Summary
Worm-align/Worm_CP es un flujo de trabajo simple de FIJI/CellProfiler que se puede utilizar para enderezar y alinear muestras de Caenorhabditis elegans y para puntuar ensayos basados en imágenes de gusano entero sin necesidad de pasos de entrenamiento previos. Hemos aplicado Worm-align/Worm_CP a la cuantificación de la expresión inducida por choque térmico en animales vivos o gotas de lípidos en muestras fijas.
Abstract
Un problema que a menudo se encuentra al adquirir datos de imagen de C. elegans fijos o anestesiados es que los gusanos se cruzan y se agrupan con sus vecinos. Este problema se agrava con la creciente densidad de gusanos y crea desafíos para la toma de imágenes y la cuantificación. Desarrollamos un flujo de trabajo basado en FIJI, Worm-align, que se puede utilizar para generar montajes de un solo canal o multicanal de gusanos seleccionados por el usuario, enderezados y alineados a partir de datos de imagen sin procesar de C. elegans. Worm-align es un flujo de trabajo simple y fácil de usar que no requiere entrenamiento previo ni del usuario ni del algoritmo de análisis. Los montajes generados con Worm-align pueden ayudar a la inspección visual de los gusanos, su clasificación y representación. Además, la salida de Worm-align se puede utilizar para la cuantificación posterior de la intensidad de fluorescencia en gusanos individuales, ya sea en FIJI directamente o en otras plataformas de software de análisis de imágenes. Esto se demuestra mediante la importación de la salida Worm-align en Worm_CP, una canalización que utiliza el software CellProfiler de código abierto. La flexibilidad de CellProfiler permite la incorporación de módulos adicionales para la selección de alto contenido. Como ejemplo práctico, hemos utilizado la canalización en dos conjuntos de datos: el primer conjunto de datos son imágenes de gusanos reporteros de choque térmico que expresan proteína fluorescente verde (GFP) bajo el control del promotor de un gen inducible por choque térmico hsp-70,y el segundo conjunto de datos son imágenes obtenidas de gusanos fijos, manchadas para reservas de grasa con un tinte fluorescente.
Introduction
Un organismo relativamente simple, el nematodo C. elegans,es un sistema modelo extremadamente útil para el estudio de enfermedades humanas. Alrededor del 38% de los genes en el genoma de C. elegans tienen contrapartes funcionales en humanos1,2. Una de las características únicas de C. elegans es que es ópticamente transparente, lo que permite un fácil acceso a la información in vivo con respecto a (sub) expresión celular de reporteros fluorescentes a través de los tejidos. Esto convierte a C. elegans en un organismo modelo principal para pantallas de alto contenido utilizando plataformas basadas en imágenes3. Sin embargo, un problema que a menudo complica estos estudios es que cuando se toman imágenes de poblaciones densas de gusanos, tienden a cruzarse y agruparse, haciendo comparaciones entre gusanos individuales desafiantes, nublando el análisis y la cuantificación de imágenes aguas abajo.
Las soluciones existentes que superan este problema suelen basarse en la optimización del protocolo de cultivo e imagen, como mediante el uso de configuraciones micro fluidísticas4,lo que permite capturar gusanos individuales en imágenes separadas5,6. Otros han aplicado algoritmos de aprendizaje automático que permiten el reconocimiento de gusanos individuales, incluso en una población agujena. Un excelente ejemplo de esto último es WormToolbox, que es una extensión modular de la plataforma de análisis de imágenes de código abierto, CellProfiler7. WormToolbox ofrece una solución de alto rendimiento y alto contenido para el análisis de C. elegans,y se beneficia claramente de su inclusión en CellProfiler, ya que se pueden incluir fácilmente módulos de análisis adicionales. Aunque WormToolbox viene incluido con un modelo previamente entrenado (DefaultWormModel.xml), el reentrenamiento del algoritmo de aprendizaje automático suele ser necesario para cada nueva aplicación. Los tutoriales en línea sobre cómo hacerlo están disponibles en Github (https://cp-website.github.io/Worm-Toolbox/). A pesar de esto, la instalación y el uso de WormToolbox requiere una importante inversión de tiempo para los usuarios principiantes.
Aquí, describimos un protocolo simple, rentable y eficaz en el tiempo para la cultura, y las poblaciones de imagen de C. elegans. Para permitir la evaluación de gusanos individuales en las imágenes adquiridas, hemos desarrollado un flujo de trabajo simple basado en FIJI de código abierto, llamado Worm-align. La alineación de gusanos se puede utilizar para generar montajes de un solo canal o multicanal de gusanos enderezar y alineados. En primer lugar, el usuario debe seleccionar manualmente gusanos individuales para su análisis dibujando una línea desde la cabeza hasta la cola. Worm-align utilizará esta selección para recortar los gusanos seleccionados de la imagen de visión general y generar un montaje en el que los gusanos seleccionados se enderezan y alinean para facilitar la comparación visual y la presentación.
Además, la salida de Worm-align se puede utilizar para la cuantificación posterior de la intensidad de fluorescencia en gusanos individuales, ya sea en FIJI directamente o en otras plataformas de software de análisis de imágenes. Esto se demuestra mediante la importación de la salida Worm-align en Worm_CP, una canalización que utiliza el software CellProfiler de código abierto. La flexibilidad de CellProfiler permite la incorporación de módulos adicionales para la selección de alto contenido. Hemos utilizado la tubería de Worm_CP para cuantificar la respuesta de choque térmico, un mecanismo de protección bien conservado que reobri las proteínas que están mal pleidas debido a factores de estrés como la alta temperatura8. Específicamente, aplicamos la tubería a los gusanos que llevan un transgén integrado de múltiples copias, donde el promotor de un gen inducible por choque térmico, hsp-70(C12C8.1), impulsa la proteína fluorescente verde (GFP)9. También hemos utilizado la Worm_CP en animales fijos que han sido etiquetados con un tinte fluorescente que visualiza las gotas de lípidos (LDs), el principal orgánulo de almacenamiento de grasa en C. elegans10. Aunque este flujo de trabajo no tiene el rendimiento ofrecido por WormToolBox, es una alternativa sencilla y fácil de usar para la presentación visual y el análisis de experimentos de C. elegans basados en imágenes.
Protocol
1. Fijación de gusanos para imágenes de contenido de grasa utilizando un tinte fluorescente para gotas de lípidos (BODIPY)10
- Preparar una población sincronizada de C. elegans blanqueando de acuerdo con los procedimientos estándar2. Placa de unos 1.000 gusanos de etapa L1 en una placa de medios de crecimiento de nematodos (NGM) de 9 cm por condición.
NOTA: Se preparan más gusanos de los que realmente se cuantifican al final, debido a la pérdida de gusanos durante el manejo. - Para tomar imágenes de animales en la etapa de adulto joven (alrededor de 50 h post L1 chapado a 20 oC), lavar cada placa de 9 cm con 15 ml de M9 en un tubo cónico, centrifugar a 252 x g durante 1 minuto, y quitar el sobrenadante.
- Repita el lavado y deje 1 ml de M9 sobre el pellet de los gusanos.
- Transfiera 1 ml de M9 que contenga los gusanos en un tubo de microcentrífuga de baja unión a proteínas de 2 ml, utilizando puntas de baja retención.
- Gire hacia abajo a 252 x g en una microcentrífuga durante 1 min y retire el sobrenadante, teniendo cuidado de no tocar el pellet de gusano en la parte inferior del tubo.
- Para monitorear el contenido de grasa usando 4,4-difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene (BODIPY) tinción10 (Tabla de materiales), fijar gusanos ya sea añadiendo 0,5 ml de 60% de isopropanol al pellet de gusano durante 3 min11,o añadiendo 2 ml de metanol helado durante 10 min. Para ambos procedimientos, invierta el tubo cada 30 s.
ADVERTENCIA: Si el metanol es el reactivo de fijación elegido, este paso debe realizarse en una campana de humo debido a su toxicidad. - Retire tanto fijador como sea posible sin tocar el pellet de gusano y agregue 1 mL de M9. Deje que los gusanos se asienten en la parte inferior del tubo durante 3 x 5 minutos.
- Lavar de nuevo con 1 ml de M9, dejar que los gusanos se asienten y retiren el sobrenadante, dejando alrededor de 50 l en el tubo. Asegure el tubo con una abrazadera.
- Congelar los gusanos hundiendo el tubo cerrado de forma segura en nitrógeno líquido y luego en un baño de agua caliente a 40 oC.
- Repita el paso 1.9 una vez más.
- Añadir 0,5 ml de BODIPY diluido en M9 a una concentración final de 1 g/l y colocar sobre un rotador a temperatura ambiente durante 1 h.
- Después de 1 h, deje que los gusanos se asienten en la parte inferior del tubo durante 3 x 5 min.
- Retire el sobrenadante y agregue 1 mL de M9.
- Deje que los gusanos se asienten en la parte inferior y retiren el sobrenadante.
NOTA: Alternativamente, es posible girar hacia abajo a 252 x g durante 1 min, ya que esto no parece afectar a la morfología. - Añadir 0,5 mL de M9.
NOTA: Si el fijador es 60% isopropanol, los gusanos sólo se pueden utilizar dentro de 48 h. Si el fijador es metanol, los gusanos deben utilizarse dentro de las 24 horas.
2. Preparación de almohadillas de agarosa para montar los gusanos
NOTA: El paso crítico mientras se prepara una almohadilla de agarosa es obtener una almohadilla de espesor regular. De lo contrario, los gusanos a través de la almohadilla estarán en diferentes planos focales, por lo que es difícil obtener una imagen enfocada de un campo de visión más amplio.
- Preparar almohadillas de agarosa al 2% añadiendo 0,2 g de agarosa a 10 ml de H2O esterilizado en un vaso de precipitados o un matraz cónico. Calentar en el microondas durante 30 s hasta que la agarosa comience a hervir.
NOTA: No se sobrecaliente y se detenga tan pronto como aparezcan burbujas; de lo contrario aumenta la viscosidad de la agarosa por lo que es más difícil lograr el espesor de la almohadilla deseada. - Una vez que la agarosa se derrite, dispensar una gota de agarosa derretida en el centro de un portaobjetos de vidrio del microscopio utilizando una punta de pipeta de 1000 l con su corte final. Inmediatamente, pero delicadamente, sostenga otro portaobjetos de vidrio muy cerca de la gota de agarosa y suéltelo en la agarosa para formar una almohadilla de espesor regular para obtener los mejores resultados de la microscopía.
NOTA: Liberar la diapositiva superior desde una altura no solo formará burbujas, sino que también dará lugar a una almohadilla desigual. Alternativamente, también es posible utilizar dos diapositivas de vidrio que flanquean la diapositiva con la almohadilla, con una fina capa de cinta en cada diapositiva. - Después de un mínimo de 2 a 3 min, retire suavemente la corredera superior. Usando el lado de la diapositiva superior, recorte la almohadilla para que sea de forma cuadrada. Monte los gusanos en un plazo de 5 min, para evitar que la almohadilla se seque antes de su uso.
3. Montaje de gusanos fijos para imágenes
- Crear una micropipeta de boca extendiendo un capilar de vidrio delgado en la llama de un quemador Bunsen (Figura 1A). Después de la extensión en la llama, romper el capilar en dos piezas (Figura 1B). Elija el más adecuado, por lo general el más largo, y pruebe si el extremo del capilar está abierto tratando de aspirar agua.
NOTA: Si el líquido no entra en el capilar, es demasiado delgado o bloqueado. Corte suavemente el extremo del capilar con un par de tijeras, evitando cortar demasiado como gusanos serán aspirados si el agujero es demasiado grande. - Enchufe el capilar de vidrio del paso 3.1 en el adaptador capilar(Figura 1C),conectado al tubo de silicona de 6 mm y enchufe el otro extremo del tubo de silicona de 6 mm en un filtro de 0,2 m, unido a un tubo de silicona de 3 mm en su otro extremo(Figura 1C). Enchufe una punta de filtro de 1 ml(Figura 1C)en el extremo libre del tubo de silicona de 3 mm para aspirar líquido.
NOTA: Se añade el filtro de 0,2 m entre la boca del experimentador y el capilar, para garantizar la máxima seguridad del experimentador. Una solución similar se utiliza para micropipetas bucales utilizadas para manejar embriones deratón 12. Cambie el filtro (generalmente cada pocos meses) si la micropipeta de la boca ya no aspira líquido. - Usando la micropipeta de la boca bajo un microscopio de disección, retire la mayor cantidad de líquido posible alrededor del pellet de gusano de gusanos fijos (Figura 2).
NOTA: Pipetear sobrenadante con una micropipeta manual se puede utilizar como alternativa a las pipetas de boca en los pasos 3.1 a 3.3 para eliminar tanto sobrenadante como sea posible. Añadir 6 s de medio de montaje. Encontramos, sin embargo, que este método no funciona tan eficientemente porque el líquido excesivo en las almohadillas crea una densidad de gusanos escasa, lo que hace que las imágenes requieran más tiempo. Reanudar el paso 3.6. Mire la parte inferior del tubo y asegúrese de que la pipeta no aspire los gusanos. - Añada rápidamente 10 ml de medio de montaje(Tabla de materiales)en la parte inferior del tubo.
- Enjuague una punta de 10 l en PBS con rastros de detergente (0,01% Tritón), para evitar que los gusanos se peguen a los lados de la punta de la pipeta de plástico. Corta el extremo de la punta con unas tijeras.
- Transfiera 8 l del medio de montaje que contiene los gusanos a la almohadilla de agarosa preparada en el paso 2.3. Bajo el microscopio, agita suavemente el portaobjetos, para evitar la superposición de los gusanos.
- Cubra la caída del medio de montaje en la almohadilla de agarosa con un cubreobjetos de 18 mm x 18 mm(Figura 3).
NOTA: Se prefieren los cubreobjetos más pequeños, ya que ejercen menos presión sobre los gusanos. Sostenga el cubreobjetos con un par de pinzas y aplique un borde del cubreobjetos contra la almohadilla de agarosa, antes de depositar suavemente el cubreobjetos con las pinzas.
4. Montaje de gusanos vivos para imágenes
NOTA: Para imaginar gusanos vivos, deben ser inmovilizados en la almohadilla. Una manera de lograr esto es paralizarlos con el agonista del receptor nicotínico: levamisol(Tabla de materiales).
- Pipeta de 3 a 4 l de 3 mM de levamisol disuelto en M9 sobre la almohadilla de agarosa creada en el paso 2.3.
NOTA: Debe haber suficiente volumen líquido que los gusanos no están uno encima del otro, pero no demasiado líquido que los gusanos son demasiado escasos en la almohadilla. Los recolectores de gusanos experimentados pueden usar 3 ml de levamisol. Los recolectores menos experimentados podrían necesitar añadir un mayor volumen de levamisol, para que el levamisol no se evapore totalmente. - Escoge 30 a 50 gusanos por condición en la gota de levamisol.
- Cubra la gota de levamisol en la almohadilla de agarosa con un cubreobjetos de 18 mm x 18 mm. Gusanos de imagen dentro de 1 h, ya que el agente paralizante eventualmente conducirá a la muerte de los gusanos.
5. Diapositivas por imágenes con un microscopio de epifluorescencia
- Con una almohadilla de agarosa de espesor uniforme, imagine todos los gusanos en la diapositiva a la vez usando una imagen grande de 6 x 6 o 7 x 7, por ejemplo, con el objetivo 20x de un microscopio fluorescente. Si el grosor de la almohadilla no es uniforme, adquiera varias imágenes más pequeñas de 3 x 3 o 4 x 4 de la misma diapositiva.
- Utilice los mismos ajustes para la intensidad de fluorescencia y el tiempo de exposición para todas las condiciones. Ajuste cada ajuste para que coincida con la diapositiva que tiene la intensidad más brillante, lo que garantiza que no haya saturación de píxeles. Para obtener instrucciones específicas sobre la adquisición de imágenes, siga las instrucciones del fabricante del microscopio.
6. Creación de imágenes de montaje de gusanos individuales alineados utilizando la tubería Fiji de alineación de gusanos
- Instale el paquete de software de análisis de imágenes de código abierto FIJI13/ImageJ14 de https://imagej.net/Fiji. Si hay disponible una instalación previa de FIJI, asegúrese de que se actualiza a la versión 1.52a o posterior, ya que algunas de las funciones utilizadas en la macro (por ejemplo, funciones de tabla) lo requieren. Descargue la macro Worm-align de Github: https://github.com/hannekeo/Worm-align.
- Abra FIJI y ejecute la macro Worm-align. Ejecute Worm-align haciendo clic en Plugins | Macros | Ejecute en la barra de menú principal de FIJI (Figura S1). Ahora busque el script Worm-align.ijm en el equipo.
- La macro se inicializa preguntando por la ubicación de las imágenes. La canalización funcionará en imágenes de fluorescencia de canal único y multicanal (Figura S2). Seleccione una carpeta de entrada y la macro generará automáticamente una carpeta de salida donde se guardarán todos los resultados (Figura S3).
NOTA: Es importante que la carpeta seleccionada contenga solo archivos de imagen, ya que la presencia de otros formatos de archivo hará que la macro se bloquee. Idealmente, solo se agrupan las imágenes que se capturaron con la misma configuración del microscopio. Worm-align aceptará muchos formatos de archivo diferentes, incluyendo nd2, czi, tif, rgb, jpg y png. El nombre de la carpeta de salida será el mismo que el de la carpeta de entrada, con '_output' añadido como postfijo, es decir, si la carpeta de entrada es 'imágenes', la salida se encuentra en 'images_output'. La carpeta de salida contendrá cuatro subcarpetas, en las que se guardarán los datos. - Permita que la macro proceda a abrir la primera imagen en la carpeta de entrada y utilízala como una imagen representativa para extraer una configuración para generar el montaje.
NOTA: Worm-align seleccionará automáticamente la primera imagen en la carpeta de entrada para generar los ajustes que se aplicarán a todas las demás imágenes de la carpeta. Si se considera que otra imagen es más representativa del conjunto de datos, asegúrese de que esta imagen se selecciona guardando una copia de la imagen en la carpeta de entrada, cambiando el nombre para que ahora aparezca en la parte superior de la lista (por ejemplo, '0_RepresentativeImage'). - Con la herramienta de dibujo de línea recta, dibuje una línea a través de la anchura de un gusano (Figura S4) y utilice la longitud de esta línea para determinar la altura de las regiones recortadas para gusanos individuales. Para cada canal, especifique el nombre, la tabla de búsqueda (LUT), la configuración de intensidad (B&C) y si debe incluirse en el montaje (Figura S4).
NOTA: Estos parámetros se registran y guardan en un archivo de configuración, Configuración.csv, ubicado en la subcarpeta CellProfiler de la carpeta de salida. - Una vez capturadas todas las configuraciones, se muestra al usuario cómo se verán las imágenes después de la aplicación de la configuración aplicada (Figura S5). Marque la casilla superior si la configuración es suficiente. Seleccione las opciones para la generación de montaje (eliminar ticks, si no es necesario): 1. Generar un montaje de gusanos seleccionados para cada imagen individual, o 2. Generar un montaje combinado en el que todos los gusanos seleccionados en todas las imágenes de la carpeta de entrada se combinarán en un solo montaje. Haga clic en Aceptar para ejecutar el resto de la macro.
NOTA: Si el cuadro superior no está marcado antes de hacer clic en 'Aceptar', la macro volverá a ejecutar la configuración, para que los ajustes de imagen se puedan optimizar. - La canalización Worm-align ahora procede a abrir todas las imágenes en la carpeta de entrada. Para cada imagen, dibuje líneas en el eje longitudinal de todos los gusanos que se incluirán en el montaje y/o cuantifique (Figura 4 y Figura S6) utilizando la herramienta 'línea segmentada' (en la barra de menú principal de FIJI). Para asegurar una alineación adecuada del gusano, dibuje líneas consistentemente desde la cabeza hasta el final (o viceversa), y a lo largo de toda la longitud del gusano (vea ejemplos de dibujo de línea "bueno" y "malo" en la Figura 4B).
- Agregue cada línea al gestor de ROI, haciendo clic en Ctrl+T. Worm-align utiliza las líneas agregadas al administrador de ROI, en combinación con el parámetro worm width (establecido en el paso 6.4) para generar imágenes recortadas de gusanos seleccionados individuales. La colección de ROI de línea se guarda en la subcarpeta 'data'. Esta carpeta también contiene una copia de la imagen original que muestra las líneas, así como el número del gusano. Las líneas están codificadas por colores con la tabla de búsqueda Glasbey_on_dark. Las imágenes de gusanos enderezados se guardan en la single_worms subcarpeta de la carpeta de salida. Además, si se selecciona en el paso 6.6 de este protocolo, Worm-align produce montajes de todos los gusanos seleccionados por imagen de visión general y/o para todas las imágenes de información general en la carpeta de entrada (consulte la figura 4C y la figura S7). Estos montajes se pueden encontrar en la subcarpeta 'alineada' de la carpeta de salida.
7. Análisis de la intensidad de fluorescencia de un solo gusano utilizando la salida de Worm-align en una tubería automatizada CellProfiler
- Para el procesamiento y análisis de datos posteriores de la salida Worm-align, descargue e instale el paquete de software de análisis de imágenes de código abierto 'CellProfiler15,16 de https://cellprofiler.org/. Descargue la canalización Worm_CP.cpproj de GitHub: https://github.com/hannekeo/Worm-align
NOTA: La canalización de ejemplo que se describe aquí se construyó con CellProfiler2.2.0 y es posible que no se ejecute en versiones posteriores de CellProfiler. - Antes de iniciar la canalización Worms_CP.cpproj, asegúrese de que todas las imágenes de salida esperadas estén presentes en la subcarpeta CellProfiler de la carpeta de salida Worm-align: una copia procesada de la imagen original (denominada: Original_), una máscara de imagen binaria de la población de gusanos (denominada: Mask_), una máscara de línea de las líneas dibujadas en gusanos seleccionados (denominadas: Lines_) y una imagen que representa cada uno de los canales presentes en la imagen original (denominada por número de canal).
- Para cuantificar la intensidad de la fluorescencia en gusanos individuales, haga clic en el módulo de entrada Imágenes y simplemente arrastre la carpeta de salida CellProfiler a la ventana que dice Soltar archivos y carpetas aquí. Si hay una lista de imágenes del análisis anterior, primero elimínelas haciendo clic con el botón derecho en la ventana y seleccionando Borrar lista de archivos. Para excluir el archivo 'Settings.csv' de la lista de imágenes, seleccione 'Images only' o 'Custom' con 'Extension is tif, tiff, ome.tif, or ome.tiff' para la configuración del filtro (Figura S8).
- Haga clic en el módulo de entrada Metadatos. En el segundo método de extracción, haga clic en la carpeta amarilla y busque la subcarpeta CellProfiler en la carpeta de salida WormAlign (Figura S9). Seleccione el archivo Settings.csv y vincule la configuración del archivo a la salida CellProfiler haciendo coincidir los metadatos de los archivos CSV con los de las imágenes (metadatos de canal).
- Haga clic en el módulo de entrada NamesAndTypes e inserte una nueva imagen para cada canal de la imagen original que se va a cuantificar.
NOTA: Ya están presentes en la canalización de ejemplo la máscara de gusano, dos imágenes de color, la máscara de línea y la imagen original, y tres imágenes de escala de grises (el canal verde y el rojo). La lista de este módulo debe ajustarse si las imágenes originales tienen más o menos canales que las imágenes de ejemplo. - Compruebe que el nombre de las imágenes de cada etiqueta/máscara/gusanos de columna sea correcto.
NOTA: Los nombres de las imágenes de una línea deben corresponder a la misma imagen inicial para analizar. Si se comete un error durante el proceso de análisis de imágenes, algunas de las imágenes de salida faltarán y los nombres debajo de las tres columnas etiqueta/máscara/gusanos ya no corresponderán a la misma imagen inicial para cada línea. Si este es el caso, encuentre dónde está el error. - Pulse Ver configuración de salida para seleccionar la carpeta para guardar la salida de Cellprofiler.
- Haga clic en Iniciar modo de prueba. Una vez en modo de prueba, compruebe dos veces la configuración de la canalización aplicándola a la primera imagen del conjunto de datos, haciendo clic en Ejecutar (que se ejecutará a través de todos los módulos activos de la canalización) o Paso (que se ejecutará a través de la canalización un módulo a la vez).
NOTA: Mientras esté en el modo de prueba, las mediciones extraídas no se exportarán, incluso si un módulo ExportToSpreadsheet está presente (y activo) en la canalización. - Una vez que la canalización funcione de la manera que debería, haga clic en Salir del modo de prueba y, a continuación, presione Analizar imágenes. Como se ha configurado actualmente, el Worms_CP (1) utilizará la imagen Mask_ para segmentar una máscara de gusano áspera y la imagen Lines_ (Figura S10A) para seleccionar los gusanos seleccionados y producir máscaras de gusano única (Figura S10C), (2) medir la intensidad de fluorescencia de todos los canales presentes en las imágenes de entrada en esos gusanos identificados y enmascarados. La canalización también puede medir la intensidad de fondo (Figura S10B) y corregir todas las imágenes en consecuencia (indicada por la palabra umbral en el nombre del parámetro medido, por ejemplo: Intensity_MeanIntensity_green_threshold), (3) medir el tamaño de los gusanos seleccionados y (4) exportar todos los parámetros medidos (Figura S10D).
- Abra la salida de Worm_CP que consta de dos archivos csv, gusanos.csv y líneas.csv que se guardan en la carpeta de salida seleccionada (consulte la figura S11). Estos archivos se pueden abrir en Excel o R (Studio) para el procesamiento posterior y la generación de informes. Si se requiere una salida adicional, por ejemplo, por datos de imagen, se puede seleccionar en el módulo ExportToSpreadsheet de la canalización.
Representative Results
Cultivar e tomar imágenes de C. elegans según el método descrito en este protocolo produce grandes imágenes de visión general de las poblaciones de gusanos. Para facilitar la inspección visual y la clasificación de gusanos a partir de estas imágenes hemos desarrollado Worm-align. Worm-align es un script FIJI simple y fácil de usar que se puede utilizar para crear montajes de gusanos enderezados y alineados. Los gusanos se seleccionan de las imágenes de visión general dibujando una línea a lo largo del eje longitudinal de los gusanos. A cada gusano seleccionado se le asigna un número, se recorta y se endereza, y se añade a un montaje. Los montajes se pueden generar por imagen o combinar todas las imágenes de la carpeta de entrada original.
Como era de esperar, la salida de la canalización depende en gran medida de la calidad de las líneas dibujadas en la parte superior de las imágenes. Para ilustrar este punto, la Figura 4 muestra varios ejemplos de línea y su salida de Worm-align. Una línea completa desde la cabeza hasta la punta de la cola produce un gusano correctamente alineado (etiquetado como "bueno"). La figura 4 también muestra cómo las imprecisiones de seguimiento durante la ejecución de Worm-align afectan a la salida de la alineación. A partir del montaje anotado incluido en la Figura 4C, se debe tener cuidado de evitar los siguientes errores, ya que dificultan la alineación adecuada de los gusanos:
- Rastreo incoherente del gusano de la cabeza a la cola (etiquetado "cola a cabeza"). Esto da como resultado que los gusanos se orienten en diferentes direcciones (es decir, de cola a cabeza frente a cabeza frente a cola) en la alineación.
- Seguimiento incompleto (etiquetado como "incompleto"). Esto da como resultado que solo la parte del gusano que se rastreó se recorte para el montaje.
- Incluyendo múltiples gusanos en un solo rastro (etiquetado "gusano con dos cabezas"). Esto da como resultado que los gusanos más (secciones significativas de) sus vecinos se inserten en el mismo panel del montaje.
- Adición de líneas aleatorias a la imagen (etiquetada como "aleatoria"). Esto da como resultado la inserción de paneles aleatorios en el montaje.
Para la creación del montaje no es un problema si dos líneas individuales se intersecan (etiquetadas "intersectando") o se unen en cualquiera de los extremos del gusano (etiquetado "unido"), siempre y cuando cada línea trace toda la longitud de un gusano individual: el script Worm-align selecciona individualmente y secuencialmente cada línea DEI, lo cultiva y endereza, de modo que cada panel del montaje final representará un solo rastro de línea. En el caso de los gusanos que se cruzan, sin embargo, aunque aparecen gusanos enderezar la longitud completa para el gusano "intersecting1" y el gusano "intersectando2" en el montaje (véase la figura 5A-B), es claramente notable que estos gusanos se cruzan entre sí en la imagen de visión general original. Por lo tanto, se puede concluir que la identificación visual de las líneas intersectantes es posible a partir de la imagen de superposición que se encuentra en la subcarpeta 'data' (Figura 5A), así como de los paneles de gusanos individuales en el montaje (Figura 5B). Además, cualquier superposición de gusanos/líneas se puede identificar desde la tabla de control de calidad (QC) generada para cada imagen procesada por Worm-align y guardada en la subcarpeta de datos. Esta tabla registra tres parámetros para cada uno de los ROI de línea dibujados en la imagen (véase la figura 5C): De estos, Longitud indica la longitud del ROI de la línea, que es un buen indicador del tamaño del gusano; y el número de gusano indica el orden en el que se dibujaron las líneas en la imagen de resumen. Por último, la última columna indica si hay superposición entre el gusano/línea en cuestión y cualquiera de los otros gusanos/líneas seleccionados en la imagen. En caso de superposición, el número de esta columna será diferente del que aparece en la columna Número de gusano. En combinación con la imagen superpuesta, la tabla de control de calidad debe ayudar al investigador a tomar decisiones aprendidas sobre qué gusanos deben excluirse del montaje y / o cuantificación.
La salida de Worm-align se puede utilizar para la cuantificación posterior de la intensidad de fluorescencia en gusanos individuales. En FIJI, los ROI de línea se pueden utilizar para medir la intensidad de la fluorescencia en los datos de imagen originales, por ejemplo ejecutando el script simple FIJI ' Worm-quant.ijm', que también se puede encontrar en el repositorio Worm-align en Github. Alternativamente, la salida Worm-align se puede importar en software de análisis de imágenes de terceros. Esto se muestra importando la salida Worm-align de dos conjuntos de datos en Worm_CP, una canalización que generamos en CellProfiler. Worm_CP utiliza los archivos de la subcarpeta 'CellProfiler' de la carpeta de salida Worm-align para ajustar las máscaras de segmentación de los gusanos individuales seleccionados durante la ejecución de la macro Worm-align. Específicamente, utiliza la máscara de línea (llamada: Lines_) para aislar los gusanos seleccionados de la población de gusanos que se ve en la máscara binaria (llamada: Mask_). Cabe señalar que las líneas que se intersecan en la imagen de vista general (Figura 5A), aunque no es un problema para la generación de montajes, son problemáticas para la canalización de Worm_CP. Por qué este es el caso, se ilustra en la Figura 5 D-E. Worm_CP utiliza la máscara de línea (Figura 5D) y no LOS ROI individuales para ayudar a la identificación de gusanos individuales. La línea de intersección dibujada en segundo lugar durante la ejecución de Worm-align se superpone en la primera línea y, por lo tanto, la intensidad a lo largo de esta línea será la de ROI2, incluso en el bit donde las líneas 1 y 2 se superponen. Como resultado, CellProfiler segmentará line2 como un objeto, pero line1 como dos objetos que están separados donde se interseca con line2. Esto significa que CellProfiler producirá dos (la mitad) máscaras de gusano para el gusano 'intersecting1' (Figura 5E). La forma más fácil de excluir estos eventos del análisis final (si es necesario), es identificar el número de gusanos que se intersecan de la tabla de control de calidad (subcarpeta de datos) y eliminar las mediciones de estos gusanos de los archivos de salida CellProfiler. Tenga en cuenta que a los gusanos no se les asignará necesariamente el mismo número en FIJI y CellProfiler: para identificar el número de gusano FIJI en la salida CellProfiler, examine los valores Intensity_Max_Intensity en el archivo de salida 'Lines.csv'. Cualquier valor Intensity_Max_Intensity que aparezca en la tabla 'Lines.csv' más de una vez por imagen es una indicación de ese ROI de línea que resulta en una máscara de gusano fracturada.
Una vez que las máscaras de gusano individuales están segmentadas, Worm_CP puede medir la intensidad de fluorescencia en los gusanos seleccionados para todos los canales grabados. Todas las mediciones se toman de los datos de imagen originales (crudos), aunque debe tenerse en cuenta que CellProfiler cambia automáticamente la escala de la intensidad del píxel en una escala de 0-1. Esto se logra dividiendo el valor de intensidad de píxel sin procesar por la intensidad de píxel máxima posible para la imagen. En el caso de imágenes de 8 bits este valor es 255, y en el caso de imágenes de 16 bits es 65535. Por lo tanto, los valores de intensidad CellProfiler deben multiplicarse por el valor de intensidad máxima posible para recuperar valores equivalentes a los datos de imagen sin procesar. La salida de Worm_CP consta de dos archivos csv, 'worms.csv' y 'Lines.csv' que se guardan en la carpeta de salida seleccionada. Al inspeccionar estos archivos, está claro que CellProfiler registra un gran número de parámetros relacionados con la intensidad de la fluorescencia. De estos, el Intensity_IntegratedIntensity corresponde a la fluorescencia total por gusano (es decir, la suma de la intensidad de fluorescencia dentro de todos los píxeles que interpretan la máscara de un gusano individual). El parámetro Intensity_MeanIntensity se refiere a la intensidad media de fluorescencia dentro de un gusano individual (es decir, la intensidad media de fluorescencia por píxel para todos los píxeles contenidos en un gusano individual). Debido a la aparición ocasional de errores (pequeños) en la segmentación de las máscaras de gusano, se recomienda que se utilicen mediciones de MeanIntensity al comparar las mediciones de fluorescencia de gusanos individuales entre dos condiciones. Si desea restar la fluorescencia de fondo de mediciones cuantificadas, utilice las medidas denominadas MeanIntensity_Threshold.
Hemos utilizado la tubería de Worm_CP para cuantificar la intensidad de fluorescencia de animales fijos que han sido etiquetados con un tinte fluorescente que se incorpora en gotas de lípidos (LDs) (Figura 6). Para validar la cuantificación de fluorescencia desde la tubería Worm-align/Worm_CP, cuantificamos la intensidad de fluorescencia en el mismo conjunto de gusanos del conjunto de datos BODIPY mediante la tubería Worm-align/Worm_CP o la cuantificación manual en FIJI/ImageJ. La cuantificación manual se realizó en FIJI/ImageJ dando vueltas a cada gusano, así como una zona de fondo oscuro en cada imagen. La intensidad de fluorescencia se midió en el gestor de ROI y el valor medido para el fondo de la imagen se restó de la medición de fluorescencia del gusano de cada gusano, como se describe17. Comparamos los gusanos N2 de tipo salvaje (WT) con los mutantes dbl-1(nk3), que muestran un contenido de gotas lipídicas disminuida18. Como era de esperar, la intensidad de fluorescencia verde se reduce significativamente entre los gusanos WT y dbl-1(nk3) con ambos métodos (Figura 6A,B). En la Figura 6C,Dse pueden observar ejemplos de gusanos alineados. El contenido de gotas de lípidos se reduce en un 17% (valor p<0.0001, prueba t no asalada) entre WT y dbl-1(nk3) mediante cuantificación manual, y en un 14% (p-value-0.0051 unpaired t-test) utilizando la Worm_CP canalización. La disminución del contenido de gotas lipídicas observada aquí en dbl-1(nk3) con ambos métodos de cuantificación está de acuerdo con la literatura18. Esto muestra que la cuantificación de las imágenes de fluorescencia adquiridas con la Worm_CP canalización CellProfiler es comparable a la cuantificación manual.
También hemos utilizado Worm_CP para cuantificar la respuesta de choque térmico en gusanos vivos que expresan la GFP bajo el control del gen inducible de choque térmico hsp-70(C12C8.1)9. La Figura 7 muestra imágenes representativas de C. elegans en vivo que llevan el hsp-70(C12C8.1)p:Reportero de GFP con capacidad de calor. En ausencia de estrés térmico, los gusanos no inducen la expresión GFP (Figura 7A, B). Sin embargo, cuando los gusanos se exponen a un choque térmico corto de 30 min a 34 oC, inducen la expresión de GFP (Figura 7C,D). Los niveles de expresión de GFP con y sin choque térmico se cuantifican en la Figura 7E.
Tal como está, Worm_CP es un gasoducto muy básico. Sin embargo, este enfoque permite una segmentación más precisa de las máscaras de gusano individuales, lo que permite una cuantificación más precisa de la intensidad de fluorescencia en los gusanos seleccionados de la imagen. Por esta razón, preferimos este enfoque sobre una cuantificación aproximada en FIJI, utilizando sólo las máscaras de línea. Además, CellProfiler ofrece la ventaja de que los módulos de análisis adicionales se pueden incluir fácilmente en la canalización. Por ejemplo, para el conjunto de datos que examina el contenido de gotas de lípidos, la inserción de módulos adicionales en la canalización de Worm_CP podría investigar los números de gotas lipídicas y la intensidad de fluorescencia de gotas individuales en los gusanos seleccionados en las imágenes de vista general.
Figura 1: Generación de una micropipeta bucal. Un capilar de vidrio se extiende en la llama de un quemador Bunsen (A), hasta que proporciona extremidades delgadas y alargadas (B). El capilar de vidrio extendido se conecta a la pieza del adaptador de la micropipeta de la boca. (C) Esquema de una micropipeta de boca. La micropipeta de la boca se ensambló con un capilar de vidrio conectado a un adaptador. Un tubo de silicona de 6 mm conecta el adaptador a un filtro de jeringa de 0,2 m, utilizado por seguridad. El otro extremo del filtro está unido a un tubo de silicona de 3 mm que termina con una punta de filtro de 1 ml. El experimentador puede aspirar a través de la punta del filtro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Aspiración del líquido que rodea el pellet de gusano, utilizando la micropipeta de la boca. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Adición del cubreobjetos a los gusanos que se encuentran en la almohadilla de agarosa Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Ejemplos de enderezamiento de gusanos utilizando la alineación de gusanos en imágenes de fluorescencia adquiridas de animales vivos que llevan la transcripción de la grasa del reportero de transcripción-7p::GFP en el intestino y un marcador de coinynción roja en la faringe (myo-2p::tdtomato). (A) Captura de pantalla de una imagen compuesta adquirida en el microscopio fluorescente de gusanos vivos en el día 3 de la edad adulta. La imagen se abrió con Worm_align y se trazaron líneas a lo largo del eje longitudinal de los gusanos usando Worm-align. (B) Captura de pantalla de la misma imagen que en (A), con ejemplos comentados de dibujo bueno y malo de las líneas a lo largo del eje de los gusanos, utilizando Worm-align. (C) Ejemplos de líneas dibujadas encima de gusanos que pueden elevarse a gusanos alineados incorrectamente. Salida de alineación de gusanos de los gusanos seleccionados en B. Las imágenes se tomaron con un objetivo de 20x en un microscopio de campo ancho invertido (ver tabla de materiales) con intensidad de fluorescencia verde 1, exposición-60 ms e intensidad de fluorescencia roja a 8, exposición 60 ms. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Ejemplos de enderezamiento de gusanos mediante Worm-align en gusanos intersectantes. (A) Captura de pantalla de una imagen compuesta adquirida en el microscopio fluorescente de gusanos vivos en el día 3 de los animales adultos que llevan la transcripción reportero de la palabra grasa-7p::GFP en el intestino y un marcador de coinynección roja en la faringe (myo-2p::tdtomato). Los gusanos que se intersecan se etiquetan como "intersectantes1" e "intersectantes2", mientras que los gusanos no superpuestos se etiquetan como "buenos3" y "buenos4". (B) Montaje creado por Worm-align que representa gusanos enderezados seleccionados en (A). Se nota en el montaje que los gusanos 1 y 2 se cruzaban en la imagen original (gusanos etiquetados como "intersectantes1" e "intersectantes2"). (C) Captura de pantalla de la tabla QC de Worm-align que permite detectar casos donde los gusanos se intersecan. Longitud: longitud de la línea ROI; número de gusano: orden en el que se trazaron las líneas; la última columna indica si hay una superposición entre el gusano/línea de interés y cualquier otro gusano. En este ejemplo, el gusano del primer raw (número de gusano1) se superpone con el número de gusano 2, como se indica en el número "2" de la última columna. (D) Captura de pantalla de las líneas dibujadas con Worm-align en los cuatro gusanos seleccionados en A. (E) Captura de pantalla de las máscaras generadas por Worm-align en los cuatro gusanos seleccionados en A, mostrando cómo se representan las máscaras para los dos gusanos intersectantes. En este caso, dos máscaras en lugar de una ahora corresponden al gusano "intersecting1". Las imágenes fueron tomadas con un objetivo de 20x en un microscopio de campo ancho invertido (ver Tabla de Materiales) con intensidad de fluorescencia verde-1, exposición-60ms e intensidad de fluorescencia roja 8, exposición a 60 ms. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: La tubería de Worm_CP cuantifica la fluorescencia con la precisión que lo haría la cuantificación manual. Comparación de la cuantificación de la fluorescencia de gusanos adultos jóvenes fijados y manchados para el contenido de gotas de lípidos con el tinte fluorescente verde BODIPY, utilizando Worm_CP tubería (A) o cuantificación manual (B). El contenido de gotas lipídicas de WT y dbl-1 (nk3) se monitorizó mediante la fijación y tinción de animales con BODIPY, que se intercala en ácidos grasos de gotas lipídicas (véase el protocolo A). Los animales adultos jóvenes se fijaron con 60% de isopropanol y se tiñeron con BODIPY durante 1h. El mismo conjunto de animales se cuantificó utilizando el Worm_CP tubería (véase el paso 7) o mediante cuantificación manual según los procedimientos estándar17. (A) Cuantificación de la fluorescencia mediante Worm_CP tubería. WT: n-22 animales, fluorescencia media 1.016 (A.U) ± 0.206 SD; dbl-1(nk3):n-25 animales, fluorescencia media 0,8714 (A.U) ± 0,126 SD. Prueba t no asalada. (B) Cuantificación manual de la fluorescencia. WT: n.o 22 animales, fluorescencia media 1,048 ± 0,153 SD; dbl-1(nk3): n-25 animales, fluorescencia media a 0,8632 ± 0,109 SD. Prueba t no asalada. (C, D) Ejemplo representativo o salida Worm-Align para animales WT (C) y dbl-1(nk3) (D) enderezados con la tubería Worm-align. Las imágenes fueron tomadas con un objetivo de 20x en un microscopio de campo ancho invertido (ver tabla Des) con intensidad de fluorescencia verde 2, exposición 60ms. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Ejemplo de cuantificación de fluorescencia y alineación de gusanos vivos a partir de imágenes de fluorescencia de gusanos vivos que llevan al reportero transcripcional hsp-70(C12C8.1)p::GFP después de choque térmico. (A) Tras un breve choque térmico (30 min a 34oC), los gusanos adultos jóvenes fueron recuperados a su temperatura de cultivo (25oC) y montados a continuación, se asociaron 3,5h después del choque térmico. Alrededor de 30 gusanos fueron cuantificados después de un choque térmico utilizando la tubería Worm-align. (A-B) Ejemplos de gusanos alineados que no han estado expuestos a golpes de calor. (C-D) Ejemplos de gusanos con choque térmico que transportan hsp-70(C12C8.1)p::GFP usando Worm-align. (E) muestra la intensidad media de la GFP (parámetro Worm_CP: MeanIntensity_Threshold) de los gusanos adultos jóvenes WT cultivados, sin choque de calor o tras la exposición a golpes de calor (34 oC durante 30 min). Las imágenes fueron tomadas con un objetivo de 20x en un microscopio de campo ancho invertido (ver Tabla de Materiales) con intensidad de fluorescencia verde-1, exposición-60ms; sin HS: n.o 12, HS: n.o 32. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura suplementaria 1: Ubicación en FIJI donde se puede encontrar la macro Worm-align, una vez instalada. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 2: Selección de la carpeta que contiene todas las imágenes tomadas con la misma configuración. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 3: Generación de 4 subcarpetas en la carpeta de salida en FIJI. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria 4: Dibujo de una línea a través de la anchura de la configuración del gusano y del canal para el montaje. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 5: Vista previa de la imagen con la configuración aplicada. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 6: Dibujo de una línea a lo largo del eje longitudinal de los gusanos de interés para su inclusión en el montaje y/o cuantificación. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 7: Montaje de los gusanos seleccionados en la carpeta de salida, en la carpeta "alineada". Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria 8: Borrar imágenes anteriores del análisis anterior en Cell Profiler. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 9: Importación de metadatos en CellProfiler desde la carpeta de salida Worm-align seleccionando la subcarpeta Settings.csv. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 10: la canalización CellProfiler Worm_CP.cpproj usa las imágenes Lines_ para un solo los gusanos seleccionados (A) y produce máscaras de gusano únicas de los gusanos de interés (C). La tubería también mide la intensidad de fondo (B). Outlook de todos los parámetros medidos por la canalización Worm_CP.ccproj que se exportan en un archivo csv (D). Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 11: Selección de archivos de salida en la hoja "ExportToSpreadsheet en la canalización Worm_CP.cpproj. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Discussion
Worm-align es una canalización de procesamiento de imágenes basada en FIJI que genera fácilmente montajes de gusanos seleccionados por el usuario, en los que los gusanos se enderezan y alinean para ayudar a la comparación visual, clasificación y representación. Aunque esta característica también es ofrecida por algunas herramientas existentes, en particular el módulo WormToolbox en CellProfiler7, Worm-align requiere comparativamente poca experiencia previa en el análisis de imágenes: los usuarios solo necesitan rastrear los gusanos que les gustaría seleccionar para el montaje (y el análisis). Aunque el seguimiento de los gusanos en los datos de imagen sin procesar es un proceso fácil -especialmente cuando un ordenador o tableta de pantalla táctil está disponible-, es primordial, que las líneas se dibujan correctamente a lo largo del eje longitudinal de los gusanos. Las líneas incompletas, que siguen sólo una parte del gusano, darán lugar a gusanos parciales en el montaje (es decir, gusanos que faltan cabezas de extremos de cola) y máscaras de segmentación parcial durante el análisis CellProfiler. Además, si las líneas de dos gusanos individuales se cruzan, los gusanos no se procesarán correctamente en el montaje de alineación del gusano, así como para la cuantificación de la fluorescencia. Para el control de calidad, se guarda una imagen superpuesta de las selecciones de línea de la imagen original en la carpeta de datos, junto con una tabla de control de calidad. A partir de estos, las líneas problemáticas que conducirán a gusanos segmentados incorrectamente pueden ser fácilmente identificadas y excluidas del montaje y / o análisis posterior.
Aunque la entrada directa del experimentador en la selección de gusanos quizás parece un poco lenta, presenta una clara ventaja del flujo de trabajo sobre otros en experimentos donde gusanos de diferentes etapas de desarrollo están presentes en la misma imagen: los gusanos se pueden seleccionar durante el "paso de seguimiento", esbozando sólo los gusanos que están en la etapa de desarrollo correcta. Alternativamente, los gusanos se pueden filtrar utilizando la salida de Worm_CP en función de la longitud de la línea de seguimiento o del área de la máscara de segmentación, ambos indicadores confiables de la longitud/tamaño de los gusanos. Podría decirse que los algoritmos de aprendizaje automático pueden tener problemas para reconocer gusanos de diferentes etapas del desarrollo, ya que su tamaño y apariencia en las imágenes DIC son tan diferentes.
La salida de Worm-align se puede utilizar para la cuantificación posterior de la intensidad de fluorescencia en gusanos individuales, ya sea en FIJI directamente o en otras plataformas de software de análisis de imágenes. Demostramos esto importando la salida Worm-align en una canalización CellProfiler simple (Worm_CP), que permite la cuantificación de la intensidad de fluorescencia multicanal en los gusanos individuales que se seleccionaron mientras se ejecutaba la canalización Worm-align. Elegimos este enfoque debido a la flexibilidad del software CellProfiler: Es sencillo incorporar módulos adicionales en la canalización para analizar características adicionales en gusanos individuales (por ejemplo, medir el tamaño de las gotas de lípidos, o gránulos de tensión, núcleos, mitocondrias). Además, las máscaras de gusano único podrían utilizarse potencialmente para entrenar un nuevo modelo para WormToolbox7.
Las principales ventajas de este método son que es rápido y requiere una configuración de montaje de gusano simple. Este método es más rápido, ya que no requiere pasar tiempo aprendiendo la operación del software ni ejecutar conjuntos de entrenamiento a través de un algoritmo de máquina7. Además, este método funciona con gusanos vivos o fijos simplemente montados en almohadillas de agarosa regulares. No es necesario utilizar cámaras microfluídicas complejas, como se ha desarrollado en otros métodos5,6.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Nos gustaría dar las gracias al Dr. Christian Lanct-t en BIOCEV (Praga, República Checa) por enseñarnos la técnica de micropipeta de boca para montar gusanos fijos y a la Dra. Fatima Santos y a la Dra. Debbie Drage por compartir la configuración de seguridad en la micropipeta de la boca. También agradecemos a Francesca Hodge por editar el manuscrito, Sharlene Murdoch y Babraham Institute Facilities por su apoyo. OC es compatible con ERC 638426 y BBSRC [BBS/E/B000C0426].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | MeLford Biolaboratories Ltd | MB1200 | |
| Aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177 | to create mouth micro-pipette (see protocol step) |
| Beaker | |||
| BODIPY 493/593 | Invitrogen | D3922 | stock solution prepared in DMSO at 1mg/mL |
| Centrifuge | MSE MISTRAL 1000 | ||
| Conical flask | |||
| Cover Slip | VWR | 631-0120 | |
| Filter 0.2 µm for Syringe | Sartrius | 16534-K | Filter, to create mouth micro-pipette (see protocol step) |
| Isopropanol | |||
| Levamisole hydrochloride | Sigma-Aldrich | BP212 | 3mM solution prepared by dissolving levamisole in M9 |
| Liquid Nitrogen | Liquid Nitrogen facility | ||
| Low Retention Tip 1000µL | Starlab | S1182-1830 | |
| Methanol | VWR chemicals | 20847.307 | |
| Microscope Slides, MENZEL GLASSER | Thermo Scientific | BS7011/2 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Microwave Oven | Delongi | ||
| M9 | prepared in the lab according to15 | ||
| 9cm NGM Plates | prepared in the lab according to15 | ||
| PBS | prepared in the lab | ||
| Protein LoBind Tube 2ml | Eppendorf | 22431102 | |
| Triton | SIGMA | T9284-500ML | |
| Ring Caps | SIGMA-ALDRICH | Z611247-250EA | glass micro-capillary tubes to create mouth micro-pipette (see protocol step) |
| Rotator | Stuart Scientific | ||
| Silicone tubine translucent | Scientific Laboratory Suppliers | TSR0600200P | 6.0 mm x 2.0 mm wall - to create mouth micro-pipette (see protocol step) |
| Sterilized H2O | MilliQ water autoclaved in the lab | ||
| 10µL Tips | Starlab | S1120-3810 | |
| 200µL Tips | Starlab | S1120-8810 | |
| 1000µL Tips | Starlab | S1122-1830 | |
| 15mL Centrifuge Tube | CORNING | 430791 | |
| Vecta Shield | VECTOR | 94010 | antifade mounting medium (H-1000) without DAPI |
References
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