Summary
Dit protocol illustreert de 1) de isolatie en kweek van primaire fibroblasten uit de gastrocnemius-spier van volwassen muizen, evenals 2) zuivering en karakterisering van exosomen met behulp van een differentiële ultracentrifugatiemethode in combinatie met sucrosedichtheidsgradiënten gevolgd door western blot-analyses.
Abstract
Exosomen zijn kleine extracellulaire blaasjes die door vrijwel alle cellen worden afgegeven en in alle biologische vloeistoffen worden uitgescheiden. Er zijn veel methoden ontwikkeld voor de isolatie van deze blaasjes, waaronder ultracentrifugatie, ultrafiltratie en chromatografie met uitsluiting van grootte. Ze zijn echter niet allemaal geschikt voor grootschalige exosoomzuivering en -karakterisering. Hier wordt een protocol beschreven voor het opzetten van culturen van primaire fibroblasten geïsoleerd uit skeletspieren van volwassen muizen, gevolgd door zuivering en karakterisering van exosomen uit de kweekmedia van deze cellen. De methode is gebaseerd op het gebruik van opeenvolgende centrifugatiestappen gevolgd door sucrosedichtheidsgradiënten. De zuiverheid van de exosomale preparaten wordt vervolgens gevalideerd door western blot-analyses met behulp van een reeks canonieke markers (d.w.z. Alix, CD9 en CD81). Het protocol beschrijft hoe bioactieve exosomen kunnen worden geïsoleerd en geconcentreerd voor elektronenmicroscopie, massaspectrometrie en opname-experimenten voor functionele studies. Het kan gemakkelijk worden opgeschaald of verkleind en aangepast voor exosoomisolatie uit verschillende celtypen, weefsels en biologische vloeistoffen.
Introduction
Exosomen zijn heterogene extracellulaire blaasjes met een grootte van 30-150 nm. Ze zijn gevestigde sleutelspelers in fysiologische en pathologische processen, gezien hun alomtegenwoordige verspreiding in weefsels en organen 1,2. Exosomen dragen een complexe lading eiwitten, lipiden, DNA-typen en RNA-typen, die variëren afhankelijk van het type cellen waaruit ze zijn afgeleid 1,2,3. Exosomen zijn verrijkt met eiwitten die verschillende functies hebben (d.w.z. tetraspanines, waaronder CD9 en CD63) die verantwoordelijk zijn voor fusiegebeurtenissen. Zo zijn heat shock-eiwitten HSP70 en HSP90 betrokken bij de binding en presentatie van antigeen. Bovendien nemen Alix, Tsg101 en flottilline deel aan de biogenese en afgifte van exosomen en worden ze veel gebruikt als markers van deze nanoblaasjes 2,3,4.
Exosomen bevatten ook een verscheidenheid aan RNA's (d.w.z. microRNA's, lange niet-coderende RNA's, ribosomale RNA's) die kunnen worden overgebracht naar ontvangende cellen, waar ze stroomafwaartse signalering beïnvloeden3. Omdat het wordt omsloten door een membraan van één eenheid, hangt de bioactiviteit van exosomen niet alleen af van de lading eiwitten en nucleïnezuren, maar ook van lipidecomponenten van het beperkende membraan1. Exosomale membranen zijn verrijkt met fosfatidylserine, fosfatidinezuur, cholesterol, sfingomyeline, arachidonzuur en andere vetzuren, die allemaal de exosoomstabiliteit en membraantopologie kunnen beïnvloeden 2,3. Als gevolg van de lading- en lipidenrangschikking initiëren exosomen signaalroutes in ontvangende cellen en nemen ze deel aan het behoud van de normale weefselfysiologie 1,2,4,5. Onder bepaalde pathologische omstandigheden (d.w.z. neurodegeneratie, fibrose en kanker) is aangetoond dat ze pathologische stimuli veroorzaken en verspreiden 4,6,7,8,9,10,11.
Vanwege hun vermogen om signalen te verspreiden naar naburige of verre locaties, zijn exosomen waardevolle biomarkers geworden voor de diagnose of prognose van ziektetoestanden. Bovendien zijn exosomen experimenteel gebruikt als voertuigen van therapeutische verbindingen 2,12. De mogelijke toepassing van deze nanoblaasjes in de kliniek maakt de isolatiemethode steeds belangrijker om maximale opbrengst, zuiverheid en reproduceerbaarheid te bereiken. Er zijn verschillende technieken ontwikkeld en geïmplementeerd voor de isolatie van exosomen. Over het algemeen kunnen exosomen worden geïsoleerd uit geconditioneerde celkweekmedia of lichaamsvloeistoffen door differentiële centrifugatie, grootte-uitsluitingschromatografie en immuunvangst (met behulp van in de handel verkrijgbare kits). Elke benadering heeft unieke voor- en nadelen die eerder zijn besproken 1,2,13,14.
Het geschetste protocol richt zich op de 1) isolatie en kweek van primaire fibroblasten uit de gastrocnemius-spier van volwassen muizen en 2) zuivering en karakterisering van exosomen die door deze cellen in het kweekmedium worden afgegeven. Een goed ingeburgerd protocol voor de isolatie van exosomen uit primaire fibroblasten voor functionele studies ontbreekt momenteel. Primaire fibroblasten scheiden geen grote hoeveelheden exosomen af, waardoor het isolatie- en zuiveringsproces een uitdaging is. Dit protocol beschrijft de zuivering van grote hoeveelheden zuivere exosomen uit grote kweekvolumes met behoud van hun morfologische integriteit en functionele activiteit. Gezuiverde exosomen verkregen uit geconditioneerd medium zijn met succes gebruikt in in vitro opname-experimenten om specifieke signaalroutes in ontvangende cellen te induceren. Ze zijn ook gebruikt voor vergelijkende proteomische analyses van exosomale ladingen uit meerdere biologische monsters4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures bij muizen werden uitgevoerd volgens dierprotocollen die zijn goedgekeurd door het St. Jude Children's Research Hospital, Institutional Animal Care and Use Committee en de richtlijnen van de National Institutes of Health.
1. Voorbereiding van oplossingen en media
- Bereid de digestieoplossing door 15,4 ml PBS te mengen met 2,5 ml 20 mg/ml collagenase P (eindconcentratie van 5 mg/ml), 2 ml 11 E/ml dispase II (eindconcentratie van 1,2 E/ml) en 100 μl 1,0 M CaCl2 (eindconcentratie van 5 mM).
- Bereid 500 ml primair fibroblastenmedium (DMEM compleet) door 440 ml DMEM te mengen met 50 ml FBS (10%), 5,0 ml pen/streptokokken (respectievelijk 100 E/ml en 100 μg/ml) en 5,0 ml glutaminesupplement (2 mM). Filter het medium met een vacuümfilter met een poriegrootte van 0,22 μm.
- Bereid exosoomvrij serum door nachtelijke ultracentrifugatie van FBS in polypropyleen buisjes van 38,5 ml bij 100.000 x g bij 4 °C en breng het supernatans over in een nieuw buisje.
- Bereid 500 ml exosoomvrij medium door 440 ml DMEM te mengen met 50 ml exosoomvrij serum (10%), 5 ml pen/streptokokken (100 E/ml en 100 μg/ml) en 5 ml glutaminesupplement (2 mM). Filter het medium met een vacuümfilter met een poriegrootte van 0,22 μm.
- Bereid 0,5 M Tris-HCl (pH 7,4) door 6,057 g Tris-base op te lossen in 90 ml dH 2 O en de pH aante passen tot 7,4 met HCl. Stel het volume in op 100 ml met dH2O.
- Bereid 10 mM Tris-HCl (pH 7,4)/1 mM Mg(Ac)2-oplossing (sacharose-werkoplossing) door 97,9 mldH2O te mengen met 2 ml 0,5 M Tris-HCl (pH = 7,4) en 100 μl 1 M Mg(Ac)2. Voeg vlak voor gebruik proteaseremmers toe aan de oplossing en bewaar de oplossing op ijs.
- Bereid sucrose-oplossingen met dichtheidsgradiënt op ijs volgens tabel 1. Deze oplossingen zijn voldoende om twee sucrosegradiëntbuizen te bereiden.
- Bereid 100% TCA door 40 ml dH2O toe te voegen aan 100 g TCA-poeder en meng tot het volledig is opgelost. Pas het eindvolume aan met dH2O tot 100 ml.
- Bereid 80% ethanol door 20 ml dH2O te mengen met 80 ml 100% ethanol.
- Bereid de lopende buffer voor westernvlekken voor door 1,8 l dH2O te mengen met 200 ml 10x lopende buffer.
- Bereid de western blot-overdrachtsbuffer voor door 1,4 l dH2O te mengen met 200 ml 10x overdrachtsbuffer en 400 ml methanol. Koel de overdrachtsbuffer voor op 4 °C.
- Bereid 20x Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) door 122 g Tris-base en 180 g natriumchloride op te lossen in 850 ml dH2O (pH 8,0). Stel het volume in op 1 L met dH2O.
- Bereid een blokkeerbuffer voor door 5 g magere droge melk op te lossen met 1 ml 10% Tween-20, 5 ml 20x TBS en 94 ml dH2O.
- Bereid een antilichaambuffer voor door 3 g BSA op te lossen met 1 ml 10% Tween-20, 5 ml 20x TBS en 94 ml dH2O.
- Bereid de wasbuffer voor door 100 ml 20x TBS en 20 ml 10% Tween-20 (10x) te mengen met 1,88 L dH2O.
- Bereid de ontwikkeloplossing voor door 1 volume luminol/enhance te mengen met 1 volume stabiele peroxidebuffer.
2. Dissectie van gastrocnemius (GA) muizenspier15,16
- Bereid buisjes van 50 ml met 10 ml PBS op ijs.
- Euthanaseer de muizen in een CO2 -kamer gevolgd door cervicale dislocatie.
- Verwijder de gastrocnemius-spier van beide benen en breng ze over naar de buis met PBS op ijs.
NOTITIE: Verwijder de soleusspier uit de GA-spier voordat u de GA-spier overbrengt naar PBS.
3. Isolatie en kweek van primaire fibroblasten bij muizen
- Weeg de spieren en breng ze over naar een schaal van 10 cm onder een bioveiligheidskap. Hak de spieren fijn met scalpels tot het een fijne pasta wordt.
- Breng de fijngehakte spierpasta over in een tube van 50 ml en voeg 3,5x volume/mg weefsel digestie-oplossing toe aan de tube en incubeer gedurende 45 minuten bij 37 °C. Meng de suspensie elke 10 minuten grondig met een pipet van 5 ml (dit helpt bij volledige dissociatie).
OPMERKING: Als alternatief kan voor deze stap een weefseldissociator worden gebruikt. - Voeg 20 ml DMEM compleet toe aan de celsuspensie om de digestieoplossing te inactiveren. Breng over naar een zeef met nyloncellen van 70 μm die op een buis van 50 ml is geplaatst. Vang de doorstroom op en was de celzeef met nog eens 5 ml DMEM compleet.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 300 x g bij kamertemperatuur (RT) gedurende 10 minuten en verwijder voorzichtig het supernatant.
- Resuspendeer de pellet in 10 ml DMEM compleet en zaai de cellen in een schaal van 10 cm.
- Kweek de cellen bij 37 °C, 5% CO 2, 3 % O2 (doorgang 0 of P0).
OPMERKING: 1) Deze culturen moeten op een laag zuurstofgehalte worden gehouden om fysiologische omstandigheden te garanderen (O 2-niveau in skeletspieren is ongeveer2.5%)17. 2) Het passagenummer (bijv. P0) van een celkweek is een registratie van het aantal keren dat de cultuur is gesubcultureerd. 3) Primaire fibroblasten op P0 worden routinematig gekweekt tot 100% confluentie plus 1 dag (en alleen voor P0). Dit is om andere soorten cellen te zuiveren en ervoor te zorgen dat de cellen die in de kweek aanwezig zijn alleen fibroblasten zijn, ontdaan van myogene cellen op basis van microscooponderzoek. De skeletspier van een volwassen dier op de leeftijd van 2 maanden bevat ongeveer 2% myogene voorlopercellen4. Bovendien hechten myogene voorlopers zich meestal niet aan de ongecoate schalen; Daarom gaan ze verloren tijdens de subculturatie18,19,20. Myogene cellen hebben een ander medium (F10) nodig, aangevuld met 20% FBS en basische fibroblastgroeifactor (bFGF)18. In DMEM complete hebben medium fibroblasten een hogere proliferatiesnelheid dan de myogene cellen, wat resulteert in de eliminatie van deze besmettende cellen vóór de eerste passage. - Spoel de P0-cellen met PBS wanneer 100% confluent plus 1 dag. Voeg 1 ml trypsinisatieoplossing toe en incubeer bij 37 °C, 5% CO 2, 3% O2 om de cellen los te maken. Stop de enzymatische activiteit door 10 ml DMEM compleet te gebruiken.
- Centrifugeer de cellen bij 300 x g gedurende 10 minuten bij RT en resuspendeer de pellet in 20 ml DMEM compleet en zaai in een schaal van 15 cm (doorgang 1 of P1). De cellen worden gekweekt tot 80%-90% samenvloeiing en kunnen worden uitgebreid tot passage 3.
OPMERKING: Afhankelijk van de stroomafwaartse experimenten kan doorgang 1, doorgang 2 (P2) of doorgang 3 (P3) worden gebruikt.
4. Zaaien van cellen en verzamelen van geconditioneerd medium
- Was de fibroblasten (P1, P2 of P3) met 10 ml PBS, voeg 2,5 ml trypsinisatieoplossing toe aan de cellen en incubeer bij 37 °C, 5% CO 2, 3% O2. Stop de enzymatische activiteit door 10 ml DMEM compleet te gebruiken.
OPMERKING: Na passage 4 worden primaire cellen weggegooid en mogen ze niet worden gebruikt voor verdere experimenten, omdat ze van karakter veranderen. - Verzamel de cellen en centrifugeer bij 300 x g bij RT gedurende 10 min.
- Resuspendeer de celpellet in 10 ml exosoomvrij medium en tel de cellen.
- Zaai de cellen bij 1,5–2,0 x 106 cellen per schaal (15 cm) en broed ze uit bij 37 °C, 5% CO 2, 3% O2.
- Verzamel het geconditioneerde medium tussen 16-24 uur in buisjes van 50 ml op ijs.
OPMERKING: Als de cellen niet voor 80% samenvloeien, kan vers exosomaal vrij medium opnieuw worden toegevoegd en na een extra periode van 16-24 uur worden verzameld. De twee collecties kunnen worden gecombineerd voor verdere verwerking.
5. Zuivering van exosomen met behulp van differentiële en ultracentrifugatie
NOTITIE: Alle stappen worden uitgevoerd bij 4 °C of op ijs. Breng de buis indien nodig in evenwicht met een buis gevuld met water.
- Centrifugeer het geconditioneerde medium gedurende 10 minuten bij 300 x g voor het verwijderen van levende cellen en breng het supernatans over in een nieuw buisje van 50 ml.
- Verwijder dode cellen door centrifugeren bij 2.000 x g gedurende 10 minuten en breng het supernatans over in een polypropyleen buis van 38,5 ml.
- Centrifugeer het supernatans op 10.000 x g gedurende 30 minuten voor het verwijderen van organellen, apoptotische lichamen en membraanfragmenten. Breng het supernatans over in een ultrahelder buisje van 38,5 ml.
- Ultracentrifugeer het supernatans bij 100.000 x g gedurende 1,5 uur om de exosomen te pelleteren.
- Gooi het supernatant voorzichtig weg, laat ongeveer 1 ml geconditioneerd medium achter en was de exosoompellet in een totaal volume van 30 ml ijskoude PBS.
- Centrifugeer op 100.000 x g gedurende 1,5 uur en gooi het supernatans voorzichtig weg door te pipetteren, waarbij u ervoor zorgt dat u de exosomale pellet niet verstoort.
- Resuspendeer de pellet in ijskoud PBS (~25 μL per schaal van 15 cm) en meet de eiwitconcentratie met behulp van de BCA-eiwittestkit en een microplaatlezer bij 562 nm.
OPMERKING: De eiwitconcentratie wordt gemeten door een verdunning van 1:2 met 0,1% Triton-X100 in dH2O. De opbrengst van exosomen uit een schaal van 15 cm (20 ml geconditioneerd medium) primaire fibroblasten bij 80% confluentie is ~3-4 μg.
6. Karakterisering van exosomen door sucrosedichtheidsgradiënt
- Laad de sucrosegradiënt in een ultraheldere buis van 13 ml door (van onder naar boven) het volgende te pipetteren: 1,5 ml 2,0 m, 2,5 ml 1,3 m, 2,5 ml 1,16 m, 2,0 ml 0,8 m en 2,0 ml 0,5 m sucroseoplossingen.
- Meng 30-100 μg exosomen met 0,25 M sacharose-oplossing en pas het volume aan tot 1 ml.
- Laad de exosomen voorzichtig bovenop de gradiënten en ultracentrifugeer de monsters gedurende 2,5 uur bij 100.000 x g en 4 °C.
- Haal de buisjes uit de ultracentrifuge en plaats ze op ijs en verzamel fracties van 1,0 ml vanaf de bovenkant van de gradiënt. Breng ze over in buisjes van 1,7 ml op ijs.
- Voeg 110 μL 100% TCA toe aan elke buis, meng goed en incubeer gedurende 10 minuten bij RT.
- Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 10.000 x g en RT en gooi het supernatant voorzichtig weg.
- Resuspendeer de pellet in 500 μL voorgekoelde 80% ethanol en laat de monsters 10 minuten wassen bij -20 °C.
- Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 10.000 x g en 4 °C en gooi het supernatant weg.
- Droog de pellet gedurende 10-15 minuten bij RT en resuspendeer de pellet in PBS voor in vitro experimenten. Meet de eiwitconcentratie met behulp van een BCA-eiwittestkit of resuspendeer de pellet rechtstreeks in 14,5 μL dH2O, 5 μL 4x Laemmli-buffer en 0,5 μL 1 M DTT voor western blot-analyses.
7. Exosoomdetectie door western blot-analyse
- Meng 5-10 μg exosomen uit stap 5.7 met 5 μl 4x Laemmli-buffer en 0,5 μl 1 M DTT en pas vervolgens het uiteindelijke volume aan tot 20 μl met dH2O. Verwarm alle monsters, inclusief die in stap 6.9, gedurende 5 minuten bij 98 °C.
- Laad de monsters in een 10% TGX vlekvrije gel en laad de eiwitladders volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
NOTITIE: Kies het percentage van de gel op basis van het molecuulgewicht van het eiwit van interesse. - Laat de gel ~1 uur in de lopende buffer op 100 V draaien totdat de laadkleurstof zich aan de onderkant van de gel bevindt.
NOTITIE: De looptijd kan variëren afhankelijk van de gebruikte apparatuur of het type en percentage gel. - Stel je de gel voor. Afbeeldingen van de vlekvrije gels worden gebruikt als laadcontrole voor immunoblots.
- Breng de gel over met behulp van een PVDF-membraan gedurende 1,5 uur bij 80 V of 's nachts bij 30 V bij 4 °C.
- Blokkeer de membranen in de blokkeerbuffer gedurende 1 uur bij RT.
- Incubeer de membranen voor specifieke antilichamen (tabel 2) in antilichaambuffer gedurende een nacht bij 4 °C met agitatie.
- Was de membranen in de wasbuffer en incubeer de membranen met de juiste secundaire antilichamen (tabel 2) gedurende 1 uur bij RT met agitatie.
- Was de membranen in de wasbuffer en breng de membranen in beeld met behulp van een ontwikkeloplossing en een op camera's gebaseerde imager. U kunt ook een röntgenfilm gebruiken om de membranen te ontwikkelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol is geschikt voor het op een kosteneffectieve manier zuiveren van exosomen uit grote hoeveelheden geconditioneerd medium. De procedure is zeer reproduceerbaar en consistent. Figuur 1 toont transmissie-elektronenmicroscopie (TEM)-beeld van exosomen die zijn gezuiverd uit het kweekmedium van primaire fibroblasten van muizen. Figuur 2 toont het eiwitexpressiepatroon van canonieke exosomale markers en de afwezigheid van cytosolische (LDH) en ER (calnexine) eiwitcontaminanten. Figuur 3 toont de verdeling van canonieke exosomale markers (Alix, CD9 en CD81) na sucrosedichtheidsgradiënten.
Figuur 1: Representatief TEM-beeld van exosomen geïsoleerd uit kweekmedium van primaire fibroblasten van muizen. Getoond zijn de relatief uniforme afmetingen van deze nanoblaasjes. Over zwarte lijnen geven de diameter van de afzonderlijke blaasjes aan. Schaalbalk = 100 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Immunoblots van exosoomlysaten gesondeerd met antilichamen tegen exosoom-, cytosolische en ER-markers. Alix-, CD81-, CD9-, flottielje1-, syndecan1-, syntenine1-, cytosolische (LDH) en ER-markers (calnexine). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Exosomen gescheiden door een sucrosedichtheidsgradiënt. Individuele fracties werden onderzocht op een western blot met antilichamen tegen Alix, CD9 en CD81. Op basis van het fractioneringspatroon van de markers sedimenteren exosomen consequent in fracties 3-6, die overeenkomen met dichtheden van 1.096-1.140 g/ml. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Sucrose (g) | Sucrose werkoplossing (ml) | |
| 2,0 miljoen | 2.74 | 4.0 |
| 1,3 miljoen | 2.67 | 6.0 |
| 1,16 m boven zeeniveau | 2.38 | 6.0 |
| 0,8 miljoen | 1.37 | 5.0 |
| 0,5 m | 0.86 | 5.0 |
| 0,25 m | 0.26 | 3.0 |
Tabel 1: Oplossingen voor sucrosedichtheidsgradiënt.
| Antistof | Gastheer | Bedrijf | Catalogusnummer |
| CD9 | Rat | BD Biowetenschappen | 553758 |
| CD81 | Muis | Santa Cruz Biotechnologieën | SC-166029 |
| Alix | Konijn | d'Azzo lab | Alix |
| Flottielje1 | Muis | BD Biowetenschappen | 610820 |
| Syndecan1 zei: | Konijn | Levens Technologieën | 36-2900 |
| Syntenine1 | Konijn | Millipore/Sigma | AB15272 |
| LDH | Geit | Chemicon | AB1222 |
| Calnexine | Geit | Santa Cruz Biotechnologieën | SC-6465 |
| rat-HRP | Ezel | Jackson Imm. Res Lab | 112-035-003 |
| Muis-HRP | Geit | Jackson Imm. Res Lab | 115-035-044 |
| Konijn-HRP | Geit | Jackson Imm. Res Lab | 111-035-144 |
Tabel 2: Primaire en secundaire antilichamen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een cruciale stap voor de succesvolle isolatie van exosomen uit de kweekmedia, zoals beschreven in dit protocol, is de juiste vestiging en instandhouding van primaire fibroblastculturen van muizen uit volwassen skeletspieren. Deze culturen moeten op een laag zuurstofgehalte worden gehouden om fysiologisch achtige omstandigheden te garanderen (O2-niveau in skeletspieren is ~2,5%)15. Primaire fibroblasten zullen van karakter veranderen wanneer ze te vaak in cultuur worden gebracht. Daarom is een laag passagegetal noodzakelijk voor een ideale exosoomopbrengst. Gezuiverde exosomen moeten onmiddellijk voor experimentele doeleinden worden gebruikt of in hoeveelheden bij -80 °C ingevroren worden bewaard totdat ze nodig zijn. Een andere belangrijke stap in het protocol is het gebruik van sucrose-oplossingen die elke keer vers worden bereid. Een beperking van de methode is dat het tijdrovend is, omdat primaire fibroblasten over het algemeen geen grote hoeveelheden exosomen afscheiden, zoals andere secretoire cellen. Daarom moeten grote culturen worden gebruikt, die resulteren in grote hoeveelheden geconditioneerde media die moeten worden verwerkt.
Het voordeel van differentiële centrifugatie die hier wordt gebruikt, is dat het een schaalbare benadering vertegenwoordigt (tot liters) en de voorkeursmethode is om exosomen uit primaire fibroblasten te isoleren. Een alternatieve methode voor grotere volumes (tot 100 ml per kolom) is grootte-uitsluitingschromatografie (SEC). Deze methode is snel en kan eiwitten scheiden van exosomen. De kolom pelleteert geen exosomen, dus verdere concentratie- of centrifugatiestappen zijn vereist. Een van de nadelen van de SEC-methode is dat de kolom na verloop van tijd verstopt en overbelast kan raken. Andere huidige methoden zijn gebaseerd op het gebruik van kleine hoeveelheden biologische vloeistoffen (d.w.z. urine, CSF, serum, plasma) en in de handel verkrijgbare kits. Hoewel deze kits reproduceerbaarheid garanderen, zijn ze kostbaar en produceren ze niet altijd een hoge opbrengst aan pure exosomen. Het geschetste protocol voor exosoomzuivering is eenvoudig en kan worden toegepast op verschillende soorten cellen, hele weefsels en organen, of andere biologische vloeistoffen, afhankelijk van de experimentele behoefte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen van de auteurs heeft belangenconflicten te melden.
Acknowledgments
Alessandra d'Azzo bekleedt de Jewelers for Children (JFC) Endowed Chair in Genetics and Gene Therapy. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door NIH-subsidies R01GM104981, RO1DK095169 en CA021764, de Assisi Foundation of Memphis en de American Libanese Syrian Associated Charities.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm dishes | Midwest Scientific, TPP | TP93100 | |
| 15 cm dishes | Midwest Scientific | TP93150 | |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific, Pierce | 23225 | |
| Bovine serum albumin Fraction V | Roche | 10735094001 | |
| CaCl2 | Sigma | C1016-100G | |
| Centrifuge 5430R with rotors FA-35-6-30/ FA-45-48-11 | Eppendorf | 022620659/5427754008 | |
| Chemidoc MP imaging system | BioRad | 12003154 | |
| Collagenase P | Sigma, Roche | 11 213 857 001 | 100 mg |
| cOmplete protease inhibitor cocktail | Millipore/Sigma, Roche | 11697498001 | |
| Criterion Blotter with plate electrodes | BioRad | 1704070 | |
| Criterion TGX stain-free protein gel | BioRad | 5678034 | 10% 18-well, midi-gel |
| Criterion vertical electrophoresis cell (midi) | BioRad | NC0165100 | |
| Dispase II | Sigma, Roche | 04 942 078 001 | neutral protease, grade II |
| Dithiothreitol | Sigma/Millipore, Roche | 10708984001 | |
| Dulbecco’s Modification Eagles Medium | Corning | 15-013-CV | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Corning | 21-031-CV | |
| Ethanol 200 proof | Pharmco by Greenfield Global | 111000200 | |
| Falcon 50 mL conical centrifuge tubes | Corning | 352070 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-028 | |
| Fluostar Omega multi-mode microplate reader | BMG Labtech | ||
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 35050-061 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Immobilon-P Transfer membranes | Millipore | IPVH00010 | |
| Laemmli sample buffer (4x) | BioRad | 1610747 | |
| Magnesium acetate solution | Sigma | 63052-100ml | |
| Non-fat dry milk | LabScientific | M-0842 | |
| O2/CO2 incubator | Sanyo | MC0-18M | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 15140-122 | 10,000 U/ml |
| Premium microcentrifuge tubes | Fisher Scientific, Midwest Scientific | AVSC1510 | 1.7 mL |
| Protected disposable scalpels | Fisher Scientific, Aspen Surgical Bard-Parker | 372610 | |
| Running buffer | BioRad | 1610732 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific, Fisher Chemical | S271-3 | |
| Stericup Quick release-GP sterile vacuum filtration system | Millipore | S2GPU05RE | 500 mL |
| Sterile cell strainer (70 mm) | Fisher Scientific, Fisher brand | 22-363-548 | |
| Sucrose | Fisher Scientific, Fisher Chemical | S5-500 | |
| SuperSignal west Femto | Thermo Fisher Scientific | 34096 | |
| Thin wall Polypropylene tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| Transfer buffer | BioRad | 16110734 | |
| Trichloroacetic Acid | Sigma | 91228-100G | |
| Tris base | BioRad | 1610719 | |
| Triton-X100 solution | Sigma | 93443-100mL | |
| TrypLE Express Enzyme | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 12604-013 | No phenol red |
| Tween-20 | BioRad | #1610781 | |
| Ultra-centrifuge Optima XPM | Beckman Coulter | A99842 | |
| Ultra-clear tube (14x89 mm) | Beckman Coulter | 344059 | |
| Ultra-clear tubes (25x89 mm) | Beckman Coulter | 344058 | |
| Water bath Isotemp 220 | Fisher Scientific | FS220 |
References
- Doyle, L. M., Wang, M. Z. Overview of Extracellular Vesicles, Their Origin, Composition, Purpose, and Methods for Exosome Isolation and Analysis. Cells. 8 (7), 727 (2019).
- Gurunanthan, S., Kang, M. H., Jeyaraj, M., Qasim, M., Kim, J. H. Review of the Isolation, Characterization, Biological Function, and Multifarious Therapeutic Approaches of Exosomes. Cells. 8 (4), 307 (2019).
- Zhang, Y., Liu, Y., Liu, H., Tang, W. H. Exosomes: biogenesis, biologic function and clinical potential. Cell & Bioscience. 9 (19), 3070-3085 (2019).
- van de Vlekkert, D., et al. Excessive exosome release is the pathogenic pathway linking a lysosomal deficiency to generalized fibrosis. Science Advances. 5 (7), 3270 (2019).
- Rackov, G., et al. A Vesicle-Mediated Control of Cell Function: The Role of Extracellular Matrix and Microenvironment. Frontiers in Physiology. 9, 651 (2018).
- Howitt, J., Hill, A. F.
- Jing, H., Tang, S., Lin, S., Liao, M., Chen, H., Zhou, J. The role of extracellular vesicles in renal fibrosis. Cell Death and Disease. 10 (5), 367 (2019).
- Asef, A., Mortaz, E., Jamaati, H., Velayati, A. Immunologic role of extracellular vesicles and exosomes in the pathogenesis of cystic fibrosis. Journal of Respiratory Diseases, Thoracic Surgery, Intensive Care and Tuberculosis. 17 (2), 66-72 (2018).
- Cai, A., Cheng, X., Pan, X., Li, J. Emerging role of exosomes in liver physiology and pathology. Hepatology Research. 47 (2), 194-203 (2017).
- Machado, E., et al. Regulated lysosomal exocytosis mediates cancer progression. Science Advances. 1 (11), 1500603 (2015).
- Tian, W., Liu, S., Li, B. Potential role of exosomes in cancer metastasis. Biomed Research International. , 4649705 (2019).
- Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of disease. Pharmacology and Therapeutics. 174, 63-78 (2017).
- Patel, G. K., et al. Comparative analysis of exosome isolation methods using culture supernatant for optimum yield, purity and downstream applications. Science Reports. 9 (1), 5335 (2019).
- Ayala-Mar, S., Donoso-Quezada, J., Gallo-Villanueva, R. C., Perez-Gonzalez, V. H., González-Valdez, J. Recent advances and challenges in the recovery and purification of cellular exosomes. Electrophoresis. 40 (23-24), 3036-3049 (2019).
- Boutagy, N. E., et al. Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements. Journal of Visualized Experiments. (105), e53217 (2015).
- Lee, Y. S. Muscle Dissection in mouse. , Available from: https://www.youtube.com/watch?v=Wh0gXfrHaH8 (2016).
- Mas-Bargues, C., et al. Relevance of oxygen concentration in stem cell culture for regenerative medicine. International Journal of Molecular Sciences. 20 (5), 1195 (2019).
- Bois, P. R., Grosveld, G. FKHR (FOX01a) is required for myotube fusion of primary mouse myoblasts. The EMBO Journal. 22 (5), 1147-1157 (2003).
- Machida, S., Spangenburg, E. E., Booth, F. W. Primary rat muscle progenitor cells have decreased proliferation and myotube formation during passages. Cell Proliferation. 37, 267-277 (2004).
- Syverud, B. C., Lee, J. D., VanDusen, K. W., Larkin, L. M. Isolation and purification of satellite cells for skeletal muscle tissue engineering. Journal of Regenerative Medicine. 3 (2), 117 (2014).
