Summary
Este protocolo describe un sistema de cultivo dinámico para producir agregados de tamaño controlado de células madre pluripotentes humanas y estimular aún más la diferenciación en organoides cerebelosos en condiciones definidas químicamente y libres de alimentadores utilizando un biorreactor de un solo uso.
Abstract
El cerebelo desempeña un papel crítico en el mantenimiento del equilibrio y la coordinación motora, y un defecto funcional en diferentes neuronas cerebelosas puede desencadenar disfunción cerebelosa. La mayor parte del conocimiento actual sobre los fenotipos neuronales relacionados con la enfermedad se basa en los tejidos postmortem, lo que dificulta la comprensión de la progresión y el desarrollo de la enfermedad. Modelos animales y líneas celulares inmortalizadas también se han utilizado como modelos para trastornos neurodegenerativos. Sin embargo, no recapitulan completamente la enfermedad humana. Las células madre pluripotentes inducidas por el ser humano (iPSC) tienen un gran potencial para el modelado de enfermedades y proporcionan una valiosa fuente para enfoques regenerativos. En los últimos años, la generación de organoides cerebrales a partir de iPSC derivados del paciente mejoró las perspectivas de modelado de enfermedades neurodegenerativas. Sin embargo, faltan protocolos que producen un gran número de organoides y un alto rendimiento de neuronas maduras en sistemas de cultivo 3D. El protocolo presentado es un nuevo enfoque para la generación reproducible y escalable de organoides humanos derivados de iPSC en condiciones definidas químicamente utilizando biorreactores escalables de un solo uso, en los que los organoides adquieren identidad cerebelosa. Los organoides generados se caracterizan por la expresión de marcadores específicos tanto a nivel de ARNm como de proteínas. El análisis de grupos específicos de proteínas permite la detección de diferentes poblaciones de células cerebelosas, cuya localización es importante para la evaluación de la estructura organoide. La criocisión organoidea y la inmunostaining de las rodajas organoides se utilizan para evaluar la presencia de poblaciones específicas de células cerebelosas y su organización espacial.
Introduction
La aparición de células madre pluripotentes humanas (PSC) representa una excelente herramienta para la medicina regenerativa y el modelado de enfermedades, ya que estas células se pueden diferenciar en la mayoría de los linajes celulares del cuerpo humano1,,2. Desde su descubrimiento, la diferenciación de PSC utilizando diversos enfoques se ha informado para modelar diferentes enfermedades, incluyendo trastornos neurodegenerativos3,,4,5,6.
Recientemente, ha habido informes de culturas 3D derivadas de PSC que se asemejan a estructuras cerebrales humanas; estos se llaman organoides cerebrales3,7,8. La generación de estas estructuras a partir de PSC saludables y específicos para el paciente proporciona una valiosa oportunidad para modelar el desarrollo humano y los trastornos del neurodesarrollo. Sin embargo, los métodos utilizados para generar estas estructuras cerebrales bien organizadas son difíciles de aplicar para su producción a gran escala. Para producir estructuras lo suficientemente grandes como para recapitular la morfogénesis tisular sin necrosis dentro de los organoides, los protocolos se basan en el compromiso neuronal inicial en condiciones estáticas, seguido de encapsulación en hidrogeles y cultivo posterior en sistemas dinámicos3. Sin embargo, estos enfoques pueden limitar la posible ampliación de la producción de organoides. A pesar de que se han hecho esfuerzos para dirigir la diferenciación de PSC a regiones específicas del sistema nervioso central, incluyendo las neuronas cortical, estriado, de cerebro medio y de la médula espinal9,,10,11,12, la generación de regiones cerebrales específicas en condiciones dinámicas sigue siendo un desafío. En particular, la generación de neuronas cerebelosas maduras en estructuras 3D aún no se ha descrito. Muguruma et al. fueron pioneros en la generación de condiciones de cultivo que recapitulan el desarrollo cerebelo temprano13 y recientemente informaron de un protocolo que permite que las células madre embrionarias humanas generen una estructura polarizada que recuerda al primer trimestre cerebelo7. Sin embargo, la maduración de las neuronas cerebelosas en los estudios notificados requiere la disociación de los organoides, la clasificación de los progenitores cerebelosos, y la cocultura con células alimentadoras en un sistema de cultivo monocapa7,14,15,16. Por lo tanto, la generación reproducible de los organoides cerebelosos deseados para el modelado de enfermedades en condiciones definidas sigue siendo un desafío asociado con el cultivo y la variabilidad de la fuente del alimentador.
Este protocolo presenta condiciones óptimas de cultivo para la expansión 3D y la diferenciación eficiente de las PSC humanas en neuronas cerebelosas utilizando biorreactores de rueda vertical de un solo uso (ver Tabla de Materiales para especificaciones), en adelante llamados biorreactores. Los biorreactores están equipados con un gran impulsor vertical, que en combinación con un fondo en forma de U, proporcionan una distribución de cizallamiento más homogénea dentro del recipiente, permitiendo una mezcla suave y uniforme y la suspensión de partículas con velocidades de agitación reducidas17. Con este sistema, se pueden obtener agregados celulares controlados por forma y tamaño, lo que es importante para una diferenciación más homogénea y eficiente. Además, un mayor número de organoides derivados de iPSC se pueden generar de una manera menos laboriosa.
La característica principal de los organoides, que son estructuras multicelulares 3D generalmente formadas a partir de células madre, es la auto-organización de diferentes tipos celulares que forma formas específicas como las observadas en la morfogénesis humana18,,19,,20. Por lo tanto, la morfología organoide es un criterio importante a evaluar durante el proceso de diferenciación. La criosectación de organoides y la inmunostaining de rodajas organoides con un conjunto específico de anticuerpos permiten la visualización espacial de marcadores moleculares para analizar la proliferación celular, la diferenciación, la identidad de la población celular y la apoptosis. Con este protocolo, mediante la inmunodetermación de criocciones organoides, un compromiso neuronal eficiente inicial se observa por el día7 de diferenciación. Durante la diferenciación, se observan varias poblaciones celulares con identidad cerebelosa. Después de 35 días en este sistema dinámico, el neuroepithelium cerebeloso se organiza a lo largo de un eje apicobasal, con una capa apical de progenitores proliferantes y neuronas postmitoticas ubicadas basalmente. Durante el proceso de maduración, de los días 35-90 de diferenciación, se pueden observar distintos tipos de neuronas cerebelosas, incluyendo células de Purkinje (Calbindin+), células de gránulos (PAX6+/MAP2+), células Golgi (Neurogranin+), células de cepillo unipolar (TBR2+), y neuroleins de proyección de núcleos cerebelosos profundos (TBR1+). Además, se observa una cantidad no insignificante de muerte celular en los organoides cerebelosos generados después de 90 días en el cultivo.
En este sistema, los organoides humanos derivados de iPSC maduran en diferentes neuronas cerebelosas y sobreviven hasta 3 meses sin necesidad de disociación y cocultura alimentadora, proporcionando una fuente de neuronas cerebelosas humanas para el modelado de enfermedades.
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Protocol
1. Aprobación y mantenimiento de iPSC humanos en cultivo monocapa
- Preparación de placas
- Descongelar la matriz de membrana del sótano (ver Tabla de Materiales)a 4oC y preparar alícuotas de 60 l. Congele las alícuotas a -20 oC.
- Para cubrir los pozos de una placa de 6 pozos, descongele una alícuota de la matriz de membrana del sótano sobre hielo. Una vez descongelado añadir 60 s a 6 ml de DMEM-F12. Resuspend suavemente pipeteando arriba y abajo.
- Añadir 1 ml de solución de matriz de membrana sótano diluida a cada pozo de una placa de 6 pozos e incubar en RT durante al menos 1 h antes de pasar o almacenar a 4 oC durante un máximo de 1 semana.
- Transmisión de colonias iPSC con EDTA
- Mantener los iPSC en cultivo monocapa en 6 placas de pozo en la incubadora a 37oC, 95% de humedad y 5% co2.
NOTA: En este protocolo, se utilizaron tres líneas iPSC humanas distintas: F002.1A.1321, línea iPSC episómico humana (iPSC6.2)22y iPS-DF6-9-9T.B obtenida comercialmente (ver Tabla de Materiales). - Antes de la venta, incubar las placas almacenadas (paso 1.1) a temperatura ambiente (RT) durante 15 min y preparar el medio mTesR1 (Tabla 1).
- Aspirar la solución de la placa con una pipeta serológica y añadir inmediatamente 0,5 ml de medio mTeSR1 a cada pozo.
- Aspirar el medio gastado del pozo que contiene iPSC y lavar una vez usando 1 mL de EDTA de 0,5 mM por poc.
- Añadir 1 ml de EDTA de 0,5 mM a cada pozo e incubar a RT durante 5 min.
- Aspirar EDTA y retirar las células de los pozos añadiendo suavemente mTeSR1 medio y pipeteando las colonias utilizando una micropipeta P1000. Recoger las células en un tubo cónico.
NOTA: No pipetee las celdas hacia arriba y hacia abajo más de 3x. - Añadir 1 ml de suspensión celular (diluida 1:4) a cada pozo para que cada pozo contenga 1,5 ml de medio después de añadir la suspensión celular. Devolver las células a la incubadora a 5% de CO2,37 oC.
- Reemplazar el medio gastado diario y el paso cada 3 días cuando se logra una confluencia del 75% al 80%.
- Mantener los iPSC en cultivo monocapa en 6 placas de pozo en la incubadora a 37oC, 95% de humedad y 5% co2.
2. Siembra de iPSC humanos en el biorreactor
- Incubar iPSCs cultivados como monocapas en mTeSR1 complementado con 10 m de inhibidor de ROCK Y-27632 (ROCKi). Añadir 1 ml de medio suplementado a cada pozo de una placa de cultivo de tejido de 6 pozos e incubar durante 1 h a 37 oC, 95% de humedad y 5% de CO2.
NOTA: ROCKi se utiliza para proteger los iPSC disociados de la apoptosis23. - Después de 1 h de incubación, aspirar el medio gastado de cada pocómo y lavar 1x con 1 ml de 1× PBS por pozo.
- Añadir 1 ml del medio de desprendimiento celular (ver Tabla de Materiales)a cada pozo de una placa de 6 pozos e incubar a 37oC durante 7 min hasta que las células se desprenden fácilmente de los pozos con un suave temblor.
- Pipetear el medio de desprendimiento de la célula hacia arriba y hacia abajo con una micropipeta P1000 hasta que las células se desasociquen y se disocian en células individuales. Añadir 2 ml de medio de cultivo celular completo a cada pozo para inactivar la digestión enzimática y pipetear las células suavemente en un tubo cónico estéril.
- Centrifugar a 210 × g durante 3 min y retire el sobrenadante.
- Resuspender el pellet celular en un medio de cultivo (es decir, mTeSR1 complementado con 10 m de ROCKi) y contar los iPSC con un hemocicómetro utilizando tinte azul tripano.
- Semilla 15 × 106 células individuales en el biorreactor (volumen máximo de 100 ml) con 60 ml de mTeSR1 complementado con 10 m de ROCKi a una densidad de células final de 250.000 células/ml.
- Inserte el recipiente que contiene los iPSC en la unidad base universal colocada en la incubadora a 37oC, 95% de humedad y 5% de CO2.
NOTA: La agitación del biorreactor se mantiene durante 24 horas ajustando el control universal de la unidad base a 27 rpm para promover la agregación iPSC.
3. Diferenciación y maduración de los agregados humanos derivados del iPSC en organoides cerebelosos
- Defina el día de la siembra de una sola celda como el día 0.
- El día 1, recoja 1 ml de la muestra de agregados iPSC utilizando una pipeta serológica. Mantener el biorreactor bajo agitación como antes colocando la unidad base universal con el biorreactor que contiene los agregados en un flujo estéril antes de recoger la muestra. Placa la suspensión celular en una placa de 24 pozos de fijación ultrabajo. Compruebe que se forman agregados derivados de iPSC.
- Adquiera imágenes con un microscopio óptico utilizando un aumento total de 40x o 100x para medir el diámetro agregado.
- Mida el área de los agregados en cada imagen utilizando el software FIJI.
- Seleccione "Analizar ? Establecer medidas" en la barra de menú y haga clic en "Area" y "OK".
- Seleccione "Archivo ? Abra" en la barra de menús para abrir un archivo de imagen almacenado. Seleccione la herramienta de selección de líneas presentada en la barra de herramientas y cree una línea recta sobre la barra de escala presentada en la imagen. Seleccione "Analizar ? Ajuste la escala" en la barra de menús.
- En "Distancia conocida",añade la extensión de la barra de escala de la imagen en m. Defina la"Unidad de longitud"como m. Haga clic en "Global" para mantener la configuración y "OK". Seleccione Selección ovalada en la barra de herramientas.
- Para cada agregado, defina el área con la herramienta ovalada. Seleccione "Analizar ? Medir". Calcular su diámetro en función del área medida, teniendo en cuenta que los agregados son aproximadamente esféricos
con A como área del agregado.
- Cuando el diámetro medio de los agregados sea de 100 m, sustituya el 80% del medio gastado por mTeSR1 fresco sin ROCKi. Cuando los agregados alcancen 200–250 m de diámetro, reemplace todo el medio gastado con gfCDM (Tabla 1), dejando que los organoides se asienten en la parte inferior del biorreactor.
NOTA: Si el diámetro medio del agregado supera los 350 m, no inicie el protocolo de diferenciación. Repita la siembra de celdas individuales. Por lo general, el agregado tarda alrededor de 1 día en alcanzar un diámetro medio de 100 m. - Inserte el biorreactor que contiene los agregados en la unidad base universal colocada en la incubadora a 37oC, 95% de humedad y 5% co2.
- Disminuya la agitación del biorreactor a 25 rpm.
- En el día 2, repita los pasos 3.2, 3.3 y 3.4 para evaluar el diámetro agregado. Añadir 30 l de FGF2 (concentración final, 50 ng/mL) y 60 l de SB431542 (concentración final, 10 oM) a 60 ml del medio de diferenciación de gfCDM(Tabla 1). Sustituya todo el medio gastado del biorreactor por el gfCDM suplementado. Repita el paso 3.6.
NOTA: SB431542 es crucial para inhibir la diferenciación mesendodérmica, induciendo la diferenciación neuronal24. FGF2 se utiliza para promover la caudalización del tejido neuroepitelial25. - En el día 5, repita los pasos 3.2, 3.3, 3.4 y 3.8.
NOTA: El tamaño agregado debe aumentar durante el protocolo de diferenciación. Sin embargo, el diámetro sólo es crítico cuando comienza la diferenciación, ya que este parámetro podría influir en la eficacia de la diferenciación. - En el día 7, repita los pasos 3.2, 3.3 y 3.4. Diluir FGF2 y SB431542 a 2/3: Añadir 20 s de FGF2 y 40 l de SB431542 a 60 mL de medio de diferenciación de gfCDM. Sustituya todo el medio gastado del biorreactor por un gfCDM suplementado. Repita el paso 3.6 y aumente la agitación del biorreactor a 30 rpm.
- En el día 14, repita los pasos 3.2, 3.3 y 3.4. Añadir 60 l de FGF19 (concentración final, 100 ng/mL) a 60 ml del medio de diferenciación de gfCDM. Sustituya todos los medios gastados del biorreactor por gfCDM complementados con FGF19. Repita el paso 3.6.
NOTA: FGF19 se utiliza para promover la polarización de las estructuras de lasbras de la mitad del hindbra26. - En el día 18, repita los pasos 3.2, 3.3, 3.4 y 3.11.
- En el día 21, repita los pasos 3.2, 3.3 y 3.4. Sustituya todo el medio gastado del biorreactor por un medio neurobasal completo(Tabla 1). Repita el paso 3.6.
NOTA: El medio neurobasal es un medio basal utilizado para mantener la población celular neuronal dentro del organoide7. - En el día 28, repita los pasos 3.2, 3.3 y 3.4. Añadir 180 l de SDF1 (concentración final, 300 ng/ml) a 60 ml de medio neurobasal completo. Sustituya todo el medio gastado del biorreactor por un medio neurobasal completo complementado con SDF1. Repita el paso 3.6.
NOTA: SDF1 se utiliza para facilitar la organización de capas de celdas distintas27. - En el día 35, repita los pasos 3.2, 3.3 y 3.4. Sustituya todo el medio gastado del biorreactor por el medio completo de BrainPhys(Tabla 1). Repita el paso 3.6.
NOTA: BrainPhys es un medio neuronal que soporta neuronas sinápticamente activas28. - Reemplace 1/3 del volumen total cada 3 días con un medio completo de BrainPhys hasta el día 90 de diferenciación.
4. Preparación de organoides para criocesión e inmunohistoquímica
- Colección de organoides para inmunosumante
- Recoger 1 ml de muestra de medio que contenga organoides con una pipeta serológica del biorreactor a un tubo cónico de 15 ml.
NOTA: Los organoides deben recogerse en diferentes momentos para evaluar la eficacia de la diferenciación, incluidos los días 7, 14, 21, 35, 56, 70, 80 y 90. - Retire el sobrenadante y lávelo una vez con 1 ml de 1× PBS.
NOTA: No centrifugar los organoides. Deje que los organoides se asienten en la parte inferior del tubo por gravedad. - Retire el sobrenadante y agregue 1 ml de 4% de paraformaldehído (PFA). Incubar a 4oC durante 30 min. Quite el PFA gastado y agregue 1 mL de 1× PBS.
- Conservar los organoides en 1 ml de 1× PBS a 4 oC hasta su procesamiento para criocisiones.
NOTA: Almacene los organoides en 1x PBS durante no más de 1 semana después de la fijación.
- Recoger 1 ml de muestra de medio que contenga organoides con una pipeta serológica del biorreactor a un tubo cónico de 15 ml.
- Preparación de organoides para la criocesión
- Retire el sobrenadante de los organoides almacenados. Añadir 1 ml de sacarosa al 15% (p/v, diluida en 1× PBS), mezclar bien por remolinos suaves e incubar durante la noche a 4oC.
- Preparar una solución de 15% de sacarosa/7,5% de gelatina(Tabla 2) y mantener a 37oC durante la preparación para evitar que la gelatina se solidifique.
- Retire la solución de sacarosa al 15%, añada 1 ml de sacarosa al 15% /7,5% de gelatina a los organoides, y mezcle rápidamente mediante un suave remolino. Incubar a 37oC durante 1 h.
- Añadir 15% de sacarosa/7,5% de solución de gelatina a un recipiente de plástico hasta la mitad de su volumen. Espere a la solidificación en RT.
- Después de una incubación de 1 h, coloque cuidadosamente una gota de sacarosa/gelatina que contenga los organoides en la gelatina solidificada con una pipeta Pasteur. Dejar solidificar en RT durante unos 15 min. Asegúrese de evitar la formación de burbujas.
- Coloque 15% de sacarosa/7,5% de gelatina encima de los organoides hasta que el recipiente esté lleno. Espere a que se complete la solidificación en RT.
- Después de la solidificación, incubar 20 min a 4oC.
- Cortar la gelatina en un cubo que contiene los organoides en el centro y fijar el cubo de gelatina en un pedazo de cartón con una gota de O.C.T. compuesto.
- Colocar 250 ml de isopentano en una taza de 500 ml y llenar un recipiente apropiado con nitrógeno líquido. Usando fórceps y guantes gruesos, coloque cuidadosamente la copa que contiene isopentano en la superficie de nitrógeno líquido y enfríe el isopentano a -80 oC.
- Cuando se alcance -80 oC, coloque el cubo de gelatina en la taza que contiene isopentano hasta que se congele, manteniendo la temperatura a -80 oC. Dependiendo del tamaño del cubo, puede tardar de 1 a 2 minutos.
NOTA: Evite temperaturas por debajo de -80 oC o tiempo de congelación excesivo, ya que podría causar agrietamiento del cubo. - Cuando esté congelado, almacene rápidamente el cubo de gelatina a -80 oC y guárdelo hasta que se crioce.
- Criosectación de organoides
- Encienda el criostato y defina las temperaturas tanto de la muestra (OT) como de la criocámara (CT) a -25 oC.
- Cuando ambas temperaturas se estabilicen, fije el cubo de gelatina que contiene los organoides en la muestra utilizando el compuesto O.C.T.
- Defina el espesor de la sección a 12 m.
- Cortar el cubo y recoger 3-4 rodajas en diapositivas de microscopio de adhesión (ver Tabla de materiales).
- Conservar a -20oC hasta su uso.
- Inmunostaining of organoids slices
- Coloque las diapositivas del microscopio que contienen secciones organoides en un frasco de copling con 50 ml de PBS preadprimido 1x, sosteniendo hasta 10 diapositivas de espaldas.
NOTA: Todas las secciones organoides deben sumergirse con líquido. - Incubar durante 45 min a 37oC para desgelatinizar los portaobjetos.
- Lavar 1x con 50 ml de 1× PBS durante 5 minutos en RT: Transfiera las diapositivas a un frasco de acazgas que contenga 1× PBS fresco.
- Transfiera los portaobjetos a un frasco de copling que contenga 50 ml de glicina recién preparada(Tabla 2)e incubar durante 10 minutos en RT.
- Transfiera las diapositivas a un frasco de acapulado que contenga 50 ml de tritón al 0,1% (Tabla 2) y permeabilizar durante 10 minutos en RT.
- Lavar con 1× PBS durante 5 min 2x.
- Prepare el plato de inmunosu mancha con papel de 3 mm empapado en 1× PBS. Seque los portaobjetos con un pañuelo alrededor de las rodajas y colóquelas en papel de 3 mm. Con una pipeta Pasteur, cubra toda la superficie de las diapositivas con solución de bloqueo (Tabla 2) con 0,5 ml por diapositiva. Incubar durante 30 min en RT.
- Retire el exceso de solución de bloqueo y seque los portaobjetos con un pañuelo alrededor de las rodajas. Colocar 50 l del anticuerpo primario (Tabla 3) diluido en solución de bloqueo sobre las secciones y cubrir con los cubreobjetos. Coloque las rodajas en un plato de inmunosuchado previamente preparado. Incubar durante la noche a 4oC.
- Transfiera los portaobjetos a un frasco de copling con 50 ml de TBST (Tabla 2), deje caer los cubreobjetos y lave con TBST durante 5 min 3x.
- Colocar 50 l del anticuerpo secundario diluido en solución de bloqueo sobre las secciones y cubrir con los cubreobjetos. Coloque las rodajas en el plato de inmunostaining previamente preparado. Incubar durante 30 minutos en RT, protegido de la luz.
- Transfiera los portaobjetos a un frasco de copling de nuevo y lave con 50 ml de TBST durante 5 min 3x.
- Seque los portaobjetos con un pañuelo alrededor de las rodajas y coloque las rodajas en un plato de inmunostaining previamente preparado. Añadir 0,5 ml de solución DAPI sobre toda la superficie de los portaobjetos con una pipeta Pasteur. Incubar durante 5 min en RT.
- Repita el paso 4.4.9.
- Seque cuidadosamente los portaobjetos con un pañuelo. Agregue 50 sl de medio de montaje gota a gota a lo largo de la diapositiva y luego baje cuidadosamente un cubreobjetos en cada diapositiva, doblando ligeramente para evitar burbujas.
- Coloque las diapositivas del microscopio que contienen secciones organoides en un frasco de copling con 50 ml de PBS preadprimido 1x, sosteniendo hasta 10 diapositivas de espaldas.
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Representative Results
El protocolo se inició promoviendo la agregación celular utilizando los biorreactores 0.1 L (Figura 1A). Se realizó la inoculación de una sola célula de los iPSC, con 250.000 células/ml sembradas en 60 ml de medio con una velocidad de agitación de 27 rpm. Esto se definió como el día 0. Después de 24 h, las células formaron eficientemente agregados en forma de esferoides (día 1, Figura 1B),y la morfología se mantuvo bien hasta el día 5, con un aumento gradual de tamaño, demostrando un alto grado de homogeneidad en la morfología agregada y el tamaño con el tiempo. (Figura 1B). Un análisis cuantitativo por microscopía también reveló una distribución normal de los tamaños de agregados para el día 1(Figura 1C). El tamaño agregado es un parámetro físico importante capaz de pedir a las celdas que se diferencien hacia diferentes linajes29,,30. Por esta razón, sobre la base del tamaño agregado notificado en estudios anteriores para inducir un compromiso neuronal eficiente31,,32 y cerebeloso21, los agregados generados se mantuvieron en el medio mTeSR1 a 25 rpm hasta que alcanzaron el diámetro deseado antes de iniciar la diferenciación (200 m). En el día 2, el diámetro medio era de 221,0 ± 54,4 m (media ± SD) para la línea celular F002.1A.13 y 212,1 ± 42,1 m para la línea celular iPSC6.2. Como tal, ambas líneas celulares alcanzaron el tamaño agregado óptimo en este punto de tiempo (Figura 1C).
Definiendo el día en que la siembra de iPSCs se realizó como día 0, en el día 2, después de alcanzar el diámetro agregado deseado, el compromiso neuronal fue inducido por el uso simultáneo de SB431542, FGF2, e insulina, promoviendo la diferenciación neuroectodérmica, así como una caudalización moderada necesaria para el patrón de cerebros traseros medios. Posteriormente, FGF19 y FDS1 se añadieron a la cultura en los días 14 y 28, respectivamente, para promover la generación de diferentes progenitores cerebelosos. Durante los primeros días de inducción neuronal, se utilizó una velocidad de rotación de 25 rpm, que se incrementó a 30 rpm después de 7 días para evitar la acumulación y aglomeración de agregados más grandes (Figura 2A). Durante la diferenciación, los organoides mostraron una epitelización más pronunciada similar a las estructuras similares a los tubos neurales con espacio luminal (Figura 2B). Además, la evaluación de la distribución del diámetro organoide demostró una distribución homogénea del tamaño durante el compromiso cerebeloso inicial hasta el día 14 (Figura 2B).
El análisis de inmunofluorescencia apoya que un compromiso neuronal eficiente de los organoides derivados del iPSC ya se alcance por el día 7 de diferenciación después de agregar FGF2 y SB431542. Las criocciones de organoides revelaron muchas estructuras que recuerdan a la tinción del tubo neural para PAX6 y NESTIN, con la mayoría de las células dentro de los organoides expresando el marcador progenitor NESTIN en los días 7 y 14 de diferenciación (Figura 2C). Posteriormente, FGF19 y SDF1 promovieron la generación de capas progenitoras continuamente proliferantes (PAX6+) y se logró una diferenciación neuronal eficiente, como lo demuestra la expresión de TUJ1, beta-tubulina de clase III específica de la neurona, por los días 21 y 35 (Figura 2C). Además, también se observó una diferenciación cerebelosa eficiente después de 21 días en los biorreactores de VW de 0,1 L, demostrada por la presencia de dos poblaciones celulares diferentes: progenitores de células de gránulos (BARLH1+ células, Figura 3A)y progenitores de células puréje (OLIG2+células, Figura 3B). Después de 35 días en el cultivo, diferentes poblaciones celulares dentro de los organoides parecían estar organizadas en capas distintas. Se observaron varias estructuras ovaladas planas dentro de los organoides con BARHL1+ progenitores cerebelosos dorsales como una capa continua en el lado superficial del organoide (Figura 3C,D) y SOX2+ en la región luminal de estas estructuras ovaladas (Figura 3D). Además, tuJ1+ neuronas recién nacidas parecían migrar hacia la superficie, restableciendo la alineación radial en la superficie externa del organoide (Figura 3E).
Después de la generación de progenitores cerebelosos, se promovió una mayor maduración usando BrainPhys medio28 complementado con factores neurotróficos BDNF y GDNF. La tinción de inmunofluorescencia de las criocciones organoides se utilizó para detectar subtipos distintos de neuronas cerebelosas. Células de Purkinje, neuronas GABAérgicas que expresan la proteína de unión al calcio de la calbinadina (CALB, Figura 3F), se detectaron en los organoides cerebelosos después del protocolo de maduración. Además, otro tipo neuronal cerebeloso importante, las células de gránulos, se identificó como un subconjunto de células que coexpresan PAX6 y MAP2 (Figura 3G). Curiosamente, una piscina de PAX6+ progenitores que no expresan MAP2 se mantuvo hasta 80 días de diferenciación. También se detectaron otros tipos de neuronas cerebelosas, incluidas las células de cepillo unipolar que expresan TBR2(Figura 3H),y las neuronas de proyección de núcleos cerebelosos profundos que expresan TBR1 (Figura 3I). Además de la diferenciación y maduración cerebelosa eficiente, este sistema de cultivo dinámico 3D que utiliza los biorreactores PBS 0.1 L VW permitió que los organoides permanecieran viables hasta 90 días, sin muerte celular y necrosis significativas (Figura 3J).
Figura 1: Generación de agregados controlados por tamaño mediante biorreactores escalables. (A) Características de diseño del biorreactor. (B) Fotomicrografía de Brightfield que muestra agregados de dos líneas iPSC diferentes en los días 1, 2 y 5. Barra de escala a 100 m. (C) La distribución del tamaño de los agregados flotantes de diferentes líneas iPSC en los biorreactores. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Generación de organoides humanos derivados de iPSC utilizando biorreactores de 0,1 L. (A) Representación esquemática del procedimiento de cultivo para inducir la diferenciación de iPSC a organoides cerebelosos. Las células se sembraron a una densidad de 250.000 células/ml y se utilizó una velocidad de agitación de 27 rpm para promover la agregación celular. Durante los primeros días de diferenciación, los agregados se mantuvieron a una velocidad de agitación de 25 rpm. Después, para evitar la acumulación de agregados más grandes, la velocidad de agitación se incrementó a 30 rpm. (B) Caracterización de la forma y el tamaño de los organoides. Fotomicrografías de Brightfield que muestran organoides derivados de iPSC durante la diferenciación cerebelosa en los biorreactores de VW de 0,1 L. Barra de escala a 100 m. La distribución de diámetros organoides demuestra que el cultivo mantuvo tamaños de organoides homogéneos a lo largo del protocolo de diferenciación. (C) Inducción neuronal eficiente en organoides derivados de iPSC. Inmunofluorescencia para NESTIN, PAX6 y TUJ1 durante la diferenciación cerebelosa. Barra de escala a 50 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Diferenciación y maduración cerebelosa eficiente en organoides humanos derivados del iPSC. (A-E) Compromiso cerebeloso eficiente. Análisis de inmunomanchas para marcadores BARHL1, SOX2, OLIG2, NCAD y TUJ1 en los puntos de tiempo indicados del protocolo de diferenciación cerebelosa. (F-I) Maduración eficiente de organoides cerebelosos derivados de iPSC humanos. Inmunofluorescencia que muestra diferentes tipos de neuronas cerebelosas, incluyendo células Purkinje (CALB, F), células de gránulos (PAX6 y MAP2, G), células de cepillo unipolar (TBR2), y neuronas de proyecciones de núcleos cerebelosos profundos (TBR1). (J) Alta viabilidad celular después de la maduración cerebelosa. La tinción viva/muerta (calceína-AM, yoduro verde y propidium, rojo) de organoides mostró alta viabilidad celular y ninguna evidencia de áreas necróticas después de 80 días en los biorreactores. Barra de escala a 50 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Preparación de los medios |
mTeSR1 Volumen final: 500 mL |
1. Descongelar mTeSR1 5× suplemento a temperatura ambiente (RT) o a 4 oC durante la noche y mezclar con medio basal 2. Almacene el medio completo mTeSR1 a 4 oC durante un máximo de 2 semanas o prepare 40 ml de alícuotas y guárdelo a -20 oC 3. Pre-caliente completo mTeSR1 en RT antes de su uso |
|
gfCDM (medio definido químicamente sin factor de crecimiento) Volumen final: 60 mL |
F12 de Jamón de 30 ml IMDM de 30 ml Concentrado de lípidos definido químicamente de 600 l (1 % v/v) 2.4 l de monotiogícigo (450 m) 30 l de apotransferrina (solución en stock a 30 mg/ml en agua, concentración final: 15 g/ml) 300 mg de BSA purificada por cristalización (5 mg/ml) 42 l de insulina (concentración de stock a 10 mg/ml, concentración final: 7 g/ml) 300 l P/S (0,5% v/v, 50 U/ml de penicilina/50 g/ml de estreptomicina) |
|
|
Neurobasal Volumen final: 60 mL |
60 mL de medio neurobasal Suplemento de 600 l N2 600 l Glutamax I 300 l P/S (0,5 % v/v). |
|
|
BrainPhys completo Volumen final: 60 mL |
60 ml de BrainPhys 1.2 mL NeuroCult SM1 Suplemento Neuronal Suplemento de 600 L N2 12 l BDNF (concentración final: 20 ng/mL) 12 l GDNF (concentración final: 20 ng/mL) 300 l Dibutyryl-CAMP (concentración de stock: 100 mg/ml en agua, concentración final: 1 mM) 42 l de ácido ascórbico (concentración de stock: 50 g/ml en agua, concentración final: 200 nM) |
|
| Soluciones de stock de factores de crecimiento y moléculas pequeñas |
Factor de crecimiento básico del fibroblasto (bFGF/FGF2) Concentración de stock: 100 g/ml |
1. Reconstituir en 5 mM Tris, pH 7,6, a una concentración de 10 mg/ml 2. Diluir con 0,1 % de BSA en PBS (v/v) a una concentración final de stock de 100 g/ml |
|
Factor derivado de células estromales 1 (SDF1) Concentración de stock: 100 g/ml |
1. Reconstituir en agua a una concentración de 10 mg/ml 2. Diluir con 0,1 % de BSA (v/v) en PBS a una concentración final de stock de 100 g/ml. |
|
|
Factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) Concentración de stock: 100 g/ml |
||
|
Factor neurotrófico derivado de células gliales (GDNF) Concentración de stock: 100 g/ml |
||
|
Factor de crecimiento de fibroblastos 19 (FGF19) Concentración de stock: 100 g/ml |
1. Reconstituir en fosfato sódico de 5 mM, pH 7,4, a una concentración de 10 mg/ml 2. Diluir con 0,1 % de BSA en PBS (v/v) a una concentración final de stock de 100 g/ml |
|
|
Inhibidor ROCK Y-27632 Concentración de stock: 10mM |
Reconstituir en DMSO a una concentración de 10 mM. | |
|
SB431542 Concentración de stock: 10mM |
||
|
Insulina Concentración de stock: 10 mg/ml |
1. Reconstituir 10 mg de insulina en 300 l de NaOH de 10 mM 2. Agregue cuidadosamente 1 M NaOH hasta que la solución se vuelva transparente 3. Llene hasta 1 ml con agua estéril. |
Tabla 1: Soluciones de stock y preparación de medios. Se enumeran todos los componentes y volúmenes utilizados para preparar medios para el protocolo de mantenimiento y diferenciación iPSCs, así como soluciones de stock de factores de crecimiento y moléculas pequeñas. Para las soluciones de stock, se enumeran todos los protocolos de concentración de stocks y protocolos de reconstitución.
|
Gelatina/Sacarosa Concentración final: 7,5%/15% p/p |
1. Pesar 15 g de sacarosa y 7,5 g de gelatina en una botella de vidrio Schott estéril y mezclar bien 2. Precalemente el PBS 1× a 65 oC 3. Agregue PBS 1 precalegado× a un peso final de 100 g y mezcle bien 4. Coloque la botella de vidrio Schott en una placa calefactora a 65 oC y agite hasta que la gelatina se derrita 5. Incubar a 37oC hasta que la solución se estabilice |
|
Glicina Concentración final: 0,1 M |
Añadir 0,37 g de glicina a 50 ml de PBS 1× recién preparado. |
|
Solución Tritón Concentración final: 0,1 % p/v |
1. Preparar una acción de 10 % Triton X-100: 5 g de Triton X-100 en 50 mL de PBS 1× 2. Agregue 0,5 mL de tritón X-100 a 50 mL de PBS 1×. |
|
TBST 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.05 % w/v Tween-20 |
20 mL Tris 1 M 30 mL NaCl 5 M 5 mL Tween-20 (10 % stock: 5 g de Tween-20 en agua de 50 ml) Llene a 1 L con agua. |
| Solución de bloqueo | Añadir 5 ml de suero bovino fetal (FBS, concentración final: 10 % v/v) a 50 ml de TBST. |
| Solución DAPI | Añadir 15 l de solución en stock de DAPI (1 mg/ml) a 10 ml de agua destilada |
| Mowiol | 1. Añadir 2,4 g de Mowiol a 6 g de glicerol y agitar durante 1 h en una placa precale calentada a 50 oC 2. Añadir 6 ml de agua destilada y agitar durante 2 horas 3. Añadir 12 mL de Tris 200 mM (pH 8.5) y agitar durante 10 min 4. Centrífuga a 5.000 × g durante 15 min 5. Aliquot y conservar a -20oC. |
Tabla 2: Soluciones para la preparación de organoides para criocciones e inmunosuchación. Se enumeran todos los componentes y volúmenes utilizados para preparar las soluciones utilizadas en la preparación de organoides para criocimiento e inmunosumanidad.
| Anticuerpo | Especies anfitrionas | Dilución |
| BARHL1 | Conejo | 1/500 |
| CALBINDIN | Conejo | 1/500 |
| MAP2 | Ratón | 1/1000 |
| N-CADHERIN | Ratón | 1/1000 |
| NESTIN | Ratón | 1/400 |
| OLIG2 | Conejo | 1/500 |
| PAX6 | Conejo | 1/400 |
| SOX2 | Ratón | 1/200 |
| TBR1 | Conejo | 1/200 |
| TBR2 | Conejo | 1/200 |
| TUJ1 | Ratón | 1/1000 |
Tabla 3: Anticuerpos primarios. Se enumeran los anticuerpos primarios, clones y diluciones optimizadas utilizados para la inmunosumanidad.
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Discussion
La necesidad de grandes números de células, así como condiciones de cultivo definidas para generar tipos celulares específicos para la detección de fármacos y aplicaciones de medicina regenerativa ha estado impulsando el desarrollo de sistemas de cultivo escalables. En los últimos años, varios grupos han reportado la generación escalable de progenitores neuronales y neuronas funcionales32,33,34, proporcionando avances significativos en el desarrollo de nuevos modelos para trastornos neurodegenerativos. Sin embargo, todavía falta la recapitulación de algunos acontecimientos críticos del desarrollo embrionario, y el mantenimiento de las neuronas funcionales generadas en suspensión durante largos períodos de tiempo aún no se ha logrado34. Aquí se presenta un sistema de cultivo 3D dinámico capaz de generar organoides neuronales derivados de iPSC con identidad cerebelosa, y para promover aún más la maduración en neuronas cerebelosas funcionales en condiciones químicamente definidas y libres de alimentadores en cultivo dinámico.
Antes de iniciar la diferenciación cerebelosa, es fundamental mantener la calidad de los iPSC humanos. Por lo tanto, para no comprometer la diferenciación, no deben realizarse más de tres pasajes de iPSC desde la descongelación hasta la inoculación del biorreactor. Un paso importante en el protocolo de diferenciación es evaluar el tamaño agregado. El tamaño agregado tiene un papel fundamental en la inducción de la diferenciación hacia un linaje celular específico29. Además de eso, hay un umbral de tamaño mínimo que parece favorecer la diferenciación35. Como ya se ha informado, el diámetro agregado óptimo derivado de iPSC para promover un compromiso neuronal eficiente31,32 y la diferenciación cerebelosa21 es un diámetro de 200 m.
Además, en este protocolo dinámico, la velocidad de agitación utilizada en los primeros días de cultivo es crucial para controlar el diámetro agregado y la inducción neuronal. El cultivo comenzó a 27 rpm, lo que es suficiente para promover la agregación de iPSC y evitar la formación de agregados más grandes (se deben evitar diámetros superiores a 350 m). La agitación utilizada para promover la agregación celular después de la siembra de una sola célula podría aumentarse a 30 rpm sin afectar la viabilidad celular; sin embargo, se espera que las velocidades de agitación más altas produzcan agregados más pequeños. Dependiendo de la línea iPSC, 24 h después de la siembra de celdas utilizando 27 rpm, se esperan dos escenarios diferentes: los agregados formados presentan diámetros más pequeños (<200 m) o han alcanzado un rango de tamaños entre 200-300 m. Si los agregados son mayores de 350 m a las 24 horas después de la siembra celular, no se debe realizar la diferenciación y se debe repetir la siembra celular, porque la eficiencia de la diferenciación será muy baja. Si los agregados son menores que 200 m, el medio gastado debe sustituirse por un medio de mantenimiento iPSC y la velocidad de agitación se reducirá a 25 rpm. Con este ajuste, se espera que el diámetro agregado aumente del día 1 al día 2, probablemente debido a la fusión de agregados individuales promovidos por la disminución de la velocidad de agitación. En el caso de los agregados con tamaños entre 200 y 300 m, el medio gastado debe sustituirse por un medio de diferenciación, y la inducción neuronal con FGF2 debe iniciarse después de 2 días en cultivo. En este punto, la velocidad de agitación también debe reducirse ligeramente para evitar la muerte excesiva celular, porque las células son más sensibles al estrés de cizallamiento en presencia de medio de diferenciación. Además, la homogeneidad de la población podría analizarse utilizando el coeficiente de variación (CV), que mide la variabilidad mediante la correlación de la desviación estándar con la media de los diámetros agregados, según la ecuación
en el que δ representa la desviación estándar del diámetro agregado y μ es el diámetro medio. En este sistema dinámico, el CV promedio observado fue de 12,5 ± 3,3% (media ± SD) para la línea celular F002.1A.13 y 19,0 ± 0,37% para la línea celular iPSC6.2 en el día 2. Por lo tanto, en este sistema, debe esperarse una población de tamaño homogéneo con un CV por debajo de 0,2 (< 20% de variación). Después de 7 días de diferenciación, el diámetro medio del agregado osciló entre 300 y 360 m, y la velocidad de agitación se incrementó a 30 rpm para evitar que los agregados se asentaran en la parte inferior del biorreactor de 0,1 L VW.
Recientemente se notificó la diferenciación de organoides cerebelosos hasta el día 35 y el análisis del tamaño agregado en condiciones estáticas21. Los autores mostraron que los agregados 3D se formaron y mantuvieron en placas (por ejemplo, Aggrewell) hasta el día 7 de diferenciación fueron homogéneos en tamaño y forma21. Sin embargo, después de transferir los agregados a placas de cultivo ultrabajos de unión de 6 pozos, los agregados comenzaron a variar en tamaño y morfología21. En el día 35 en condiciones estáticas, algunos de los agregados 3D alcanzaron 1.000 m para diferentes líneas celulares, lo que limitó la difusión de nutrientes y oxígeno. Por el contrario, utilizando nuestras condiciones dinámicas, los agregados no alcanzaron más de 800 m de diámetro para el día 35, con una transferencia de masa mejorada debido a la agitación constante del medio promovido por la rueda vertical. Además, los tamaños de los agregados se mantuvieron hasta el final del proceso de maduración, mostrando un diámetro agregado de 646,6 ± 104,2 m para el día 90, el cultivo más largo realizado en biorreactores de VW de 0,1 L.
La inducción cerebelosa eficiente fue inducida por la adición secuencial de SB431542, FGF2, FGF19 y SDF1 en este sistema dinámico 3D. El protocolo comienza con la combinación de SB431542, que es un bloqueador de receptores beta del factor de crecimiento transformador (TGF-o) que inhibe la diferenciación mesendodermal, y FGF2, que tiene un efecto importante en la caudalización del tejido neuroepitelial25. Por lo tanto, la adición de estas dos moléculas durante los primeros días de cultivo es esencial para promover la diferenciación celular a la mitad del cerebro trasero, el territorio que da lugar al tejido cerebeloso. Después de la inducción inicial al tejido de la mitad del hindbrain, es necesario añadir FGF19 para promover la generación espontánea de estructuras de la mitad del hindbrano con polaridad dorsal-ventral, así como la generación de diferentes progenitores cerebelosos36,26. SDF1 facilita la organización de distintas capas de progenitores cerebelosos, como se ve en la etapa de desarrollo en la que se produce la neurogénesis cerebelosa27. Hasta el día 35, estas moléculas pueden promover la organización de organoides cerebelosos que pueden recapitular el desarrollo cerebeloso humano, que corresponde al primer trimestre cerebelo. Después de la organización de los progenitores cerebelosos en diferentes capas, se utilizó un medio neuronal definido para promover su maduración28. Otros medios utilizados para mantener las células neuronales también podrían ser probados, pero se prevén menores eficiencias. Así, en este protocolo, BrainPhys se utilizó para promover la diferenciación de las células comprometidas con cerebeloso en neuronas cerebelosas, porque se ha informado para imitar mejor el ambiente neuronal saludable y para apoyar la actividad neurofisiológica de las neuronas generadas28.
Usando estas condiciones dinámicas, se puede lograr una difusión más eficiente de nutrientes, oxígeno y factores de crecimiento. Sin embargo, algunas limitaciones se asocian con la agitación utilizada en el protocolo de diferenciación. Parte del estrés de cizallamiento puede ser introducido por el proceso de agitación, que puede afectar la supervivencia, proliferación, y la diferenciación de las células. Por lo tanto, durante el paso de maduración, en el que las células son más sensibles, el cultivo debe ser cuidadosamente monitoreado.
La diferenciación de organoides cerebelosos que recuerdan al desarrollo cerebeloso embrionario humano ya se ha notificado7. Sin embargo, la maduración adicional de estos organoides cerebelosos embrionarios en neuronas cerebelosas utilizando cultivos 3D sigue siendo un desafío. La generación de neuronas cerebelosas funcionales sólo se logró coculturándose con células de gránulos de varias fuentes4,7,15. Este protocolo aumentó con éxito el compromiso cerebeloso de los iPSC humanos; además, este es el primer protocolo para la diferenciación de diferentes neuronas cerebelosas en un sistema de cultivo 3D sin coculturlar con células alimentadoras. Específicamente, se pueden producir los siguientes tipos de células en nuestro sistema de cultivo dinámico: células Purkinje (Calbindin+), células de gránulos (PAX6+/MAP2+),células de cepillo unipolar (TBR2+),y neuronas de proyección de núcleos cerebelosos profundos (TBR1+), que se mantuvieron en suspensión durante 3 meses.
La generación escalable de organoides cerebelosos representa una valiosa herramienta para estudiar el desarrollo embrionario del cerebelo y las vías patológicas implicadas en la degeneración de este órgano. Además, el cribado de alto rendimiento para moléculas que restauran la función cerebelosa se puede realizar utilizando organoides obtenidos con este sistema escalable. En general, este método satisface una necesidad insatisfecha de un protocolo escalable para la generación de organoides cerebelosos de alta calidad que pueden ser importantes para una variedad de aplicaciones biomédicas.
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Disclosures
Los autores YH y SJ son empleados de PBS Biotech. El autor BL es CEO y cofundador de PBS Biotech, Inc. Estos autores colaboradores participaron en el desarrollo de los biorreactores utilizados en el manuscrito. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de la revista sobre el intercambio de datos y materiales. Todos los demás autores no declaran ningún conflicto de intereses.
Acknowledgments
Esta obra fue apoyada por la Fundación Para la Ciudad y la Tecnología (FCT), Portugal (UIDB/04565/2020 a través del Programa Operacional Regional de Lisboa 2020, Proyecto N. 007317, PD/BD/105773/2014 a T.P.S y PD/BD/128376/2017 a D.E.S.N.), proyectos cofinanciados por FEDER (POR Lisboa 2020—Programación Operacional Regional de Lisboa PORTUGAL 32020) y FCT a través de la subvención PAC-PRECISE LISBOA-01-0145-FEDER-016394 y CEREBEX Generación de Organoides Cerebelosos para Ataxia Research subvención LISBOA-01-0145-FEDER-029298. La financiación también se recibió del Programa de Investigación e Innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea, en virtud del Acuerdo de Subvención número 739572—El Centro de Descubrimientos de Medicina Regenerativa y de Precisión H2020-WIDESPREAD-01-2016-2017.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3MM paper | WHA3030861 | Merck | |
| Accutase | A6964 - 500mL | Sigma | cell detachment medium |
| Anti-BARHL1 Antibody | HPA004809 | Atlas Antibodies | |
| Anti-Calbindin D-28k Antibody | CB28 | Millipore | |
| Anti-MAP2 Antibody | M4403 | Sigma | |
| Anti-N-Cadherin Antibody | 610921 | BD Transduction | |
| Anti-NESTIN Antibody | MAB1259-SP | R&D | |
| Anti-OLIG2 Antibody | MABN50 | Millipore | |
| Anti-PAX6 Antibody | PRB-278P | Covance | |
| Anti-SOX2 Antibody | MAB2018 | R&D | |
| Anti-TBR1 Antibody | AB2261 | Millipore | |
| Anti-TBR2 Antibody | ab183991 | Abcam | |
| Anti-TUJ1 Antibody | 801213 | Biolegend | |
| Apo-transferrin | T1147 | Sigma | |
| BrainPhys Neuronal Medium N2-A & SM1 Kit | 5793 - 500mL | Stem cell tecnhnologies | |
| Chemically defined lipid concentrate | 11905031 | ThermoFisher | |
| Coverslips 24x60mm | 631-1575 | VWR | |
| Crystallization-purified BSA | 5470 | Sigma | |
| DAPI | 10236276001 | Sigma | |
| Dibutyryl cAMP | SC- 201567B -500mg | Frilabo | |
| DMEM-F12 | 32500-035 | ThermoFisher | |
| Fetal bovine serum | A3840001 | ThermoFisher | |
| Gelatin from bovine skin | G9391 | Sigma | |
| Glass Copling Jar | E94 | ThermoFisher | |
| Glutamax I | 10566-016 | ThermoFisher | |
| Glycine | MB014001 | NZYtech | |
| Ham’s F12 | 21765029 | ThermoFisher | |
| Human Episomal iPSC Line | A18945 | ThermoFisher | iPSC6.2 |
| IMDM | 12440046 | ThermoFisher | |
| Insulin | 91077C | Sigma | |
| iPS DF6-9-9T.B | WiCell | ||
| Iso-pentane | PHR1661-2ML | Sigma | |
| L-Ascorbic acid | A-92902 | Sigma | |
| Matrigel | 354230 | Corning | basement membrane matrix |
| Monothioglycerol | M6154 | Sigma | |
| Mowiol | 475904 | Millipore | mounting medium |
| mTeSR1 | 85850 -500ml | Stem cell technologies | |
| N2 supplement | 17502048 | ThermoFisher | |
| Neurobasal | 12348017 | ThermoFisher | |
| Paraformaldehyde | 158127 | Sigma | |
| PBS-0.1 Single-Use Vessel | SKU: IA-0.1-D-001 | PBS Biotech | |
| PBS-MINI MagDrive Base Unit | SKU: IA-UNI-B-501 | PBS Biotech | |
| Recombinant human BDNF | 450-02 | Peprotech | |
| Recombinant human bFGF/FGF2 | 100-18B | Peprotech | |
| Recombinant human FGF19 | 100-32 | Peprotech | |
| Recombinant human GDNF | 450-10 | Peprotech | |
| Recombinant human SDF1 | 300-28A | Peprotech | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | 72302 | Stem cell technologies | |
| SB431542 | S4317 | Sigma | |
| Sucrose | S7903 | Sigma | |
| SuperFrost Microscope slides | 12372098 | ThermoFisher | adhesion microscope slides |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | 25608-930 | VWR | |
| Tris-HCL 1M | T3038-1L | Sigma | |
| Triton X-100 | 9002-93-1 | Sigma | |
| Tween-20 | P1379 | Sigma | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | 15575020 | ThermoFisher |
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