Summary
Worm-align/Worm_CP er en simpel FIJI / CellProfiler workflow, der kan bruges til at rette og justere Caenorhabditis elegans prøver og til at score hele ormen billede-baserede analyser uden behov for forudgående uddannelse trin. Vi har anvendt Worm-align/Worm_CP til kvantificering af varmechok induceret udtryk i levende dyr eller lipiddråber i faste prøver.
Abstract
Et problem, der ofte opstår, når de henter billeddata fra fast eller bedøvet C. elegans er, at orme krydser og klynger med deres naboer. Dette problem forværres med stigende tæthed af orme og skaber udfordringer for billedbehandling og kvantificering. Vi udviklede en FIJI-baseret arbejdsgang, Worm-align, der kan bruges til at generere enkelt- eller multikanalmontager af brugeropdelede, rettede og justerede orme fra rå billeddata af C. elegans. Worm-align er en enkel og brugervenlig arbejdsproces, der ikke kræver forudgående uddannelse af hverken brugeren eller analysealgoritmen. Montager genereret med Worm-align kan støtte den visuelle inspektion af orme, deres klassificering og repræsentation. Desuden kan produktionen af Worm-align bruges til efterfølgende kvantificering af fluorescensintensitet i enkelte orme, enten i FIJI direkte eller i andre billedanalysesoftwareplatforme. Vi demonstrerer dette ved at importere Worm-align output Worm_CP, en pipeline, der bruger open source CellProfiler software. CellProfilers fleksibilitet gør det muligt at inkorporere yderligere moduler til screening med højt indhold. Som et praktisk eksempel har vi brugt rørledningen på to datasæt: det første datasæt er billeder af varmechok reporter orme, der udtrykker grønt fluorescerende protein (GFP) under kontrol af promotoren for et varmechok inducerende gen hsp-70, og det andet datasæt er billeder fra faste orme, farves for fedt-butikker med en fluorescerende farvestof.
Introduction
En forholdsvis enkel organisme, nematode C. elegans, er en yderst nyttig model system til at studere sygdomme hos mennesker. Omkring 38% af generne i C. elegans genomet har funktionelle modstykker hos mennesker1,2. En af de unikke egenskaber ved C. elegans er, at det er optisk gennemsigtig, så nem adgang til in vivo oplysninger om (sub) cellulære udtryk for fluorescerende journalister på tværs af væv. Dette gør C. elegans en førsteklasses model organisme for højt indhold skærme ved hjælp af billedbaserede platforme3. Men et problem, der ofte komplicerer disse undersøgelser er, at når billeddannelse tætte populationer af orme, de har tendens til at krydse og klynge, foretage sammenligninger på tværs af de enkelte orme udfordrende, uklarhed downstream billedanalyse og kvantitet.
Eksisterende løsninger, derovervinderdette problem, er typisk afhængige af optimering af dyrknings- og billeddiagnostisk protokol,f.eks. Andre har anvendt machine-learning algoritmer giver mulighed for anerkendelse af enkelte orme, selv i en klumpet befolkning. Et glimrende eksempel på sidstnævnte er WormToolbox, som er en modulær udvidelse af open source-billedanalyse platform, CellProfiler7. WormToolbox tilbyder en løsning med høj overførselshastighed og højt indhold til analyse af C. elegans, og det er klart, at det er en god fordel, at den er inkluderet i CellProfiler, da yderligere analysemoduler nemt kan medtages. Selvom WormToolbox leveres med en færdig uddannet model (DefaultWormModel.xml), er omskoling af maskinlæringsalgoritmen normalt påkrævet for hvert nyt program. Online tutorials om hvordan du gør dette er tilgængelige på Github (https://cp-website.github.io/Worm-Toolbox/). På trods af dette, installere og bruge WormToolbox kræver en betydelig tidsinvestering for nybegyndere.
Her beskriver vi en enkel og omkostningseffektiv og tidseffektiv protokol til kultur og billedpopulationer af C. elegans. For at gøre det muligt at vurdere de enkelte orme i de erhvervede billeder har vi udviklet en simpel open source FIJI-baseret arbejdsgang, kaldet Worm-align. Worm-align kan bruges til at generere enkelt- eller multikanalmontager af rettede og justerede orme. For det første skal brugeren manuelt vælge individuelle orme til analyse ved at trække en linje fra hovedet til halen. Worm-align bruger denne markering til at beskære markerede orme fra oversigtsbilledet og generere en montage, hvor udvalgte orme rettes og justeres for at lette visuel sammenligning og præsentation.
Desuden kan produktionen af Worm-align bruges til efterfølgende kvantificering af fluorescensintensitet i enkelte orme, enten i FIJI direkte eller i andre billedanalysesoftwareplatforme. Vi demonstrerer dette ved at importere Worm-align output Worm_CP, en pipeline, der bruger open source CellProfiler software. CellProfilers fleksibilitet gør det muligt at inkorporere yderligere moduler til screening med højt indhold. Vi har brugt Worm_CP rørledningen til at kvantificere varmechokrespons, en godt bevaret beskyttende mekanisme, der omfolderer proteiner, der er fejlfoldet på grund af stressfaktorer såsom høj temperatur8. Konkret har vi anvendt rørledningen til orme bærer en integreret multi-kopi transgene, hvor initiativtageren til en varmechok inducerende gen, hsp-70 (C12C8.1), drev grøn fluorescerende protein (GFP)9. Vi har også brugt Worm_CP rørledningen på faste dyr, der er blevet mærket med en fluorescerende farvestof, der visualiserer lipid dråber (LDs), de vigtigste fedt opbevaring organelle i C. elegans10. Selvom denne arbejdsproces ikke har det gennemløb, der tilbydes af WormToolBox, er det et brugervenligt og enkelt alternativ til visuel præsentation og analyse af billedbaserede C. elegans eksperimenter.
Protocol
1. Fiksering af orme til billeddannelse med fedtindhold ved hjælp af et fluorescerende farvestof til lipiddråber (BODIPY)10
- Forbered en synkroniseret population af C. elegans ved blegning i henhold til standardprocedurer2. Plade omkring 1.000 L1-trins orme på en 9 cm nematode vækstmedier (NGM) plade pr betingelse.
BEMÆRK: Der fremstilles flere orme end faktisk kvantificeret i slutningen på grund af tab af orme ved håndtering. - Til billeddyr i ung voksenfase (ca. 50 h post L1 plating ved 20 °C) vaskes hver 9 cm plade med 15 ml M9 i et konisk rør, centrifuge ved 252 x g i 1 min.
- Gentag vask og lad 1 ml M9 over pellet af orme.
- Overfør 1 ml M9 indeholdende ormene i et 2 ml lavt proteinbindende mikrocentrifugerør ved hjælp af lave retentionsspidser.
- Spin ned på 252 x g i en mikrocentrifuge i 1 min og fjern supernatant, være omhyggelig med ikke at røre ormen pellet i bunden af røret.
- Til overvågning af fedtindhold ved hjælp af 4,4-difluor-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene (BODIPY) farvning10 (Tabel over materialer), fastsætte orme enten ved at tilføje 0,5 ml af 60% isopropanol til ormen pellet i 3 min11, eller ved at tilføje 2 ml iskold methanol i 10 min. For begge procedurer, invertere røret hver 30 s.
FORSIGTIG: Hvis methanol er det valgte fikseringsgenser, skal dette trin udføres i en røghætte på grund af dets toksicitet. - Fjern så meget fiksativ som muligt uden at røre ormen pellet og tilsæt 1 ml M9. Lad ormene sætte sig i bunden af røret i 3−5 min.
- Vask igen med 1 ml M9, lad ormene bosætte sig og fjerne supernatant, efterlader omkring 50 μL i røret. Fastgør røret ved hjælp af en klemme.
- Frys ormene ved at kaste det sikkert lukkede rør i flydende nitrogen og derefter ind i et varmt vandbad ved ~ 40 °C.
- Gentag trin 1.9 en gang til.
- Der tilsættes 0,5 ml BODIPY fortyndet i M9 ved en endelig koncentration på 1 μg/μL, og den sættes på en rotator ved stuetemperatur i 1 time.
- Efter 1 time, lad ormene bosætte sig i bunden af røret i 3−5 min.
- Fjern supernatant og tilsæt 1 ml M9.
- Lad ormene bosætte sig i bunden og fjerne supernatant.
BEMÆRK: Alternativt er det muligt at dreje ned ved 252 x g i 1 min. - Der tilsættes 0,5 ml M9.
BEMÆRK: Hvis fiksativ er 60% isopropanol, kan ormene kun anvendes inden for 48 timer. Hvis fikseringsmiddel er methanol, bør ormene udnyttes inden for 24 timer.
2. Forberedelse agarose puder til at montere orme
BEMÆRK: Det kritiske trin under forberedelsen af en agarosepude er at få en pude med regelmæssig tykkelse. Ellers vil orme på tværs af puden være i forskellige brændpunkter, hvilket gør det vanskeligt at få et fokuseret billede af et bredere synsfelt.
- Der tilsættes 2 % agarosepuder ved tilsætning af 0,2 g agarose til 10 ml steriliseret H2O i et bægerglas eller en konisk kolbe. Varm mikrobølgeovnen i 30 s, indtil agarose begynder at koge.
BEMÆRK: Overophedes og stop ikke, så snart der opstår bobler. ellers øger det agaroseens viskositet, hvilket gør det sværere at opnå den ønskede padtykkelse. - Når agarose er smeltet, dispenseres en dråbe smeltet agarose i midten af et mikroskopglasskreds ved hjælp af en 1000 μL pipettespids med det helt store snit. Umiddelbart, men fint, holde en anden glas dias meget tæt på agarose drop og slip den på agarose til at danne en pude af regelmæssig tykkelse for bedste mikroskopi resultater.
BEMÆRK: Hvis du slipper det øverste dias fra en højde, dannes det ikke kun bobler, men vil resultere i en ujævn pude. Alternativt er det også muligt at bruge to glasdias, der flankerer diaset med puden, med et tyndt lag tape på hvert dias. - Efter mindst 2−3 min, fjern forsigtigt den øverste slide. Brug siden af den øverste slide, trimme puden for at gøre det firkantet formet. Monter ormene inden for 5 min, for at forhindre puden i at tørre før brug.
3. Montering af faste orme til billeddannelse
- Opret en mundmikropipette ved at udvide en tynd glaskapillær i flammen af en Bunsen brænder (Figur 1A). Efter forlængelse i flammen, bryde kapillær i to stykker (Figur 1B). Vælg den mest hensigtsmæssige, normalt den længste, og test, om enden af kapillær er åben ved at forsøge at aspirere vand.
BEMÆRK: Hvis væsken ikke kommer ind i kapillæren, er den for tynd eller blokeret. Skær forsigtigt enden af kapillæren med en saks, undgå at skære for meget som orme vil blive aspireret, hvis hullet er for stort. - Sæt glaskapillæren fra trin 3.1 i kapillæradapteren (Figur 1C), der er fastgjort til silikonerøret på 6 mm silikone, og sæt den anden ende af silikonerøret i et 0,2 μm filter, der er fastgjort til et 3 mm silikonerør i den anden ende (Figur 1C). Sæt en 1 ml filterspids (Figur 1C) i den frie ende af silikonerøret for at aspirere væske.
BEMÆRK: Der tilsættes 0,2 μm filter mellem eksperimentatorens munding og kapillæren for at sikre maksimal sikkerhed for eksperimentatoren. En lignende opløsning anvendes til mundmikropipetter, der anvendes til håndtering af museembryoner12. Skift filteret (normalt med få måneders mellemrum), hvis mundmikropipetten ikke længere aspirerer væske. - Brug munden mikropipette under en dissektion mikroskop, fjerne så meget væske som muligt omkring ormen pellet af faste orme (Figur 2).
BEMÆRK: Pipettering supernatant ud ved hjælp af en manuel mikropipette kan bruges som et alternativ til munden pipetter i trin 3.1 til 3.3 for at fjerne så meget supernatant som muligt. Der tilsættes 6 μL monteringsmedium. Vi finder dog, at denne metode ikke virker så effektivt, fordi overdreven væske i puder skaber en sparsom orm tæthed, hvilket gør billeddannelse mere tidskrævende. Fortsæt trin 3.6. Kig på bunden af røret og sørg for, at pipetten ikke aspirere ormene. - Der tilsættes hurtigt 10 μL monteringsmedium (Materialetabel) til bunden af røret.
- Skyl en 10 μL spids i PBS med spor af vaskemiddel (0,01% Triton) for at forhindre orme i at holde sig til siderne af plastpipettespidsen. Skær slutningen af spidsen med en saks.
- Overfør 8 μL monteringsmedium, der indeholder ormene, over på agarosepuden, der er fremstillet i trin 2.3. Under mikroskopet skal du forsigtigt ryste diaset for at undgå overlapning af ormene.
- Dæk dråben af monteringsmediet på agarosepuden med en dæksel på 18 mm x 18 mm (Figur 3).
BEMÆRK: Mindre dækslæb foretrækkes, da de udøver mindre pres på ormene. Hold dækslæbet med en pincet og påfør den ene kant af dækslæbet mod agarosepuden, før dækslæbet forsigtigt deponeres med pincetten.
4. Montering levende orme til billeddannelse
BEMÆRK: For at billedet levende orme, de skal immobiliseres på puden. En måde at opnå dette på er at lamme dem med nikotinreceptoren agonist: levamisole (Tabel over Materialer).
- Pipette 3−4 μL μL 3 mM levamisole opløst i M9 på agarosepuden, der er skabt i trin 2.3.
BEMÆRK: Der skal være nok flydende volumen, at ormene ikke er oven på hinanden, men ikke for meget væske, at ormene er for sparsomme på puden. Erfarne orm plukkere kan bruge 3 μL levamisole. Mindre erfarne plukkere kan være nødvendigt at tilføje en større mængde levamisole, således at levamisole ikke helt fordampe. - Pick 30−50 orme pr tilstand i dråbe levamisole.
- Dæk dråben af levamisole på agarosepuden med en 18 mm x 18 mm dækslet. Billede orme inden for 1 h, som lammende agent i sidste ende vil føre til døden af ormene.
5. Billeddiagnostiske dias med epifluorescensmikroskop
- Med en agarose pad af ensartet tykkelse, billede alle orme på diaset på én gang ved hjælp af en 6 x 6 eller 7 x 7 stort billede for eksempel med 20x målsætningen om en fluorescerende mikroskop. Hvis tykkelsen af puden ikke er lige, erhverve flere mindre 3 x 3 eller 4 x 4 billeder af samme dias.
- Brug de samme indstillinger til fluorescensintensitet og eksponeringstid for alle forhold. Juster hver indstilling, så den passer til det dias, der har den klareste intensitet, så der ikke er nogen pixelmætning. Følg producentens anvisninger for at få specifikke instruktioner om anskaffelse af billeder.
6. Oprettelse af montagebilleder af justerede enkelte orme ved hjælp af Worm-align FIJI-rørledningen
- Installer open source-billedanalysesoftwarepakken FIJI13/ImageJ14 fra https://imagej.net/Fiji. Hvis en forudgående installation af FIJI er tilgængelig, skal du sikre dig, at den er opdateret til version 1.52a eller nyere, da nogle af de funktioner, der anvendes i makroen (f.eks. tabelfunktioner), kræver dette. Hent makroen Worm-align fra Github: https://github.com/hannekeo/Worm-align.
- Åbn FIJI, og kør makroen Worm-align. Udfør Worm-align ved at klikke på Plugins | Makroer | Kør i FIJI hovedmenulinjen(Figur S1). Find nu scriptet Worm-align.ijm på computeren.
- Makroen initialiserer ved at bede om placeringen af billederne. Rørledningen vil arbejde på både single-channel og multi-kanal fluorescens billeder (Figur S2). Vælg en inputmappe, og makroen genererer automatisk en outputmappe, hvor alle resultater gemmes (Figur S3).
BEMÆRK: Det er vigtigt, at den valgte mappe kun indeholder billedfiler, da tilstedeværelsen af andre filformater får makroen til at gå ned. Ideelt set kun gruppere billeder, der blev taget med de samme indstillinger for mikroskoper. Worm-align vil acceptere mange forskellige filformater, herunder nd2, czi, tif, rgb, jpg og png. Navnet på outputmappen vil være det samme som inputmappen, hvor '_output' tilføjes som et postfix, images_output dvs. Outputmappen indeholder fire undermapper, hvor dataene gemmes. - Lad makroen fortsætte med at åbne det første billede i inputmappen og bruge det som et repræsentativt billede til at udtrække en indstilling for at generere montagen.
BEMÆRK: Worm-align vælger automatisk det første billede i inputmappen for at generere de indstillinger, der skal anvendes på alle andre billeder i mappen. Hvis et andet billede anses for at være mere repræsentativt for datasættet, skal du sikre dig, at dette billede er valgt ved at gemme en kopi af billedet i inputmappen og ændre navnet, så det nu står øverst på listen (f.0_RepresentativeImage eks. - Med tegneværktøjet på lige linje tegnes en linje hen over bredden af en orm (Figur S4) og bruge længden af denne linje til at bestemme højden af de beskårne områder for enkelte orme. For hver kanal skal du angive navnet, opslagstabellen (LUT), intensitetsindstillinger (B&C), og om den skal medtages i montagen (Figur S4).
BEMÆRK: Disse parametre registreres og gemmes i en indstillingsfil, Indstillinger.csv, der er placeret i undermappen CellProfiler i outputmappen. - Når alle indstillinger er blevet fanget, brugeren er vist, hvad billederne vil se ud efter anvendelse af de anvendte indstillinger (Figur S5). Markér det øverste felt, hvis indstillingerne er tilstrækkelige. Vælg indstillinger for montagegenerering (fjern flåter, hvis det ikke er nødvendigt): 1. Generér en montage af udvalgte orme for hvert enkelt billede eller 2. Generér en kombineret montage, hvor alle orme, der er valgt på alle billeder i inputmappen, kombineres til en enkelt montage. Klik på OK for at udføre resten af makroen.
BEMÆRK: Hvis det øverste felt ikke er markeret, før du klikker på 'OK', kører makroen opsætningen igen, så billedindstillingerne kan optimeres. - Worm-align-pipelinen fortsætter nu med at åbne alle billeder i inputmappen. For hvert billede tegnes linjer på længdeaksen for alle orme, der skal indgå i montagen og/eller kvantificeringen (figur 4 og Figur S6) ved hjælp af værktøjet »segmenteret linje« (på FIJI's hovedmenulinje). For at sikre korrekt justering af orm, tegne linjer konsekvent fra hoved til hale ende (eller omvendt), og langs hele længden af ormen (se eksempler på "god" og "dårlig" linje tegning i figur 4B).
- Føj hver linje til roi-lederenved at klikke på Ctrl+T. Worm-align bruger de linjer, der er føjet til roi-lederen, i kombination med parameteren worm width (angivet i trin 6.4) til at generere beskårne billeder af enkelte markerede orme. Samlingen af linje-RO'er gemmes i undermappen 'data'. Denne mappe indeholder også en kopi af det oprindelige billede, der viser linjerne, samt nummeret på ormen. Streger er farvekodet med Glasbey_on_dark opslagstabellen. Billederne af udsøgte orme gemmes i den single_worms i outputmappen. Hvis Worm-align er valgt i trin 6.6 i denne protokol, producerer den desuden montager af alle orme, der er valgt pr. oversigtsbillede og/eller for alle oversigtsbilleder i inputmappen (se Figur 4C og Figur S7). Disse montager findes i undermappen 'justeret' i outputmappen.
7. Analyse af fluorescensintensitet med en enkelt orm ved hjælp af output fra Worm-align i en automatiseret CellProfiler-pipeline
- Til downstream-databehandling og -analyse af Worm-align-outputtet skal du hente og installere open source-billedanalysesoftwarepakken 'CellProfiler15,16 fra https://cellprofiler.org/. Download Worm_CP.cpproj pipeline fra GitHub: https://github.com/hannekeo/Worm-align
BEMÆRK: Det eksempelpipeline, der er beskrevet her, blev bygget ved hjælp af CellProfiler2.2.0 og kører muligvis ikke i senere versioner af CellProfiler. - Før du starter pipelinen Worms_CP.cpproj, skal du sikre dig, at alle forventede outputbilleder er til stede i undermappen CellProfiler i outputmappen Worm-align: en behandlet kopi af det oprindelige billede (navngivet: Original_), en binær billedmaske af ormenpopulationen (navngivet: Mask_), en stregmaske af de linjer, der er tegnet på udvalgte orme (navngivet: Lines_), og et billede, der repræsenterer hver af de kanaler, der findes i det oprindelige billede (navngivet efter kanalnummer).
- Hvis du vil kvantificere fluorescensintensiteten i enkelte orme, skal du klikke på inputmodulet Billeder og blot trække cellprofiler-outputmappen ind i det vindue, hvor der står Slip filer og mapper her. Hvis der findes en liste over billeder fra tidligere analyser, skal du først fjerne dem ved at højreklikke i vinduet og vælge Ryd filliste. Hvis du vil ekskludere filen 'Indstillinger.csv' fra billedlisten, skal du vælge enten 'Kun billeder' eller 'Brugerdefineret' med 'Udvidelse er tif, tiff.tif ome.tif eller ome.tiff' for filterindstillingerne (Figur S8).
- Klik på inputmodulet Metadata. I den anden udtrækningsmetode skal du klikke på den gule mappe og finde undermappen CellProfiler i outputmappen WormAlign (Figur S9). Vælg filen Indstillinger.csv og sammenkæd indstillingerne i filen med CellProfiler-outputtet ved at matche metadataene i CSV-filerne med dem i billederne (kanalmetadata).
- Klik på inputmodulet NamesAndTypes, og indsæt et nyt billede for hver kanal i det oprindelige billede, der skal kvantificeres.
BEMÆRK: Der findes allerede i eksempelpipelinen ormenmasken, to farvebilleder, linjemasken og det oprindelige billede og tre gråskalabilleder (den grønne og den røde kanal). Listen i dette modul skal justeres, hvis de oprindelige billeder har flere eller færre kanaler end eksempelbillederne. - Kontroller, at navnet på billederne i hver kolonneetiket/maske/orme er korrekt.
BEMÆRK: Navnene på billederne på en linje skal alle svare til det samme oprindelige billede, der skal analyseres. Hvis der opstår en fejl under billedanalyseprocessen, mangler nogle af outputbillederne, og navnene under de tre kolonners etiket/maske/orme svarer ikke længere til det samme oprindelige billede for hver linje. Hvis dette er tilfældet, finde, hvor fejlen er. - Tryk på Vis outputindstilling for at vælge den mappe, der skal gemmes fra Cellprofiler.
- Klik på Start testtilstand. Når du er i testtilstand, skal du dobbelttjekke indstillingerne for pipelinen ved at anvende dem på det første billede i datasættet ved at klikke på Kør (som vil køre gennem alle aktive moduler i pipelinen) eller Trin (som vil køre gennem rørledningen et modul ad gangen).
BEMÆRK: Mens de udtrukne målinger er i testtilstand, eksporteres de ikke, selvom der findes et ExportToSpreadsheet-modul (og er aktivt) i pipelinen. - Når rørledningen udfører, som den skal, skal du klikke på Afslut testtilstand og derefter trykke på Analysér billeder. Som det er konfigureret i øjeblikket, vil Worms_CP (1) bruge Mask_-billedet til at segmentere en grov ormmaske og Lines_-billedet (Figur S10A) til at fremhæve de valgte orme og producere enkelt ormmasker (Figur S10C), (2) måle fluorescensintensiteten for alle kanaler, der er til stede i inputbillederne i de identificerede og maskerede orme. Rørledningen kan også måle baggrundsintensiteten (Figur S10B) og korrigere alle billeder i overensstemmelse hermed (angivet med ordtærsklen i navnet på den målte parameter, f.eks.: Intensity_MeanIntensity_green_threshold), (3) måle størrelsen af de valgte orme og (4) eksportere alle målte parametre (Figur S10D).
- Åbn Worm_CP output bestående af to csv-filer, orme.csv og linjer.csv der er gemt i den valgte outputmappe (se Figur S11). Disse filer kan åbnes i Excel eller R (Studio) til efterbehandling og rapportering. Hvis der er behov for yderligere output, f.eks.
Representative Results
Dyrkning og billeddannelse C. elegans efter den metode, der er beskrevet i denne protokol producerer store overblik billeder af orm populationer. For at lette visuel inspektion og klassificering af orme fra disse billeder har vi udviklet Worm-align. Worm-align er et enkelt og brugervenligt FIJI-script, der kan bruges til at oprette montager af rettede og justerede orme. Orme vælges ud fra oversigtsbilleder ved at tegne en linje langs ormenes længdeakse. Hver markeret orm tildeles et nummer, beskæres og rettes og føjes til en montage. Montager kan genereres pr billede eller kombinere alle billeder fra den oprindelige input mappe.
Som forventet afhænger rørledningens output i høj grad af kvaliteten af de linjer, der trækkes oven på billederne. For at illustrere dette punkt viser figur 4 flere linjeeksempler og deres output fra Worm-align. En komplet linje fra hovedet til spidsen af halen producerer en korrekt justeret orm (mærket "god"). Figur 4 viser også, hvordan sporings unøjagtigheder under udførelsen af Worm-align påvirker outputtet af justeringen. Fra den kommenterede montage, der er inkluderet i figur 4C, skal der gøres en omhu for at undgå følgende fejl, da de hindrer en korrekt justering af orme:
- Inkonsekvent sporing af ormen fra hoved til hale (mærket "hale til hoved"). Dette resulterer i orme, der orienteres i forskellige retninger (dvs. hale-til-hoved versus head-to-tail) i tilpasningen.
- Ufuldstændig sporing (mærket "ufuldstændig"). Dette resulterer kun i den del af ormen, der blev sporet til beskæres for montagen.
- Herunder flere orme i et enkelt spor (mærket "orm med to hoveder"). Dette resulterer i orme plus (betydelige dele af) deres naboer bliver indsat i samme panel af montage.
- Tilføjelse af tilfældige linjer til billedet (mærket "tilfældig"). Dette resulterer i indsættelse af tilfældige paneler i montagen.
For oprettelsen af montagen er det ikke et problem, hvis to individuelle linjer skærer hinanden (mærket "skærer") eller er forenet i hver ende af ormen (mærket "forenet"), så længe hver linje sporer hele længden af en individuel orm: Worm-align script individuelt og sekventielt vælger hver linje ROI'er, afgrøder og retter det, således at hvert panel i den endelige montage vil repræsentere en enkelt linje spor. I tilfælde af de krydsende orme, men selv om fuld længde rettede orme vises for ormen "skærer1" og orm "skærer2" i montagen (se figur 5A-B),er det tydeligt, at disse orme krydser hinanden i det oprindelige oversigtsbillede. Det kan derfor konkluderes, at visuel identifikation af krydsende linjer er mulig fra overlejringsbilledet, der findes i undermappen »data« (figur 5A) samt fra panelerne af individuelle orme i montagen (figur 5B). Desuden kan enhver overlapning af orme/linjer identificeres fra den kvalitetskontroltabel (QC), der genereres for hvert behandlet billede af Worm-align, og gemmes i dataundermappen. Denne tabel registrerer tre parametre for hver af de linje-ROI'er, der er tegnet i billedet (se Figur 5C): Af disse angiver Længde længden af linjeafkastet, som er en god indikator for ormens størrelse. og Worm-nummeret angiver den rækkefølge, som linjerne blev tegnet i på oversigtsbilledet. Endelig angiver den sidste kolonne, om der er overlapning mellem den pågældende orm/linje og en af de andre orme/linjer, der er valgt i billedet. I tilfælde af overlapning vil tallet i denne kolonne være forskelligt fra det, der er angivet i kolonnen Worm-tal. I kombination med overlejringsbilledet bør QC-tabellen hjælpe forskeren med at træffe lærde beslutninger om, hvilke orme der skal udelukkes fra montagen og/eller kvantificeringen.
Produktionen af Worm-align kan bruges til efterfølgende kvantificering af fluorescensintensiteten i enkelte orme. I FIJI kan linje-RO'erne bruges til at måle fluorescensintensiteten i de oprindelige billeddata, for eksempel ved at udføre det simple FIJI-script 'Worm-quant.ijm', som også kan findes i Worm-align-lageret på Github. Alternativt kan Worm-align output importeres til tredjeparts billedanalyse software. Vi demonstrerer dette ved at importere Worm-align output af to datasæt til Worm_CP, en pipeline, vi genererede i CellProfiler. Worm_CP bruger filerne i undermappen 'CellProfiler' i outputmappen Worm-align til at finjustere segmenteringsmasker for de enkelte orme, der er valgt under udførelsen af makroen Worm-align. Den bruger især linjemasken (navngivet: Lines_) til at isolere udvalgte orme fra ormenpopulationen, der ses i den binære maske (navngivet: Mask_). Det skal bemærkes, at linjer, der skærer på oversigtsbilledet (Figur 5A), selv om det ikke er et problem for generationen af montager, er problematiske for Worm_CP rørledningen. Hvorfor dette er tilfældet, er illustreret i figur 5 D-E. Worm_CP bruger linjemasken (Figur 5D) og ikke individuelle ROI'er til at hjælpe med at identificere individuelle orme. Den krydsende linje trukket sekunder under udførelsen af Worm-align er overlejret på den første linje, og derfor intensiteten langs denne linje vil være, at af investeringsafkast2 herunder i den smule, hvor linje 1 og 2 overlapper hinanden. Som følge heraf segmenterer CellProfiler linje2 som ét objekt, men linje1 som to objekter, der er adskilt, hvor det skærer med linje2. Det betyder, at CellProfiler vil producere to (halv) orm masker for orm 'skærer1' (Figur 5E). Den nemmeste måde at udelukke disse hændelser fra den endelige analyse (hvis det er nødvendigt), er at identificere ormen antallet af krydsende orme fra QC-tabellen (dataundermappe) og at fjerne målinger for disse orme fra CellProfiler-outputfilerne. Bemærk, at orme ikke nødvendigvis tildeles det samme nummer i FIJI og CellProfiler: For at identificere FIJI-ormenummeret i CellProfiler-outputet skal du se på Intensity_Max_Intensity-værdierne i outputfilen 'Lines.csv'. Alle Intensity_Max_Intensity, der vises i tabellen 'Linjer.csv' mere end én gang pr. billede, er en indikation af den pågældende linjeafkastet, hvilket resulterer i en brækket ormmaske.
Når individuelle ormemasker er segmenteret, Worm_CP kan måle fluorescensintensiteten i de valgte orme for alle registrerede kanaler. Alle målinger er taget fra de oprindelige (rå) billeddata, selv om det skal bemærkes, at CellProfiler automatisk skalerer pixelintensiteten på en skala fra 0-1. Dette opnås ved at dividere den rå pixelintensitetsværdi med den maksimale mulige pixelintensitet for billedet. I tilfælde af 8-bit billeder er denne værdi 255, og i tilfælde af 16-bit billeder er det 65535. Celleprofilintensitetsværdier skal derfor ganges med den maksimale mulige intensitetsværdi for at genvinde værdier, der svarer til de rå billeddata. Det Worm_CP output består af to csv-filer, 'orme.csv' og 'Lines.csv', der gemmes i den valgte outputmappe. Mens inspicere disse filer, er det klart, at CellProfiler registrerer et stort antal parametre relateret til fluorescens intensitet. Af disse svarer Intensity_IntegratedIntensity til den totale fluorescens pr. orm (dvs. summen af fluorescensintensiteten inden for alle pixels, der fortolker masken af en individuel orm). Parameteren Intensity_MeanIntensity henviser til den gennemsnitlige fluorescensintensitet i en individuel orm (dvs. den gennemsnitlige fluorescensintensitet pr. pixel for alle pixel i en individuel orm). På grund af den lejlighedsvise forekomst af (små) fejl i segmenteringen af ormenmaskerne anbefales det, at middelintensitetsmålinger anvendes ved sammenligning af fluorescensmålinger af individuelle orme mellem to betingelser. Hvis du ønsker at undertrykke baggrunden fluorescens fra kvantificerede mål, skal du bruge de mål, der MeanIntensity_Threshold.
Vi har brugt Worm_CP rørledningen til at kvantificere fluorescensintensiteten fra faste dyr, der er mærket med et fluorescerende farvestof, der inkorporerer i lipiddråber (LDs) (Figur 6). For at validere fluorescens kvantificering fra Worm-align/Worm_CP-rørledningen kvantificerede vi fluorescensintensiteten i det samme sæt orme fra BODIPY-datasættet ved enten Worm-align/Worm_CP-rørledningen eller manuel kvantificering i FIJI/ImageJ. Manuel kvantificering blev udført i FIJI/ImageJ ved at cirkling hver orm samt en mørk baggrund zone i hvert billede. Fluorescensintensiteten blev målt i roi-lederen, og den målte værdi for billedbaggrunden blev trukket fra ormens fluorescensmåling af hver orm som beskrevet17. Vi sammenlignede vilde type (WT) N2 orme til dbl-1 (nk3) mutanter, som udviser nedsat lipid dråbe indhold18. Som forventet er den grønne fluorescensintensitet signifikant nedsat mellem WT og dbl-1(nk3) orme med begge metoder (Figur 6A, B). Eksempler på justerede orme kan observeres i figur 6C,D. Lipiddråbeindholdet reduceres med 17 % (p-value<0,0001, unalydt t-test) mellem WT og dbl-1(nk3) ved hjælp af manuel kvantificering og med 14 % (p-value=0,0051 uaftaleret t-test) ved hjælp af Worm_CP-rørledningen. Faldet i lipiddråbeindholdet observeret her i dbl-1(nk3) med begge kvantificeringsmetoder er i overensstemmelse medlitteraturen 18. Dette viser, at kvantificering af anskaffede fluorescensbilleder med Worm_CP CellProfiler-rørledningen kan sammenlignes med manuel kvantificering.
Vi har også brugt Worm_CP til at kvantificere varmechok respons i levende orme udtrykke GFP under kontrol af varmechok inducerende gen hsp-70 (C12C8.1)9. Figur 7 viser repræsentative billeder af levende C. elegans bærer varme-responsive hsp-70 (C12C8.1)p::GFP reporter. I mangel af varmestress fremkalder ormene ikke GFP-udtryk (Figur 7A,B). Men når orme udsættes for et kort varmechok på 30 minutter ved 34 °C, fremkalder de GFP-udtryk(Figur 7C,D). GFP-udtryksniveauer med og uden varmechok er kvantificeret i figur 7E.
Som det ser ud nu, Worm_CP er en meget grundlæggende rørledning. Men denne fremgangsmåde gør det muligt for en mere præcis segmentering af de enkelte orm masker, som giver mulighed for en mere præcis kvantificering af fluorescens intensitet i de orme valgt fra billedet. Af denne grund foretrækker vi denne tilgang frem for en grov kvantificering i FIJI, ved hjælp af netop den linje masker. Derudover giver CellProfiler den fordel, at yderligere analysemoduler nemt kan indgå i pipelinen. For det datasæt, der ser på lipiddråbeindhold, kan indsættelse af yderligere moduler i Worm_CP-pipelinen undersøge lipiddråber og fluorescensintensiteten af de enkelte dråber i de orme, der er valgt i oversigtsbillederne.
Figur 1: Generering af en mundmikropipette. En glas kapillær forlænges i flammen af en Bunsen brænder (A), indtil det giver tynde aflange ekstremiteter (B). Den udvidede glas kapillær er derefter sat i adapteren stykke af munden mikropipette. c) Skematisk af en mundmikropipette. Mundmikropipetten blev samlet med en glaskapillær tilsluttet en adapter. Et 6 mm silikonerør forbinder adapteren med et sprøjtefilter på 0,2 μm, der anvendes af sikkerhedsmæssige hensyn. Den anden ende af filteret er fastgjort til et 3 mm silikonerør, der slutter med en 1 ml filterspids. Eksperimentatoren kan aspirere via filterspidsen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Aspiration af væsken omkring ormen pellet, ved hjælp af munden mikropipette. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Tilføjelse af coverslip på orme om på agarose pad Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Eksempler på orm glatning ved hjælp worm-align på fluorescens billeder erhvervet fra levende dyr bærer transskriptionel reporter fedt-7p:: GFP i tarmen og en rød co-injektion markør i svælg (myo-2p::tdtomato). (A)Skærmbillede af et sammensat billede erhvervet på fluorescerende mikroskop af levende orme på dag 3 i voksenalderen. Billedet blev åbnet med Worm_align og linjer blev tegnet langs langsgående akse af ormene ved hjælp af Worm-align. (B) Skærmbillede af det samme billede som i (A), med eksempler kommenteret på god og dårlig tegning af linjerne langs aksen af ormene, ved hjælp af Worm-align. (C) Eksempler på linjer, der er tegnet oven på orme, og som kan stige til forkert justerede orme. Worm-align output af orme valgt i B. Billeder blev taget med en 20x mål på en omvendt widefield mikroskop (se Materialer tabel) med grøn fluorescens intensitet = 1, eksponering = 60 ms og rød fluorescens intensitet = 8, eksponering = 60 ms. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Eksempler på ormudjætning ved hjælp af Worm-align på krydsende orme. (A)Skærmbillede af et sammensat billede erhvervet på fluorescerende mikroskop af levende orme på dag 3 af voksenalderen dyr bærer transskriptionelle reporter fedt-7p:: GFP i tarmen og en rød co-markør i svængning (myo-2p::tdtomato). Krydsende orme er mærket "skærer1" og "skærer2", mens ikke overlappende orme er mærket "good3" og "good4". (B) Montage skabt af Worm-align, der repræsenterer rettede orme, der er valgt i (A). Det er bemærkelsesværdigt i montagen, at ormene 1 og 2 var skærer på det oprindelige billede (orme mærket som "skærer1" og "skærer2"). (C) Screenshot af QC tabellen fra Worm-align, som gør det muligt at få øje på tilfælde, hvor orme skærer. Længde: længden af roi-linjen; ormnummer: den rækkefølge, som linjerne blev trukket i; den sidste kolonne angiver, om der er en overlapning mellem ormen/den interesselinje, der er en anden orm. I dette eksempel overlapper ormen i det første rå (ormetal1) orme nummer 2, som angivet med tallet "2" i den sidste kolonne. (D) Skærmbillede af de linjer, der er tegnet med Worm-align på de fire orme, der er valgt i A. (E) Skærmbillede af de masker, der genereres af Worm-align på de fire orme, der er valgt i A, og som viser, hvordan maskerne for de to krydsende orme gengives. I dette tilfælde er to masker i stedet for en nu svarer til ormen "skærer1". Billeder blev taget med en 20x mål på en omvendt widefield mikroskop (se Materialer tabel) med grøn fluorescens intensitet = 1, eksponering = 60ms og rød fluorescens intensitet = 8, eksponering = 60 ms. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Den Worm_CP rørledning kvantificerer fluorescens så nøjagtigt som manuel kvantificering. Sammenligning af fluorescens kvantificering af unge voksne orme, der er fastgjort og farves for indholdet af lipiddråbe, med det grønne fluorescerende farvestof BODIPY ved hjælp af enten Worm_CP rørledning (A) eller manuel kvantificering (B). Lipiddråbeindholdet i WT og dbl-1 (nk3) blev overvåget ved fastsættelse og farvning af dyr med BODIPY, som intercalater i fedtsyrer af lipiddråber (se protokol A). Unge voksne dyr blev fastsat med 60% isopropanol og farves med BODIPY i 1 timer. Det samme sæt dyr blev kvantificeret enten ved hjælp af Worm_CP rørledning (se trin 7) eller ved manuel kvantificering i henhold til standardprocedurer17. A) Kvantificering af fluorescens ved hjælp Worm_CP rørledningen. WT: n=22 dyr, gennemsnitlig fluorescens= 1,016 (A.U) ± 0,206 SD; dbl-1(nk3):n=25 dyr, gennemsnitlig fluorescens= 0,8714 (A.U) ± 0,126 SD. Umisket t-test. B) Manuel kvantificering af fluorescens. WT: n=22 dyr, gennemsnitlig fluorescens = 1,048 ± 0,153 SD; dbl-1(nk3): n=25 dyr, gennemsnitlig fluorescens = 0,8632 ± 0,109 SD. Ikke-friskrevet t-test. (C, D) Repræsentativt eksempel eller Worm-Align-output for WT (C) og dbl-1(nk3) (D)dyr, der er rettet mod worm-align-rørledningen. Billeder blev taget med en 20x mål på en omvendt widefield mikroskop (se Materialer tabel) med grøn fluorescens intensitet = 2, eksponering = 60ms. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Eksempel på fluorescens kvantificering og tilpasning af levende orme fra fluorescensbilleder af levende orme med den transskriptionelle reporter hsp-70(C12C8.1)p::GFP efter varmechok. (A) Ved et kort varmechok (30 min. ved 34 °C) blev unge voksne orme genvundet ved deres dyrkningstemperatur (25 °C) og monteret derefter afbildet 3,5 timer efter varmechok. Omkring 30 orme blev kvantificeret efter varmechok ved hjælp af Worm-align rørledningen. (A-B) Eksempler på justerede orme, der ikke har været udsat for varmechok. (C-D) Eksempler på varmechokerede orme med hsp-70(C12C8.1)p::GFP ved hjælp af Worm-align. (E) viser GFP Gennemsnitsintensiteten (Worm_CP parameter: MeanIntensity_Threshold) af voksne WT-orme, der dyrkes, uden varmechok eller ved udsættelse for varmechok (34 °C i 30 min.). Billeder blev taget med en 20x mål på en omvendt widefield mikroskop (se Materialer tabel) med grøn fluorescens intensitet = 1, eksponering = 60ms; ingen HS: n=12, HS: n=32. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 1: Placering i FIJI, hvor makroen Worm-align kan findes, når den er installeret. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 2: Valg af mappe, der indeholder alle billeder taget med de samme indstillinger. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 3: Generering af 4 undermapper i outputmappen i FIJI. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 4: Tegning af en linje over bredden af ormen og kanalindstillinger for montagen. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 5: Eksempel på billedet med de anvendte indstillinger. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 6: Tegning af en linje langs længdeaksen af de orme, der er af interesse for at indgå i montagen og/eller kvantificeringen. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 7: Montage af de valgte orme i outputmappen under mappen "justeret". Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 8: Rydning af tidligere billeder fra tidligere analyse i Celleprofiler. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 9: Import af metadata til CellProfiler fra outputmappen Worm-align ved at vælge .csv undermappen Indstillinger. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 10: CellProfiler-rørledningen Worm_CP.cpproj bruger Lines_-billederne til at enkeltelægge de valgte orme (A) og producerer enkelt ormemasker af interesseormene (C). Rørledningen måler også baggrundsintensitet (B). Outlook af alle de parametre, der måles af pipelinen Worm_CP.ccproj, som eksporteres i en csv-fil (D). Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 11: Valg af outputfiler i "ExportToSpreadsheet i Worm_CP.cpproj-rørledningen. Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Worm-align er en FIJI-baseret billedbehandlingspipeline, der let genererer montager af brugervalgte orme, hvor orme rettes og justeres for at hjælpe med visuel sammenligning, klassificering og repræsentation. Selv om denne funktion er også tilbydes af nogle eksisterende værktøjer, især WormToolbox modul i CellProfiler7, Worm-align kræver forholdsvis lidt forudgående billedanalyse erfaring: Brugere behøver kun at spore de orme, de gerne vil vælge til montage (og analyse). Selv om det er nemt at spore ormene på de rå billeddata , især når en berøringsskærmscomputer eller -tablet er tilgængelig, er det altafgørende, at linjer tegnes korrekt langs ormenes længdeakse. Ufuldstændige linjer, der kun følger en del af ormen, vil resultere i delvise orme i montagen (dvs. orme manglende hoveder af hale ender) og delvis segmentering masker under CellProfiler analyse. Hvis linjer fra to individuelle orme krydser, behandles ormene heller ikke korrekt i ormenjusteringsmontagen samt til fluorescens kvantificering. Til kvalitetskontrol gemmes et overlejringsbillede af linjevalgene på det oprindelige billede i datamappen sammen med en QC-tabel. Fra disse kan problematiske linjer, der fører til forkert segmenterede orme, let identificeres og udelukkes fra montage og/eller efterfølgende analyse.
Selv om den direkte input fra eksperimentatoren i udvælgelsen af orme måske synes lidt tidskrævende, det præsenterer en klar fordel af arbejdsgangen i forhold til andre i eksperimenter, hvor orme fra forskellige udviklingsstadier er til stede i det samme billede: Orme kan vælges i løbet af "sporing trin", ved at skitsere kun de orme, der er i den rigtige udviklingsfase. Alternativt kan orme filtreres ved hjælp af output fra Worm_CP baseret på enten længden af sporingslinjen eller segmentmaskens område, begge pålidelige indikatorer for ormenes længde/størrelse. Velsagtens, machine-learning algoritmer kan kæmpe for at genkende orme fra forskellige udviklingsstadier, som deres størrelse og udseende i DIC billeder er så forskellige.
Produktionen af Worm-align kan bruges til efterfølgende kvantificering af fluorescensintensitet i enkelte orme, enten i FIJI direkte eller i andre billedanalysesoftwareplatforme. Vi demonstrerede dette ved at importere Worm-align output i en simpel CellProfiler pipeline (Worm_CP), som gør det muligt at kvantificere multi-kanal fluorescens intensitet i de enkelte orme, der blev valgt, mens du kører Worm-align pipeline. Vi valgte denne tilgang på grund af cellprofiler-softwarens fleksibilitet: Det er ligetil at indarbejde yderligere moduler i rørledningen for at analysere yderligere funktioner i de enkelte orme (f.eks. måling af størrelsen af lipiddråber eller stressgranulat, kerner, mitokondrier). Desuden kan de enkelte orm masker potentielt bruges til at træne en ny model for WormToolbox7.
De vigtigste fordele ved denne metode er, at det er hurtigt og kræver en simpel orm montering set-up. Denne metode er hurtigere, da det ikke kræver at bruge tid på at lære software drift eller kører uddannelse sæt gennem en maskinealgoritme 7. Desuden virker denne metode med enten levende eller faste orme simpelthen monteret på regelmæssige agarose puder. Der er ingen grund til at anvende komplekse mikrofluidiske kamre, som er udviklet i andremetoder 5,6.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Dr. Christian Lanctôt på BIOCEV (Prag, Tjekkiet) for at lære os munden mikropipette teknik til at montere faste orme og Dr. Fatima Santos og Dr. Debbie Drage for at dele sikkerhed setup på munden mikropipette. Vi takker også Francesca Hodge for at have redigeret manuskriptet, Sharlene Murdoch og Babraham Institute Facilities for deres støtte. OC understøttes af ERC 638426 og BBSRC [BBS/E/B000C0426].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | MeLford Biolaboratories Ltd | MB1200 | |
| Aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177 | to create mouth micro-pipette (see protocol step) |
| Beaker | |||
| BODIPY 493/593 | Invitrogen | D3922 | stock solution prepared in DMSO at 1mg/mL |
| Centrifuge | MSE MISTRAL 1000 | ||
| Conical flask | |||
| Cover Slip | VWR | 631-0120 | |
| Filter 0.2 µm for Syringe | Sartrius | 16534-K | Filter, to create mouth micro-pipette (see protocol step) |
| Isopropanol | |||
| Levamisole hydrochloride | Sigma-Aldrich | BP212 | 3mM solution prepared by dissolving levamisole in M9 |
| Liquid Nitrogen | Liquid Nitrogen facility | ||
| Low Retention Tip 1000µL | Starlab | S1182-1830 | |
| Methanol | VWR chemicals | 20847.307 | |
| Microscope Slides, MENZEL GLASSER | Thermo Scientific | BS7011/2 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Microwave Oven | Delongi | ||
| M9 | prepared in the lab according to15 | ||
| 9cm NGM Plates | prepared in the lab according to15 | ||
| PBS | prepared in the lab | ||
| Protein LoBind Tube 2ml | Eppendorf | 22431102 | |
| Triton | SIGMA | T9284-500ML | |
| Ring Caps | SIGMA-ALDRICH | Z611247-250EA | glass micro-capillary tubes to create mouth micro-pipette (see protocol step) |
| Rotator | Stuart Scientific | ||
| Silicone tubine translucent | Scientific Laboratory Suppliers | TSR0600200P | 6.0 mm x 2.0 mm wall - to create mouth micro-pipette (see protocol step) |
| Sterilized H2O | MilliQ water autoclaved in the lab | ||
| 10µL Tips | Starlab | S1120-3810 | |
| 200µL Tips | Starlab | S1120-8810 | |
| 1000µL Tips | Starlab | S1122-1830 | |
| 15mL Centrifuge Tube | CORNING | 430791 | |
| Vecta Shield | VECTOR | 94010 | antifade mounting medium (H-1000) without DAPI |
References
- Shave, D. D., Greenwald, I. OrthoList: A compendium of C. elegans genes with human orthologs. PLoS One. 6 (5), 20085 (2011).
- Stiernagle, T.
- Letizia, M. C., et al. Microfluidics-enabled phenotyping of a whole population of C. elegans worms over their embryonic and post-embryonic development at single-organism resolution. Microsystems & Nanoengineering. 4 (6), (2018).
- San-Miguel, A., Lu, H. Microfluidics as a tool for C. elegans research. WormBook. , (2013).
- Atakan, H. B., et al. Automated Platform for Long-Term Culture and High-Content Phenotyping of Single C. elegans Worms. Scientific Reports. 9 (1), 120-135 (2019).
- Atakan, H. B., Cornaglia, M., Mouchiroud, L., Auwerx, J., Gijs, M. A. M. Automated high-content phenotyping from the first larval stage till the onset of adulthood of the nematode Caenorhabditis elegans. Lab on a Chip. 19 (1), 120-135 (2018).
- Wählby, C., et al. An image analysis toolbox for high-throughput C. elegans assays. Nature Methods. 9 (7), 714 (2012).
- Morimoto, R. I. The heat shock response: systems biology of proteotoxic stress in aging and disease. Biology. 76 (9), 91-99 (2012).
- Guisbert, E., Czyz, D. M., Richter, K., McMullen, P. D., Morimoto, R. I. Identification of a tissue-selective heat shock response regulatory network. PLoS Genetics. 9 (4), (2018).
- Klapper, M., et al. Fluorescence-based fixative and vital staining of lipid droplets in Caenorhabditis elegans reveal fat stores using microscopy and flow cytometry approaches. Journal of Lipid Research. 52 (6), 1281-1293 (2011).
- Wählby, C., et al. and low-throughput scoring of fat mass and body fat distribution in C. elegans. Methods. 68 (3), 9 (2014).
- Kurimoto, K., Yabuta, Y., Ohinata, Y., Saitou, M. Global single-cell cDNA amplification to provide a template for representative high-density oligonucleotide microarray analysis. Nature Protocols. 2 (3), 739-752 (2007).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18, 529 (2017).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome. 7, 100 (2006).
- Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).
- Casanueva, M. O., Burga, A., Lehner, B. Fitness trade-offs and environmentally induced mutation buffering in isogenic C. elegans. Science. 335 (6064), 82-85 (2012).
- Clark, F. J., Meade, M., Ranepura, G., Hall, D. H., Savage-Dunn, C. Caenorhabditis elegans DBL-1/BMP Regulates Lipid Accumulation via Interaction with Insulin Signaling. G3. 8 (1), Bethesda. 343-351 (2017).
