Summary
Worm-align/Worm_CP, Caenorhabditis elegans örneklerini düzeltmek ve hizalamak ve önceki eğitim adımlarına gerek kalmadan tüm solucan görüntü tabanlı tahlilleri yapmak için kullanılabilecek basit bir FIJI/CellProfiler iş akışıdır. Solucan hizalama/Worm_CP, canlı hayvanlarda ısı şokuna bağlı ekspresyonun veya sabit numunelerdeki lipid damlacıklarının ölçülebilirhale uyguladık.
Abstract
Sabit veya anestezili C. elegans görüntü verileri elde ederken sık karşılaşılan bir sorun solucanlar çapraz ve komşuları ile küme olmasıdır. Bu sorun solucanların artan yoğunluğu ile ağırlaştırılmış ve görüntüleme ve nicelik için zorluklar yaratır. C. elegans'ın ham görüntü verilerinden kullanıcı tarafından seçilen, düzleştirilmiş ve hizalanmış solucanların tek veya çok kanallı montajlarını oluşturmak için kullanılabilecek, Solucan hizalama olan FIJI tabanlı bir iş akışı geliştirdik. Solucan hizalama, kullanıcının veya çözümleme algoritmasının önceden eğitilmesini gerektirmeyen basit ve kullanıcı dostu bir iş akışıdır. Worm-align ile oluşturulan montajlar solucanların görsel denetimine, sınıflandırılmasına ve temsiline yardımcı olabilir. Buna ek olarak, Worm-align çıktısı tek solucanlarda floresan yoğunluğunun sonraki nicelikselleştirilmesi için, doğrudan FIJI'de veya diğer görüntü analizi yazılım platformlarında kullanılabilir. Bunu, Worm-align çıktısını açık kaynak hücre profili yazılımını kullanan bir boru hattı olan Worm_CP'a aktararak gösteriyoruz. CellProfiler'ın esnekliği, yüksek içerikli tarama için ek modüllerin eklenmesini sağlar. Pratik bir örnek olarak, biz iki veri kümesi üzerinde boru hattı kullandık: ilk veri seti ısı şoku indükleyici gen hsp-70organizatörü kontrolü altında yeşil floresan protein (GFP) ifade ısı şok muhabiri solucanların görüntüleri , ve ikinci veri seti sabit solucanlar elde edilen görüntüler, floresan boya ile yağ depoları için boyanmış.
Introduction
Nispeten basit bir organizma, nematod C. elegans, insan hastalıkları incelemek için son derece yararlı bir model sistemidir. C. elegans genomundaki genlerin yaklaşık %38'inin insanlarda fonksiyonel benzerleri vardır1,2. C. elegans'ın benzersiz özelliklerinden biri, dokular arasında floresan muhabirlerin hücresel ekspresyonu ile ilgili in vivo bilgilere kolay erişim sağlayan optik saydam olmasıdır. Bu c. elegans görüntü tabanlı platformlar kullanarak yüksek içerikli ekranlar için bir prime model organizma yapar3. Ancak, bu çalışmaları sık sık karmaşıklaştıran bir konu, solucanların yoğun popülasyonlarını görüntülerken, çapraz lama ve kümelenme eğiliminde olmaları, tek tek solucanlar arasında karşılaştırmalar yapma, aşağı akış görüntü analizi ve nicelik bulanıklaştırma.
Bu sorunu aşmak mevcut çözümler genellikle culturing ve görüntüleme protokolü optimizasyonu güveniyor, mikro-akışkan kurulumları kullanımı yoluyla gibi4, tek solucanlar ayrı görüntülerde yakalanmasına izin5,6. Diğerleri, kümelenmiş bir popülasyonda bile tek solucanların tanınmasına olanak sağlayan makine öğrenimi algoritmaları uyguladılar. Ikincisi mükemmel bir örnek WormToolbox, açık kaynak görüntü analiz platformu, CellProfiler7modüler bir uzantısıdır. WormToolbox C. elegansanalizi için yüksek iş hacmi ve yüksek içerikli bir çözüm sunuyor , ve açıkça CellProfiler dahil yararlanır, ek analiz modülleri kolayca dahil edilebilir gibi. WormToolbox önceden eğitilmiş bir model (DefaultWormModel.xml ile birlikte gelse de, makine öğrenme algoritmasının yeniden eğitilmesi genellikle her yeni uygulama için gereklidir. Bunun nasıl yapılacıla ilgili çalışan ları Github' da (https://cp-website.github.io/Worm-Toolbox/) sAtınalı ş Buna rağmen, yükleme ve WormToolbox kullanarak acemi kullanıcılar için önemli bir zaman yatırım gerektirir.
Burada, kültüre basit ve maliyet ve zaman-etkili bir protokol ve C. elegansgörüntü popülasyonları açıklar. Edinilen görüntülerde tek tek solucanların değerlendirilmesine izin vermek için Worm-align adında basit bir açık kaynak FIJI tabanlı iş akışı geliştirdik. Solucan hizalama, düzleştirilmiş ve hizalanmış solucanların tek veya çok kanallı montajlarını oluşturmak için kullanılabilir. İlk olarak, kullanıcı kafadan kuytu bir çizgi çizerek analiz için tek tek solucanları el ile seçmelidir. Solucan hizalama, seçilen solucanları genel bakışta görüntüden kırpmak için bu seçimi kullanır ve seçilen solucanların düzeltildiği ve görsel karşılaştırma ve sunum kolaylaştırmak için hizalandığı bir montaj oluşturur.
Buna ek olarak, Worm-align çıktısı tek solucanlarda floresan yoğunluğunun sonraki nicelikselleştirilmesi için, doğrudan FIJI'de veya diğer görüntü analizi yazılım platformlarında kullanılabilir. Bunu, Worm-align çıktısını açık kaynak hücre profili yazılımını kullanan bir boru hattı olan Worm_CP'a aktararak gösteriyoruz. CellProfiler'ın esnekliği, yüksek içerikli tarama için ek modüllerin eklenmesini sağlar. Biz ısı şoku tepkisi ölçmek için Worm_CP boru hattı kullandık, yüksek sıcaklık gibi stres nedeniyle yanlış katlanmış proteinleri yeniden katlanır iyi korunmuş koruyucu bir mekanizma8. Özellikle, entegre bir multi-copy transgene taşıyan solucanlar için boru hattı uygulanan, bir ısı şoku indükleyici gen organizatörü, hsp-70 (C12C8.1), yeşil floresan protein sürücüler (GFP)9. Biz de lipid damlacıkları görselleştirir bir floresan boya ile etiketlenmiş sabit hayvanlar üzerinde Worm_CP boru hattı kullandık (LDs), C. elegansana yağ depolama organel10. Bu iş akışı WormToolBox tarafından sunulan iş akışı na sahip olmasa da, görüntü tabanlı C. elegans deneylerinin görsel sunumu ve analizi için kullanıcı dostu ve basit bir alternatiftir.
Protocol
1. Lipid damlacıkları için floresan boya kullanarak yağ içeriği görüntüleme için solucanların fiksasyonu (BODIPY)10
- Standart prosedürlere göre ağartma tarafından C. elegans senkronize bir nüfus hazırlayın2. Her koşulda 9 cm'lik nematod büyüme ortamı (NGM) plakasına yaklaşık 1.000 L1 kademeli solucan plakası.
NOT: Daha fazla solucan aslında sonunda ölçülen daha hazırlanır, kullanım sırasında solucan kaybı nedeniyle. - Genç yetişkin evresinde hayvanları (20 °C'de yaklaşık 50 saat l1 kaplaması) görmek için, her 9 cm'lik plakayı 15 mL M9'luk bir konik tüpte, santrifüjü 252 x g'da 1 dk boyunca yıkayın ve süpernatantı çıkarın.
- Yıkamayı tekrarlayın ve solucan peletinin üzerine 1 mL M9 m9 bırakın.
- Düşük tutma ipuçları kullanarak, 2 mL düşük protein bağlayıcı mikrosantrifüj tüp solucanlar içeren M9 1 mL aktarın.
- 1 dakika mikrosantrifüj içinde 252 x g aşağı spin ve supernatant kaldırmak, tüpün altındaki solucan pelet dokunmamaya dikkat.
- 4,4-difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indasel (BODIPY) boyama10 kullanarak yağ içeriğinin izlenmesi için (Malzeme Tablosu), solucanları ya 3 dk11için solucan peletine %60 isopropanol ekleyerek ya da 10 dakika boyunca 2 mL buz gibi metanol ekleyerek düzeltin. Her iki işlem için de, tüp her 30 s ters.
DİkKAT: Metanol seçilen fiksasyon reaktifi ise, bu adım toksisitesi nedeniyle bir duman başlık içinde yapılmalıdır. - Solucan peletine dokunmadan mümkün olduğunca çok fiksatifi çıkarın ve 1 mL M9 ekleyin. Solucanlar tüpün dibine 3−5 dk kadar yerleşin.
- 1 mL M9 ile tekrar yıkayın, solucanların yerleşmesine ve süpernatantı çıkararak tüpte yaklaşık 50 μL'lik bir kısmını bırakmasına izin verin. Tüpü bir kelepçe kullanarak sabitle.
- Güvenli bir şekilde kapalı tüpü sıvı nitrojene batırarak solucanları dondurun-kırın ve ~40 °C'de ılık su banyosuna yerleştirin.
- Adımı 1.9'u bir kez daha tekrarlayın.
- M9'da seyreltilmiş 0,5 mL BODIPY'yi 1 μg/μL'lik son konsantrasyonda ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca bir rotator üzerine yerleştirin.
- 1 saat sonra, solucanlar 3−5 dk için tüpün dibinde yerleşmek sağlar.
- Supernatant çıkarın ve M9 1 mL ekleyin.
- Solucanlar alt yerleşmek ve supernatant kaldıralım.
NOT: Alternatif olarak, morfolojiyi etkilemediği için 252 x g'de 1 dk boyunca aşağı dönmek mümkündür. - 0,5 mL M9 ekleyin.
NOT: Fiksatif %60 izopropanol ise, solucanlar sadece 48 saat içinde kullanılabilir. Fiksatif metanol ise, solucanlar 24saat içinde kullanılmalıdır.
2. Solucanlar monte agarose pedleri hazırlanması
NOT: Agarose ped hazırlarken kritik adım düzenli kalınlıkta bir ped elde etmektir. Aksi takdirde, pad genelinde solucanlar farklı odak düzlemlerinde olacak, daha geniş bir görüş alanı odaklı bir görüntü elde etmek zor hale.
- Bir kabın veya konik şişenin 10 mL'ine 0,2 g agarose ekleyerek%2agarose pedleri hazırlayın. Agarose kaynamaya başlayana kadar mikrodalga 30 s ısıtın.
NOT: Kabarcıklar belirir görünmez aşırı ısınmayın ve durmayın; aksi takdirde istenilen yastık kalınlığı elde etmek için daha zor hale agarose viskozitesini artırır. - Agarose eritildikten sonra, mikroskop cam kaydırağının ortasına bir damla erimiş agarose dağıtın ve ucunu kesmiş 1000 μL pipet ucu nu kullanarak. Hemen, ama ince, agarose damla çok yakın başka bir cam slayt tutun ve en iyi mikroskopi sonuçları için düzenli kalınlıkta bir yastık oluşturmak için agarose üzerine bırakın.
NOT: Üst kaydırağı bir yükseklikten serbest bırakmak sadece kabarcıklar oluşturmakla kalmamış, aynı zamanda eşit olmayan bir pedle sonuçlanır. Alternatif olarak, her slaytta ince bir bant tabakası ile slaytı pedle çevreleyen iki cam slayt da kullanmak mümkündür. - En az 2−3 dakika sonra üst teki slaydı yavaşça çıkarın. Üst slaydın yan tarafını kullanarak, kare şeklinde yapmak için pedi kırpın. Kullanmadan önce pedin kurumasını önlemek için solucanları 5 dk içinde monte edin.
3. Görüntüleme için sabit solucanların montajı
- Bir Bunsen brülör alev ince bir cam kılcal genişleterek bir ağız mikropipet oluşturun (Şekil 1A). Alev uzatma sonra, iki parçaya kılcal kırmak(Şekil 1B). En yeterli, genellikle en uzun seçin ve su aspire etmeye çalışarak kılcal damar sonu açık olup olmadığını test edin.
NOT: Sıvı kılcal damara girmezse, çok ince veya bloke olur. Kılcal damarın ucunu bir makasla hafifçe kesin, delik çok büyükse solucanlar aspire edilsin diye çok fazla kesilmekten kaçının. - Cam kılcal damarı adım 3.1'den 6 mm silikon boruya bağlı olan kapiller adaptörüne(Şekil 1C)takın ve 6 mm silikon borunun diğer ucunu diğer ucundaki 3 mm silikon boruya bağlı 0,2 m'lik bir filtreye takın(Şekil 1C). Sıvı aspire etmek için 3 mm silikon borunun serbest ucuna 1 mL filtre ucu(Şekil 1C)takın.
NOT: Deneycinin maksimum güvenliğini sağlamak için deneycinin ağzı ile kılcal damar arasına 0,2 μm filtre eklenir. Benzer bir çözüm fare embriyoları işlemek için kullanılan ağız mikropipetler için kullanılır12. Ağız mikropipeti artık sıvı aspire değilse filtreyi (genellikle birkaç ayda bir) değiştirin. - Ağız mikropipemini bir diseksiyon mikroskobu altında kullanarak, sabit solucanların solucan peletinin etrafında mümkün olduğunca çok sıvı çıkarın(Şekil 2).
NOT: El ile mikropipet kullanarak supernatant dışarı Pipetleme adımlar 3.1 için 3.3 mümkün olduğunca supernatant kaldırmak için ağız pipetler alternatif olarak kullanılabilir. 6 μL montaj ortamı ekleyin. Ancak, pedlerde aşırı sıvı seyrek bir solucan yoğunluğu oluşturur, bu da görüntülemeyi daha zaman alıcı hale getirir, çünkü bu yöntemin verimli çalışmadığını görüyoruz. Devam adım 3.6. Tüpün altına bakın ve pipetin solucanları aspire etmediğinden emin olun. - Tüpün altına hızlıca 10 μL montaj ortamı(Malzeme Tablosu)ekleyin.
- Solucanların plastik pipet ucunun kenarlarına yapışmasını önlemek için PBS'de 10 μL'lik bir ucu deterjan izleriyle (%0,01 Triton) durulayın. Ucunu bir makasla kesin.
- Solucanları içeren 8 μL'lik montaj ortamını adım 2.3'te hazırlanan agarose pedin üzerine aktarın. Mikroskop altında, solucanların çakışmasını önlemek için yavaşça kaydırağı sallayın.
- Agarose pedüzerindeki montaj ortamının 18 mm x 18 mm kapaklı kapağını kapatın(Şekil 3).
NOT: Solucanlara daha az baskı uyguladıkları için daha küçük kapaklar tercih edilir. Bir çift cımbızla kapağı tutun ve kapağın bir kenarını agarose pede doğru uygulayın, daha sonra kapağı cımbızla hafifçe yatırın.
4. Görüntüleme için canlı solucanmontajı
NOT: Canlı solucanları görebilmek için ped üzerinde hareketsiz hale getirilmelidir. Bunu başarmak için bir yolu nikotinik reseptör agonist ile onları felç etmektir: levamisole (Malzeme Tablosu).
- 3 mM levamisole'li pipet 3−4 μL,M9'da çözünmüş ve 2.3 adımda oluşturulan agarose pedüzerine.
NOT: Solucanların üst üste değil de, solucanların yastıkta çok seyrek olduğu kadar çok fazla sıvı olmadığı kadar sıvı hacmi olmalıdır. Deneyimli solucan toplayıcıları 3 μL levamisole kullanabilirler. Daha az deneyimli toplayıcılar levamisole daha büyük bir hacim eklemek gerekebilir, böylece levamisole tamamen buharlaşmaz. - Levamisole damla içine durum başına 30−50 solucanlar seçin.
- Agarose ped üzerindeki levamisole damlasını 18 mm x 18 mm kapak lı olarak kapatın. Görüntü solucanlar içinde 1 saat, felç edici ajan sonunda solucanların ölümüne yol açacaktır gibi.
5. Epifloresan mikroskobu ile görüntüleme slaytları
- Düzgün kalınlıkta bir agarose ped ile, bir floresan mikroskobun 20x hedefi ile örneğin 6 x 6 veya 7 x 7 büyük görüntü kullanarak slayt üzerinde bir anda tüm solucanlar görüntü. Pedin kalınlığı eşit değilse, aynı slayttan daha küçük 3 x 3 veya 4 x 4 görüntü elde edin.
- Tüm koşullar için floresan yoğunluğu ve maruz kalma süresi için aynı ayarları kullanın. Her ayarı en parlak yoğunluğa sahip slaytla eşleşecek şekilde ayarlayın ve piksel doygunluğu olmamasını sağlar. Görüntü edinme ile ilgili özel talimatlar için mikroskop üreticisinin talimatlarına uyun.
6. Worm-align FIJI boru hattını kullanarak hizalanmış tek solucanların montaj görüntüleri oluşturma
- https://imagej.net/Fiji gelen açık kaynak görüntü analizi yazılım paketi FIJI13/ImageJ14'ü yükleyin. FIJI'nin önceden yüklenmesi varsa, makroda kullanılan bazı işlevler (örneğin, Tablo işlevleri) bunu gerektirdiğinden, sürüm 1.52a veya sonraki sürümlere güncelleştirdiğinden emin olun. Github: https://github.com/hannekeo/Worm-align'dan Worm-align makrosu indirin.
- FIJI'yi açın ve Solucan hizalama makrosu çalıştırın. Eklentileri tıklatarak Worm-align'ı | Makrolar | FIJI ana menü çubuğunda çalıştırın (Şekil S1). Şimdi bilgisayarda Worm-align.ijm komut dosyası nın yerini bulun.
- Makro, görüntülerin konumunu sorarak başharflere sahiptir. Boru hattı hem tek kanallı hem de çok kanallı floresan görüntüler üzerinde çalışacaktır(Şekil S2). Bir giriş klasörü seçin ve makro otomatik olarak tüm sonuçların kaydedeceği bir çıktı klasörü oluşturur(Şekil S3).
NOT: Diğer dosya biçimlerinin varlığı makronun çökmesine neden olacağından, seçili klasörün yalnızca görüntü dosyaları içermesi önemlidir. İdeal olarak, yalnızca aynı mikroskop ayarlarıyla yakalanan görüntüleri gruplandırın. Worm-align nd2, czi, tif, rgb, jpg ve png dahil olmak üzere birçok farklı dosya biçimleri kabul edecektir. Çıktı klasörünün adı giriş klasörüyle aynı olacak, '_output' bir postfix olarak eklenecektir, yani giriş klasörü 'görüntüler'se, çıktı 'images_output' bulunur. Çıktı klasörü, verilerin kaydedildiği dört alt klasör içerir. - Makronun giriş klasöründeki ilk görüntüyü açmaya devam etmesine izin verin ve montajı oluşturmak için bir ayar ayıklamak için temsili bir görüntü olarak kullanın.
NOT: Solucan hizalama, klasördeki diğer tüm resimlere uygulanacak ayarları oluşturmak için giriş klasöründeki ilk görüntüyü otomatik olarak seçer. Başka bir görüntünün veri kümesini daha fazla temsil ettiği kabul edilirse, bu görüntünün giriş klasörüne görüntünün bir kopyasını kaydederek ve artık listenin en üstünde listelenen adı değiştirerek seçildiğinden emin olun (örn. '0_RepresentativeImage'). - Düz çizgi çizim aracıyla, solucan genişliği(Şekil S4)boyunca bir çizgi çizin ve tek solucanlar için kırpılmış bölgelerin yüksekliğini belirlemek için bu çizginin uzunluğunu kullanın. Her kanal için, adı, arama tablosunu (LUT), yoğunluk ayarlarını (B&C) ve montaja dahil edilip edilmemesini belirtin(Şekil S4).
NOT: Bu parametreler, çıktı klasörünün CellProfiler alt klasöründe bulunan ayarlar dosyası, Ayarlar.csv,kaydedilir ve kaydedilir. - Tüm ayarlar yakalandıktan sonra, kullanıcıya uygulanan ayarlar uygulandıktan sonra görüntülerin nasıl görüneceği gösterilir (Şekil S5). Ayarlar yeterliyse üst kutuyu işaretleyin. Montaj oluşturma seçenekleri seçin (gerekli değilse keneleri kaldırın): 1. Her görüntü için seçilen solucanların montajını oluşturun veya 2. Giriş klasöründeki tüm görüntülerde seçilen tüm solucanların tek bir montajda birleştirileceği birleştirilmiş montaj oluşturun. Makronun geri kalanını çalıştırmak için Tamam'ı tıklatın.
NOT: 'Tamam' seçeneğini tıklatmadan önce üst kutu işaretlenmezse makro kurulumu yeniden çalıştıracaktır, böylece görüntü ayarları optimize edilebilir. - Worm-align ardışık düzenebde giriş klasöründeki tüm görüntüleri açmak için devam ediyor. Her görüntü için, 'parçalı çizgi' aracını (FIJI ana menü çubuğunda) kullanarak montaja dahil edilecek ve/veya ölçülecek tüm solucanların uzunlamasına eksenine çizgiler çizin . Solucanın doğru hizalanmasını sağlamak için, sürekli olarak tepeden tırnağa (veya tam tersi) ve solucanın tam uzunluğu boyunca çizgiler çizin (Şekil 4B'deki"iyi" ve "kötü" çizgi çizimörneklerine bakın).
- Her satırı YG yöneticisineekleyin, Ctrl+T. Worm-align'ı tıklatarak, tek seçili solucanların kırpılmış görüntülerini oluşturmak için solucan genişliği parametresi (adım 6.4 olarak ayarlanır) ile birlikte YG yöneticisine eklenen satırları kullanır. Satır ROI'larının toplanması 'veri' alt klasörüne kaydedilir. Bu klasör ayrıca satırları gösteren orijinal görüntünün bir kopyasını ve solucan sayısını içerir. Satırlar Glasbey_on_dark arama tablosu ile renk kodludur. Düzeltilmiş solucanların görüntüleri çıktı klasörünün single_worms alt klasörüne kaydedilir. Buna ek olarak, bu protokolün 6.6 adımında seçilirse, Worm-align genel bakış görüntüsü başına seçilen tüm solucanların montajlarını ve/veya giriş klasöründeki tüm genel bakış görüntüleri için montajüretir (Bkz. Şekil 4C ve Şekil S7). Bu montajlar çıktı klasörünün 'hizalanmış' alt klasöründe bulunabilir.
7. Otomatik cellProfiler boru hattında Worm-align çıktısını kullanarak tek solucan floresan yoğunluğunu analiz etme
- Worm-align çıktı downstream veri işleme ve analizi için, indirin ve açık kaynak görüntü analizi yazılım paketi yüklemek 'CellProfiler15,16 https://cellprofiler.org/. GitHub Worm_CP.cpproj boru hattını indirin: https://github.com/hannekeo/Worm-align
NOT: Burada açıklanan örnek ardışık hatlar CellProfiler2.2.0 kullanılarak oluşturulmuştur ve CellProfiler'ın sonraki sürümlerinde çalışmayabilir. - Worms_CP.cpproj ardışık başlatılmadan önce, beklenen tüm çıktı görüntülerinin Worm-align çıkış klasörünün CellProfiler alt klasöründe bulunduğundan emin olun: özgün görüntünün işlenmiş bir kopyası (ad: Original_), solucan popülasyonunun ikili görüntü maskesi (adı: Mask_), seçili solucanlar üzerinde çizilen çizgilerin bir çizgi maskesi (adı: Lines_) ve orijinal görüntüde bulunan kanalların her birini temsil eden bir görüntü (kanal numarasına göre adlandırılır).
- Tek solucanlarda floresan yoğunluğunu ölçmek için, Görüntüler giriş modülüne tıklayın ve cellprofiler çıkış klasörünü burada bırak dosya ve klasörleriyazan pencereye sürükleyin. Önceki çözümlemeden bir resim listesi varsa, önce pencereye sağ tıklayarak ve Dosya Listesini Temizle'yiseçerek bunları kaldırın. 'Ayarlar.csv' dosyasını görüntü listesinden çıkarmak için, filtre ayarları için 'Yalnızca Görüntüler' veya 'Özel' seçeneğini belirleyin ve 'Uzantı tif, tiff, ome.tif veya ome.tiff' seçeneğini belirleyin (Şekil S8).
- Meta veri giriş modülüne tıklayın. İkinci çıkarma yönteminde, sarı klasöre tıklayın ve WormAlign çıktı klasöründe CellProfiler alt klasörünü bulun (Şekil S9). Ayarlar.csv dosyasını seçin ve CSV dosyalarındaki meta verileri görüntülerdekilerle (Kanal meta verileri) eşleştirerek dosyadaki ayarları CellProfiler çıkışına bağlayın.
- NamesAndTypes giriş modülüne tıklayın ve sayısallaştırılmak üzere orijinal görüntünün her kanalı için yeni bir görüntü ekleyin.
NOT: Zaten örnek boru hattı mevcut solucan maskesi, iki renkli görüntüler, çizgi maskesi ve orijinal görüntü ve üç gri ölçekli görüntüler (yeşil ve kırmızı kanal) vardır. Orijinal görüntülerde örnek görüntülerden daha fazla veya daha az kanal varsa, bu modüldeki listenin ayarlanması gerekir. - Her sütun etiketindeki/maskedeki/solucantaki resimlerin adının doğru olup olmadığını kontrol edin.
NOT: Bir satırdaki resimlerin adlarının tümü analiz etmek için aynı ilk görüntüye karşılık gelir. Görüntü analizi işlemi sırasında bir hata yapılırsa, çıktı görüntülerinden bazıları eksik olur ve üç sütun etiketi/maske/solucan altındaki adlar artık her satır için aynı ilk görüntüye karşılık gelmez. Bu durumda, hatanın nerede olduğunu bulun. - Çıktıyı Cellprofiler'dan kaydetmek için klasörü seçmek için çıkış ayarını görüntüle'ye basın.
- Test Modunu Başlat'ıtıklatın. Test Modu'na geçtikten sonra, veri kümesindeki ilk görüntüye uygulayarak, Çalıştır 'ı (ardışık yol daki tüm etkin modüller arasında çalışacak) veya Step 'e (boru hattı modülünden bir seferde bir modül üzerinden çalışacak) tıklayarak ardışık lığın ayarlarını iki kez kontrol edin.
NOT: Test Modundayken, ayıklanan ölçümler, ardışık ardışık alanda ExportToSheet modülü (ve etkin) olsa bile dışa aktarılmaz. - Ardışık etki hattı olması gerektiği gibi performans gösterdiğinde, Test Modu'nu Çıkar'ı tıklatın ve ardından Görüntüleri Çözümle'ye basın. Şu anda yapılandırıldığı gibi, Worms_CP (1) Mask_ görüntüyü kullanarak kaba bir solucan maskesini ve Lines_ görüntüyü(Şekil S10A)seçili solucanları ayırmak ve tek solucan maskeleri(Şekil S10C),(2) tanımlanan ve maskelenmiş solucanlar daki giriş görüntülerinde bulunan tüm kanalların floresan yoğunluğunu ölçer. Boru hattı ayrıca arka plan yoğunluğunu(Şekil S10B)ölçebilir ve tüm görüntüleri buna göre düzeltebilir (ölçülen parametre adına sözcük eşiğiyle gösterilir, örneğin: Intensity_MeanIntensity_green_threshold), (3) seçilen solucanların boyutunu ölçebilir ve (4) ölçülen tüm parametreleri dışa aktarabilir(Şekil S10D).
- Seçili çıktı klasörüne kaydedilen iki csv dosyası, solucan.csv ve.csv satırdan oluşan Worm_CP çıktısını açın (Bkz. Şekil S11). Bu dosyalar, işlem sonrası ve raporlama için Excel veya R'de (Studio) açılabilir. Ek çıktı gerekiyorsa, örneğin görüntü verileri başına bu işlem, ardışık işlem hattındaki ExportToSheet modülünde seçilebilir.
Representative Results
Bu protokolde açıklanan yönteme göre c. elegans toplama ve görüntüleme solucan popülasyonlarının büyük genel bakış görüntüleri üretir. Bu görüntülerden solucanların görsel olarak incelenmesini ve sınıflandırılmasını kolaylaştırmak için Worm-align'ı geliştirdik. Worm-align düzleştirilmiş ve hizalanmış solucanmontajları oluşturmak için kullanılabilecek basit ve kullanıcı dostu bir FIJI komut dosyasıdır. Solucanlar, solucanların uzunlamasına ekseni boyunca bir çizgi çizerek genel bakış görüntülerinden seçilir. Seçilen her solucana bir sayı atanır, kırpılır ve düzeltilir ve montaja eklenir. Montajlar görüntü başına oluşturulabilir veya orijinal giriş klasöründeki tüm görüntüleri birleştirir.
Beklendiği gibi, boru hattının çıkışı büyük ölçüde görüntülerin üstüne çizilen çizgilerin kalitesine bağlıdır. Bu noktayı göstermek için Şekil 4 birkaç satır örneği ve bunların Worm-align'dan çıktılarını gösterir. Kuyruk ucuna kafadan tam bir çizgi düzgün hizalanmış bir solucan üretir (etiketli "iyi"). Şekil 4 ayrıca Solucan hizalaması sırasında ki yanlışlıkların izlenmesinin hizalama çıktısını nasıl etkilediğini de gösterir. Şekil 4C'deyer alan açıklamalı montajdan, solucanların uygun hizalanmasını engelledikleri için aşağıdaki hataları önlemeye özen verilmelidir:
- Solucanın tepeden tırnağa tutarsız izlenmesi ("kuyruktan başa" olarak etiketlenir). Bu, solucanların hizada farklı yönlere (yani kuyruk-to-to-to-to-tail) yönlendirilmesiile sonuçlanır.
- Eksik izleme ("eksik" olarak etiketlenmiştir). Bu, solucanın montaj için kırpılmış olarak izlenen kısmının sadece bir kısmının kırpılmasıyla sonuçlanır.
- Tek bir iz ("iki başlı solucan" etiketli) birden fazla solucan dahil. Bu solucanlar artı (önemli bölümleri) komşuları montaj aynı panele eklenen neden olur.
- Görüntüye rasgele çizgiler ekleme ("rastgele" olarak etiketlenmiştir). Bu montaj rasgele paneller ekleme ile sonuçlanır.
Montajın oluşturulması için, her satır tek bir solucanın tüm uzunluğunu tek tek iz olarak izlediği sürece, iki ayrı çizginin kesişmesi ("kesişme" olarak etiketlenmiş) veya solucanın her iki ucunda birleştirilmiş olması sorun değildir: Solucan hizalama komut dosyası ayrı ayrı ve sırayla her satırı seçer, ekinler ve düzleştirir, böylece son montajdaki her panel tek bir çizgiyi temsil eder. Ancak kesişen solucanlar durumunda, montajda solucan "kesişme1" ve solucan "kesişme2" için tam uzunlukta düzleştirilmiş solucanlar görünse de (Şekil 5A-B'yebakınız), bu solucanların orijinal genel bakışta birbirlerine çapraz lamaları açıkça fark edilir. Bu nedenle, kesişen çizgilerin görsel tanımlamasının 'veri' alt klasöründe(Şekil 5A)bulunan bindirme görüntüsünden ve montajdaki tek tek solucan panellerinden(Şekil 5B)mümkün olduğu sonucuna varılabilir. Buna ek olarak, solucanların/satırların herhangi bir çakışması, Worm-align tarafından işlenen her görüntü için oluşturulan kalite denetimi (QC) tablosundan tanımlanabilir ve veri alt klasörüne kaydedilebilir. Bu tablo, resimde çizilen roi'lerin her biri için üç parametre kaydeder (Bkz. Şekil 5C): Bunlardan Uzunluk, solucanın boyutunun iyi bir göstergesi olan RoI çizgisinin uzunluğunu gösterir; ve Solucan numarası, genel bakış görüntüsünde çizgilerin çizilme sırasını gösterir. Son olarak, son sütun, söz konusu solucan/çizgi ile görüntüde seçilen diğer solucanlar/çizgiler arasında çakışma olup olmadığını gösterir. Çakışması durumunda bu sütundaki sayı Solucan sayısı sütununda listelenenden farklı olacaktır. Bindirme görüntüsüyle birlikte QC tablosu, solucanların montaj ve/veya nicelikten dışlanması gereken öğrenilen kararlar alması için araştırmacıya yardımcı olmalıdır.
Worm-align çıkışı tek solucanlarda floresan yoğunluğunun sonraki nicelikselleştirilmesi için kullanılabilir. FIJI'de, roi hattı orijinal görüntü verilerindeki floresan yoğunluğunu ölçmek için kullanılabilir, örneğin Github'daki Worm-align deposunda da bulunan basit FIJI komut dosyası 'Worm-quant.ijm' komut dosyası yürütülerek. Alternatif olarak, Worm-align çıktıüçüncü taraf görüntü çözümleme yazılımına içe aktarılabilir. Bunu, iki veri kümesinin Worm-align çıktısını CellProfiler'da oluşturduğumuz bir boru hattı olan Worm_CP'a aktararak gösteriyoruz. Worm_CP, Worm-align makrosu yürütülmesi sırasında seçilen solucanların tek tek segmentasyon maskelerine ince ayar yapmak için Worm-align çıktı klasörünün 'CellProfiler' alt klasöründeki dosyaları kullanır. Özellikle, seçilen solucanları ikili maskede görülen solucan popülasyonundan izole etmek için çizgi maskesini (adlandırılmış: Lines_) kullanır (adı: Mask_). Montajların oluşumunda bir sorun olmasa da, genel bakış görüntüsünde(Şekil 5A)kesişen çizgilerin Worm_CP boru hattı için sorunlu olduğu unutulmamalıdır. Neden bu durumda, Şekil 5 D-Egösterilmiştir . Worm_CP tek tek solucanların tanımlanmasına yardımcı olmak için tek tek ROI'ları değil, çizgi maskesini(Şekil 5D)kullanır. Worm-align'ın yürütülmesi sırasında ikinci olarak çizilen kesişen çizgi ilk satıra yerleştirilir ve bu nedenle bu çizgi deki yoğunluk, 1 ve 2'nin çakıştığı bit de dahil olmak üzere ROI2'nin ki olacaktır. Sonuç olarak, CellProfiler line2'yi tek bir nesne olarak, satır1'i ise satır2 ile kesiştiği yerde ayrılan iki nesne olarak bölümlere ayırır. Bu, CellProfiler'ın solucan 'kesişmesi1' için iki (yarım) solucan maskesi üreteceği anlamına gelir(Şekil 5E). Bu olayları son çözümlemeden (gerekirse) dışlamanın en kolay yolu, QC tablosundan (veri alt klasörü) kesişen solucanların solucan sayısını belirlemek ve bu solucanlar için ölçümleri CellProfiler çıktı dosyalarından kaldırmaktır. Solucanların FIJI ve CellProfiler'da aynı numaranın ayrılması gerekmeyeceğini lütfen unutmayın: CellProfiler çıkışındaki FIJI solucan numarasını tanımlamak için 'Çizgiler.csv' çıktı dosyasındaki Intensity_Max_Intensity değerlerine bakın. 'Çizgiler.csv' tablosunda görüntü başına birden fazla kez görünen herhangi bir Intensity_Max_Intensity değeri, bu satırın yatırım getirisinin bir göstergesidir ve bu da kırık bir solucan maskesi ile sonuçlanır.
Tek tek solucan maskeleri bölünürse, Worm_CP tüm kaydedilmiş kanallar için seçilen solucanlarda floresan yoğunluğunu ölçebilir. CellProfiler'ın piksel yoğunluğunu 0-1 ölçeğinde otomatik olarak yeniden ölçeklendirdiğini belirtmek gerekirken, tüm ölçümler orijinal (ham) görüntü verilerinden alınır. Bu, ham piksel yoğunluğu değerinin görüntü için mümkün olan en yüksek piksel yoğunluğuna bölünmesiyle elde edilir. 8 bit görüntüler de bu değer 255, 16 bitlik görüntüler de 65535'tir. Bu nedenle CellProfiler yoğunluk değerleri ham görüntü verilerine eşdeğer değerleri yeniden kazanmak için mümkün olan en yüksek yoğunluk değeri ile çarpılması gerekir. Worm_CP çıktısı, seçili çıktı klasörüne kaydedilen iki csv dosyasından oluşur: 'worms.csv' ve 'Lines.csv' Bu dosyaları incelerken, CellProfiler floresan yoğunluğu ile ilgili parametrelerin çok sayıda kaydeder açıktır. Bunlardan Intensity_IntegratedIntensity solucan başına toplam floresan (yani, tek bir solucanın maskesini oluşturan tüm pikseller içindeki floresan yoğunluğunun toplamı) karşılık gelir. parametre Intensity_MeanIntensity, tek bir solucanın içindeki ortalama floresan yoğunluğunu (yani, tek bir solucanın içinde bulunan tüm pikseller için piksel başına ortalama floresan yoğunluğu) ifade eder. Solucan maskelerinin ayrı ayrı floresan ölçümlerini iki koşul arasında karşılaştırırken Ortalama Yoğunluk ölçümlerinin kullanılması tavsiye edilir. Arka plan floresanını nicel ölçülerden çıkarmak istiyorsanız, MeanIntensity_Threshold adlı ölçüleri kullanın.
Worm_CP boru hattını, lipid damlacıklarına (LD) dahil olan floresan boya ile etiketlenmiş sabit hayvanlardan floresan yoğunluğunu ölçmek için kullandık(Şekil 6). Worm-align/Worm_CP boru hattından floresan niceliğini doğrulamak için, BODIPY veri setindeki aynı solucan kümesindeki floresan yoğunluğunu Worm-align/Worm_CP boru hattı veya FIJI/ImageJ'deki manuel niceleme ile ölçtük. Fiji/ImageJ'de her solucanın etrafında ve her görüntüde koyu bir arka plan bölgesi nin etrafında dönerek manuel nicelleştirme yapılmıştır. Floresan yoğunluğu Yatırım Getirisi yöneticisinde ölçüldü ve görüntü arka planı için ölçülen değer, her solucanın solucan floresanölçümünden çıkarılarak17. Yabani tip (WT) N2 solucanlarını dbl-1(nk3) mutantları ile karşılaştırdık ve bu solucanlar lipid damlacık içeriğinde azalma18. Beklendiği gibi, yeşil floresan yoğunluğu her iki yöntemle WT ve dbl-1(nk3) solucanları arasında önemli ölçüde azalır(Şekil 6A,B). Şekil 6C,D'dehizalanmış solucan örnekleri görülebilir. Lipid damlacık içeriği wt ve dbl-1(nk3) arasında manuel nicelik kullanılarak %17 (p-value<0.0001, eşleşmemiş t-testi) ve Worm_CP boru hattı kullanılarak %14 (p-value=0.0051 eşleşmemiş t-testi) oranında azalır. Burada dbl-1(nk3)'de her iki niceleme metotile gözlenen lipid damlacık içeriğindeki azalma literatür18'euygun olarak dır. Bu, edinilmiş floresan görüntülerinin Worm_CP CellProfiler boru hattı ile nicelleştirilmesinin manuel niceleme karşılaştırılabilir olduğunu göstermektedir.
Ayrıca Worm_CP, GFP'yi ısı şoku indükleyici gen hsp-70(C12C8.1)9kontrolü altında ifade eden canlı solucanlarda ısı şoku tepkisini ölçmek için kullandık. Şekil 7, Canlı C. eleganların ısıya duyarlı hsp-70(C12C8.1)p::GFP muhabiritaşıyan temsili görüntülerini gösterir. Isı stresi yokluğunda solucanlar GFP ekspresyonuna neden olmazlar (Şekil 7A,B). Ancak, solucanlar 34 °C'de 30 dk'lık kısa bir ısı şokuna maruz kaldığında GFP ekspresyonuna neden olurlar (Şekil 7C,D). Isı şoku olan ve olmayan GFP ifade düzeyleri Şekil 7E'deölçülür.
Şu anda Worm_CP çok temel bir boru hattıdır. Ancak, bu yaklaşım, görüntüden seçilen solucanlarda floresan yoğunluğunun daha doğru bir şekilde ölçülmesini sağlayan tek tek solucan maskelerinin daha doğru bir segmentasyonunu sağlar. Bu nedenle, biz fiji kaba bir nicelik üzerinde, sadece çizgi maskeleri kullanarak bu yaklaşımı tercih ederim. Buna ek olarak, CellProfiler ek analiz modülleri kolayca boru hattı dahil edilebilir avantajı sunuyor. Örneğin, lipid damlacık içeriğine bakan veri seti için, Worm_CP boru hattına ek modüllerin eklenmesi, genel bakışta seçilen solucanlardaki tek tek damlacıkların lipid damlacık sayılarını ve floresan yoğunluğunu araştırabilir.
Şekil 1: Bir ağız mikropipet imal. Bir cam kılcal bir Bunsen brülör alev uzatılır(A), ince uzamış ekstremiteler sağlayana kadar (B). Genişletilmiş cam kılcal sonra ağız mikropipet adaptör parçası takılır. (C) Bir ağız mikropipet şeması. Ağız mikropipeti bir adaptör takılı bir cam kılcal ile monte edildi. 6 mm'lik silikon boru, adaptörü güvenlik için kullanılan 0,2 m şırınga filtresine bağlar. Filtrenin diğer ucu, 1mL filtre ucu ile biten 3 mm'lik silikon boruya takılır. Deneyci filtre ucu üzerinden aspire edebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Ağız mikropipetini kullanarak solucan peletini çevreleyen sıvının aspirasyonu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Agarose pad'de yatan solucanların üzerine kapak kaymasını eklemek lütfen bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: Transkripsiyonel muhabir yağ-7ptaşıyan canlı hayvanlardan elde edilen floresan görüntüler üzerinde Worm-align kullanarak solucan doğrultma örnekleri: :Bağırsakta GFP ve yutakta kırmızı bir co-enjeksiyon belirteci (myo-2p::tdtomato). (A) Yetişkinliğin 3. Görüntü Worm_align ile açıldı ve Worm-align kullanarak solucanların uzunlamasına ekseni boyunca çizgiler çizildi. (B) Solucan hizalama kullanarak, solucanların ekseni boyunca çizgilerin iyi ve kötü çizimini yorumladığı örneklerle (A)ile aynı görüntünün ekran görüntüsü. (C) Yanlış hizalanmış solucanlara yükselebilen solucanların üzerine çizilen çizgilere örnekler. B. Images'da seçilen solucanların solucan hizalama çıktısı, yeşil floresan yoğunluğu=1, pozlama=60 ms ve kırmızı floresan yoğunluğu = 8, pozlama=60 ms. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen buraya tıklayarak, ters geniş alan mikroskobunda (bkz. Malzemeler tablosuna bakınız) 20 x objektif olarak alınmıştır.
Şekil 5: Kesişen solucanlarda Worm-align kullanarak solucan doğrultma örnekleri. (A) Transkripsiyonel muhabir yağ-7ptaşıyan yetişkinhayvanların 3 gün canlı solucanların floresan mikroskobu nda elde edilen kompozit bir görüntü ekran görüntüsü: :Bağırsakta GFP ve yutakta kırmızı bir co-enjeksiyon belirteci (myo-2p::tdtomato). Kesişen solucanlar "kesişme1" ve "kesişme2" olarak, çakışmayan solucanlar ise "good3" ve "good4" olarak etiketlenir. (B) Worm-align tarafından oluşturulan ve(A)olarak seçilen düzleştirilmiş solucanları temsil eden montaj. Montajda 1 ve 2 solucanlarının orijinal görüntüde kesiştiği fark edilir ("kesişme1" ve "kesişme2" olarak etiketlenmiş solucanlar). (C) Solucanların kesiştiği durumları tespit etmenizi sağlayan Worm-align'dan QC tablosunun ekran görüntüsü. Uzunluk: YG çizgisinin uzunluğu; solucan numarası: çizgilerin çizildiği sıra; son sütun, solucan/ilgi hattı ile diğer solucanlar arasında bir çakışma olup olmadığını gösterir. Bu örnekte, ilk ham solucan (solucan sayısı 1), son sütundaki "2" sayısıyla belirtildiği gibi, 2 numaralı solucanla çakışıyor. (D) A. (E) A'da seçilen dört solucan üzerinde Worm-align tarafından oluşturulan maskelerin Worm-align ile çizilen çizgilerin ekran görüntüsü, kesişen iki solucanın maskelerinin nasıl işlenir olduğunu gösterir. Bu durumda, bir yerine iki maske şimdi solucan "kesişme1" karşılık gelir. Görüntüler, yeşil floresan yoğunluğu=1, pozlama=60ms ve kırmızı floresan yoğunluğu = 8, pozlama = 60 ms. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Worm_CP boru hattı floresan'ı manuel nicelleştirme kadar doğru bir şekilde ölçer. Worm_CP boru hattı(A) veya manuel niceleme(B)kullanılarak, lipid damlacık içeriği için sabit ve lekeli genç erişkin solucanların floresan niceliği ile karşılaştırılır. WT ve dbl-1 (nk3) lipid damlacık içeriği, lipid damlacıklarının yağ asitlerine interkatelasyon sağlayan BODIPY ile hayvanların sabitlenmesi ve boyanarak izlendi (bkz. protokol A). Genç yetişkin hayvanlar % 60 isopropanol ile sabitlendi ve 1saat için BODIPY ile boyandı. Hayvanların aynı küme ya Worm_CP boru hattı (adım 7 bakınız) veya standart prosedürlere göre manuel nicel17kullanılarak ölçüldü. (A) Worm_CP boru hattı kullanılarak floresan ölçülmesi. WT: n=22 hayvan, ortalama floresan= 1.016 (A.U) ± 0.206 SD; dbl-1(nk3):n=25 hayvan, ortalama floresan= 0.8714 (A.U) ± 0.126 SD. Eşleşmemiş t-testi. (B) Floresan manuel nicelleştirme. WT: n=22 hayvan, ortalama floresan = 1.048 ± 0.153 SD; dbl-1(nk3): n=25 hayvan, ortalama floresan = 0.8632 ± 0.109 SD. Eşleşmemiş t-testi. (C, D) WT(C)ve dbl-1(nk3) (D) hayvanlar için temsili örnek veya Worm-Align çıkışı Worm-align boru hattı ile düzeltildi. Görüntüler, yeşil floresan yoğunluğu=2, pozlama=60ms olan ters geniş alan mikroskobunda (Bkz. Malzemeler tablosu) 20 x objektif olarak alınmıştır.
Şekil 7: Transkripsiyonel muhabir hsp-70(C12C8.1)p::GFP'yi taşıyan canlı solucanların floresan görüntülerinden canlı solucanların floresan niceliği ve hizalama örneği. (A) Kısa bir ısı şoku üzerine (34 °C'de 30 dk) genç yetişkin solucanlar yetiştirme sıcaklığında (25 °C) kurtarıldı lar ve 3.5 h sonrası ısı şoku görüntülenerek monte edildiler. Yaklaşık 30 solucan, Solucan hizalama boru hattı kullanılarak ısı şoku sonrasında ölçüldü. (A-B) Isı şokuna maruz kalmamış hizalanmış solucanörnekleri. (C-D) Hsp-70(C12C8.1)p::Worm-align kullanarak GFP taşıyan ısı şoklu solucanlara örnekler. (E) GFP Ortalama yoğunluğunu gösterir (Worm_CP parametresi: MeanIntensity_Threshold) WT genç yetişkin solucanlar, ısı şoku olmadan veya ısı şokuna maruz kalma (34 °C 30 dakika için). Görüntüler, yeşil floresan yoğunluğu=1, pozlama=60ms; HS yok: n=12, HS: n=32. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: FIJI'de Solucan hizalama makrosu yüklendikten sonra bulunabileceği konum. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
Ek Şekil 2: Aynı ayarlarla çekilen tüm görüntüleri içeren klasörün seçimi. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
Ek Şekil 3: FIJI'deki çıktı klasöründe 4 alt klasörün üretimi. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
Ek Şekil 4: Montaj için solucan genişliği ve kanal ayarları arasında bir çizgi çizimi. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
Ek Şekil 5: Uygulanan ayarlarla görüntünün önizlemesi. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
Ek Şekil 6: Montaj ve/veya nicelleştirme nin dahil edilmesi için ilgi çeken solucanların uzunlamasına ekseni boyunca bir çizgi çizilmesi. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
Ek Şekil 7: Çıkış klasöründe seçili solucanların "hizalanmış" klasörü altında montajı. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
Ek Şekil 8: Hücre Profiler önceki analizönceki görüntüleri temizleme. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
Ek Şekil 9: Ayarlar.csv alt klasörünü seçerek Worm-align çıktı klasöründen CellProfiler'a meta veri alma. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
Ek Şekil 10: CellProfiler boru hattı Worm_CP.cpproj seçilen solucanları (A) ayırmak için Lines_ görüntüleri kullanır ve ilgi solucanlarının tek solucan maskelerini (C) üretir. Boru hattı aynı zamanda arka plan yoğunluğunu (B) ölçer. Bir csv dosyasında (D) dışa aktarılan Worm_CP.ccproj ardışık ardışık hatlar tarafından ölçülen tüm parametrelerin görünümü. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
Ek Şekil 11: "Worm_CP.cpproj boru hattındaki ExportToSheet tablosunda çıktı dosyalarının seçimi. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
Discussion
Solucan hizalama, kullanıcı tarafından seçilen solucanların montajlarını kolayca oluşturan ve solucanların görsel karşılaştırma, sınıflandırma ve gösterime yardımcı olacak şekilde hizalandığı FIJI tabanlı bir görüntü işleme ardışık hattıdır. Bu özellik aynı zamanda bazı mevcut araçlar tarafından sunulsa da, özellikle CellProfiler7'dekiWormToolbox modülü, Worm-align nispeten az önceki görüntü analizi deneyimi gerektirir: Kullanıcılar sadece montaj (ve analiz) için seçmek istedikleri solucanları izlemeleri gerekir. Ham görüntü verilerindeki solucanları izlemek kolay bir işlem olsa da -özellikle dokunmatik ekranlı bir bilgisayar veya tablet mevcutolduğunda-, bu çizgilerin solucanların uzunlamasına ekseni boyunca doğru şekilde çizildiği çok önemlidir. Solucanın sadece bir kısmını takip eden eksik çizgiler, CellProfiler analizi sırasında montajda kısmi solucanlara (yani kuyruk uçlarının kafaları eksik olan solucanlara) ve kısmi segmentasyon maskelerine neden olur. Ayrıca, iki solucanın çizgileri geçerse, solucanlar solucan hizalama montajında ve floresan nicelleştirme de doğru bir şekilde işlenmeyecektir. Kalite kontrolü için, orijinal görüntüdeki satır seçimlerinin yer kaplaması görüntüsü, bir QC tablosuyla birlikte veri klasörüne kaydedilir. Bunlardan, yanlış bölümlenmiş solucanlara yol açacak sorunlu çizgiler kolayca tanımlanabilir ve montaj ve/veya sonraki analizlerin dışında tutulabilir.
Solucan seçiminde deneyciden gelen doğrudan girdi belki de biraz zaman alıcı gibi görünse de, farklı gelişim aşamalarından gelen solucanların aynı görüntüde bulunduğu deneylerde diğerleri üzerinde iş akışının açık bir avantajını sunar: Solucanlar sadece doğru gelişim aşamasındaolan solucanları özetleyerek "izleme adımı" sırasında seçilebilir. Alternatif olarak, solucanlar, hem solucanların uzunluğuna/boyutuna ilişkin güvenilir göstergeler olan izleme hattının uzunluğuna veya segmentasyon maskesinin alanına göre Worm_CP çıktıkullanılarak filtrelenebilir. Dic görüntülerindeki boyutları ve görünümleri çok farklı olduğundan, makine öğrenme algoritmalarının solucanları farklı gelişim evrelerinden tanımakta zorlanabilir.
Worm-align çıktısı, tek solucanlarda, doğrudan FIJI'de veya diğer görüntü analizi yazılım platformlarında floresan yoğunluğunun sonraki nicelikselleştirilmesi için kullanılabilir. Bunu, Worm-align boru hattını çalıştırırken seçilen solucanlarda çok kanallı floresan yoğunluğunun ölçülmesine olanak tanıyan basit bir CellProfiler boru hattına (Worm_CP) Worm-align çıktısını ithal ederek gösterdik. CellProfiler yazılımının esnekliği nedeniyle bu yaklaşımı seçtik: Tek tek solucanlardaki ek özellikleri analiz etmek için boru hattına ek modüller dahil etmek kolaydır (örn. lipid damlacıklarının boyutunun ölçülmesi veya stres granülleri, çekirdekler, mitokondri). Buna ek olarak, tek solucan maskeleri potansiyel WormToolbox7için yeni bir model eğitmek için kullanılabilir.
Bu yöntemin temel avantajları hızlı olması ve basit bir solucan montaj kurulum gerektirir. Bu yöntem yazılım işlemi öğrenme veya bir makinealgoritması7 ile eğitim setleri çalışan zaman harcama gerektirmez gibi daha hızlıdır. Ayrıca, bu yöntem ya canlı ya da sabit solucanlar sadece normal agarose pedleri üzerine monte çalışır. Diğer yöntemlerde geliştirilen karmaşık mikroakışkan odaları kullanmaya gerek yoktur5,6.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
BIOCEV'den (Prag, Çek Cumhuriyeti) Dr. Christian Lanctôt'a sabit solucanlar monte etmek için ağız mikropipet tekniğini öğrettiği için teşekkür ederiz ve Dr. Fatima Santos ve Dr Debbie Drage ağız mikropipetinde güvenlik kurulumlarını paylaştırdığımız için. Ayrıca francesca Hodge'a el yazması, Sharlene Murdoch ve Babraham Institute Facilities'e desteklerinden dolayı teşekkür ederiz. OC, ERC 638426 ve BBSRC [BBS/E/B000C0426] tarafından desteklenir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | MeLford Biolaboratories Ltd | MB1200 | |
| Aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177 | to create mouth micro-pipette (see protocol step) |
| Beaker | |||
| BODIPY 493/593 | Invitrogen | D3922 | stock solution prepared in DMSO at 1mg/mL |
| Centrifuge | MSE MISTRAL 1000 | ||
| Conical flask | |||
| Cover Slip | VWR | 631-0120 | |
| Filter 0.2 µm for Syringe | Sartrius | 16534-K | Filter, to create mouth micro-pipette (see protocol step) |
| Isopropanol | |||
| Levamisole hydrochloride | Sigma-Aldrich | BP212 | 3mM solution prepared by dissolving levamisole in M9 |
| Liquid Nitrogen | Liquid Nitrogen facility | ||
| Low Retention Tip 1000µL | Starlab | S1182-1830 | |
| Methanol | VWR chemicals | 20847.307 | |
| Microscope Slides, MENZEL GLASSER | Thermo Scientific | BS7011/2 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Microwave Oven | Delongi | ||
| M9 | prepared in the lab according to15 | ||
| 9cm NGM Plates | prepared in the lab according to15 | ||
| PBS | prepared in the lab | ||
| Protein LoBind Tube 2ml | Eppendorf | 22431102 | |
| Triton | SIGMA | T9284-500ML | |
| Ring Caps | SIGMA-ALDRICH | Z611247-250EA | glass micro-capillary tubes to create mouth micro-pipette (see protocol step) |
| Rotator | Stuart Scientific | ||
| Silicone tubine translucent | Scientific Laboratory Suppliers | TSR0600200P | 6.0 mm x 2.0 mm wall - to create mouth micro-pipette (see protocol step) |
| Sterilized H2O | MilliQ water autoclaved in the lab | ||
| 10µL Tips | Starlab | S1120-3810 | |
| 200µL Tips | Starlab | S1120-8810 | |
| 1000µL Tips | Starlab | S1122-1830 | |
| 15mL Centrifuge Tube | CORNING | 430791 | |
| Vecta Shield | VECTOR | 94010 | antifade mounting medium (H-1000) without DAPI |
References
- Shave, D. D., Greenwald, I. OrthoList: A compendium of C. elegans genes with human orthologs. PLoS One. 6 (5), 20085 (2011).
- Stiernagle, T.
- Letizia, M. C., et al. Microfluidics-enabled phenotyping of a whole population of C. elegans worms over their embryonic and post-embryonic development at single-organism resolution. Microsystems & Nanoengineering. 4 (6), (2018).
- San-Miguel, A., Lu, H. Microfluidics as a tool for C. elegans research. WormBook. , (2013).
- Atakan, H. B., et al. Automated Platform for Long-Term Culture and High-Content Phenotyping of Single C. elegans Worms. Scientific Reports. 9 (1), 120-135 (2019).
- Atakan, H. B., Cornaglia, M., Mouchiroud, L., Auwerx, J., Gijs, M. A. M. Automated high-content phenotyping from the first larval stage till the onset of adulthood of the nematode Caenorhabditis elegans. Lab on a Chip. 19 (1), 120-135 (2018).
- Wählby, C., et al. An image analysis toolbox for high-throughput C. elegans assays. Nature Methods. 9 (7), 714 (2012).
- Morimoto, R. I. The heat shock response: systems biology of proteotoxic stress in aging and disease. Biology. 76 (9), 91-99 (2012).
- Guisbert, E., Czyz, D. M., Richter, K., McMullen, P. D., Morimoto, R. I. Identification of a tissue-selective heat shock response regulatory network. PLoS Genetics. 9 (4), (2018).
- Klapper, M., et al. Fluorescence-based fixative and vital staining of lipid droplets in Caenorhabditis elegans reveal fat stores using microscopy and flow cytometry approaches. Journal of Lipid Research. 52 (6), 1281-1293 (2011).
- Wählby, C., et al. and low-throughput scoring of fat mass and body fat distribution in C. elegans. Methods. 68 (3), 9 (2014).
- Kurimoto, K., Yabuta, Y., Ohinata, Y., Saitou, M. Global single-cell cDNA amplification to provide a template for representative high-density oligonucleotide microarray analysis. Nature Protocols. 2 (3), 739-752 (2007).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18, 529 (2017).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome. 7, 100 (2006).
- Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).
- Casanueva, M. O., Burga, A., Lehner, B. Fitness trade-offs and environmentally induced mutation buffering in isogenic C. elegans. Science. 335 (6064), 82-85 (2012).
- Clark, F. J., Meade, M., Ranepura, G., Hall, D. H., Savage-Dunn, C. Caenorhabditis elegans DBL-1/BMP Regulates Lipid Accumulation via Interaction with Insulin Signaling. G3. 8 (1), Bethesda. 343-351 (2017).
