Summary
ワームアライン/Worm_CPは 、Caenorhabditis elegans サンプルをまっすぐにして整列させ、事前のトレーニング手順を必要とせずにワーム画像ベースのアッセイを採点するために使用できるシンプルなFIJI /CellProfilerワークフローです。生きた動物の熱ショック誘発発現や固定試料中の脂質滴の定量化に、ワームアライメント/Worm_CPを適用しました。
Abstract
固定または麻酔付き C. elegans から画像データを取得する際に頻繁に発生する問題は、ワームが近隣のワームと交差してクラスター化することです。この問題は、ワームの密度の増加に伴って悪化し、イメージングと定量化の課題を生み出します。私たちは 、C.エレガン スの生画像データからユーザーが選択した、まっすぐに整えられた、整列したワームの単一または複数チャネルのモンタージュを生成するために使用できるFIJIベースのワークフロー、ワームアライメントを開発しました。ワームアラインは、ユーザーまたは解析アルゴリズムの事前トレーニングを必要としない、シンプルでユーザーフレンドリーなワークフローです。ワームアライメントで生成されたモンタージュは、ワームの目視検査、分類および表現を支援することができます。さらに、Worm-alignの出力は、フィジーの直接または他の画像解析ソフトウェアプラットフォームで、単一ワームにおける蛍光強度の後続の定量に使用することができます。このことを示す方法は、ワームアライン出力を、オープンソースの CellProfiler ソフトウェアを使用するパイプラインであるWorm_CPにインポートすることです。CellProfilerの柔軟性により、高コンテンツスクリーニング用の追加モジュールを組み込むことが可能です。実際の例として、2つのデータセットにパイプラインを使用しました:最初のデータセットは、熱ショック誘導可能な遺伝子 hsp-70のプロモーターの制御下にある緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現するヒートショックレポーターワームの画像であり、2番目のデータセットは、蛍光色素を有する脂肪店に染色された固定ワームから得られた画像である。
Introduction
比較的単純な生物である線虫C.エレガンスは、ヒトの病気を研究するのに非常に有用なモデルシステムです。C.エレガンスゲノム中の遺伝子の約38%はヒト1,2に機能的な対応を有する。C.エレガンスのユニークな特徴の1つは、光学的に透明であり、組織全体の蛍光レポーターの(サブ)細胞発現に関するin vivo情報に簡単にアクセスできる点です。これにより、C.エレガンスは、画像ベースのプラットフォーム3を使用して、コンテンツの多い画面のための主要なモデル生物になります。しかし、これらの研究を複雑にすることが多い問題の1つは、ワームの密集した集団をイメージングすると、交差してクラスター化する傾向があり、個々のワーム間の比較が困難になり、下流の画像分析と定量が曇るということです。
この問題を解決する既存のソリューションは、通常、マイクロ流体セットアップ4を使用するなど、培養およびイメージングプロトコルの最適化に依存しており、単一のワームを別々の画像5,6にキャプチャできるようにします。他の人は、束の集団であっても、単一のワームの認識を可能にする機械学習アルゴリズムを適用しています。後者の優れた例は、オープンソース画像解析プラットフォームCellProfiler7のモジュール拡張であるWormToolboxです。WormToolbox は、C. elegansの分析に高スループットと高コンテンツソリューションを提供し、追加の分析モジュールを簡単に含めることができるため、CellProfiler に含めることによって明らかにメリットを得ています。ワームツールボックスには事前にトレーニング済みのモデル (DefaultWormModel.xml が付属していますが、通常は新しいアプリケーションごとに機械学習アルゴリズムの再トレーニングが必要です。これを行う方法についてのオンラインチュートリアルは、Github (https://cp-website.github.io/Worm-Toolbox/) で入手できます。それにもかかわらず、WormToolboxをインストールして使用するには、初心者のユーザーに多大な時間投資が必要です。
ここでは、文化に対するシンプルでコスト効果の高いプロトコル、および C.エレガンスの画像集団について説明します。取得した画像の個々のワームの評価を可能にするために、ワームアライメントという名前の単純なオープンソースのFIJIベースのワークフローを開発しました。ワームアラインは、矯正された、整列したワームのシングルまたはマルチチャネルモンタージュを生成するために使用することができます。まず、ユーザーは、ヘッドからテールに線を引くことによって、解析のために個々のワームを手動で選択する必要があります。ワームアライメントは、この選択を使用して、選択したワームを概要イメージから切り取り、選択したワームをまっすぐにして整列して、視覚的な比較とプレゼンテーションを容易にするモンタージュを生成します。
さらに、Worm-alignの出力は、フィジーの直接または他の画像解析ソフトウェアプラットフォームで、単一ワームにおける蛍光強度の後続の定量に使用することができます。このことを示す方法は、ワームアライン出力を、オープンソースの CellProfiler ソフトウェアを使用するパイプラインであるWorm_CPにインポートすることです。CellProfilerの柔軟性により、高コンテンツスクリーニング用の追加モジュールを組み込むことが可能です。Worm_CPパイプラインを使用して、高温8などのストレッサーによって誤って折り畳まれるタンパク質を再折する十分に保存された保護機構であるヒートショック応答を定量化しました。具体的には、ヒートショック誘導性遺伝子のプロモーターであるhsp-70(C12C8.1)が緑色蛍光タンパク質(GFP)9を駆動する、統合マルチコピートランスジーンを運ぶワームにパイプラインを適用した。また、C.エレガンス10の主な脂肪貯蔵小器官である脂質滴(LD)を視覚化する蛍光色素で標識された固定動物に対するWorm_CPパイプラインを使用した。このワークフローには WormToolBox が提供するスループットはありませんが、画像ベースのC. elegans実験の視覚的な表示と分析のためのユーザーフレンドリーで簡単な代替手段です。
Protocol
1. 脂質滴用蛍光色素(BODIPY)を用いた脂肪分イメージング用ワームの固定
- 標準的な手順2に従って漂白することによってC.エレガンスの同期された集団を準備する。約1,000 L1ステージワームを9cm線虫増殖培地(NGM)プレートにプレートします。
注: 処理時にワームが失われたため、最後に実際に定量化するよりも多くのワームが準備されています。 - 若年成人期(約50時間ポストL1めっき20°C)で動物をイメージするには、円錐管で15mLのM9で各9cmのプレートを洗浄し、252 x g で遠心分離機を1分間洗浄し、上清を取り除きます。
- 洗浄を繰り返し、ワームのペレットの上にM9の1 mLを残します。
- 2 mL 低タンパク質結合マイクロ遠心分離チューブにワームを含むM9の1 mLを、低保持のヒントを使用して移動します。
- マイクロ遠心分離機で252 x g で1分間スピンダウンし、上清を取り除き、チューブの底部にあるワームペレットに触れないように注意してください。
- 4,4-ジフルオロ-1,3,5,7,8-ペンタメチル-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン(BODIPY)染色10 を使用して脂肪含有量を監視するには (材料表)、3分11のワームペレットに0.5mLのイソプロパノールを加えるか、10分間氷冷メタノール2mLを添加して、ワームを修正します。両方の手順では、チューブを30sごとに反転します。
注意:メタノールが選択された固定試薬である場合、このステップは、その毒性のためにヒュームフードで行われなければなりません。 - ワームペレットに触れることなく、できるだけ多くの固定剤を除去し、M9の1 mLを追加します。ワームは3-5分間チューブの底に落ち着くようにしましょう。
- M9の1 mLで再び洗い、ワームが沈降させ、チューブに約50μLを残して上清を取り除きます。クランプを使用してチューブを固定します。
- 密閉チューブを液体窒素で突っ込み、次いで約40°Cの温水浴に入れて、ワームを凍結クラックします。
- ステップ 1.9 をもう一度繰り返します。
- 0.5 mLの BODIPY を M9 で希釈して、最終濃度の 1 μg/μL で加え、室温で 1 時間回転器に置きます。
- 1時間後、ワームは3-5分チューブの底に落ち着きます。
- 上清を取り除き、M9の1mLを加えます。
- ワームは底に落ち着き、上清を除去してみましょう。
注: また、252 x g で 1 分間スピンダウンしても、これは形態に影響を与えないようです。 - 0.5 mL の M9 を追加します。
注:固定剤が60%イソプロパノールである場合、ワームは48時間以内にのみ利用できます。固定剤がメタノールである場合、ワームは24時間以内に利用されるべきです。
2. ワームをマウントするためのアガロースパッドの準備
注:アガロースパッドを準備する上で重要なステップは、通常の厚さのパッドを取得することです。さもなければ、パッドを横切るワームは異なる焦点面にあり、より広い視野の焦点を当てた画像を得るのは難しい。
- ビーカーまたは円錐形フラスコで殺菌されたH2Oの10 mLにアガロースの0.2gを加えることによって2%アガロースパッドを準備する。アガロースが沸騰し始めるまで電子レンジで30s熱します。
注:バブルが現れたらすぐに過熱して停止しないでください。それ以外の場合は、アガロースの粘度を増加させ、所望のパッド厚さを達成することが困難になります。 - アガロースが溶けたら、1000 μLピペットチップを使用して、顕微鏡ガラススライドの中央に溶けたアガロースの滴を塗布し、最後に切り取ります。すぐに、しかし繊細に、アガロースドロップに非常に近い別のガラススライドを保持し、最良の顕微鏡結果のために規則的な厚さのパッドを形成するためにアガロースにそれを解放します。
注:高さから上のスライドを放すと、泡が形成されるだけでなく、パッドが不均一になります。あるいは、パッドでスライドを横切る2枚のガラススライドを、各スライドにテープの薄い層で使用することもできる。 - 最低2~3分経過した後、上のスライドをそっと取り外します。上のスライドの側面を使用して、パッドをトリミングして正方形にします。使用前にパッドが乾燥するのを防ぐために、5分以内にワームをマウントします。
3. イメージング用に固定ワームを取り付ける
- ブンゼンバーナーの炎の中に薄いガラスキャピラリーを伸ばして口マイクロピペットを作る(図1A)。炎の中で伸展した後、毛細管を2つに分割します(図1B)。最も適切な、通常最も長いを選択し、水を吸引しようとすることによって毛細血管の端が開いているかどうかをテストします。
注:液体が毛細血管に入らない場合は、薄すぎたり、ブロックされたりします。毛細血管の端をハサミでそっと切り、穴が大きすぎるとワームが吸引されるように切り過ぎるのを避けます。 - ステップ3.1のガラスキャピラリーをキャピラリーアダプター(図1C)に差し込み、6mmシリコーンチューブに接続し、6mmシリコーンチューブのもう一方の端を0.2 μmのフィルターに差し込み、もう一方の端にある3mmシリコーンチューブに取り付けます(図1C)。1 mLフィルターチップ(図1C)を3mmシリコーンチューブの自由端に差し込み、液体を吸引します。
注:実験者の口と毛管の間に0.2 μmのフィルターが加えられたので、実験者の安全性を最大限に高めます。同様の溶液は、マウス胚12を処理するために使用される口のマイクロピペットに使用される。口マイクロピペットがもはや液体を吸引していない場合は、フィルター(通常は数ヶ月ごとに)を変更します。 - 解剖顕微鏡下で口マイクロピペットを用いて、固定ワームのワームペレットの周りにできるだけ多くの液体を取り除く(図2)。
注:手動マイクロピペットを使用してピペットの上澄み出しは、可能な限り多くの上清を除去するために、ステップ3.1〜3.3の口のピペットの代替として使用することができます。6 μLの取り付け媒体を追加します。しかし、パッド内の過度の液体がまばらなワーム密度を作り出し、イメージングの時間が長くなるため、この方法は効率的に機能しないことがわかります。ステップ 3.6 を再開します。チューブの底を見て、ピペットがワームを吸引しないことを確認してください。 - 10 μLの取り付け媒体 (材料表) をチューブの底部に素早く追加します。
- 洗浄剤(0.01%トリトン)の痕跡をPBSで10μLの先端に洗い流し、プラスチックピペットチップの側面にワームが付着するのを防ぎます。先端の端をハサミで切ります。
- ステップ2.3で調製したアガロースパッドにワームを含む取り付け媒体の8 μLを移します。顕微鏡下で、虫の重なりを避けるために、スライドを穏やかに振ります。
- アガロースパッドの取り付け媒体のドロップを18 mm x 18 mmのカバースリップで覆います(図3)。
注: 小さなカバーリップは、ワームへの圧力が小さいため、推奨されます。カバースリップをピンセットで保持し、カバースリップの1つの端をアガロースパッドに当て、ピンセットでカバースリップを静かに堆積させる前に適用します。
4. イメージング用のライブワームの取り付け
注:ライブワームをイメージするには、パッドに固定する必要があります。これを達成する1つの方法は、ニコチン受容体アゴニストでそれらを麻痺させるです: レバミゾール (材料のテーブル).
- ステップ2.3で作成したアガロースパッドにM9に溶解した3mMレバミソールのピペット3-4 μL。
注:ワームが互いの上にはないが、ワームがパッド上であまりにもまばらであることをあまりにも多くの液体ではない十分な液体量があるはずです。経験豊富なワームピッカーはレバミソールの3 μLを使用することができます。経験の浅いピッカーは、レバミソールが完全に蒸発しないように、レバミソールの大量を追加する必要があるかもしれません。 - レバミソールのドロップに条件ごとに30-50ワームを選びます。
- アガロースパッドのレバミソールのドロップを18 mm x 18 mmのカバースリップで覆います。1時間以内に画像ワームは、麻痺剤が最終的にワームの死につながるように。
5. 蛍光顕微鏡によるイメージングスライド
- 均一な厚さのアガロースパッドを使用して、例えば蛍光顕微鏡の20倍の目的を持つ6 x 6または7 x 7の大きな画像を使用して、スライド上のすべてのワームを一度に画像化します。パッドの厚さが均一でない場合は、同じスライドのいくつかの小さい3 x 3または4 x 4のイメージを取得します。
- すべての条件で蛍光強度と露光時間に同じ設定を使用します。各設定を、明るい強度のスライドに合わせて調整し、ピクセルの彩度がないようにします。画像の取得に関する具体的な手順については、顕微鏡メーカーの指示に従ってください。
6. ワームアライメントFIJIパイプラインを使用して、単一ワームのモンタージュ画像を作成する
- https://imagej.net/Fijiからオープンソース画像解析ソフトウェアパッケージFIJI13/ImageJ14 をインストールします。以前にインストールした FIJI が使用可能な場合は、マクロで使用される関数の一部 (表関数など) で必要とされるよう、バージョン 1.52a 以降に更新されていることを確認してください。ワームアライメントマクロを Github: https://github.com/hannekeo/Worm-alignからダウンロードします。
- フィジーを開き、ワームアラインマクロを実行します。[プラグイン] |をクリックしてワーム整列を実行するマクロ|フィジーのメインメニューバー(図S1)で実行します。次に、コンピュータ上でワームの align.ijmスクリプトを探します。
- マクロは、イメージの場所を指定して初期化します。このパイプラインは、単一チャネルとマルチチャネルの両方の蛍光画像で動作します(図S2)。入力フォルダを選択すると、マクロはすべての結果が保存される出力フォルダを自動的に生成します(図 S3)。
注 : 他のファイル形式が存在するとマクロがクラッシュするので、選択したフォルダに画像ファイルのみが含まれていることが重要です。理想的には、同じ顕微鏡設定で撮影された画像をグループ化するだけです。ワームアライメントは、nd2、czi、tif、rgb、jpg、pngなど、さまざまなファイル形式を受け入れます。出力フォルダの名前は入力フォルダと同じで、後置として「_output」が追加されます images_output。出力フォルダーには、データを保存する 4 つのサブフォルダーが含まれます。 - マクロが入力フォルダーの最初の画像を開き、モンタージュを生成する設定を抽出する代表的なイメージとして使用するようにします。
注: Worm-align は、入力フォルダ内の最初のイメージを自動的に選択して、フォルダ内の他のすべてのイメージに適用される設定を生成します。別の画像がデータセットの代表であると見なされる場合は、画像のコピーを入力フォルダーに保存し、リストの一番上に表示されるように名前を変更して、このイメージを選択します (例: '0_RepresentativeImage')。 - 直線描画ツールを使用して、ワームの幅を横切る線を描画し (図 S4)、この線の長さを使用して、単一のワームのトリミング領域の高さを決定します。各チャンネルに対して、名前、ルックアップ テーブル (LUT)、強度設定 (B&C) 、およびモンタージュに含めるかどうかを指定します (図 S4)。
注: これらのパラメータは、出力フォルダのCellProfilerサブフォルダにある設定ファイル「設定.csvに記録され、保存されます。 - すべての設定がキャプチャされると、ユーザーは、適用された設定の適用後に画像がどのようなものになるかを示します(図S5)。設定が十分であれば、トップボックスにチェックを入れます。モンタージュ生成のオプションを選択する(必要でない場合はティックを削除する):1.1.1つの画像ごとに選択したワームのモンタージュを生成するか、2.入力フォルダ内のすべての画像で選択されたすべてのワームを結合して1つのモンタージュに結合する組み合わせモンタージュを生成します。 [OK] を クリックして、残りのマクロを実行します。
注: [OK] をクリックする前にトップ ボックスにチェックが付いていない場合、マクロは設定を再実行するため、画像の設定を最適化できます。 - ワーム位置合わせパイプラインが入力フォルダ内のすべてのイメージを開くようになりました。各画像について、モンタージュに含まれるすべてのワームの縦軸に線を引き、(フィジーのメインメニューバーの)「セグメント線」ツールを使用して、モンタージュや定量(図4 および 図S6)に含めます。ワームの適切な位置合わせを確実にするために、頭から端まで一貫して線を引き(またはその逆)、およびワームの全長に沿って線を引きます( 図4Bの「良い」と「悪い」線の描画の例を参照)。
- [Ctrl+T] をクリックして各行を ROI マネージャに追加します。行の ROI のコレクションは'data' サブフォルダに保存されます。このフォルダには、線を示す元の画像のコピーとワームの数も含まれています。線は、Glasbey_on_dark参照テーブルで色分けされます。まっすぐにしたワームのイメージは、出力フォルダの single_worms サブフォルダに保存されます。さらに、このプロトコルのステップ 6.6 で選択した場合、Worm-align は、入力フォルダー内のすべての概要イメージまたは/またはすべての概要イメージについて選択されたすべてのワームのモンタージュを生成します ( 図 4C および 図 S7を参照)。これらのモンタージュは、出力フォルダの'aligned' サブフォルダにあります。
7. 自動化されたCellProfilerパイプラインでワームアライメントからの出力を使用して単一ワーム蛍光強度を分析する
- ワームアライメント出力のダウンストリームデータ処理と分析のために、オープンソースの画像解析ソフトウェアパッケージ 'CellProfiler15,16をhttps://cellprofiler.org/からダウンロードしてインストールします。GitHub からWorm_CP.cpprojパイプラインをダウンロードhttps://github.com/hannekeo/Worm-align
注: ここで説明するサンプル パイプラインは CellProfiler2.2.0 を使用して構築されており、以降のバージョンの CellProfiler では実行されない可能性があります。 - Worms_CP.cpprojパイプラインを開始する前に、予期されるすべての出力イメージが Worm-align 出力フォルダの CellProfiler サブフォルダー (元のイメージの処理済みコピー(名前: Original_)、ワーム集団のバイナリイメージマスク(名前: Mask_)、選択したワーム(名前:Lines_)に描画された線のラインマスク、および元の画像内に存在する各チャンネルを表す1つの画像(チャンネル番号によって名前が付けられた)であることを確認してください。
- 単一ワームの蛍光強度を定量化するには、Images 入力モジュールをクリックし、単にCellProfiler出力フォルダを「ここにファイルとフォルダをドロップする」と表示されているウィンドウにドラッグします。以前の分析から画像の一覧が表示されている場合は、まず、ウィンドウ内を右クリックし、[ファイルリストのクリア] を選択して、これらを削除します。画像リストから 'Settings.csv' ファイルを除外するには、フィルタ設定に 'イメージのみ' または 'カスタム' を選択し、'拡張子が tif、tiff、ome.tif、または ome.tiff を選択します (図 S8)。
- メタデータ入力モジュールをクリックします。2 番目の抽出方法では、黄色のフォルダーをクリックし、WormAlign出力フォルダー内のCellProfilerサブフォルダーを見つけます (図 S9)。CSV ファイル内のメタデータをイメージ (チャンネル メタデータ) に一致させることにより、設定.csvファイルを選択し、ファイル内の設定を CellProfiler 出力にリンクします。
- NamesAndTypes入力モジュールをクリックし、定量化する元の画像のチャンネルごとに新しいイメージを挿入します。
注: この例のパイプラインには、ワームマスク、2 つのカラーイメージ、ラインマスクとオリジナルイメージ、3 つのグレースケールイメージ(緑と赤のチャンネル)が既に存在します。元の画像のチャンネル数がサンプル画像より多いか少ない場合、このモジュールのリストを調整する必要があります。 - すべての列ラベル/マスク/ワームのイメージの名前が正しいことを確認します。
注: 1 行のイメージの名前はすべて、分析する同じ初期イメージに対応している必要があります。画像解析プロセス中に間違いが発生すると、出力イメージの一部が欠落し、3 列のラベル/マスク/ワームの下の名前が各行の同じ初期イメージに対応しなくなります。この場合は、間違いがどこにあるかを見つけてください。 - 出力 設定を表示 を押して、Cellprofiler からの出力を保存するフォルダを選択します。
- [ テスト モードの開始]をクリックします。テスト モードになったら、パイプラインの設定をデータセットの最初のイメージに適用して 、( パイプライン内のすべてのアクティブなモジュールを実行する)、または ステップ (パイプラインを 1 つのモジュールを一度に実行する) をクリックして、その設定を再確認します。
注: テスト モードでは、 エクスポート ToSpreadsheet モジュールがパイプラインに存在し、アクティブな場合でも、抽出された測定値はエクスポートされません。 - パイプラインが必要な処理を実行したら、[テスト モードの終了] をクリックし、[イメージの分析] をクリックします。現在構成されているように、Worms_CPはMask_画像を使用して、ラフなワームマスクとLines_画像(図S10A)をセグメント化して、選択したワームを単一に切り取り、単一のワームマスク(図S10C)を生成し、(2)特定されマスクされたワームの入力画像に存在するすべてのチャネルの蛍光強度を測定する。パイプラインはまた、背景強度を測定し、それに応じてすべての画像を修正することができます(例えば、Intensity_MeanIntensity_green_threshold、(3)選択されたワームのサイズを測定し、(図S10D)すべての測定されたパラメータをエクスポートします。
- 選択した出力フォルダーに保存される 2 つの csv ファイル .csv.csv および .csv行 から構成されるWorm_CP出力を開きます ( 図 S11を参照)。これらのファイルは、後処理とレポートのためにExcelまたはR(スタジオ)で開くことができます。画像データごとに追加の出力が必要な場合は、パイプラインの ExportToSpreadsheet モジュールで選択できます。
Representative Results
このプロトコルに記載された方法に従った C.エレガンス の培養およびイメージングは、ワーム集団の大規模な概観画像を生成する。これらの画像からワームの目視検査と分類を容易にするために、ワームアラインを開発しました。ワームアラインは、単純で使いやすいフィジースクリプトで、矯正された、整列したワームのモンタージュを作成するために使用できます。ワームは、ワームの縦軸に沿って線を引くことによって、概要画像から選択されます。選択した各ワームには番号が割り当てられ、トリミングされてまっすぐになり、モンタージュに追加されます。モンタージュは、画像ごとに生成することも、元の入力フォルダからのすべての画像を組み合わせることもできます。
予想通り、パイプラインの出力は、画像の上に描画される線の品質に大きく依存します。この点を説明するために、 図 4 に、いくつかの行の例と、それらの Worm-align からの出力を示します。頭から尾の先端までの完全なラインは、適切に整列したワーム(「良い」とラベル付け)を生成します。 図 4 は、Worm-align の実行中のトレースの不正確さが、アライメントの出力にどのように影響するかを示しています。 図 4Cに示されている、説明付きのモンタージュから、次のエラーがワームの適切な配置を妨げるため、注意が必要です。
- 頭から尾までのワームの一貫性のないトレース(「テールからヘッド」とラベル付け)。これにより、ワームはアライメント内の異なる方向(すなわち、尾から頭、頭から尾)に向いています。
- 不完全なトレース (「不完全」と表示されます)。これにより、モンタージュのトリミングのためにトレースされたワームの部分のみが得られます。
- 1 つのトレースに複数のワームを含む ("2 つのヘッドを持つワーム" と表示されます)。これにより、ワームと近隣のネイバーがモンタージュの同じパネルに挿入されます。
- 画像にランダムな線を追加する("ランダム"と表示)。これにより、モンタージュにランダムパネルが挿入されます。
モンタージュの作成では、2 つの個々の線が交差するか(「交差」とラベル付けされた)、またはワームの両端で結合されている場合("joined"とラベル付け)、各ラインが個々のワームの全長をトレースする限り、問題ではありません: ワーム整列スクリプトは、各ラインのROI、作物、直線を個別に選択し、最終モンタージュの各パネルが単一のトレースラインを表すようにします。しかし、交差するワームの場合、モンタージュ内のワーム"intersecting1"とワーム"intersecting2"に対して完全な長さをまっすぐにしたワームが現れますが( 図5A-Bを参照)、これらのワームが元の概要画像で互いに交差していることは明らかに顕著です。したがって、'data' サブフォルダ (図 5A)にあるオーバーレイ画像と、モンタージュ内の個々のワームのパネルから、交差する線の視覚的な識別が可能であると結論付けることができます (図 5B)。さらに、ワーム/ラインの重複は、Worm-alignによって処理された各イメージに対して生成された品質管理(QC)テーブルから識別され、データサブフォルダに保存されます。この表には、画像に描画された線の ROI ごとに 3 つのパラメータが記録されています ( 図 5Cを参照): これらの中で、 長さは 、線の ROI の長さを示します。 ワーム番号 は、概要画像に線が描画された順序を示します。最後の列は、対象のワーム/ラインと、画像で選択された他のワーム/ラインとの間に重複があるかどうかを示します。この列の番号が重なる場合は、[ ワーム番号 ] 列に表示されている番号とは異なります。オーバーレイ画像と組み合わせて、QCテーブルは、モンタージュや定量から除外されるべきワームに関する学習した決定を行うために研究者を支援する必要があります。
ワームアラインの出力は、単一ワームにおける蛍光強度のその後の定量に使用できます。フィジーでは、ライン ROI を使用して元の画像データの蛍光強度を測定できます。あるいは、ワームアライン出力をサードパーティの画像解析ソフトウェアにインポートすることもできます。この例では、CellProfiler で生成したパイプラインである Worm_CP に 2 つのデータセットのワームアライメント出力をインポートします。Worm_CPはワームアライメント出力フォルダの 'CellProfiler' サブフォルダ内のファイルを使用して、ワームアライメントマクロの実行中に選択された個々のワームのセグメンテーションマスクを微調整します。具体的には、ライン マスク (名前: Lines_) を使用して、バイナリ マスク (名前: Mask_) に見られるワームの集団から選択したワームを分離します。概要画像上で交差する線 (図 5A) は、モンタージュの生成に問題はないが、Worm_CPパイプラインでは問題が生じます。これがなぜそうなのかは、図 5 D-Eに示されています。Worm_CPは、個々のワームの識別を支援するために、個々の ROI ではなく、ライン マスク (図 5D)を使用します。ワームalignの実行中に 2 番目に描画される交差する線は最初のラインに重ね合わされるので、この線に沿った強度は、ライン 1 と 2 が重なるビットを含む ROI2 の強度になります。その結果、CellProfiler は 1 つのオブジェクトとしてライン 2 をセグメント化しますが、line1 は line2 と交差する場所で分離された 2 つのオブジェクトとして分割されます。これは、CellProfiler がワーム 'intersecting1' 用に 2 つの (半分) のワーム マスクを生成することを意味します (図 5E)。これらのイベントを最終的な解析から除外する最も簡単な方法 (必要な場合) は、QC テーブル (データ サブフォルダー) からワーム数の交差するワームを特定し、CellProfiler 出力ファイルからこれらのワームの測定値を削除することです。「フィジーと CellProfiler で必ずしも同じ番号が割り当てられる」という問題点に注意してください: CellProfiler 出力でフィジーワーム番号を識別するには、'Lines.csv' 出力ファイルのIntensity_Max_Intensity値を確認してください。「Lines.csv」テーブルに 2 回以上画像に表示されるIntensity_Max_Intensity値は、そのライン ROI が破損したワームマスクを生成することを示します。
個々のワームマスクがセグメント化されると、Worm_CPはすべての記録されたチャネルについて選択したワームの蛍光強度を測定できます。すべての測定値は元の(生の)画像データから取得されますが、CellProfiler は自動的に 0 から 1 のスケールでピクセル強度を再スケールします。これは、生のピクセルの強度の値を画像の最大ピクセル強度で割ることによって達成されます。8 ビット イメージの場合、この値は 255 であり、16 ビット イメージの場合は 65535 です。したがって、CellProfiler の強度値は、生画像データと同等の値を取り戻すために、可能な最大強度値を掛ける必要があります。Worm_CP出力は、選択した出力フォルダーに保存される 2 つの csv ファイルである「worms.csv」と「行.csv」で構成されます。これらのファイルを検査している間、CellProfilerが蛍光強度に関連する多数のパラメータを記録していることは明らかです。このうち、Intensity_IntegratedIntensityは、ワームあたりの全蛍光(すなわち、個々のワームのマスクを仮定するすべてのピクセル内の蛍光強度の合計)に相当する。Intensity_MeanIntensityパラメータは、個々のワーム内の平均蛍光強度(すなわち、個々のワーム内に含まれるすべてのピクセルのピクセルあたりの平均蛍光強度)を指します。ワームマスクのセグメント化における(小さな)エラーの発生が時折起こるため、2つの条件間で個々のワームの蛍光測定値を比較する際にMeanIntensity測定を使用することをお勧めします。バックグラウンド蛍光を定量測定から抑制したい場合は、MeanIntensity_Thresholdという名前の測定を使用してください。
我々は、Worm_CPパイプラインを用いて、脂質滴(LD)に組み込まれた蛍光色素で標識された固定動物の蛍光強度を定量化した(図6)。ワームアライメント/Worm_CPパイプラインから蛍光定量を検証するために、WORM-align/Worm_CPパイプラインまたはフィジー/ImageJの手動定量化により、BODIPYデータセットから同じワームセットの蛍光強度を定量しました。手動定量は、各ワームを周回し、すべての画像の暗い背景ゾーンを回すことによって、フィジー/ImageJで行われました。蛍光強度をROIマネージャで測定し、画像背景について測定した値を各ワームのワーム蛍光測定から差し引いた、17を説明した。野生型(WT)N2ワームを dbl-1(nk3) 変異体と比較し、脂質滴含有量が18を減少させた。予想通り、緑の蛍光強度は、両方の方法でWTと dbl-1(nk3) ワームの間で有意に減少する(図6A,B)。アラインメントされたワームの例は 、図6C,Dで観察できます。脂質滴の含有量は、手動定量化を使用してWTと dbl-1(nk3) の間で17%(p値<0.0001、未対t検定)、およびWorm_CPパイプラインを使用して14%(p値=0.0051非対t検定)減少する。 dbl-1(nk3) で観察された脂質滴量の減少は、両方の定量方法で、文献18に従う。これは、Worm_CP CellProfiler パイプラインを使用した取得した蛍光画像の定量が手動定量に匹敵することを示しています。
また、熱ショック誘導性遺伝子hsp-70(C12C8.1)9の制御下でGFPを発現する生きたワームにおける熱ショック応答を定量化するためにWorm_CPを用いた。図7は、熱応答性hsp-70(C12C8.1)p::GFPレポーターを搭載した生きたC.エレガンスの代表的な画像を示しています。熱ストレスがない場合、ワームはGFP発現を誘発しない(図7A,B)。しかし、34°Cで30分の短い熱ショックにさらされると、それらはGFP発現を誘発する(図7C,D)。ヒートショックの有無にかかわらずGFP発現レベルを図7Eで定量化します。
現状では、Worm_CPは非常に基本的なパイプラインです。しかし、このアプローチは、個々のワームマスクのより正確なセグメンテーションを可能にし、画像から選択されたワームの蛍光強度をより正確に定量することができます。このため、このアプローチは、ラインマスクのみを使用して、フィジーでの大まかな定量化よりも好ましいです。さらに、CellProfiler には、追加の分析モジュールをパイプラインに簡単に含めることができるという利点があります。例えば、脂質滴含有量を調べるデータセットでは、Worm_CPパイプラインへの追加モジュールの挿入は、概要画像で選択されたワームの個々の液滴の脂質滴数および蛍光強度を調査することができる。
図1:口マイクロピペットの生成.ガラスキャピラリーは、ブンゼンバーナー(A)の炎の中で、細い細長い四肢(B)を提供するまで延長される。延長されたガラスの毛細管は口のマイクロピペットのアダプター部分にそれから差し込む。(C)口マイクロピペットの概略図。口マイクロピペットは、アダプターに差し込まれたガラスキャピラリーで組み立てられました。6 mm シリコーンチューブは、安全のために使用される 0.2 μm シリンジフィルターにアダプターを接続します。フィルターのもう一端は1mLフィルター先端で終わる3 mmシリコーン管に取り付けられている。実験者はフィルター先端を介して吸引することができる。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ミミズペレットを囲む液体の吸引は、口マイクロピペットを用いた。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:アガロースパッドに敷設ワームにカバースリップを追加するには、この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:転写レポーター fat-7pを運ぶ生きている動物から取得した蛍光画像にワームアライメントを使用したワームアライメントを用いたワーム矯正の例:腸内のGFPと咽頭の赤い共注射マーカー(myo-2p::tdtomato)。(A)成人期の3日目に生きたワームの蛍光顕微鏡で取得した合成画像のスクリーンショット。画像はWorm_alignで開かれ、ワームアライメントを使用してワームの縦軸に沿って線が描かれました。(B)(A)と同じ画像のスクリーンショットと、ワームの軸に沿った線の良い描画と悪い描画の例を、ワームアライメントを使用してコメントしています。(C) ワームの上に描かれた線の例。Bで選択されたワームのワームアライメント出力は、緑色蛍光強度=1、露出=60ms、赤色蛍光強度=8、露光=60msの反転広視野顕微鏡(材料表参照)で20倍の目的で撮影されました。
図 5: 交差するワームに対するワームアラインを使用したワーム矯正の例() 転写レポーター FAT-7pを運ぶ成人動物の3日目の生きたワームの蛍光顕微鏡で取得した合成画像のスクリーンショット: :腸内のGFPと咽頭の赤い共注射マーカー(myo-2p:tdtomato).交差するワームには「交差1」と「交差2」のラベルが付けられており、重複していないワームには「good3」と「good4」とラベルが付きます。(B) で選択されたまっすぐなワームを表すワームアライメントによって作成されたモンタージュ (A)モンタージュでは、ワーム 1 と 2 が元の画像 ("intersecting1" と "intersecting2" と表示されたワーム) で交差していたことが分かりました。(C)ワームが交差するケースを見つけることができるワームアライメントのQCテーブルのスクリーンショット。長さ: ROI ラインの長さ;ワーム番号: 線が描画された順序;最後の列は、対象となるワーム/対象のワームと他のワームとの間に重複があるかどうかを示します。この例では、最初の生 (ワーム番号 1) のワームは、最後の列の番号 "2" で示されるように、ワーム番号 2 と重複しています。(D) A. (E) A で選択された 4 つのワームに Worm-align で描画された線のスクリーンショット A で選択された 4 つのワームに対するワームアラインによって生成されたマスクのスクリーンショットを、交差する 2 つのワームのマスクがどのようにレンダリングされているかを示します。この場合、1つではなく2つのマスクがワーム"intersecting1"に対応するようになりました。画像は、緑色の蛍光強度=1、露光=60ms、赤色蛍光強度=8、露出=60ミリ秒の反転ワイドフィールド顕微鏡(材料表参照)で20倍の目的で撮影されました。
図6:パイプラインWorm_CPは、手動定量と同じくらい正確に蛍光を定量化します。 緑色蛍光色素BODIPYと脂質滴量に対して固定され染色された若年成虫の蛍光定量の比較は、Worm_CPパイプライン(A)または手動定量(B)のいずれかを用いた緑色蛍光色素BODIPYとを有する。WTおよび dbl-1(nk3)の 脂質液滴含有量を、動物をBODIPYで固定・染色することにより監視し、脂質滴の脂肪酸に補間する(プロトコルA参照)。若い成虫動物は60%イソプロパノールで固定され、1時間のBODIPYで染色された。同じ動物群を、Worm_CPパイプライン(ステップ7参照)を使用するか、標準手順17に従って手動で定量化して定量化した。(a)Worm_CPパイプラインを用いた蛍光の定量化。WT: n=22 動物, 平均蛍光= 1.016 (A.U) ± 0.206 SD; dbl-1(nk3):n=25動物, 平均蛍光= 0.8714 (A.U) ± 0.126 SD. ペアリングされていないt検定.(B) 蛍光の手動定量化。WT: n=22動物, 平均蛍光 = 1.048 ± 0.153 SD; dbl-1(nk3): n=25動物,平均蛍光= 0.8632±0.109 SD. 非対t検定.(C, D)WT (C) および dbl-1(nk3) (D) の代表的な例またはワームアライメント出力は、ワームアライン パイプラインでまっすぐにします。画像は、緑色の蛍光強度=2、露光=60msの反転広視野顕微鏡(材料表を参照)で20倍の目的で撮影 されました。
図7:転写レポーター hsp-70(C12C8.1)p::熱ショック後のGFPを運ぶ生きたワームの蛍光画像からの蛍光定量と生きたワームのアライメントの例。(A)短い熱ショック(34°Cで30分)の場合、若年成虫を栽培温度(25°C)で回収し、3.5hポストヒートショックをイメージした。ワームアライメントパイプラインを使用したヒートショックの後、約30個のワームが定量化されました。(A-B)ヒートショックにさらされていないアラインドワームの例(C-D)hsp-70(C12C8.1)p::GFP をウォームアライメントで運ぶ熱衝撃ワームの例(E)は、熱ショックを受けずに、または熱ショック(30分間34°C)に曝露したWT若成虫のGFP平均強度(Worm_CPパラメータ:MeanIntensity_Threshold)を示す。画像は、緑色の蛍光強度=1、露光=60msの反転広視野顕微鏡(材料表を参照)上で20倍の目的で撮影されました。いいえ HS: n =12, HS: n=32.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図 1: インストール後にワームアライメント マクロが見つかるフィジーの場所。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図 2: 同じ設定で撮影したすべての画像を含むフォルダの選択このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
図 3: フィジーの出力フォルダ内の 4 つのサブフォルダの生成このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
図 4: ワームの幅を横切る線の描画とモンタージュのチャネル設定このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図 5: 適用された設定で画像のプレビュー。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図6:モンタージュや定量に含める目的のワームの縦軸に沿った線の描画。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
図 7:出力フォルダ内の選択したワームのモンタージュ("整列済み"フォルダの下)このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図 8: セル プロファイラでの以前の分析の前の画像を消去します。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図 9: 設定.csvサブフォルダーを選択して、ワーム位置合わせ出力フォルダーから CellProfiler にメタデータをインポートするこのファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図 10: CellProfiler パイプライン Worm_CP.cpproj は、Lines_イメージを使用して、選択したワーム (A) を 1 つにまとめ、対象のワーム (C) の単一のワーム マスクを生成します。パイプラインは、バックグラウンドの強度 (B) も測定します。csv ファイル (D) にエクスポートされるパイプライン Worm_CP.ccproj によって測定されたすべてのパラメーターの Outlook。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図 11: Worm_CP.cpproj パイプラインの"ExportToSpreadsheet" 内の出力ファイルの選択このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Discussion
ワームアライメントは、ユーザーが選択したワームのモンタージュを容易に生成するフィジーベースの画像処理パイプラインで、ワームを矯正し、視覚的な比較、分類、表現を支援します。この機能は、いくつかの既存のツール、特に CellProfiler7の WormToolbox モジュールでも提供されていますが、Worm-align は比較的少ない事前イメージ解析経験を必要とします: ユーザーはモンタージュ (および分析) に選択したいワームを追跡するだけで済みます。生画像データ上のワームのトレースは簡単なプロセスですが、特にタッチスクリーンコンピュータやタブレットが利用可能な場合は、ワームの縦軸に沿って線が正しく描画されるという最も重要です。不完全な行は、ワームの一部に続くもので、CellProfiler 分析中にモンタージュ (つまり、尾端の頭部が欠落しているワーム) に部分的なワームが生じ、部分的なセグメンテーション マスクが発生します。また、2つの個々のワームの線が交差する場合、ワームは、蛍光定量化のためだけでなく、ワームのアライメントモンタージュで正しく処理されません。品質管理のために、元の画像上のライン選択のオーバーレイ画像は、QCテーブルと一緒にデータフォルダに保存されます。これらのことから、誤ったセグメント化されたワームにつながる問題のあるラインを容易に識別し、モンタージュおよび/またはその後の分析から除外することができます。
実験者からの直接の入力は、おそらく少し時間がかかるように思えますが、異なる発達段階のワームが同じ画像に存在する実験では、他の人よりもワークフローの明確な利点を提示します: ワームは、正しい発達段階にあるワームのみを概説することによって、「トレースステップ」の間に選択することができます。また、ワームの長さ/サイズの両方の信頼性の高いインジケーターである、トレース ラインの長さ、またはセグメンテーション マスクの領域に基づいて、Worm_CPからの出力を使用して、ワームをフィルタリングすることもできます。間違いなく、機械学習アルゴリズムは、DIC画像のサイズと外観が非常に異なっているので、異なる発達段階からのワームを認識するのに苦労するかもしれません。
Worm-alignの出力は、フィジーの直接または他の画像解析ソフトウェアプラットフォームで、単一ワームにおける蛍光強度の後続の定量に使用できます。ワームアライメント出力を単純なCellProfilerパイプライン(Worm_CP)にインポートすることで、ワームアライメントパイプラインの実行中に選択された個々のワームのマルチチャネル蛍光強度を定量化できます。CellProfilerソフトウェアの柔軟性のためにこのアプローチを選択しました:個々のワームの追加機能(例えば、脂質滴、またはストレス顆粒、核、ミトコンドリアのサイズを測定する)を分析するために、パイプラインに追加のモジュールを組み込むのは簡単です。さらに、単一のワーム マスクを使用して、WormToolbox7の新しいモデルをトレーニングする可能性があります。
この方法の主な利点は、高速であり、簡単なワームマウントセットアップが必要です。この方法は、ソフトウェアの操作を学習したり、マシンアルゴリズム7を介してトレーニングセットを実行する時間を必要としないため、より高速です。さらに、この方法は、単に通常のアガロースパッドに取り付けられたライブまたは固定ワームのいずれかで動作します。他の方法5、6で開発された複雑なマイクロ流体室を使用する必要はありません。
Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
BIOCEV(プラハ、チェコ共和国)のクリスチャン・ランクトー博士に、固定ワームを取り付ける口マイクロピペット技術と、口のマイクロピペットの安全セットアップを共有してくれたファティマ・サントス博士とデビー・ドラゲ博士に感謝します。また、フランチェスカ・ホッジが原稿を編集してくれたことに感謝します, シャーリーン・マードックとバブラハム研究所の彼らのサポートのために.OC は、ERC 638426 および BBSRC [BBS/E/B000C0426]でサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | MeLford Biolaboratories Ltd | MB1200 | |
| Aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177 | to create mouth micro-pipette (see protocol step) |
| Beaker | |||
| BODIPY 493/593 | Invitrogen | D3922 | stock solution prepared in DMSO at 1mg/mL |
| Centrifuge | MSE MISTRAL 1000 | ||
| Conical flask | |||
| Cover Slip | VWR | 631-0120 | |
| Filter 0.2 µm for Syringe | Sartrius | 16534-K | Filter, to create mouth micro-pipette (see protocol step) |
| Isopropanol | |||
| Levamisole hydrochloride | Sigma-Aldrich | BP212 | 3mM solution prepared by dissolving levamisole in M9 |
| Liquid Nitrogen | Liquid Nitrogen facility | ||
| Low Retention Tip 1000µL | Starlab | S1182-1830 | |
| Methanol | VWR chemicals | 20847.307 | |
| Microscope Slides, MENZEL GLASSER | Thermo Scientific | BS7011/2 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Microwave Oven | Delongi | ||
| M9 | prepared in the lab according to15 | ||
| 9cm NGM Plates | prepared in the lab according to15 | ||
| PBS | prepared in the lab | ||
| Protein LoBind Tube 2ml | Eppendorf | 22431102 | |
| Triton | SIGMA | T9284-500ML | |
| Ring Caps | SIGMA-ALDRICH | Z611247-250EA | glass micro-capillary tubes to create mouth micro-pipette (see protocol step) |
| Rotator | Stuart Scientific | ||
| Silicone tubine translucent | Scientific Laboratory Suppliers | TSR0600200P | 6.0 mm x 2.0 mm wall - to create mouth micro-pipette (see protocol step) |
| Sterilized H2O | MilliQ water autoclaved in the lab | ||
| 10µL Tips | Starlab | S1120-3810 | |
| 200µL Tips | Starlab | S1120-8810 | |
| 1000µL Tips | Starlab | S1122-1830 | |
| 15mL Centrifuge Tube | CORNING | 430791 | |
| Vecta Shield | VECTOR | 94010 | antifade mounting medium (H-1000) without DAPI |
References
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