R., Giustarini, D., Milzani, A. Biomarkers of oxidative damage in human disease. Clinical Chemistry. 52 (4), 601-623 (2006).
  34. Jentzsch, A. M., Bachmann, H., Fürst, P., Biesalski, H. K. Improved analysis of malondialdehyde in human body fluids. Free Radical Biology and Medicine. 20 (2), 251-256 (1996).
  35. Jo, C., Ahn, D. U. Fluorometric Analysis of 2-Thiobarbituric Acid Reactive Substances in Turkey. Poultry Science. 77 (3), 475-480 (1998).
  36. Tsikas, D., et al. Development, validation and biomedical applications of stable-isotope dilution GC-MS and GC-MS/MS techniques for circulating malondialdehyde (MDA) after pentafluorobenzyl bromide derivatization: MDA as a biomarker of oxidative stress and its relation to 15(S)-8-iso-prostaglandin F2α and nitric oxide (NO). Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1019, 95-111 (2016).
  37. Barden, A. E., Mas, E., Croft, K. D., Phillips, M., Mori, T. A. Minimizing artifactual elevation of lipid peroxidation products (F 2-isoprostanes) in plasma during collection and storage. Analytical Biochemistry. 449 (1), 129-131 (2014).
  38. Jeffs, J. W., Ferdosi, S., Yassine, H. N., Borges, C. R. Ex vivo instability of glycated albumin: A role for autoxidative glycation. Archives of Biochemistry and Biophysics. 629, 36-42 (2017).
  39. Lee, D. M. Malondialdehyde in Stored Plasma. Biochemical and Biophysical Research Communications. 95 (4), 1663-1672 (1980).
  40. Tsikas, D., et al. Simultaneous GC-MS/MS measurement of malondialdehyde and 4-hydroxy-2-nonenal in human plasma: Effects of long-term L-arginine administration. Analytical Biochemistry. 524, 31-44 (2017).

Tags

الكيمياء، العدد 159، المواد التفاعلية حمض ثيوباربيتيوريك، TBARS، الأكسدة، البيروكسيد الدهون، مالونديالديهيد، MDA، حمض ثيوباربيتيوريك، TBA، الإجهاد التأكسدي
تقييم الإجهاد التأكسدي في العينات البيولوجية باستخدام اختبار المواد التفاعلية حمض ثيوباربيتريك
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Aguilar Diaz De Leon, J., Borges, C. … More

Aguilar Diaz De Leon, J., Borges, C. R. Evaluation of Oxidative Stress in Biological Samples Using the Thiobarbituric Acid Reactive Substances Assay. J. Vis. Exp. (159), e61122, doi:10.3791/61122 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter