Summary
Worm-align/Worm_CP är ett enkelt FIJI/CellProfiler-arbetsflöde som kan användas för att räta ut och rikta In Caenorhabditis elegans-prover och för att göra poäng med bildbaserade analyser med hela mask utan behov av föregående utbildningssteg. Vi har tillämpat Worm-align/Worm_CP till kvantifieringen av värme-chock inducerad uttryck i levande djur eller lipiddroppar i fasta prover.
Abstract
Ett problem som ofta påträffas när man skaffar bilddata från fast eller sövd C. elegans är att maskar korsar och kluster med sina grannar. Detta problem förvärras med ökande täthet av maskar och skapar utmaningar för bildbehandling och kvantifiering. Vi utvecklade ett FIJI-baserat arbetsflöde, Worm-align, som kan användas för att generera enkel- eller flerkanalsmontage av användarvalda, rätade och anpassade maskar från råa bilddata av C. elegans. Worm-align är ett enkelt och användarvänligt arbetsflöde som inte kräver föregående utbildning av vare sig användaren eller analysalgoritmen. Montage som genereras med Worm-align kan hjälpa den visuella inspektionen av maskar, deras klassificering och representation. Dessutom kan produktionen av Worm-align användas för efterföljande kvantifiering av fluorescensintensitet i enstaka maskar, antingen i FIJI direkt, eller i andra bildanalysprogramplattformar. Vi visar detta genom att importera Worm-align-utdata Worm_CP, en pipeline som använder programvaran CellProfiler med öppen källkod. CellProfilers flexibilitet möjliggör införlivandet av ytterligare moduler för screening med hög innehåll. Som ett praktiskt exempel har vi använt rörledningen på två datamängder: den första datauppsättningen är bilder av värmechock reporter maskar som uttrycker grönt fluorescerande protein (GFP) under kontroll av promotorn för en värmechock inducible gen hsp-70, och den andra datauppsättningen är bilder som erhållits från fasta maskar, färgas för fett-butiker med en fluorescerande färgämne.
Introduction
En relativt enkel organism, nematoden C. elegans, är ett extremt användbart modellsystem för att studera mänskliga sjukdomar. Omkring 38% av generna i C. elegans genomet har funktionella motsvarigheter hos människor1,2. En av de unika egenskaperna hos C. elegans är att det är optiskt transparent, vilket möjliggör enkel tillgång till in vivo information om (sub) cellulära uttryck av fluorescerande reportrar över vävnader. Detta gör C. elegans till en utmärkt modellorganism för skärmar med hög innehållshalt med hjälp av bildbaserade plattformar3. Men en fråga som ofta komplicerar dessa studier är att när imaging täta populationer av maskar, de tenderar att korsa och kluster, vilket gör jämförelser mellan enskilda maskar utmanande, grumlar nedströms bildanalys och kvantifiering.
Befintliga lösningar som övervinner denna fråga förlitar sig vanligtvis på optimering av protokollet för odling och bildframställning, till exempel genom användning av mikro-fluidikuppställningar4, vilket gör att enstaka maskar kan fångas iseparata bilder 5,6. Andra har tillämpat maskininlärningsalgoritmer som möjliggör erkännande av enstaka maskar, även i en klumpig population. Ett utmärkt exempel på det senare är WormToolbox, som är en modulär förlängning av den öppna källkoden bild analysplattform, CellProfiler7. WormToolbox erbjuder en lösning med hög genomströmning och hög innehållslig lösning för analys av C. elegans, och drar klart nytta av att den ingår i CellProfiler, eftersom ytterligare analysmoduler enkelt kan inkluderas. Även om WormToolbox levereras med en förtränad modell (DefaultWormModel.xml), krävs omskolning av maskininlärningsalgoritmen vanligtvis för varje nytt program. Online tutorials om hur man gör detta finns på Github (https://cp-website.github.io/Worm-Toolbox/). Trots detta, installera och använda WormToolbox kräver en betydande tid-investering för nybörjare användare.
Här beskriver vi ett enkelt och kostnads- och tids-effektivt protokoll till kultur, och bildpopulationer av C. elegans. För att möjliggöra bedömning av enskilda maskar i de förvärvade bilderna har vi utvecklat en enkel öppen källkod FIJI-baserade arbetsflöde, med namnet Worm-align. Worm-align kan användas för att generera en- eller flerkanalsmontage av uträtade och anpassade maskar. För det första måste användaren manuellt välja enskilda maskar för analys genom att dra en linje från huvudet till svansen. Worm-align kommer att använda detta urval för att beskära valda maskar från översiktsbilden, och generera ett montage där valda maskar rätas och justeras för att underlätta visuell jämförelse och presentation.
Dessutom kan produktionen av Worm-align användas för efterföljande kvantifiering av fluorescensintensitet i enstaka maskar, antingen i FIJI direkt, eller i andra bildanalysprogramplattformar. Vi visar detta genom att importera Worm-align-utdata Worm_CP, en pipeline som använder programvaran CellProfiler med öppen källkod. CellProfilers flexibilitet möjliggör införlivandet av ytterligare moduler för screening med hög innehåll. Vi har använt Worm_CP pipeline för att kvantifiera värmechock svar, en väl bevarad skyddsmekanism som återfölrar proteiner som är felvikt på grund av stressfaktorer såsom hög temperatur8. Specifikt tillämpade vi rörledningen på maskar som bär en integrerad multi-kopia transgen, där främjare av en värmechock inducerbar gen, hsp-70(C12C8.1), driver grön fluorescerande protein (GFP)9. Vi har också använt Worm_CP-ledningen på fasta djur som har märkts med ett fluorescerande färgämne som visualiserar lipiddroppar (LDs), den viktigaste fettlagringsorganellen i C. elegans10. Även om detta arbetsflöde inte har det dataflöde som erbjuds av WormToolBox, är det ett användarvänligt och enkelt alternativ för visuell presentation och analys av bildbaserade C. elegans-experiment.
Protocol
1. Fixering av maskar för fettinnehållsavbildning med hjälp av ett fluorescerande färgämne för lipiddroppar (BODIPY)10
- Förbered en synkroniserad population av C. elegans genom blekning enligt standardrutiner2. Plate om 1 000 L1-stegs maskar på en 9 cm nematodtillväxtmedia (NGM) platta per tillstånd.
OBS: Fler maskar är beredda än faktiskt kvantifieras i slutet, på grund av förlust av maskar vid hantering. - För att avbilda djur på ung vuxenstadium (runt 50 h inlägg L1-plätering vid 20 °C), tvätta varje 9 cm-platta med 15 mL M9 i ett koniskt rör, centrifug vid 252 x g i 1 min och ta bort supernatanten.
- Upprepa tvätten och lämna 1 mL M9 över pelleten på maskar.
- Överför 1 mL M av M9 som innehåller maskarna i ett 2 mL lågproteinbindande mikrocentrifugrör, med hjälp av låg retentionstips.
- Snurra ner i 252 x g i en mikrocentrifug i 1 min och ta bort supernatanten, var noga med att inte röra maskens pellet nedtill på tuben.
- För övervakning av fetthalt med hjälp av 4,4-difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene (BODIPY) färgning10 (Tabell över material), fixa maskar antingen genom att lägga till 0,5 mL på 60% isopropanol till masken pelleten i 3 min11, eller genom att lägga till 2 mL iskall metanol i 10 min. För båda förfarandena, invertera röret var 30:e s.
VAR FÖRSIKTIG: Om metanol är det valda fixeringsreagenset måste detta steg företagas i en rökhuv på grund av dess toxicitet. - Ta bort så mycket fixativ som möjligt utan att vidröra maskpelleten och tillsätt 1 mL M9. Låt maskarna lägga sig i botten av röret i 3−5 min.
- Tvätta igen med 1 mL M9, låt maskarna lägga sig och ta bort supernatanten och lämna ca 50 μL i röret. Säkra röret med hjälp av en klämma.
- Frys-knäcka maskarna genom att störta det säkert stängda röret i flytande kväve och sedan i ett varmt vattenbad vid ~40 °C.
- Upprepa steg 1.9 en gång till.
- Tillsätt 0,5 mL BODIPY utspädd i M9 vid en slutkoncentration på 1 μg/μL och placera på en rotator vid rumstemperatur i 1 h.
- Efter 1 h, låt maskarna lägga sig i botten av röret i 3−5 min.
- Ta bort supernatant och tillsätt 1 mL M9.
- Låt maskarna lägga sig i botten och ta bort supernatant.
OBS: Alternativt är det möjligt att snurra ner vid 252 x g i 1 min, eftersom detta inte verkar påverka morfologin. - Lägg till 0,5 mL M9.
OBS: Om fixativet är 60% isopropanol, maskarna kan endast utnyttjas inom 48 h. Om fixativet är metanol, maskarna bör utnyttjas inom 24h.
2. Förbereda agarose kuddar för att montera maskarna
OBS: Det kritiska steget när du förbereder en agarospad är att få en dyna med regelbunden tjocklek. Annars kommer maskar över dynan att vara i olika fokalplan, vilket gör det svårt att få en fokuserad bild av ett bredare synfält.
- Förbered 2% agarosrondynorna genom att tillsätta 0,2 g agaros till 10 mL steriliserad H2O i en bägare eller en konisk kolv. Värm i mikron i 30 s tills agaros börjar koka.
OBS: Överhettas inte och stanna så snart bubblor visas; annars ökar viskositeten i agaros gör det svårare att uppnå önskad pad tjocklek. - När agarosen smält, dispensera en droppe smält agaros i mitten av ett mikroskop glasglas med hjälp av en 1000 μL pipett spets med sin mycket slutskuren. Omedelbart, men försiktigt, håll en annan glas glida mycket nära agaros droppe och släpp den på agaros för att bilda en pad av regelbunden tjocklek för bästa mikroskopi resultat.
OBS: Släppa den övre bilden från en höjd kommer inte bara att bilda bubblor men kommer att resultera i en ojämn pad. Alternativt är det också möjligt att använda två glas diabilder flankerar bilden med dynan, med ett tunt lager tejp på varje bild. - Efter minst 2−3 min tar du försiktigt bort den övre bilden. Med hjälp av den övre bildens sida trimmar du dynan så att den blir fyrkantig. Montera maskarna inom 5 min, för att förhindra att dynan torkar innan den används.
3. Montering av fasta maskar för avbildning
- Skapa en mun mikropipette genom att förlänga en tunn glas kapillär i lågan av en Bunsen brännare (Bild 1A). Efter förlängning i lågan, bryt kapillären i två bitar (Bild 1B). Välj den mest adekvata, oftast längsta, och testa om slutet av kapillären är öppen genom att försöka aspirera vatten.
OBS: Om vätskan inte kommer in i kapillären är den för tunn eller blockerad. Skär försiktigt kapilläränden med en sax, undvika att skära för mycket som maskar kommer att aspirera om hålet är för stort. - Plugga in glaskamsillären från steg 3.1 i kapillärad adaptern (Bild 1C), kopplad till 6 mm silikonröret och plugga in den andra änden av 6 mm silikonröret i ett 0,2 μm filter, fäst på ett 3 mm silikonrör på dess andra ände (Figur 1C). Sätt i en 1 mL-filterspets (Bild 1C) i den fria änden av 3 mm silikonröret för att aspirera vätska.
OBS: 0,2 μm-filtret tillsätts mellan försöksörens mynning och kapillären, för att garantera maximal säkerhet för försökssprutan. En liknande lösning används för mun mikropipetter som används för att hantera mus embryon12. Byt filter (vanligtvis med några månaders mellanrum) om munnen mikropipette inte aspirerar vätska längre. - Använd munnen mikropipette under en dissekering mikroskop, ta bort så mycket vätska som möjligt runt masken pelleten av fasta maskar (Figur 2).
OBS: Pipetting supernatant ut med hjälp av en manuell mikropipette kan användas som ett alternativ till munpipetterna i steg 3.1 till 3.3 för att ta bort så mycket supernatant som möjligt. Tillsätt 6 μL monteringsmedium. Vi finner dock att denna metod inte fungerar lika effektivt eftersom överdriven vätska i kuddar skapar en gles mask densitet, vilket gör bildbehandling mer tidskrävande. Återuppta steg 3.6. Titta på botten av röret och se till att pipetten inte aspirera maskarna. - Tillsätt snabbt 10 μL monteringsmedium (Table of Materials) till botten av röret.
- Skölj en 10 μL spets i PBS med spår av rengöringsmedel (0,01% Triton), för att förhindra att maskar fastnar på sidorna av plastpipetsspetsen. Skär den allra ände av spetsen med en sax.
- Överför 8 μL monteringsmedium som innehåller maskarna på agarospaden som bereds i steg 2.3. Under mikroskopet, försiktigt skaka bilden, för att undvika överlappning av maskarna.
- Täck ned fall av monteringsmedium på agarospaden med en 18 mm x 18 mm täckslip (Figur 3).
OBS: Mindre täckslips är att föredra då de utövar mindre tryck på maskarna. Håll täckplattan med ett par pincett och applicera ena kanten av täcket mot agarospaden, innan du försiktigt sätter in täcket med pincett.
4. Montering levande maskar för bildframställning
OBS: För att avbilda levande maskar, de måste vara immobiliserade på dynan. Ett sätt att uppnå detta är att förlama dem med den nikotinreceptorasenisten: levamisole (Table of Materials).
- Pipett 3−4 μL på 3 mM levamisole upplöst i M9 på agarospaden som skapats i steg 2.3.
OBS: Det bör finnas tillräckligt med vätskevolym att maskarna inte är ovanpå varandra men inte för mycket vätska att maskarna är för glesa på dynan. Erfarna maskplockare kan använda 3 μL levamisole. Mindre erfarna plockare kan behöva lägga till en större volym levamisole, så att levamisole inte helt avdunstar. - Plocka 30−50 maskar per tillstånd i droppen av levamisole.
- Täck droppe levamisole på agarospaden med en 18 mm x 18 mm täckplatta. Bild maskar inom 1 h, som förlamande agenten kommer så småningom leda till döden av maskarna.
5. Bildbilder med ett epifluorescensmikroskop
- Med en agaros dyna av enhetlig tjocklek, bild alla maskar på bilden på en gång med en 6 x 6 eller 7 x 7 stor bild till exempel med 20x målet för ett fluorescerande mikroskop. Om tjockleken på dynan är inte jämn, förvärva flera mindre 3 x 3 eller 4 x 4 bilder av samma bild.
- Använd samma inställningar för fluorescensintensitet och exponeringstid för alla förhållanden. Justera varje inställning så att den matchar bilden som har den ljusaste intensiteten, vilket garanterar att det inte finns någon pixelmättnad. För specifika instruktioner om bildanskaffning, följ mikroskoptillverkarens anvisningar.
6. Skapa montagebilder av justerade enstaka maskar med hjälp av Worm-align FIJI pipeline
- Installera programpaketet för analys av öppen källkod FIJI13/ImageJ14 från https://imagej.net/Fiji. Om en tidigare installation av FIJI finns tillgänglig, se till att den uppdateras till version 1.52a eller senare, eftersom vissa av de funktioner som används i makrot (t.ex. Tabellfunktioner) kräver detta. Hämta makrot Worm-align från Github: https://github.com/hannekeo/Worm-align.
- Öppna FIJI och kör makrot Worm-align. Utför Worm-align genom att klicka på Plugins | Makron | Kör i huvudmenyraden FIJI (bild S1). Nu leta reda på Worm-align.ijm skriptet på datorn.
- Makrot initieras genom att be om var bilderna befinner sig. Rörledningen kommer att fungera på både enkanaliga och flerkanaliga fluorescensbilder (Bild S2). Välj en indatamapp så genererar makrot automatiskt en utdatamapp där alla resultat kommer att sparas (Bild S3).
OBS: Det är viktigt att den valda mappen innehåller endast bildfiler som förekomsten av andra filformat kommer att orsaka makrot att krascha. Helst bara gruppera ihop bilder som togs med samma mikroskop inställningar. Worm-align kommer att acceptera många olika filformat, inklusive nd2, czi, tif, rgb, jpg och png. Namnet på utdatamappen kommer att vara samma som indatamappen, med '_output' images_output tillagt som ett postfix, dvs. Utdatamappen kommer att innehålla fyra undermappar, där data kommer att sparas. - Tillåt makrot att fortsätta att öppna den första bilden i inmatningsmappen och använda den som en representativ bild för att extrahera en inställning för att generera montaget.
OBS: Worm-align kommer automatiskt att välja den första bilden i inmatningsmappen för att generera de inställningar som kommer att tillämpas på alla andra bilder i mappen. Om en annan bild anses vara mer representativ för datauppsättningen, se till att denna bild väljs genom att spara en kopia av bilden i inmatningsmappen, ändra namnet så att det nu finns listat överst i listan (t.0_RepresentativeImage ex. - Med verktyget För ritning med rak linje ritar du en linje över bredden på en mask (Bild S4) och använder längden på denna linje för att bestämma höjden på de beskurna regionerna för enstaka maskar. För varje kanal anger du namn, uppslagstabell (LUT), intensitetsinställningar (B&C) och om den ska ingå i montaget (Bild S4).
OBS: Dessa parametrar registreras och sparas i en inställningsfil, Inställningar.csv, som finns i Undermappen CellProfiler av utdatamappen. - När alla inställningar har fångats, användaren visas hur bilderna kommer att se ut efter tillämpning av de inställningar som tillämpas (Figur S5). Kryssa i den övre rutan om inställningarna är tillräckliga. Välj alternativ för montagegenerering (ta bort fästingar, om det inte krävs): 1. Generera ett montage av valda maskar för varje enskild bild, eller 2. Generera ett kombinerat montage där alla maskar som valts på alla bilder i inmatningsmappen kommer att kombineras till ett enda montage. Klicka på OK om du vill utföra resten av makrot.
OBS: Om den övre rutan inte är kryssad innan du klickar på 'OK' makrot kommer att köra om setup, så bildinställningar kan optimeras. - Worm-align-pipelinen fortsätter nu att öppna alla bilder i inmatningsmappen. För varje bild ritar du linjer på den längsgående axeln av alla maskar som ska ingå i montaget och/eller kvantifiera (bild 4 och bild S6) med hjälp av verktyget 'segmenterad linje' (på FIJI huvudmenyraden). För att säkerställa korrekt anpassning av mask, dra linjer konsekvent från huvud till svansen (eller vice versa), och längs hela längden av masken (se exempel på bra och dålig linje ritning i figur 4B).
- Lägg till varje rad i ROI-hanteraren, genom att klicka på Ctrl+T. Worm-align använder de linjer som lagts till i ROI-hanteraren, i kombination med parametern maskbredd (anges i steg 6.4) för att generera beskurna bilder av enstaka valda maskar. Insamlingen av rad-ROIs sparas i undermappen 'data'. Den här mappen innehåller också en kopia av originalbilden som visar linjerna, samt maskens nummer. Linjer färgkodas med Glasbey_on_dark uppslagstabellen. Bilderna av rätade maskar sparas i single_worms undermappen i utdatamappen. Om det dessutom väljs i steg 6.6 i detta protokoll, producerar Worm-align montage av alla maskar som valts per översiktsbild och/eller för alla översiktsbilder i indatamappen (se bild 4C och figur S7). Dessa montage finns i den 'justerade' undermappen för utdatamappen.
7. Analysera enmask fluorescens intensitet med hjälp av utdata från Worm-align i en automatiserad CellProfiler pipeline
- För nedströms databearbetning och analys av Worm-align-utdata, ladda ner och installera open-source image analysis software package 'CellProfiler15,16 från https://cellprofiler.org/. Ladda ner Worm_CP.cpproj-pipelinen från GitHub: https://github.com/hannekeo/Worm-align
OBS: Exemplet pipeline som beskrivs här konstruerades med cellprofiler2.2.0 och kanske inte körs i senare versioner av CellProfiler. - Innan du startar Worms_CP.cpproj-pipelinen, se till att alla förväntade utdatabilder finns i undermappen CellProfiler i mappen Worm-align output: en bearbetad kopia av den ursprungliga bilden (med namnet: Original_), en binär bildmask av maskpopulationen (benämnd: Mask_), en linjemask av de linjer som ritats på valda maskar (benämnd: Lines_) och en bild som representerar var och en av kanalerna som finns i originalbilden (namngiven efter kanalnummer).
- För att kvantifiera fluorescens intensiteten i enstaka maskar, klicka på Images indatamodul och helt enkelt dra CellProfiler utdata mappen in i fönstret som säger Släpp filer och mappar här. Om en lista med bilder finns från tidigare analys tar du först bort dessa genom att högerklicka i fönstret och välja Rensa fillista. Om du vill utesluta 'Inställningar.csv'-filen från avbildningslistan väljer du antingen 'Endast bilder' eller 'Anpassad' med 'Extension is tif, tiff, ome.tif eller ome.tiff' för filterinställningarna (Bild S8).
- Klicka på metadataingångsmodulen. I den andra extraktionsmetoden klickar du på den gula mappen, och lokaliserar undermappen CellProfiler i utmatningsmappen WormAlign (Figur S9). Välj filen Inställningar.csv och länka inställningarna i filen till CellProfiler-utdata genom att matcha metadata i CSV-filerna till dem i bilderna (Channel metadata).
- Klicka på NamesAndTypes ingångsmodul och infoga en ny bild för varje kanal av den ursprungliga bilden som ska kvantifieras.
OBS: Redan finns i exemplet rörledningen är masken masken, två färgbilder, linjemasken och den ursprungliga bilden, och tre grå skala bilder (den gröna och den röda kanalen). Listan i den här modulen behöver justeras om originalbilderna har fler eller färre kanaler än exempelbilderna. - Kontrollera att namnet på bilderna i varje kolumnetikett/mask/mask är korrekt.
OBS: Namnen på bilderna på en rad ska alla motsvara samma initialbild att analysera. Om ett misstag görs under bildanalysprocessen kommer några av utdatabilderna att saknas och namnen under de tre kolumnerna etikett/maskar kommer inte att motsvara samma initialbild längre för varje rad. Om så är fallet, hitta var misstaget är. - Tryck på Visa utdatainställning för att välja mappen för att spara utdata från Cellprofiler.
- Klicka på Starta testläge. Väl i Testläge dubbelkollar du inställningarna för rörledningen genom att tillämpa dem på den första bilden i datauppsättningen, genom att klicka på Kör (som kommer att köras genom alla aktiva moduler i pipelinen) eller Steg (som kommer att köras genom pipelinen en modul i taget).
OBS: Medan de extraherade mätningarna är i testläget kommer de inte att exporteras, även om en ExportToSpreadsheet-modul är närvarande (och aktiv) i rörledningen. - När pipelinen har presterat som den ska klickar du på Avsluta testläge och trycker sedan på Analysera bilder. Som för närvarande konfigurerad kommer Worms_CP (1) att använda Mask_-bilden för att segmentera en grov maskmask och Lines_-bilden (Figur S10A) för att peka ut de valda maskarna och producera enmaskmaskar (Figur S10C), (2) mäta fluorescensintensiteten hos alla kanaler som finns i ingångsbilderna i de maskar som identifieras och maskeras. Rörledningen kan också mäta bakgrundsintensitet (figur S10B) och korrigera alla bilder i enlighet med detta (anges med ordet tröskelvärde i namnet på parametern mätt. t.ex.: Intensity_MeanIntensity_green_threshold), (3) mäta storleken på de valda maskarna, och (4) exportera alla uppmätta parametrar (Figur S10D).
- Öppna utdata Worm_CP som består av två csv-filer, maskar.csv och linjer.csv som sparas i den valda utdatamappen (se bild S11). Dessa filer kan öppnas i Excel eller R (Studio) för efterbehandling och rapportering. Om ytterligare utdata krävs, t ex per bilddata, kan detta väljas i exportToSpreadsheet-modulen i pipelinen.
Representative Results
Culturing och bildframställning C. elegans enligt den metod som beskrivs i detta protokoll producerar stora översiktsbilder av maskpopulationer. För att underlätta visuell inspektion och klassificering av maskar från dessa bilder har vi utvecklat Worm-align. Worm-align är ett enkelt och användarvänligt FIJI-skript som kan användas för att skapa montage av rätade och anpassade maskar. Maskar väljs från översiktsbilder genom att rita en linje längs maskarnas längsgående axel. Varje vald mask tilldelas ett nummer, beskärs och rätas och läggs till i ett montage. Montage kan genereras per bild eller kombinera alla bilder från den ursprungliga inmatningsmappen.
Som väntat beror rörledningens utdata till stor del på kvaliteten på de linjer som dras ovanpå bilderna. För att illustrera denna punkt, visar figur 4 flera linjeexempel, och deras utdata från Worm-align. En komplett linje från huvudet till svansspetsen ger en korrekt anpassad mask (märkt "bra"). Bild 4 visar också hur spårning av felaktigheter under körningen av Worm-align påverkar utflödet av justeringen. Från den kommenterade montage som ingår i figur 4C, bör man se till att undvika följande fel, eftersom de hindrar korrekt anpassning av maskar:
- Inkonsekvent spårning av masken från huvud till svans (märkt "svans till huvud"). Detta resulterar i maskar som är orienterade i olika riktningar (dvs. svans mot huvud kontra head-to-tail) i anpassningen.
- Ofullständig spårning (märkt "ofullständig"). Detta resulterar i endast den del av masken som spårades för att beskäras för montaget.
- Inklusive flera maskar i ett enda spår (märkt "mask med två huvuden"). Detta resulterar i maskar plus (betydande delar av) deras grannar som sätts in i samma panel av montaget.
- Lägga till slumpmässiga linjer i bilden (märkt "slumpmässig"). Detta resulterar i införandet av slumpmässiga paneler i montaget.
För skapandet av montaget är det inte en fråga om två enskilda linjer skär (märkt "korsande") eller är förenade i vardera änden av masken (märkt "förenade"), så länge varje rad spår hela längden av en enskild mask: Den Worm-align script individuellt och sekventiellt väljer varje rad ROIs, grödor och räta ut den, så att varje panel i den slutliga montage kommer att representera en enda rad spåra. I fall att de korsande maskar dock, även om full längd räta maskar visas för mask "korsa1" och mask "korsa2" i montaget (se figur 5A-B), är det tydligt märkbart att dessa maskar korsar varandra i den ursprungliga översikt bilden. Därför kan man dra slutsatsen att visuell identifiering av korsande linjer är möjlig från överläggsbilden som finns i undermappen 'data' (figur 5A), samt från panelerna av enskilda maskar i montaget (Figur 5B). Dessutom kan eventuell överlappning av maskar/linjer identifieras från den tabell för kvalitetskontroll (QC) som genereras för varje bearbetad bild av Worm-align, och sparas i dataundermappen. Denna tabell registrerar tre parametrar för var och en av de linje-ROIs som ritas i bilden (se bild 5C): Av dessa anger Längd längden på linjen ROI, vilket är en bra indikator på maskens storlek; och Worm-numret anger i vilken ordning linjerna ritades på översiktsbilden. Slutligen anger den sista kolumnen om det finns överlappning mellan masken/linjen i fråga och någon av de andra maskar/linjer som valts i bilden. Vid överlappning antalet i denna kolumn kommer att vara annorlunda än den som anges i Worm nummer kolumnen. I kombination med överlagringsbilden bör TABELLEN QC hjälpa forskaren att fatta lärda beslut om vilka maskar som ska uteslutas från montaget och/eller kvantifieringen.
Utdata från Worm-align kan användas för efterföljande kvantifiering av fluorescensintensitet i enstaka maskar. I FIJI kan rad-ROIs användas för att mäta fluorescensintensitet i de ursprungliga bilddata, till exempel genom att utföra det enkla FIJI-skriptet ' Worm-quant.ijm ', som också kan hittas i Worm-align-lagringsplatsen på Github. Alternativt kan Worm-align-utdata importeras till tredje part bildanalys programvara. Vi visar detta genom att importera Worm-align-utdata av två datauppsättningar till Worm_CP, en pipeline som vi genererade i CellProfiler. Worm_CP använder filerna i undermappen 'CellProfiler' i utdatamappen Worm-align för att finjustera segmenteringsmasker av de enskilda maskar som valts under körning av makrot Worm-align. Specifikt använder den linjemasken (namngiven: Lines_) för att isolera valda maskar från maskpopulationen som ses i den binära masken (namngiven: Mask_). Det bör noteras att linjer som skär på översiktsbilden (Bild 5A), även om det inte är ett problem för genereringen av montage, är problematiska för Worm_CP pipeline. Varför detta är fallet, illustreras i figur 5 D-E. Worm_CP använder linjemasken (bild 5D), och inte enskilda ROIs för att hjälpa identifiering av enskilda maskar. Den korsande linje dras andra under körningen av Worm-align är överlagras på den första linjen och därför intensiteten längs denna linje kommer att vara att AV ROI2 inklusive i den bit där linje 1 och 2 överlappning. Som ett resultat kommer CellProfiler segmentera linje2 som ett objekt, men linje1 som två objekt som är åtskilda där den skär med linje2. Detta innebär att CellProfiler kommer att producera två (halv) maskmasker för mask 'intersecting1' (Bild 5E). Det enklaste sättet att utesluta dessa händelser från den slutliga analysen (om det krävs), är att identifiera masken antalet korsande maskar från TABELLEN QC (data undermapp), och att ta bort mätningar för dessa maskar från CellProfiler utdatafiler. Observera att maskar inte nödvändigtvis kommer att tilldelas samma nummer i FIJI och CellProfiler: För att identifiera FIJI masknummer i CellProfiler utdata titta på Intensity_Max_Intensity-värdena i 'Lines.csv' utdatafilen. Alla Intensity_Max_Intensity som visas i tabellen 'Linjer.csv' mer än en gång per bild är en indikation på den linjen ROI vilket resulterar i en bruten maskmask.
När enskilda maskmasker är segmenterade kan Worm_CP mäta fluorescensintensiteten i de valda maskarna för alla inspelade kanaler. Alla mätningar är hämtade från de ursprungliga (råa) bilddata, även om det bör noteras att CellProfiler automatiskt skalar om pixelintensiteten på en skala från 0-1. Detta uppnås genom att dela upp värdet för rå pixelintensitet med största möjliga pixelintensitet för bilden. Vid 8-bitarsbilder är detta värde 255, och vid 16-bitarsbilder är det 65535. CellProfiler-intensitetsvärden behöver därför multipliceras med det maximala möjliga intensitetsvärdet för att återfå värden som motsvarar råda bilddata. Den Worm_CP utdata består av två csv-filer, 'maskar.csv' och 'Lines.csv' som sparas i den valda utdatamappen. Medan inspektera dessa filer, är det tydligt att CellProfiler registrerar ett stort antal parametrar relaterade till fluorescens intensitet. Av dessa motsvarar Intensity_IntegratedIntensity den totala fluorescensen per mask (dvs. summan av fluorescensintensiteten inom alla pixlar som tolkar masken hos en enskild mask). Parametern Intensity_MeanIntensity avser den genomsnittliga fluorescensintensiteten inom en enskild mask (dvs. den genomsnittliga fluorescensintensensen per pixel för alla pixlar som finns inom en enskild mask). På grund av enstaka förekomst av (små) fel i segmentering av maskmasker rekommenderas att MeanIntensity mätningar används vid jämförelse av fluorescens mätningar av enskilda maskar mellan två villkor. Om vill substrahera bakgrunden fluorescens från kvantifierade mätstenar, använd de measurments som heter MeanIntensity_Threshold.
Vi har använt Worm_CP pipeline för att kvantifiera fluorescensintensitet från fasta djur som har märkts med ett fluorescerande färgämne som införlivar i lipiddroppar (LDs) (Figur 6). För att validera fluorescenskvantifiering från Worm-align/Worm_CP-pipelinen kvantifierade vi fluorescensintensiteten i samma uppsättning maskar från BODIPY-datauppsättningen av antingen Worm-align/Worm_CP-pipelinen eller manuell kvantifiering i FIJI/ImageJ. Manuell kvantifiering utfördes i FIJI/ImageJ genom att cirkla varje mask samt en mörk bakgrundszon i varje bild. Fluorescensintensiteten mättes i ROI-chefen och värdet mätt för bildbakgrunden subtraherades från maskens fluorescensmätning av varje mask, enligtbeskrivningen 17. Vi jämförde vild typ (WT) N2 maskar till dbl-1(nk3) mutanter, som uppvisar minskad lipiddropp innehåll18. Som väntat är den gröna fluorescensintensiteten signifikant minskad mellan WT och dbl-1(nk3) maskar med båda metoderna (Figur 6A,B). Exempel på injusterade maskar kan observeras i figur 6C,D. Lipiddropphalten minskas med 17% (p-value<0,0001, oparared t-test) mellan WT och dbl-1(nk3) med hjälp av manuell kvantifiering, och med 14% (p-value=0,0051 opararerad t-test) med hjälp av Worm_CP pipeline. Den minskning av lipiddropphalten som observerats här i dbl-1(nk3) med båda kvantifieringsmetoderna är ienlighet med litteraturen 18. Detta visar att kvantifiering av förvärvade fluorescensbilder med Worm_CP CellProfiler-pipelinen är jämförbar med manuell kvantifiering.
Vi har också använt Worm_CP för att kvantifiera värmechocksvaret i levande maskar som uttrycker GFP under kontroll av värmechocken inducerbar gen hsp-70(C12C8.1)9. I figur 7 visas representativa bilder av live C. elegans som bär på den värme-responsiva hsp-70(C12C8.1)p::GFP-reporter. I avsaknad av värmestress inducerar maskarna inte GFP-uttryck (Figur 7A,B). När maskar utsätts för en kort värme-chock på 30 min vid 34 °C inducerar de dock GFP-uttryck (Figur 7C,D). GFP-uttrycksnivåer med och utan värme-chock kvantifieras i figur 7E.
Som det ser ut Worm_CP en mycket grundläggande pipeline. Detta tillvägagångssätt möjliggör dock en mer exakt segmentering av enskilda maskmasker, vilket möjliggör en mer exakt kvantifiering av fluorescensintensiteten i de maskar som valts ut från bilden. Av denna anledning föredrar vi detta tillvägagångssätt framför en grov kvantifiering i FIJI, med bara linjemasker. Dessutom erbjuder CellProfiler fördelen att ytterligare analysmoduler enkelt kan inkluderas i rörledningen. För datauppsättningen som tittar på innehållet i lipiddroppningen kan till exempel insättning av ytterligare moduler i Worm_CP-rörledningen undersöka lipiddroppenummer och fluorescensintensitet hos enskilda droppar i de maskar som valts i översiktsbilderna.
Bild 1: Generera en mun micropipette. En kapillär av glas förlängs i flamman på en Bunsenbrännare (A), tills den ger tunna avlånga extremiteter (B). Den förlängda glas kapillären pluggas sedan in i adapter bit av munnen mikropipette. (C) Schematiska av en mun mikropipette. Munnen mikropipette var monterad med ett glas kapillär ansluten till en adapter. Ett 6 mm silikonrör kopplar adaptern till ett 0,2 μm sprutfilter, som används för säkerhet. Den andra änden av filtret är fäst vid ett 3 mm silikonrör som slutar med en 1mL filterspets. Försökssprutaren kan aspirera via filterspetsen. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2: Aspiration av vätskan som omger maskpelleten, med hjälp av munmikropipettet. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 3: Lägga till täckslip på maskarna om på agarospaden Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Exempel på mask uträtning med hjälp av Worm-align på fluorescens bilder som förvärvats från levande djur som bär transkriptionella reportern fett-7p::GFP i tarmen och en röd co-injection markör i svalget (myo-2p::tdtomato). (A) Skärmdump av en sammansatt bild som förvärvats på fluorescerande mikroskop av levande maskar vid dag 3 i vuxen ålder. Bilden öppnades med Worm_align linjer ritades längs maskarnas längsgående axel med hjälp av Worm-align. (B) Skärmdump av samma bild som i (A), med exempel kommenterade av bra och dåligt ritning av linjerna längs axeln av maskarna, med hjälp av Worm-align. (C) Exempel på linjer ritade ovanpå maskar som kan stiga till felaktigt anpassade maskar. Mask-align-utdata av maskarna som valts i B. Bilder togs med ett 20x-mål på ett inverterat widefieldmikroskop (se Materialtabell) med grön fluorescensintensitet=1, exponering=60 ms och röd fluorescensintensitet = 8, exposure=60 ms. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 5: Exempel på maskrätning med hjälp av Worm-align på korsande maskar. (A) Skärmdump av en sammansatt bild som förvärvats på fluorescerande mikroskop av levande maskar på dag 3 av vuxenlivet djur som bär transkriptionella reportern fett-7p::GFP i tarmen och en röd co-injection markör i svalget (myo-2p::tdtomato). Korsande maskar är märkta "korsande1" och "korsande2", medan icke överlappande maskar är märkta "good3" och "good4". (B) Montage som skapats av Worm-align representerar uträtade maskar som valts i (A). Det märks i montaget att maskarna 1 och 2 var korsande på den ursprungliga bilden (maskar märkta som "korsande1" och "korsande2"). (C) Skärmdump av QC tabellen från Worm-align som gör det möjligt att upptäcka fall där maskar skär. Längd: längd på ROI-linjen; avmasknummer: ordning i vilken linjerna drogs; sista kolumnen anger om det finns en överlappning mellan masken/raden av intresse och någon annan mask. I det här exemplet överlappar masken i det första råa (masknumret1) med masknummer 2, vilket anges av siffran "2" i den sista kolumnen. (D) Skärmdump av de linjer som dras med Worm-align på de fyra maskar som valts i A. (E) Skärmdump av de masker som genereras av Worm-align på de fyra maskar som valts i A, som visar hur maskerna för de två korsande maskarna återges. I detta fall är två masker i stället för en nu motsvarar masken "korsande1". Bilder togs med ett 20x-mål på ett inverterat widefieldmikroskop (se Materialtabell) med grön fluorescensintensitet=1, exponering=60ms och röd fluorescensintens = 8, exponering = 60 ms. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 6: Worm_CP rörledning kvantifierar fluorescens så exakt som skulle manuell kvantifiering. Jämförelse av fluorescenskvantifiering av unga vuxna maskar fast och färgas för lipiddroppinnehåll med det gröna fluorescerande färgämnet BODIPY, med hjälp av antingen Worm_CP pipeline (A) eller manuell kvantifiering (B). Lipiddropphalten i WT och dbl-1 (nk3) övervakades genom att man fixade och färgade in djur med BODIPY, som intercalates till fettsyror av lipiddroppar (se protokoll A). Unga vuxna djur var fast med 60% isopropanol och färgas med BODIPY för 1h. Samma uppsättning djur kvantifierades antingen med hjälp av Worm_CP (se steg 7) eller genom manuell kvantifiering enligt standardrutiner17. (A) Kvantifiering av fluorescens med hjälp Worm_CP rörledning. WT: n=22 djur, genomsnittlig fluorescens= 1,016 (A.U) ± 0,206 SD; dbl-1(nk3): n=25 djur, genomsnittlig fluorescens= 0,8714 (A.U) ± 0,126 SD. Oavlönat t-test. (B) Manuell kvantifiering av fluorescens. WT: n=22 djur, genomsnittlig fluorescens = 1,048 ± 0,153 SD; dbl-1(nk3): n=25 djur, genomsnittlig fluorescens = 0,8632 ± 0,109 SD. Oavlastat t-test. (C, D) Representativt exempel eller Worm-Align-utdata för WT (C) och dbl-1(nk3) (D) djur rätade med Worm-align-pipelinen. Bilder togs med en 20x mål på en inverterad widefield mikroskop (se Material tabell) med grön fluorescens intensitet = 2, exponering = 60ms. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 7: Exempel på fluorescenskvantifiering och anpassning av levande maskar från fluorescensbilder av levande maskar som bär transkriptionella reportern hsp-70(C12C8.1)p::GFP efter värme-chock. (A) Vid en kort värme-chock (30 min vid 34 °C), unga vuxna maskar återfanns vid sin odlingstemperatur (25 °C) och monterade sedan avbildas 3.5h post värme chock. Omkring 30 maskar kvantifierades efter värmechock med hjälp av Worm-align pipeline. (A-B) Exempel på justerade maskar som inte utsatts för värmestöt. (C-D) Exempel på värmechockade maskar som bär på HSP-70(C12C8.1)p::GFP med hjälp av Worm-align. (E) visar GFP Genomsnittlig intensitet (Worm_CP parameter: MeanIntensity_Threshold) av WT unga vuxna maskar som odlas, utan värmestöt eller vid exponering för värmestöt (34 °C i 30 min). Bilder togs med en 20x målsättning på ett inverterat widefield mikroskop (se Materialtabell) med grön fluorescensintensitet=1, exponering=60ms; ingen HS: n=12, HS: n=32. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Kompletterande figur 1: Plats i FIJI där Worm-align makro kan hittas, en gång installerat. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Kompletterande figur 2: Val av den mapp som innehåller alla bilder som tagits med samma inställningar. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Kompletterande figur 3: Generering av 4 undermappar i utdatamappen i FIJI. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Kompletterande figur 4: Ritning av en linje över maskens bredd och kanalinställningar för montaget. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Kompletterande figur 5: Förhandsvisning av bilden med de tillämpade inställningarna. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Kompletterande figur 6: Ritning av en linje längs med den längsgående axeln hos maskarna av intresse för inkludering i montaget och/eller kvantifieringen. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Kompletterande figur 7: Montage av de valda maskarna i utdatamappen, under "justerad" mapp. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Kompletterande figur 8: Rensa tidigare bilder från tidigare analys i Cell Profiler. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Kompletterande figur 9: Importera metadata till CellProfiler från utdatamappen Worm-align genom att välja undermappen Inställningar.csv. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Kompletterande figur 10: CellProfiler-pipelinen Worm_CP.cpproj använder Lines_-bilderna för att enstaka de valda maskarna (A), och producerar enmaskmaskar av de maskar som är av intresse (C). Rörledningen mäter också bakgrundsintensiteten (B). Utsikter för alla parametrar som mäts av rörledningen Worm_CP.ccproj som exporteras i en csv-fil (D). Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Kompletterande figur 11: Val av utdatafiler i "ExportToSpreadsheet i Worm_CP.cpproj pipeline. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Discussion
Worm-align är en FIJI-baserad bildbehandling pipeline som lätt genererar montage av användarvalda maskar, där maskar rätas och anpassas för att underlätta visuell jämförelse, klassificering och representation. Även om denna funktion erbjuds också av vissa befintliga verktyg, särskilt WormToolbox-modulen i CellProfiler7, kräver Worm-align jämförelsevis lite tidigare bildanalysupplevelse: Användare behöver bara spåra de maskar som de skulle vilja välja för montaget (och analysen). Även spåra maskar på rå bilddata är en enkel process-särskilt när en pekskärm dator eller surfplatta är tillgänglig-, är det av största vikt, att linjerna är korrekt dras längs den längsgående axeln av maskarna. Ofullständiga linjer, som följer endast en del av masken, kommer att resultera i partiella maskar i montaget (dvs, maskar saknas huvuden av svansändar) och partiell segmentering masker under CellProfiler analys. Dessutom, om linjer från två enskilda maskar kors, maskarna kommer inte att korrekt bearbetas i masken anpassning montage samt för fluorescens kvantifiering. För kvalitetskontroll en överlagringsbild av linjevalen på den ursprungliga bilden sparas i mappen data, tillsammans med en QC-tabell. Från dessa kan problematiska linjer som kommer att leda till felaktigt segmenterade maskar lätt identifieras och uteslutas från montage och /eller efterföljande analys.
Även om den direkta inmatningen från experimentören i valet av maskar kanske verkar lite tidskrävande, presenterar den en klar fördel av arbetsflödet framför andra i experiment där maskar från olika utvecklingsstadier finns i samma bild: Maskar kan väljas under "spårande steg", genom att endast skissera de maskar som är i rätt utvecklingsstadium. Alternativt kan maskar filtreras med hjälp av utdata från Worm_CP baserat på antingen längden på spårningslinjen, eller området för segmenteringsmasken, båda tillförlitliga indikatorer på maskarnas längd/storlek. Förmodligen kan maskininlärningsalgoritmer kämpa för att känna igen maskar från olika utvecklingsstadier, eftersom deras storlek och utseende i DIC-bilderna är så olika.
Utdata från Worm-align kan användas för efterföljande kvantifiering av fluorescensintensitet i enstaka maskar, antingen i FIJI direkt, eller i andra bildanalysprogramplattformar. Vi visade detta genom att importera Worm-align-utdata till en enkel CellProfiler-pipeline (Worm_CP), som gör det möjligt att kvantifiering av flera kanaler fluorescens intensitet i de enskilda maskar som valdes medan du kör Worm-align pipeline. Vi valde detta tillvägagångssätt på grund av flexibiliteten i CellProfiler-programvaran: Det är enkelt att införliva ytterligare moduler i rörledningen för att analysera ytterligare funktioner i enskilda maskar (t.ex. mäta storleken på lipiddroppar, eller stressgranulat, kärnor, mitokondrier). Dessutom kan den enda mask masker potentiellt användas för att träna en ny modell för WormToolbox7.
De viktigaste fördelarna med denna metod är att det är snabbt och kräver en enkel mask montering set-up. Denna metod är snabbare eftersom det inte kräver att spendera tid lärande programvara drift och inte köra träningsuppsättningar genom en maskin algoritm7. Vidare, denna metod fungerar med antingen levande eller fasta maskar helt enkelt monterad på vanliga agaros kuddar. Det finns ingen anledning att använda komplexa mikrofluidiska kammare, som utvecklats i andra metoder5,6.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka Dr Christian Lanctôt vid BIOCEV (Prag, Tjeckien) för att lära oss munnen micropipette teknik för att montera fasta maskar och Dr Fatima Santos och Dr Debbie Drage för att dela säkerhet setup på munnen micropipette. Vi tackar också Francesca Hodge för redigering av manuskriptet, Sharlene Murdoch och Babraham Institute Facilities för deras stöd. OC stöds av ERC 638426 och BBSRC [BBS/E/B000C0426].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | MeLford Biolaboratories Ltd | MB1200 | |
| Aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177 | to create mouth micro-pipette (see protocol step) |
| Beaker | |||
| BODIPY 493/593 | Invitrogen | D3922 | stock solution prepared in DMSO at 1mg/mL |
| Centrifuge | MSE MISTRAL 1000 | ||
| Conical flask | |||
| Cover Slip | VWR | 631-0120 | |
| Filter 0.2 µm for Syringe | Sartrius | 16534-K | Filter, to create mouth micro-pipette (see protocol step) |
| Isopropanol | |||
| Levamisole hydrochloride | Sigma-Aldrich | BP212 | 3mM solution prepared by dissolving levamisole in M9 |
| Liquid Nitrogen | Liquid Nitrogen facility | ||
| Low Retention Tip 1000µL | Starlab | S1182-1830 | |
| Methanol | VWR chemicals | 20847.307 | |
| Microscope Slides, MENZEL GLASSER | Thermo Scientific | BS7011/2 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Microwave Oven | Delongi | ||
| M9 | prepared in the lab according to15 | ||
| 9cm NGM Plates | prepared in the lab according to15 | ||
| PBS | prepared in the lab | ||
| Protein LoBind Tube 2ml | Eppendorf | 22431102 | |
| Triton | SIGMA | T9284-500ML | |
| Ring Caps | SIGMA-ALDRICH | Z611247-250EA | glass micro-capillary tubes to create mouth micro-pipette (see protocol step) |
| Rotator | Stuart Scientific | ||
| Silicone tubine translucent | Scientific Laboratory Suppliers | TSR0600200P | 6.0 mm x 2.0 mm wall - to create mouth micro-pipette (see protocol step) |
| Sterilized H2O | MilliQ water autoclaved in the lab | ||
| 10µL Tips | Starlab | S1120-3810 | |
| 200µL Tips | Starlab | S1120-8810 | |
| 1000µL Tips | Starlab | S1122-1830 | |
| 15mL Centrifuge Tube | CORNING | 430791 | |
| Vecta Shield | VECTOR | 94010 | antifade mounting medium (H-1000) without DAPI |
References
- Shave, D. D., Greenwald, I. OrthoList: A compendium of C. elegans genes with human orthologs. PLoS One. 6 (5), 20085 (2011).
- Stiernagle, T.
- Letizia, M. C., et al. Microfluidics-enabled phenotyping of a whole population of C. elegans worms over their embryonic and post-embryonic development at single-organism resolution. Microsystems & Nanoengineering. 4 (6), (2018).
- San-Miguel, A., Lu, H. Microfluidics as a tool for C. elegans research. WormBook. , (2013).
- Atakan, H. B., et al. Automated Platform for Long-Term Culture and High-Content Phenotyping of Single C. elegans Worms. Scientific Reports. 9 (1), 120-135 (2019).
- Atakan, H. B., Cornaglia, M., Mouchiroud, L., Auwerx, J., Gijs, M. A. M. Automated high-content phenotyping from the first larval stage till the onset of adulthood of the nematode Caenorhabditis elegans. Lab on a Chip. 19 (1), 120-135 (2018).
- Wählby, C., et al. An image analysis toolbox for high-throughput C. elegans assays. Nature Methods. 9 (7), 714 (2012).
- Morimoto, R. I. The heat shock response: systems biology of proteotoxic stress in aging and disease. Biology. 76 (9), 91-99 (2012).
- Guisbert, E., Czyz, D. M., Richter, K., McMullen, P. D., Morimoto, R. I. Identification of a tissue-selective heat shock response regulatory network. PLoS Genetics. 9 (4), (2018).
- Klapper, M., et al. Fluorescence-based fixative and vital staining of lipid droplets in Caenorhabditis elegans reveal fat stores using microscopy and flow cytometry approaches. Journal of Lipid Research. 52 (6), 1281-1293 (2011).
- Wählby, C., et al. and low-throughput scoring of fat mass and body fat distribution in C. elegans. Methods. 68 (3), 9 (2014).
- Kurimoto, K., Yabuta, Y., Ohinata, Y., Saitou, M. Global single-cell cDNA amplification to provide a template for representative high-density oligonucleotide microarray analysis. Nature Protocols. 2 (3), 739-752 (2007).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18, 529 (2017).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome. 7, 100 (2006).
- Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).
- Casanueva, M. O., Burga, A., Lehner, B. Fitness trade-offs and environmentally induced mutation buffering in isogenic C. elegans. Science. 335 (6064), 82-85 (2012).
- Clark, F. J., Meade, M., Ranepura, G., Hall, D. H., Savage-Dunn, C. Caenorhabditis elegans DBL-1/BMP Regulates Lipid Accumulation via Interaction with Insulin Signaling. G3. 8 (1), Bethesda. 343-351 (2017).
