Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

ह्यूमन प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल और इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा लक्षण वर्णन से परिपक्व सेरिबेलर ऑर्गेनॉइड की स्केलेबल जनरेशन

Published: June 13, 2020 doi: 10.3791/61143
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1,2,3, 4, 4, 4, 2, 1
1iBB - Institute for Bioengineering and Biosciences and Department of Bioengineering, Instituto Superior Técnico, Universidade de Lisboa, 2Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 3The Discoveries Centre for Regenerative and Precision Medicine, Lisbon Campus, Universidade de Lisboa, 4PBS Biotech, Inc, Camarillo, CA, USA

Summary

यह प्रोटोकॉल मानव बहुल स्टेम कोशिकाओं के नियंत्रित आकार के समुच्चय का उत्पादन करने के लिए एक गतिशील संस्कृति प्रणाली का वर्णन करता है और एकल उपयोग बायोरिएक्टर का उपयोग करके रासायनिक रूप से परिभाषित और फीडर-मुक्त स्थितियों के तहत सेरिबेलर ऑर्गेनॉइड में भेदभाव को और प्रोत्साहित करता है।

Abstract

सेरिबैलम संतुलन और मोटर समन्वय के रखरखाव में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, और विभिन्न सेरिबेलर न्यूरॉन्स में एक कार्यात्मक दोष सेरिबेलर डिसफंक्शन को ट्रिगर कर सकता है। रोग से संबंधित न्यूरोनल फेनोटाइप के बारे में वर्तमान ज्ञान के अधिकांश पोस्टमॉर्टम ऊतकों पर आधारित है, जो रोग प्रगति और विकास की समझ मुश्किल बनाता है । न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों के लिए मॉडल के रूप में पशु मॉडल और अमर सेल लाइनों का भी उपयोग किया गया है। हालांकि, वे पूरी तरह से मानव रोग का पुनर्पूंजीकरण नहीं करते हैं। मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (आईपीएससी) रोग मॉडलिंग के लिए महान क्षमता है और पुनर्योजी दृष्टिकोण के लिए एक मूल्यवान स्रोत प्रदान करते हैं । हाल के वर्षों में, रोगी-व्युत्पन्न आईपीएससी से सेरेब्रल ऑर्गेनॉइड की पीढ़ी ने न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग मॉडलिंग की संभावनाओं में सुधार किया। हालांकि, प्रोटोकॉल है कि ऑर्गेनॉइड की बड़ी संख्या का उत्पादन और 3 डी संस्कृति प्रणालियों में परिपक्व न्यूरॉन्स की एक उच्च उपज की कमी है । प्रस्तुत प्रोटोकॉल स्केलेबल एकल उपयोग बायोरिएक्टरों का उपयोग करके रासायनिक रूप से परिभाषित स्थितियों के तहत मानव आईपीएससी-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड की प्रजनन योग्य और स्केलेबल पीढ़ी के लिए एक नया दृष्टिकोण है, जिसमें ऑर्गेनॉइड सेरिबेलर पहचान प्राप्त करते हैं। उत्पन्न ऑर्गेनॉइड को एमआरएनए और प्रोटीन दोनों स्तर पर विशिष्ट मार्कर की अभिव्यक्ति की विशेषता है। प्रोटीन के विशिष्ट समूहों का विश्लेषण विभिन्न सेरिबेलर सेल आबादी का पता लगाने की अनुमति देता है, जिसका स्थानीयकरण ऑर्गेनॉइड संरचना के मूल्यांकन के लिए महत्वपूर्ण है। ऑर्गेनॉइड क्रायोसेक्शनिंग और ऑर्गेनॉइड स्लाइस के आगे इम्यूनोसटेनिंग का उपयोग विशिष्ट सेरिबेलर सेल आबादी और उनके स्थानिक संगठन की उपस्थिति का मूल्यांकन करने के लिए किया जाता है।

Introduction

मानव बहुल स्टेम सेल (पीएससी) का उद्भव पुनर्योजी दवा और रोग मॉडलिंग के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है, क्योंकि इन कोशिकाओं को मानव शरीर के अधिकांश सेल वंश में अंतर किया जा सकता है1,,2। उनकी खोज के बाद से, विभिन्न दृष्टिकोणों का उपयोग करके पीएससी भेदभाव को विभिन्न रोगों को मॉडल करने के लिए सूचित किया गया है, जिसमें न्यूरोडीजेनेरेटिव विकार3,,4,,5,,6शामिल हैं।

हाल ही में, मानव मस्तिष्क संरचनाओं जैसी पीएससी से प्राप्त 3 डी संस्कृतियों की रिपोर्टें आई हैं; ये कहाजाताहै ब्रेन ऑर्गेनॉइड 3,7,8. स्वस्थ और रोगी-विशिष्ट पीएससी दोनों से इन संरचनाओं का उत्पादन मानव विकास और न्यूरोडेवलपमेंटल विकारों को मॉडल करने का एक मूल्यवान अवसर प्रदान करता है। हालांकि, इन अच्छी तरह से संगठित मस्तिष्क संरचनाओं को उत्पन्न करने के लिए उपयोग किए जाने वाले तरीकों को उनके बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए लागू करना मुश्किल है। ऑर्गेनॉइड के अंदर परिगलित किए बिना ऊतक मॉर्फोजेनेसिस को फिर से शुरू करने के लिए काफी बड़ी संरचनाओं का उत्पादन करने के लिए, प्रोटोकॉल स्थिर परिस्थितियों में प्रारंभिक तंत्रिका प्रतिबद्धता पर भरोसा करते हैं, इसके बाद हाइड्रोगेल में एनकैप्सुलेशन और गतिशील प्रणालियों में बाद की संस्कृति3। हालांकि, इस तरह के दृष्टिकोण ऑर्गेनॉइड उत्पादन के संभावित पैमाने को सीमित कर सकते हैं। हालांकि केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के विशिष्ट क्षेत्रों में पीएससी भेदभाव को निर्देशित करने के प्रयास किए गए हैं, जिनमें कॉर्टिकल, स्ट्राटाल, मिडब्रेन और रीढ़ की हड्डी के न्यूरॉन्स9,10,,,11,,12शामिल हैं, गतिशील परिस्थितियों में विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों की पीढ़ी अभी भी एक चुनौती है। विशेष रूप से, 3 डी संरचनाओं में परिपक्व सेरिबेलर न्यूरॉन्स की पीढ़ी का वर्णन अभी बाकी है। मुगुरूमा एट अल ने संस्कृति की स्थितियों की पीढ़ी का बीड़ा उठाया है जो प्रारंभिक सेरिबेलर विकास13 को पुनः प्राप्त करता है और हाल ही में एक प्रोटोकॉल की सूचना देता है जो मानव भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं को पहली तिमाही सेरिबैलम7की याद ताजा करने वाली ध्रुवीकृत संरचना उत्पन्न करने की अनुमति देता है। हालांकि, रिपोर्ट किए गए अध्ययनों में सेरिबेलर न्यूरॉन्स की परिपक्वता के लिए ऑर्गेनॉइड के वियोजन, सेरिबेलर जनकों की छंटाई और मोनोलेयर संस्कृति प्रणाली7,14, 15,,,16में फीडर कोशिकाओं के साथ सहसंस्कृति की आवश्यकता होती है।,15 इसलिए, परिभाषित परिस्थितियों में रोग मॉडलिंग के लिए वांछित सेरिबेलर ऑर्गेनॉइड की प्रजनन योग्य पीढ़ी अभी भी संस्कृति और फीडर स्रोत परिवर्तनशीलता से जुड़ी एक चुनौती है।

यह प्रोटोकॉल एकल उपयोग ऊर्ध्वाधर व्हील बायोरिएक्टर (विनिर्देशों के लिए सामग्री की तालिका देखें), इसके बाद बायोरिएक्टर कहा जाता है, का उपयोग करते हुए सेरिबेलर न्यूरॉन्स में मानव पीएससी के 3 डी विस्तार और कुशल भेदभाव के लिए इष्टतम संस्कृति की स्थिति प्रस्तुत करता है। बायोरिएक्टर एक बड़े ऊर्ध्वाधर इम्पेलर से लैस हैं, जो यू-आकार के नीचे के संयोजन में, पोत के अंदर एक अधिक सजातीय कतरनी वितरण प्रदान करते हैं, जिससे कम आंदोलन की गति17के साथ कोमल, समान मिश्रण और कण निलंबन की अनुमति मिलती है। इस प्रणाली के साथ, आकार और आकार नियंत्रित सेल समुच्चय प्राप्त किया जा सकता है, जो अधिक सजातीय और कुशल भेदभाव के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, कम श्रमसाध्य तरीके से बड़ी संख्या में आईपीएससी-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड उत्पन्न किए जा सकते हैं।

ऑर्गेनॉइड की मुख्य विशेषता, जो आमतौर पर स्टेम सेल से बनने वाली 3 डी बहुकोशिकीय संरचनाएं हैं, विभिन्न कोशिका प्रकारों का आत्म-संगठन है,जो मानव मॉर्फोजेनेसिस18, 19,20में देखे गए विशिष्ट आकार बनाता है।,19 इसलिए, ऑर्गेनॉइड आकृति विज्ञान एक महत्वपूर्ण कसौटी है जिसे भेदभाव प्रक्रिया के दौरान मूल्यांकन किया जाना है। ऑर्गेनॉइड का क्रायोसेक्शनिंग और एंटीबॉडी के एक विशिष्ट सेट के साथ ऑर्गेनॉइड स्लाइस का आगे इम्यूनोसटेनिंग कोशिका प्रसार, भेदभाव, सेल जनसंख्या पहचान और एपोप्टोसिस का विश्लेषण करने के लिए आणविक मार्कर के स्थानिक दृश्य की अनुमति देता है। इस प्रोटोकॉल के साथ, ऑर्गेनॉइड क्रायोसेक्शन को इम्यूनोसटेन करके, भेदभाव के 7वें दिन तक एक प्रारंभिक कुशल तंत्रिका प्रतिबद्धता देखी जाती है। भेदभाव के दौरान, सेरिबेलर पहचान के साथ कई सेल आबादी देखी जाती है। इस गतिशील प्रणाली में 35 दिनों के बाद, सेरिबेलर न्यूरोएपिथेलियम एक एपिकोबासल धुरी के साथ आयोजित होता है, जिसमें जनक जनक और बेसली स्थित पोस्टमिटोटिक न्यूरॉन्स की एक एपिकल परत होती है। परिपक्वता प्रक्रिया के दौरान, भेदभाव के 35-90 दिनों से, सेरिबेलर न्यूरॉन्स के विशिष्ट प्रकार देखा जा सकता है, जिसमें पुरकिंजे कोशिकाएं (कैल्बिन्डिन+),ग्रैन्यूल कोशिकाएं (पैक्स6+ /MAP2+),गोलगी कोशिकाएं (न्यूरोग्रेन +), एकध्रुक्षुक्षु ब्रश कोशिकाएं (टीबीआर2+),और गहरे सेरिबेलर नाभिक अनुमानों न्यूरॉन्स (टी 1बीआर+)शामिल हैं।+ इसके अलावा, संस्कृति में 90 दिनों के बाद उत्पन्न सेरिबेलर ऑर्गेनॉइड में सेल डेथ की एक गैर-विशिष्ट मात्रा देखी जाती है।

इस प्रणाली में, मानव आईपीएससी-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड विभिन्न सेरिबेलर न्यूरॉन्स में परिपक्व होते हैं और वियोजन और फीडर कोसंस्कृति की आवश्यकता के बिना 3 महीने तक जीवित रहते हैं, जो रोग मॉडलिंग के लिए मानव सेरिबेलर न्यूरॉन्स का स्रोत प्रदान करते हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. मोनोलेयर संस्कृति में मानव आईपीएससी का पासेजिंग और रखरखाव

  1. प्लेटों की तैयारी
    1. बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स गल (सामग्री की मेजदेखें) 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टॉक और 60 μL aliquots तैयार करते हैं। -20 डिग्री सेल्सियस पर एलिकोट्स फ्रीज करें।
    2. एक 6 अच्छी तरह से थाली के कुओं कोट करने के लिए, बर्फ पर तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के एक aliquot गल । एक बार गल डीएमईएम-एफ 12 के 6 एमसीएल में 60 माइक्रोल जोड़ें। धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पाइपिंग करके रीसस्लपेंड करें।
    3. एक 6 अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में पतला तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स समाधान के 1 एमएल जोड़ें और 1 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर पास बढ़ने या स्टोर करने से पहले कम से कम 1 घंटे के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें।
  2. ईडीटीए के साथ आईपीएससी कॉलोनियों की पासिंग
    1. 37 डिग्री सेल्सियस, 95% आर्द्रता, और 5% सीओ 2 पर इनक्यूबेटर में 6 अच्छी प्लेटों में मोनोलेयर संस्कृति में आईपीएससी बनाएरखें।
      नोट: इस प्रोटोकॉल में, तीन अलग-अलग मानव आईपीएससी लाइनों का उपयोग किया गया था: F002.1A.1321,मानव एपिसोमल आईपीएससी लाइन (आईपीएससी 6.2)22,और व्यावसायिक रूप से प्राप्त आईपीएस-डीएफ6-9-9T.B (सामग्री की तालिकादेखें)।
    2. पासिंग से पहले, स्टोर की गई प्लेटों (चरण 1.1) को कमरे के तापमान (आरटी) पर 15 मिनट के लिए बढ़ाएं और mTesR1 माध्यम(तालिका 1)तैयार करें।
    3. सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके प्लेट से समाधान को एएसपिरेट करें और तुरंत प्रत्येक अच्छी तरह से mTeSR1 माध्यम के 0.5 एमएल जोड़ें।
    4. खर्च किए गए माध्यम को अच्छी तरह से आईपीएससी युक्त से हटाएं और एक बार 0.5 m EDTA के 1 मिलियन का उपयोग करके धोएं।
    5. प्रत्येक कुएं में 0.5 m EDTA का 1 मिलियन एलए जोड़ें और 5 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें।
    6. EDTA को एस्पिरेट करें और धीरे-धीरे mTeSR1 माध्यम जोड़कर और P1000 माइक्रोपिपेट का उपयोग करके कालोनियों को पाइपिंग करके कोशिकाओं को हटा दें। कोशिकाओं को शंकु नली में इकट्ठा करें।
      नोट: 3x से अधिक कोशिकाओं को ऊपर और नीचे न करें।
    7. सेल निलंबन के 1 एमएल जोड़ें (पतला 1:4) प्रत्येक अच्छी तरह से ताकि प्रत्येक अच्छी तरह से कोशिका निलंबन के बाद माध्यम के 1.5 एमएल होते हैं। 5% सीओ2, 37डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर को वापसी कोशिकाओं।
    8. खर्च किए गए माध्यम को प्रतिदिन बदलें और हर 3 दिन में 75%-80% संगम प्राप्त होने पर पारित हों।

2. बायोरिएक्टर में मानव आईपीएससी की सीडिंग

  1. एमटीएसआर1 में मोनोलेयर के रूप में उगाए जाने वाले इनक्यूबेट आईपीएससी में रॉक अवरोधक वाई-27632 (आरओकेआई) के 10 माइक्रोन के साथ पूरक किया गया है। एक 6 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेट से प्रत्येक अच्छी तरह से पूरक माध्यम के 1 मिलीएल जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस, 95% आर्द्रता, और 5% सीओ 2 पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेटकरें।
    नोट: ROCKi का उपयोग एपोप्टोसिस23से अलग आईपीएससी की रक्षा के लिए किया जाता है ।
  2. इनक्यूबेशन के 1 घंटे के बाद, प्रत्येक अच्छी तरह से खर्च किए गए माध्यम को एस्पिरेट करें और 1x को 1× पीबीएस के 1 एमएल के साथ अच्छी तरह से धोएं।
  3. कोशिका टुकड़ी माध्यम के 1 मिलीएल जोड़ें (सामग्री की मेजदेखें) एक 6 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में और 7 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट जब तक कोशिकाओं कोमल मिलाते हुए के साथ कुओं से आसानी से अलग ।
  4. पिपेट सेल टुकड़ी माध्यम ऊपर और नीचे एक P1000 माइक्रोपिपेट के साथ जब तक कोशिकाओं को अलग और एकल कोशिकाओं में अलग । एंजाइमेटिक पाचन को निष्क्रिय करने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से पूर्ण कोशिका संस्कृति माध्यम के 2 एमएल जोड़ें और कोशिकाओं को धीरे-धीरे बाँझ शंकु नली में पिपेट करें।
  5. 3 मिनट के लिए 210 × जी पर सेंट्रलाइज करें और सुपरनेट को हटा दें।
  6. संस्कृति माध्यम में सेल गोली को फिर से रीसुस्ट करें (यानी, आरओसीके के 10 माइक्रोन के साथ पूरक mTeSR1) और ट्राइपैन ब्लू डाई का उपयोग करके हीमोसाइटोमीटर के साथ आईपीएससी की गणना करें।
  7. बीज 15 × बायोरिएक्टर में6 एकल कोशिकाओं (100 एमएल की अधिकतम मात्रा) के साथ 60 एमएल mTeSR1 के साथ 250,000 कोशिकाओं/एमएल के अंतिम सेल घनत्व पर आरओसीकी के 10 माइक्रोन के साथ पूरक।
  8. इनक्यूबेटर में रखी यूनिवर्सल बेस यूनिट में आईपीएससी युक्त पोत को 37 डिग्री सेल्सियस, 95% आर्द्रता और 5% सीओ2 डालें।
    नोट: आईपीएससी एकत्रीकरण को बढ़ावा देने के लिए 27 आरपीएम के लिए यूनिवर्सल बेस यूनिट कंट्रोल सेट करके बायोरिएक्टर सरगर्मी को 24 घंटे के लिए बनाए रखा जाता है ।

3. सेरिबेलर ऑर्गेनॉइड में मानव आईपीएससी-व्युत्पन्न समुच्चय का भेदभाव और परिपक्वता

  1. एकल कोशिका सीडिंग के दिन को 0 दिन के रूप में परिभाषित करें।
  2. 1 दिन, आईपीएससी के 1 एमसीएल एकत्र एक सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग कर नमूना एकत्र करें। नमूना एकत्र करने से पहले एक बाँझ प्रवाह में समुच्चय युक्त बायोरिएक्टर के साथ सार्वभौमिक आधार इकाई रखकर आंदोलन के तहत बायोरिएक्टर को बनाए रखें। एक अल्ट्रा कम लगाव 24 अच्छी तरह से थाली में सेल निलंबन प्लेट। चेक करें कि आईपीएससी-व्युत्पन्न समुच्चय बनते हैं।
  3. कुल व्यास को मापने के लिए 40x या 100x के कुल आवर्धन का उपयोग करके ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के साथ छवियों को प्राप्त करें।
  4. फिजी सॉफ्टवेयर का उपयोग करके प्रत्येक छवि में समुच्चय के क्षेत्र को मापें।
    1. चुनें "विश्लेषण करें । मेनू बार से माप सेटकरें "और "क्षेत्र"और"ठीक है"पर क्लिक करें।
    2. चुनें "फाइल । एकसंग्रहीत छवि फ़ाइल खोलने के लिए मेनू बार से खोलें। टूल बार में प्रस्तुत लाइन चयन उपकरण का चयन करें और छवि में प्रस्तुत स्केल बार पर एक सीधी रेखा बनाएं। चुनें "विश्लेषण करें । मेनू बार से स्केल सेट करें"
    3. "ज्ञात दूरी"में माइक्रोन में छवि के स्केल बार का विस्तार जोड़ें। "लंबाई की इकाई"को माइक्रोन के रूप में परिभाषित करें। सेटिंग और'ओके'बनाए रखने के लिए'ग्लोबल'पर क्लिक करें। टूल बार में ओवल चयन का चयन करें।
    4. प्रत्येक कुल के लिए अंडाकार उपकरण के साथ क्षेत्र को चित्रित करें। चुनें "विश्लेषण करें । उपाय"। मापा क्षेत्र के आधार पर उनके व्यास की गणना, विचार है कि समुच्चय लगभग गोलाकार का उपयोग कर रहे है
      Equation 1
      कुल के क्षेत्र के रूप में एक के साथ।
  5. जब समुच्चय का औसत व्यास 100 माइक्रोन होता है, तो आरओसीकी के बिना ताजा mTeSR1 के साथ खर्च किए गए माध्यम का 80% बदलें। जब एकत्रक व्यास में 200-250 माइक्रोन तक पहुंचते हैं, तो सभी खर्च किए गए माध्यम को जीएफसीडीएम(तालिका 1)के साथ बदल दें, जिससे ऑर्गेनॉइड बायोरिएक्टर के नीचे व्यवस्थित हो जाते हैं।
    नोट: यदि औसत कुल व्यास 350 माइक्रोन से अधिक है तो भेदभाव प्रोटोकॉल शुरू नहीं करते हैं। एकल कोशिकाओं की सीडिंग दोहराएं। आम तौर पर, कुल 100 माइक्रोन के औसत व्यास तक पहुंचने में लगभग 1 दिन लगते हैं।
  6. इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस, 95% आर्द्रता, और 5% सीओ2पर रखी यूनिवर्सल बेस यूनिट में समुच्चय युक्त बायोरिएक्टर डालें।
  7. बायोरिएक्टर आंदोलन को घटाकर 25 आरपीएम कर दिया जाए।
  8. दूसरे दिन, कुल व्यास का मूल्यांकन करने के लिए 3.2, 3.3 और 3.4 चरणों को दोहराएं। GFCDM विभेदन माध्यम(तालिका1) के 60 मिलियनल में FGF2 (अंतिम एकाग्रता, 50 एनजी/एमएल) और एसबी431542 (अंतिम एकाग्रता, 10 माइक्रोन) के 60 माइक्रोनल जोड़ें। पूरक gfCDM के साथ बायोरिएक्टर से सभी खर्च किए गए माध्यम को बदलें। दोहराएं चरण 3.6।
    नोट: SB431542 mesendodermal भेदभाव को बाधित करने के लिए महत्वपूर्ण है, तंत्रिका भेदभाव24inducing । एफजीएफ 2 का उपयोग न्यूरोएपिथेलियल ऊतक25के कौडलीकरण को बढ़ावा देने के लिए किया जाता है ।
  9. 5 दिन, दोहराने कदम 3.2, 3.3, 3.4, और 3.8.
    नोट: भेदभाव प्रोटोकॉल के दौरान कुल आकार में वृद्धि होनी चाहिए। हालांकि, जब भेदभाव शुरू होता है तो व्यास केवल महत्वपूर्ण होता है, क्योंकि यह पैरामीटर भेदभाव की प्रभावकारिता को प्रभावित कर सकता है।
  10. 7 दिन, दोहराने कदम 3.2, 3.3, और 3.4. तनु FGF2 और SB431542 से 2/3: FGF2 के 20 माइक्रोन और GFCDM भेदभाव माध्यम के 60 एमसीएल के SB431542 के 40 माइक्रोन जोड़ें। पूरक gfCDM के साथ बायोरिएक्टर से सभी खर्च किए गए माध्यम को बदलें। स्टेप 3.6 दोहराएं और बायोरिएक्टर आंदोलन को बढ़ाकर 30 आरपीएम करें।
  11. 14 दिन, दोहराने कदम 3.2, 3.3, और 3.4. GFCDM विभेदन माध्यम के 60 एमएल के लिए FGF19 (अंतिम एकाग्रता, 100 एनजी/एमएल) के 60 μL जोड़ें। बायोरिएक्टर से खर्च किए गए सभी माध्यम को FGF19 के साथ पूरक gfCDM के साथ बदलें। दोहराएं चरण 3.6।
    नोट: FGF19 का उपयोग मध्य-हिम्ब्राइनसंरचनाओं 26के ध्रुवीकरण को बढ़ावा देने के लिए किया जाता है ।
  12. 18 दिन, दोहराने कदम 3.2, 3.3, 3.4, और 3.11.
  13. 21 दिन, दोहराने कदम 3.2, 3.3, और 3.4. बायोरिएक्टर से खर्च किए गए सभी माध्यमों को पूर्ण न्यूरोबेसल माध्यम(तालिका 1)से बदलें। दोहराएं चरण 3.6।
    नोट: न्यूरोबेसल माध्यम एक बेसल माध्यम है जो ऑर्गेनॉइड 7 के भीतर न्यूरोनल सेल आबादी को बनाए रखने के लिए उपयोग कियाजाताहै।
  14. 28 दिन, दोहराने कदम 3.2, 3.3, और 3.4. पूर्ण न्यूरोबेसल माध्यम के 60 एमएल में एसडीएफ1 (अंतिम एकाग्रता, 300 एनजी/एमएल) के 180 माइक्रोन जोड़ें। बायोरिएक्टर से सभी खर्च किए गए माध्यम को एसडीएफ1 के साथ पूरक पूर्ण न्यूरोबेसल माध्यम के साथ बदलें। दोहराएं चरण 3.6।
    नोट: SDF1 का उपयोग अलग सेल परतों27के संगठन को सुविधाजनक बनाने के लिए किया जाता है ।
  15. दिन 35 पर, 3.2, 3.3, और 3.4 कदम दोहराएं। बायोरिएक्टर से खर्च किए गए सभी माध्यमों को पूर्ण ब्रेनफिज माध्यम(टेबल 1)से बदलें। दोहराएं चरण 3.6।
    नोट: ब्रेनफिज एक न्यूरोनल माध्यम है जो सिंएप्टिक रूप से सक्रिय न्यूरॉन्स28का समर्थन करता है।
  16. अंतर के दिन 90 तक पूर्ण BrainPhys माध्यम के साथ हर 3 दिनों में कुल मात्रा के 1/3 की जगह ।

4. क्रायोसेक्शनिंग और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए ऑर्गेनॉइड तैयार करना

  1. इम्यूनोदाता के लिए ऑर्गेनॉइड का संग्रह
    1. बायोरिएक्टर से 15 एमएल शंकुदाता के लिए एक सीरोलॉजिकल पिपेट के साथ मध्यम युक्त ऑर्गेनॉइड के नमूने का 1 एमएल एकत्र करें।
      नोट: 7, 14, 21, 35, 56, 70, 80 और 90 दिनों सहित भेदभाव की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए ऑर्गेनॉइड को अलग-अलग समय बिंदुओं पर एकत्र किया जाना चाहिए।
    2. सुपरनेट निकालें और 1× पीबीएस के 1 एमसीएल के साथ एक बार धोएं।
      नोट: ऑर्गेनॉइड को अपकेंद्रित्र न करें। ऑर्गेनॉइड को गुरुत्वाकर्षण द्वारा ट्यूब के तल पर व्यवस्थित होने दें।
    3. सुपरनेट निकालें और 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के 1 एमसीएल जोड़ें। 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट। खर्च किए गए पीएफए को हटा दें और 1× पीबीएस के 1 एमएल जोड़ें।
    4. क्रोस्ेक्शनिंग के लिए प्रोसेसिंग तक 1× पीबीएस के 1 एमएल में ऑर्गेनॉइड को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: फिक्सेशन के बाद 1x पीबीएस में ऑर्गेनॉइड को 1 सप्ताह से अधिक समय तक स्टोर करें।
  2. क्रायोसेक्शनिंग के लिए ऑर्गेनॉइड तैयार करना
    1. संग्रहित ऑर्गेनॉइड से सुपरनिटेंट निकालें। 15% सुक्रोज (w/v, 1× पीबीएस में पतला) का 1 एमएल जोड़ें, कोमल घूमता द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं, और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    2. 15% सुक्रोज/7.5% जिलेटिन(टेबल 2)का समाधान तैयार करें और जिलेटिन को जमना से बचने के लिए तैयारी के दौरान 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें।
    3. 15% सुक्रोज समाधान निकालें, ऑर्गेनॉइड में 15% सुक्रोज/7.5% जिलेटिन के 1 एमएल जोड़ें, और कोमल घूमता द्वारा जल्दी से मिलाएं। 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
    4. एक प्लास्टिक कंटेनर के लिए 15% सुक्रोज/७.५% जिलेटिन समाधान जोड़ें इसकी मात्रा का आधा तक । आरटी में ठोसकरण के लिए प्रतीक्षा करें ।
    5. 1 घंटे इनक्यूबेशन के बाद, ध्यान से एक सुक्रोज/जिलेटिन ड्रॉप रखें जिसमें एक पाश्चर पिपेट के साथ जम जिलेटिन पर ऑर्गेनॉइड होता है। के बारे में 15 मिनट के लिए आरटी पर जमना छोड़ दें । बुलबुला गठन से बचने के लिए सुनिश्चित करें।
    6. जब तक कंटेनर भर न जाए तब तक ऑर्गेनॉइड के शीर्ष पर 15% सुक्रोज/7.5% जिलेटिन रखें। आरटी में पूर्ण ठोसकरण के लिए प्रतीक्षा करें।
    7. जमना के बाद 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट की कमी करें।
    8. जिलेटिन को केंद्र में ऑर्गेनॉइड युक्त घन में काटें और ओ.C टी यौगिक की एक बूंद के साथ गत्ते के एक टुकड़े पर जिलेटिन घन को ठीक करें।
    9. 500 एमएल कप में आइसोपेन की 250 एमएल रखें और लिक्विड नाइट्रोजन के साथ एक उपयुक्त कंटेनर भरें। संदंश और मोटे दस्ताने का उपयोग करके, तरल नाइट्रोजन की सतह पर आइसोपेंटेन युक्त कप को सावधानी से रखें और आइसोपेंटेन को -80 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें।
    10. जब -80 डिग्री सेल्सियस पहुंच जाता है, तो जिलेटिन क्यूब को आइसोपेन युक्त कप में तब तक रखें जब तक कि यह जमा न हो जाए, तापमान को -80 डिग्री सेल्सियस पर रखें। घन के आकार के आधार पर, इसमें 1-2 मिनट लग सकते हैं।
      नोट: -80 डिग्री सेल्सियस या अत्यधिक ठंड समय से नीचे के तापमान से बचें, क्योंकि यह घन के खुर का कारण बन सकता है।
    11. जब जमे हुए, जल्दी से -80 डिग्री सेल्सियस पर जिलेटिन घन स्टोर और क्रायोसेक्शनिंग तक स्टोर करें।
  3. ऑर्गेनॉइड का क्रायोसेक्शनिंग
    1. क्रायोस्टेट चालू करें और -25 डिग्री सेल्सियस पर नमूना (ओटी) और क्रायोचैम्बर (सीटी) तापमान दोनों को परिभाषित करें।
    2. जब दोनों तापमान स्थिर हो जाते हैं, तो ओ.C टी यौगिक का उपयोग करके नमूने पर ऑर्गेनॉइड युक्त जिलेटिन घन को ठीक करें।
    3. 12 माइक्रोन पर अनुभाग मोटाई को परिभाषित करें।
    4. घन को काटें और आसंजन माइक्रोस्कोप स्लाइड पर 3-4 स्लाइस एकत्र करें (सामग्री की तालिकादेखें)।
    5. उपयोग होने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. ऑर्गेनॉइड स्लाइस का इम्यूनोदाता
    1. प्रीवार्मेड 1x पीबीएस के 50 एमएल के साथ एक कॉपलिंग जार में ऑर्गेनॉइड सेक्शन युक्त माइक्रोस्कोप स्लाइड रखें, जो 10 स्लाइड्स को बैक-टू-बैक तक पकड़े हुए हैं।
      नोट: सभी ऑर्गेनॉइड वर्गों को तरल के साथ जलमग्न किया जाना चाहिए।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए इनक्यूबेट स्लाइड को डिजेलटिनाइज करने के लिए।
    3. आरटी में 5 मिनट के लिए 1× पीबीएस के 50 एमएल के साथ 1x धोएं: स्लाइड को ताजा 1× पीबीएस वाले एक कॉपलिंग जार में स्थानांतरित करें।
    4. स्लाइड्स को एक कॉपलिंग जार में स्थानांतरित करें जिसमें 50 एमएल हौसले से तैयार ग्लाइसिन(टेबल 2)और आरटी में 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया है।
    5. स्लाइड्स को 0.1% ट्राइटन(टेबल 2)के 50 एमएल वाले कॉपलिंग जार में स्थानांतरित करें और आरटी में 10 मिनट के लिए परमीलाइज करें।
    6. 5 मिनट 2x के लिए 1× पीबीएस के साथ धो लें।
    7. 1× पीबीएस में भिगोए गए 3 एमएम पेपर के साथ इम्यूनोस्टेपिंग डिश तैयार करें। स्लाइस के चारों ओर एक ऊतक के साथ सूखी स्लाइड और उन्हें 3 मिमी कागज पर रखें। एक पाश्चर पिपेट के साथ, स्लाइड की पूरी सतह को ब्लॉकिंग समाधान(टेबल 2)के साथ ~ 0.5 एमएल प्रति स्लाइड के साथ कवर करें। आरटी में 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट ।
    8. अतिरिक्त अवरुद्ध समाधान निकालें और स्लाइस के चारों ओर एक ऊतक के साथ स्लाइड सूखी। प्राथमिक एंटीबॉडी(तालिका 3)के 50 माइक्रोन को अनुभागों पर समाधान को अवरुद्ध करने और कवरस्लिप के साथ कवर करने में पतला रखें। स्लाइस को पहले से तैयार इम्यूनोदाता डिश में रखें। रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    9. स्लाइड्स को टीबीएसटी(टेबल 2)के 50 एमएल के साथ एक कॉपलिंग जार में ट्रांसफर करें, कवरस्लिप्स को गिरने दें, और 5 मिनट 3x के लिए टीबीएसटी के साथ धोएं।
    10. वर्गों पर समाधान को अवरुद्ध करने और कवरस्लिप के साथ कवर करने में पतला माध्यमिक एंटीबॉडी के 50 माइक्रोन रखें। स्लाइस को पहले से तैयार इम्यूनोदाता डिश में रखें। आरटी में 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट, प्रकाश से संरक्षित।
    11. स्लाइड्स को फिर से एक कॉप्लिंग जार में ट्रांसफर करें और 5 मिनट 3x के लिए टीबीस्ट के 50 एमएल से धोएं।
    12. स्लाइस के चारों ओर एक ऊतक के साथ स्लाइड सुखाएं और स्लाइस को पहले से तैयार इम्यूनोदाता पकवान में रखें। एक पाश्चर पिपेट के साथ स्लाइड की पूरी सतह पर DAPI समाधान के 0.5 एमएल जोड़ें। आरटी में 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट ।
    13. दोहराएं चरण 4.4.9।
    14. एक टिश्यू के साथ स्लाइड्स को ध्यान से सुखा लें। स्लाइड के साथ ड्रॉप द्वारा बढ़ते मध्यम ड्रॉप के 50 μL जोड़ें और फिर ध्यान से प्रत्येक स्लाइड पर एक कवरस्लिप कम, थोड़ा बुलबुले से बचने के लिए झुकने।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

प्रोटोकॉल 0.1 एल बायोरिएक्टर(चित्रा 1 ए)का उपयोग करके सेल एकत्रीकरण को बढ़ावा देकर शुरू किया गया था। आईपीएससी का एकल प्रकोष्ठ टीका किया गया, जिसमें 27 आरपीएम की आंदोलन गति के साथ 60 एमएल मध्यम में 250,000 कोशिकाओं/एमएल वरीयता प्राप्त है। इसे 0 दिन के रूप में परिभाषित किया गया था। 24 घंटे के बाद, कोशिकाओं ने कुशलतापूर्वक गोलाकार आकार के समुच्चय (दिन 1, चित्रा 1B)का गठन किया, और आकृति विज्ञान को 5 दिन तक अच्छी तरह से बनाए रखा गया था, आकार में क्रमिक वृद्धि के साथ, समग्र आकृति विज्ञान और समय के साथ आकार में एकरूपता की एक उच्च डिग्री का प्रदर्शन। (चित्रा 1B)। माइक्रोस्कोपी द्वारा एक मात्रात्मक विश्लेषण भी 1 दिन(चित्रा 1C)द्वारा कुल आकार के सामान्य वितरण से पता चला । कुल आकार एक महत्वपूर्ण भौतिक पैरामीटर है जो कोशिकाओं को विभिन्न वंशों की ओर अंतर करने के लिए प्रेरित करने में सक्षम है29,30। इस कारण से, एक कुशल तंत्रिका31, 32,32 और सेरिबेलर प्रतिबद्धता21को प्रेरित करने के लिए पिछले अध्ययनों में सूचित कुल आकार के आधार पर, उत्पन्न समुच्चय को 25 आरपीएम पर mTeSR1 माध्यम में बनाए रखा गया था जब तक कि वे भेदभाव शुरू करने से पहले वांछित व्यास तक नहीं पहुंच गए (~ 200 माइक्रोन)। दूसरे दिन, औसत व्यास F002.1A.13 सेल लाइन के लिए 221.0 ± 54.4 माइक्रोन (मतलब ± एसडी) और 212.1 ± 42.1 माइक्रोन आईपीएससी 6.2 सेल लाइन के लिए था। जैसे, दोनों सेल लाइनों ने इस समय बिंदु(चित्रा 1C)पर इष्टतम समग्र आकार प्राप्त किया।

जिस दिन आईपीएससी की सीडिंग 0 दिन के रूप में किया गया था, उस दिन को परिभाषित करते हुए, 2 दिन में, वांछित समग्र व्यास प्राप्त करने के बाद, तंत्रिका प्रतिबद्धता को एक साथ SB431542, FGF2, और इंसुलिन का उपयोग करके प्रेरित किया गया था, न्यूरोेक्टोडर्मल भेदभाव को बढ़ावा देने के साथ-साथ मध्य-हिंडब्रेन पैटर्निंग के लिए आवश्यक एक मध्यम काउडलाइजेशन। बाद में, विभिन्न सेरिबेलर जनकों की पीढ़ी को बढ़ावा देने के लिए क्रमशः 14 और 28 दिनों में एफजीएफ 19 और एसडीएफ1 को संस्कृति में जोड़ा गया। न्यूरल इंडक्शन के पहले दिनों के लिए, 25 आरपीएम की रोटेशन गति का उपयोग किया गया था, जिसे 7 दिनों के बाद 30 आरपीएम तक बढ़ा दिया गया था ताकि बड़े समुच्चय(चित्रा 2 ए)के संचय और झुरमुट से बचा जा सके। भेदभाव के दौरान, ऑर्गेनॉइड ने ल्यूमिनल स्पेस(चित्रा 2B)के साथ तंत्रिका ट्यूब जैसी संरचनाओं के समान अधिक स्पष्ट एपीथिलाइजेशन दिखाया। इसके अतिरिक्त, ऑर्गेनॉइड व्यास वितरण के मूल्यांकन ने 14 दिन(चित्रा 2B)तक प्रारंभिक सेरिबेलर प्रतिबद्धता के दौरान एक सजातीय आकार वितरण का प्रदर्शन किया।

इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण का समर्थन करता है कि एफजीएफ 2 और एसबी 431542 जोड़ने के बाद विभेदन के दिन 7 तक आईपीएससी-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड की एक कुशल तंत्रिका प्रतिबद्धता पहले से ही हासिल की जाती है। ऑर्गेनॉइड के क्रायोसेक्शन ने पैक्स6 और नेस्टिन के लिए तंत्रिका ट्यूब स्टेनिंग की याद ताजा करने वाली कई संरचनाओं का खुलासा किया, जिसमें ऑर्गेनॉइड के भीतर अधिकांश कोशिकाएं 7 और 14 दिनों में जनक मार्कर नेस्टिन को व्यक्त करती हैं। बाद में, FGF19 और SDF1 लगातार जनक परतों (PAX6+)की पीढ़ी को बढ़ावा दिया और एक कुशल न्यूरोनल भेदभाव हासिल किया गया था, के रूप में TUJ1, न्यूरॉन विशिष्ट वर्ग III बीटा-ट्यूबलिन की अभिव्यक्ति द्वारा प्रदर्शन किया, दिन 21 और ३५(चित्रा 2C)द्वारा । इसके अलावा, 0.1 एल वीडब्ल्यू बायोरिएक्टर में 21 दिनों के बाद एक कुशल सेरिबेलर भेदभाव भी देखा गया था, जो दो अलग-अलग सेल आबादी की उपस्थिति द्वारा प्रदर्शित किया गया था: ग्रेन्यूल सेल जनक (बारलएच 1+ कोशिकाएं, चित्रा 3 ए),और पुरकिंजे सेल जनक (OLIG2+ कोशिकाएं, चित्रा 3B)। संस्कृति में 35 दिनों के बाद, ऑर्गेनॉइड के भीतर विभिन्न सेल आबादी को अलग-अलग परतों में व्यवस्थित किया जाता दिखाई दिया। ऑर्गेनॉइड के भीतर विभिन्न फ्लैट-अंडाकार संरचनाओं को बारHL1+ पृष्ठीय सेरिबेलर प्रोजेनिटर के साथ इन अंडाकार संरचनाओं (चित्रा 3 डी) के चमकदार क्षेत्र में ऑर्गेनॉइड(चित्रा 3 सी,डी)और SOX2+ के सतही पक्ष पर एक सतत परत के रूप मेंदेखा गयाथा। इसके अलावा, TUJ1+ नवजात न्यूरॉन्स सतह की ओर पलायन करने के लिए दिखाई दिया, ऑर्गेनॉइड(चित्रा 3E)की बाहरी सतह पर रेडियल संरेखण को फिर से स्थापित करते हुए ।

सेरिबेलर जनकों की पीढ़ी के बाद, न्यूरोट्रोफिक कारकों बीडीएनएफ और जीडीएनएफ के साथ पूरक ब्रेनफिज माध्यम28 का उपयोग करके आगे परिपक्वता को बढ़ावा दिया गया था। सेरिबेलर न्यूरॉन्स के अलग-अलग उपप्रकारों का पता लगाने के लिए ऑर्गेनॉइड क्रायोस्ेक्शन के इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग का उपयोग किया गया था। पुरकिंजे कोशिकाएं, गैबार्गिक न्यूरॉन्स कैल्शियम-बाध्यकारी प्रोटीन कैलिबिन्ड (सीएएलबी, चित्रा 3एफ)को परिपक्वता प्रोटोकॉल के बाद सेरिबेलर ऑर्गेनॉइड में पाया गया। इसके अलावा, एक अन्य प्रमुख सेरिबेलर न्यूरोनल प्रकार, ग्रैन्यूल कोशिकाओं को पैक्स 6 और MAP2(चित्रा 3G)को सहएक्सप्रेस करने वाली कोशिकाओं के सबसेट के रूप में पहचाना गया था। दिलचस्प बात यह है कि PAX6+ जनकों का एक पूल जो MAP2 को व्यक्त नहीं करता है, 80 दिनों के भेदभाव तक बनाए रखा गया था। अन्य प्रकार के सेरिबेलर न्यूरॉन्स का भी पता लगाया गया, जिसमें टीबीआर 2(चित्रा 3 एच)व्यक्त करने वाली एकध्रुवीय ब्रश कोशिकाएं और टीबीआर 1(चित्रा 3आई)व्यक्त करने वाले गहरे सेरिबेलर न्यूक्लियी प्रोजेक्शन न्यूरॉन्स शामिल हैं। कुशल सेरिबेलर भेदभाव और परिपक्वता के अलावा, पीबीएस 0.1 एल वीडब्ल्यू बायोरिएक्टर का उपयोग करके इस 3डी गतिशील संस्कृति प्रणाली ने ऑर्गेनॉइड को 90 दिनों तक व्यवहार्य रहने की अनुमति दी, बिना महत्वपूर्ण सेल डेथ और नेक्रोसिस(चित्रा 3J)।

Figure 1
चित्र 1: स्केलेबल बायोरिएक्टर का उपयोग करके आकार-नियंत्रित समुच्चय का उत्पादन। (A)बायोरिएक्टर के डिजाइन फीचर्स। (ख)ब्राइटफील्ड फोटोमाइक्रोग्राफ 1, 2 और 5 दिन पर दो अलग-अलग आईपीएससी लाइनों से एकत्रित दिखा। स्केल बार = 100 माइक्रोन। (ग)बायोरिएक्टरों में विभिन्न आईपीएससी लाइनों से फ्लोटिंग समुच्चय का आकार वितरण । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: 0.1 एल बायोरिएक्टर का उपयोग करके मानव आईपीएससी-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड का उत्पादन। (ए)आईपीएससी के विभेदन को सेरिबेलर ऑर्गेनॉइड के लिए प्रेरित करने के लिए संस्कृति प्रक्रिया का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । कोशिकाओं को २५०,००० कोशिकाओं/एमएल के घनत्व पर वरीयता दी गई थी और सेल एकत्रीकरण को बढ़ावा देने के लिए 27 आरपीएम की आंदोलन गति का उपयोग किया गया था । विभेदन के पहले दिनों के दौरान, 25 आरपीएम की गति से समुच्चय बनाए रखा गया था। बाद में, बड़े समुच्चय के संचय से बचने के लिए, आंदोलन की गति को बढ़ाकर 30 आरपीएम कर दिया गया था। (ख)ऑर्गेनॉइड आकार और आकार का लक्षण वर्णन। 0.1 एल वीडब्ल्यू बायोरिएक्टर्स में सेरिबेलर भेदभाव के दौरान आईपीएससी-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड दिखाते हुए ब्राइटफील्ड फोटोमाइक्रोग्राफ। स्केल बार = 100 माइक्रोन। ऑर्गेनॉइड व्यास का वितरण दर्शाता है कि संस्कृति ने भेदभाव प्रोटोकॉल के साथ सजातीय ऑर्गेनॉइड आकार बनाए रखा। (ग)आईपीएससी-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड में कुशल तंत्रिका प्रेरण। सेरिबेलर भेदभाव के दौरान नेस्टिन, पैक्स6 और तुजे 1 के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस। स्केल बार = 50 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: मानव आईपीएससी-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड में कुशल सेरिबेलर भेदभाव और परिपक्वता। (A-ई) कुशल सेरिबेलर प्रतिबद्धता। सेरिबेलर विभेदन प्रोटोकॉल के संकेत समय बिंदुओं पर BARHL1, SOX2, OLIG2, NCAD, और TUJ1 मार्कर के लिए इम्यूनोस्टेटिंग विश्लेषण। (एफ-I) मानव आईपीएससी-व्युत्पन्न सेरिबेलर ऑर्गेनॉइड की कुशल परिपक्वता। इम्यूनोफ्लोरेसेंस में पुरकिंजे कोशिकाओं (सीएएलबी, एफ), कणिका कोशिकाओं (पैक्स6 और मानचित्र 2, जी), एकध्रुवीय ब्रश कोशिकाओं (टीबीआर2), और डीप सेरिबेलर न्यूक्लियी अनुमानों न्यूरॉन्स (टीबीआर1) सहित विभिन्न प्रकार के सेरिबेलर न्यूरॉन्स दिखाई देते हैं। (जम्मू)सेरिबेलर परिपक्वता के बाद उच्च कोशिका व्यवहार्यता। लाइव/डेड (कैल्सीन-एएम, ग्रीन और प्रोपिडियम आयोडाइड, रेड) ऑर्गेनॉइड के धुंधला होने से उच्च कोशिका व्यवहार्यता दिखाई दी और बायोरिएक्टर्स में ८० दिनों के बाद परिगलित क्षेत्रों का कोई सबूत नहीं मिला । स्केल बार = 50 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

मीडिया की तैयारी mTeSR1
अंतिम मात्रा: 500 एमएल		 1. गल mTeSR1 5× कमरे के तापमान (आरटी) पर या रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर पूरक और बेसल माध्यम के साथ मिश्रण
2. 2 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर पूरा mTeSR1 माध्यम स्टोर करें या 40 एमएल एलिकोट तैयार करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें
3. उपयोग से पहले आरटी में प्री-वार्म पूर्ण mTeSR1
जीएफसीडीएम (विकास कारक मुक्त रासायनिक रूप से परिभाषित माध्यम)
अंतिम मात्रा: 60 एमएल		 30 एमएल हैम के F12
30 एमएल आईएमडीएम
600 μL रासायनिक रूप से परिभाषित लिपिड ध्यान केंद्रित (1% v/v)
2.4 माइक्रोन मोनोथिओग्लिसेरोल (450 माइक्रोन)
30 μL apo-ट्रांसफरिन (पानी में 30 मिलीग्राम/एमएल पर स्टॉक समाधान, अंतिम एकाग्रता: 15 μg/mL)
300 मिलीग्राम क्रिस्टलीकरण-शुद्ध बीएसए (5 मिलीग्राम/एमएल)
42 माइक्रोन इंसुलिन (10 मिलीग्राम/
300 μL P/S (0.5% v/v, 50 U/ml पेनिसिलिन/50 μg/ml स्ट्रेप्टोमाइसिन)
न्यूरोबेसल
अंतिम मात्रा: 60 एमएल		 न्यूरोबेसल माध्यम के 60 एमएल
600 μL N2 पूरक
600 माइक्रोल ग्लूटामैक्स I
300 μL P/S (0.5% v/v) ।
पूरा ब्रेनफिजिस
अंतिम मात्रा: 60 एमएल		 ब्रेनफिजिस का 60mL
1.2 एमएल न्यूरोक्यूल्ट एसएम 1 न्यूरोनल सप्लीमेंट
600 μL N2 पूरक
12 μL BDNF (अंतिम एकाग्रता: 20 एनजी/
12 μL GDNF (अंतिम एकाग्रता: 20 एनजी/
300 μL Dibutyryl-cAMP (स्टॉक एकाग्रता: 100 मिलीग्राम /
42 माइक्रोन एस्कॉर्बिक एसिड (स्टॉक एकाग्रता: पानी में 50 माइक्रोग्राम/एमएल, अंतिम एकाग्रता: 200 एनएम)
विकास कारकों और छोटे अणुओं के स्टॉक समाधान बेसिक फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर (bFGF/FGF2)
स्टॉक एकाग्रता: 100 μg/		 1. 10 मिलीग्राम/एमएल की एकाग्रता पर 5 एमएम ट्रिस, पीएच 7.6 में पुनर्गठन
2. पीबीएस (v/v) में 0.1% बीएसए के साथ 100 μg/mL की अंतिम स्टॉक एकाग्रता के साथ पतला
स्ट्रोमल सेल-व्युत्पन्न कारक 1 (एसडीएफ 1)
स्टॉक एकाग्रता: 100 μg/		 1. 10 मिलीग्राम/एमएल की एकाग्रता पर पानी में पुनर्गठन
2. पीबीएस में 0.1% बीएसए (v/v) के साथ पतला 100 μg/mL के अंतिम स्टॉक एकाग्रता के लिए।
मस्तिष्क से व्युत्पन्न न्यूरोट्रोफिक फैक्टर (बीडीएनएफ)
स्टॉक एकाग्रता: 100 μg/
ग्लियल सेल-व्युत्पन्न न्यूरोट्रोफिक फैक्टर (जीडीएनएफ)
स्टॉक एकाग्रता: 100 μg/
फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर 19 (FGF19)
स्टॉक एकाग्रता: 100 μg/		 1. 10 मिलीग्राम/एमएल की एकाग्रता पर 5 एमएम सोडियम फॉस्फेट, पीएच 7.4 में पुनर्गठन
2. पीबीएस (v/v) में 0.1% बीएसए के साथ 100 μg/mL की अंतिम स्टॉक एकाग्रता के साथ पतला
रॉक अवरोधक वाई-27632
स्टॉक एकाग्रता: 10mM		 10 mm की एकाग्रता पर DMSO में पुनर्गठन।
एसबी431542
स्टॉक एकाग्रता: 10mM
इनसुलिन
स्टॉक एकाग्रता: 10 मिलीग्राम/एमएल		 1. 10 mm NaOH के 300 माइक्रोन में 10 मिलीग्राम इंसुलिन का पुनर्गठन
2. ध्यान से 1 एम NaOH जोड़ें जब तक समाधान स्पष्ट पारदर्शी हो जाता है
3. बाँझ पानी के साथ 1 एमएल तक भरें।

तालिका 1: स्टॉक समाधान और मीडिया की तैयारी। सूचीबद्ध सभी घटकों और संस्करणों को आईपीएससी रखरखाव और भेदभाव प्रोटोकॉल के लिए मीडिया तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है, साथ ही विकास कारकों और छोटे अणुओं के स्टॉक समाधान । स्टॉक समाधानों के लिए, सभी स्टॉक एकाग्रता और पुनर्गठन के लिए प्रोटोकॉल सूचीबद्ध हैं।

जिलेटिन/सुक्रोज
अंतिम एकाग्रता: 7.5%/15% w/w		 1. एक बाँझ स्कूट ग्लास बोतल में सुक्रोज के 15 ग्राम और 7.5 ग्राम जिलेटिन का वजन करें और अच्छी तरह से मिलाएं
2. पीबीएस 1× 65 डिग्री सेल्सियस पर प्री-वार्म करें
3. 100 ग्राम के अंतिम वजन में प्री-गर्म पीबीएस 1× जोड़ें और अच्छी तरह से मिलाएं
4. 65 डिग्री सेल्सियस पर एक हीटिंग प्लेट में Schott ग्लास की बोतल प्लेस और हिला जब तक जिलेटिन पिघला देता है
5. समाधान स्थिर होने तक 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट
ग्लाइसिन
अंतिम एकाग्रता: 0.1 मीटर		 हौसले से तैयार PBS 1× के 50 एमएल में 0.37 glycine जोड़ें।
ट्राइटन समाधान
अंतिम एकाग्रता: 0.1% w/v		 1. 10% ट्राइटन एक्स-100 स्टॉक तैयार करें: 5 ग्राम ट्राइटन एक्स-100 में पीबीएस 1 के 50 एमएल में×
2. ट्राइटन एक्स-100 स्टॉक का 0.5 एमएल पीबीएस 1× के 50 एमएल में जोड़ें।
टीबीस्ट
20 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच 8.0, 150 एमएम एनएसीएल, 0.05% डब्ल्यू/वी ट्वीन-20		 20 एमएल ट्रिस 1 एम
30 एमएल एनएसीएल 5 एम
5 एमएल ट्वीन-20 (10% स्टॉक: 5 ग्राम ट्वीन-20 में 50 एमएल पानी)
पानी के साथ 1 एल करने के लिए भरें।
समाधान अवरुद्ध भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस, अंतिम एकाग्रता: 10% v/v) के 50 एमएल टीबीस्ट के 5 एमएल जोड़ें।
दापी समाधान 15 μL DAPI स्टॉक समाधान (1 मिलीग्राम/एमएल) को 10 एमएल डेटिलेटेड पानी में जोड़ें
मोओओल 1. ग्लिसरोल के 6 ग्राम में मोओल का 2.4 ग्राम जोड़ें और 50 डिग्री सेल्सियस पर प्री-गर्म प्लेट में 1 घंटे के लिए हिलाएं
2. आसुत पानी के 6 एमएल जोड़ें और 2 घंटे के लिए हिला
3. Tris 200 mm (पीएच 8.5) के 12 एमएल जोड़ें और 10 मिनट के लिए हिला
4. 15 मिनट के लिए 5,000 × जी पर सेंट्रलाइज
5. Aliquot और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।

तालिका 2: क्रायोसेक्शनिंग और इम्यूनोस्टेपिंग के लिए ऑर्गेनॉइड तैयार करने के लिए समाधान। सूचीबद्ध सभी घटक और वॉल्यूम हैं जो क्रायोसेक्शनिंग और इम्यूनोसटेनिंग के लिए ऑर्गेनॉइड की तैयारी में उपयोग किए जाने वाले समाधान तैयार करने के लिए उपयोग किए जाते हैं।

प्रतिपिंड मेजबान प्रजातियां कमजोर पड़ने
बारहल1 शशक 1/500
कैल्बिनडिन शशक 1/500
MAP2 माउस 1/1000
एन-कैडेरिन माउस 1/1000
नेस्टिन माउस 1/400
ओलिग2 शशक 1/500
पैक्स6 शशक 1/400
SOX2 माउस 1/200
टीबीआर1 शशक 1/200
टीबीआर2 शशक 1/200
TUJ1 माउस 1/1000

तालिका 3: प्राथमिक एंटीबॉडी। इम्यूनोदाता के लिए उपयोग किए जाने वाले प्राथमिक एंटीबॉडी, क्लोन और अनुकूलित कमजोर पड़ने सूचीबद्ध हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

दवा स्क्रीनिंग और पुनर्योजी दवा अनुप्रयोगों के लिए विशिष्ट सेल प्रकार उत्पन्न करने के लिए बड़े सेल नंबरों के साथ-साथ परिभाषित संस्कृति स्थितियों की आवश्यकता स्केलेबल संस्कृति प्रणालियों के विकास को चला रही है। हाल के वर्षों में, कई समूहों ने तंत्रिका जनक और कार्यात्मक,न्यूरॉन्स32, 33,,34की स्केलेबल पीढ़ी की सूचना दी है, जो न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों के लिए नए मॉडलों के विकास में महत्वपूर्ण प्रगति प्रदान करता है।34 फिर भी, भ्रूणीय विकास की कुछ महत्वपूर्ण घटनाओं के पुनर्पूंजीकरण में अभी भी कमी है, और लंबे समय तक निलंबन में उत्पन्न कार्यात्मक न्यूरॉन्स का रखरखाव अभी तक34प्राप्त नहीं किया गया है। यहां प्रस्तुत एक गतिशील 3 डी संस्कृति प्रणाली है जो सेरिबेलर पहचान के साथ आईपीएससी-व्युत्पन्न तंत्रिका ऑर्गेनॉइड उत्पन्न करने में सक्षम है, और गतिशील संस्कृति में रासायनिक रूप से परिभाषित और फीडर-मुक्त स्थितियों के तहत कार्यात्मक सेरिबेलर न्यूरॉन्स में परिपक्वता को बढ़ावा देने के लिए।

सेरिबेलर भेदभाव शुरू करने से पहले, मानव आईपीएससी की गुणवत्ता को बनाए रखना महत्वपूर्ण है। इस प्रकार, भेदभाव से समझौता न करने के लिए, आईपीएससी के तीन से अधिक मार्ग को विगलन से बायोरिएक्टर टीका तक नहीं किया जाना चाहिए। भेदभाव प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम कुल आकार का मूल्यांकन करना है। एक विशिष्ट कोशिका वंश29के प्रति भेदभाव को प्रेरित करने में समग्र आकार की महत्वपूर्ण भूमिका होती है । इसके अलावा, एक न्यूनतम आकार सीमा है जो भेदभाव35के पक्ष में प्रतीत होती है। जैसा कि पहले से ही बताया गया है, एक कुशल तंत्रिका प्रतिबद्धता31,,32 और सेरिबेलर भेदभाव21 को बढ़ावा देने के लिए इष्टतम आईपीएससी-व्युत्पन्न कुल व्यास ~ 200 माइक्रोन व्यास है।

इसके अतिरिक्त, इस गतिशील प्रोटोकॉल में, संस्कृति के पहले दिनों में उपयोग की जाने वाली आंदोलन की गति कुल व्यास और तंत्रिका प्रेरण को नियंत्रित करने के लिए महत्वपूर्ण है। संस्कृति 27 आरपीएम में शुरू हुई, जो आईपीएससी एकत्रीकरण को बढ़ावा देने और बड़े समुच्चय के गठन से बचने के लिए पर्याप्त है (350 माइक्रोन से ऊपर व्यास से बचा जाना चाहिए)। एकल सेल सीडिंग के बाद सेल एकत्रीकरण को बढ़ावा देने के लिए उपयोग किए जाने वाले आंदोलन को कोशिका व्यवहार्यता को प्रभावित किए बिना 30 आरपीएम तक बढ़ाया जा सकता है; हालांकि, उच्च आंदोलन की गति से छोटे समुच्चय का उत्पादन होने की उम्मीद है । आईपीएससी लाइन के आधार पर, 27 आरपीएम का उपयोग करके सेल सीडिंग के बाद 24 घंटे, दो अलग-अलग परिदृश्यों की उम्मीद की जाती है: समुच्चय वर्तमान छोटे व्यास (एंड एलटी; 200 माइक्रोन) का गठन किया गया है या 200-300 माइक्रोन के बीच आकार की एक श्रृंखला तक पहुंच गए हैं। यदि कोशिका सीडिंग के बाद 24 घंटे में 350 माइक्रोन से अधिक एकत्रित होते हैं, तो भेदभाव नहीं किया जाना चाहिए, और सेल सीडिंग को दोहराया जाना चाहिए, क्योंकि भेदभाव की दक्षता बहुत कम होगी। यदि समुच्चय 200 माइक्रोन से छोटे हैं, तो खर्च किए गए माध्यम को आईपीएससी रखरखाव माध्यम से प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए, और आंदोलन की गति 25 आरपीएम तक कम हो जानी चाहिए। इस समायोजन के साथ, कुल व्यास 1 दिन से 2 दिन तक बढ़ने की उम्मीद है, शायद आंदोलन की गति में कमी से पदोन्नत व्यक्तिगत समुच्चय के विलय के कारण। 200-300 माइक्रोन के बीच आकार के साथ समुच्चय के मामले में, खर्च किए गए माध्यम को भेदभाव माध्यम से प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए, और संस्कृति में 2 दिनों के बाद FGF2 के साथ तंत्रिका प्रेरण शुरू किया जाना चाहिए। इस बिंदु पर, अत्यधिक कोशिका मृत्यु को रोकने के लिए आंदोलन की गति को भी थोड़ा कम किया जाना चाहिए, क्योंकि कोशिकाएं विभेदन माध्यम की उपस्थिति में कतरनी तनाव के प्रति अधिक संवेदनशील होती हैं। इसके अतिरिक्त, जनसंख्या एकरूपता का विश्लेषण भिन्नता (सीवी) के गुणांक का उपयोग करके किया जा सकता है, जो समीकरण के अनुसार, समग्र व्यास के साथ मानक विचलन को सहसंबंधित करके परिवर्तनशीलता को मापता है।

Equation 2

जिसमें δ कुल व्यास के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करता है और μ औसत व्यास है। इस गतिशील प्रणाली में, मनाया औसत सीवी F002.1A.13 सेल लाइन के लिए 12.5 ± 3.3% (मतलब ± एसडी) और 19.0 ± 0.37% आईपीएससी 6.2 सेल लाइन के लिए 2 दिन में 2. इस प्रकार, इस प्रणाली में, 0.2 (एंड एलटी; 20% भिन्नता) से नीचे सीवी के साथ एक सजातीय आकार की आबादी की उम्मीद की जानी चाहिए। भेदभाव के 7 दिनों के बाद, औसत कुल व्यास 300-360 माइक्रोन से लेकर, और आंदोलन की गति को 30 आरपीएम तक बढ़ा दिया गया था ताकि 0.1 एल वीडब्ल्यू बायोरिएक्टर के नीचे बसने के लिए समुच्चय को रोका जा सके।

35 दिन तक सेरिबेलर ऑर्गेनॉइड का भेदभाव और स्थिर परिस्थितियों में कुल आकार का विश्लेषण हाल ही में21बताया गया था । लेखकों ने दिखाया कि 3 डी समुच्चय प्लेटों (जैसे, एग्रीवेल) में बनाए गए और बनाए रखा गया जब तक कि भेदभाव के 7 दिन आकार और आकार21में सजातीय थे। हालांकि, अति-कम लगाव 6 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों में समुच्चय स्थानांतरित करने के बाद, समुच्चय आकार और आकृति विज्ञान21में भिन्न होना शुरू हो गया। स्थिर परिस्थितियों में 35 दिन, 3 डी समुच्चय में से कुछ विभिन्न सेल लाइनों के लिए 1,000 माइक्रोन तक पहुंच गए, जो पोषक तत्वों और ऑक्सीजन के प्रसार को सीमित करते हैं। इसके विपरीत, हमारी गतिशील स्थितियों का उपयोग करके, वर्टिकल व्हील द्वारा प्रचारित माध्यम के निरंतर आंदोलन के कारण बेहतर जन हस्तांतरण के साथ, 35 दिन तक व्यास में 800 माइक्रोन से अधिक तक नहीं पहुंच पाया। इसके अलावा, परिपक्वता प्रक्रिया के अंत तक कुल आकार बनाए रखे गए थे, जो 90 दिन तक 646.6 ± 104.2 माइक्रोन का कुल व्यास दिखाते थे, सबसे लंबी संस्कृति 0.1 एल वीडब्ल्यू बायोरिएक्टर में प्रदर्शन की गई थी।

इस 3 डी गतिशील प्रणाली में SB431542, FGF2, FGF19 और SDF1 के अनुक्रमिक जोड़ द्वारा कुशल सेरिबेलर प्रेरण को प्रेरित किया गया था। प्रोटोकॉल SB431542 के संयोजन के साथ शुरू होता है, जो एक परिवर्तन विकास कारक बीटा (TGF-ß) रिसेप्टर अवरोधक है जो मेसेंडोडरमल भेदभाव को रोकता है, और FGF2, जिसका न्यूरोएपिटेलियल ऊतक25के कॉडलाइजेशन में एक बड़ा प्रभाव पड़ता है। इसलिए, संस्कृति के पहले दिनों के दौरान इन दो अणुओं के अलावा मध्य हिंडब्रेन, क्षेत्र है कि मस्तिष्क ऊतक को जंम देता है के लिए सेल भेदभाव को बढ़ावा देने के लिए आवश्यक है । मध्य-हिंदब्रेन ऊतक में प्रारंभिक प्रेरण के बाद, पृष्ठीय-वेंट्रल ध्रुवीयता के साथ मध्य-हिंडब्रेन संरचनाओं की सहज पीढ़ी को बढ़ावा देने के साथ-साथ विभिन्न सेरिबेलर जनकों की पीढ़ी36, 26,के लिए एफजीएफ19 जोड़ना आवश्यक है।26 एसडीएफ1 सेरिबेलर प्रोजेनिटर की अलग-अलग परतों के संगठन की सुविधा प्रदान करता है, जैसा कि विकास के स्तर पर देखा गया है जिसमें सेरिबेलर न्यूरोजेनेसिस27होता है। 35 दिन तक, ये अणु सेरिबेलर ऑर्गेनॉइड के संगठन को बढ़ावा दे सकते हैं जो मानव सेरिबेलर विकास को पुन: रीजिटेट कर सकते हैं, जो पहली तिमाही सेरिबैलम से मेल खाती है। विभिन्न परतों में सेरिबेलर जनकों के संगठन के बाद, उनकी परिपक्वता28को बढ़ावा देने के लिए एक परिभाषित न्यूरोनल माध्यम का उपयोग किया गया था। न्यूरोनल कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए उपयोग किए जाने वाले अन्य मीडिया का भी परीक्षण किया जा सकता है, लेकिन कम क्षमता का अनुमान है। इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल में, ब्रेनफिज का उपयोग सेरिबेलर-प्रतिबद्ध कोशिकाओं के विभेदन को को बढ़ावा देने के लिए किया गया था, क्योंकि यह स्वस्थ न्यूरोनल वातावरण की बेहतर नकल करने और उत्पन्न न्यूरॉन्स28की न्यूरोफिजियोलॉजिकल गतिविधि का समर्थन करने के लिए सूचित किया गया है।

इन गतिशील स्थितियों का उपयोग करके, पोषक तत्वों, ऑक्सीजन और विकास कारकों का अधिक कुशल प्रसार प्राप्त किया जा सकता है। हालांकि, कुछ सीमाएं विभेदन प्रोटोकॉल में इस्तेमाल होने वाले आंदोलन से जुड़ी हैं। आंदोलन प्रक्रिया द्वारा कुछ कतरनी तनाव शुरू किया जा सकता है, जो कोशिकाओं के अस्तित्व, प्रसार और भेदभाव को प्रभावित कर सकता है। इसलिए, परिपक्वता चरण के दौरान, जिसमें कोशिकाएं अधिक संवेदनशील होती हैं, संस्कृति की सावधानीपूर्वक निगरानी की जानी चाहिए।

मानव भ्रूणीय सेरिबेलर विकास की याद ताजा करने वाले सेरिबेलर ऑर्गेनॉइड का भेदभाव पहले ही7रिपोर्ट किया जा चुका है । हालांकि, 3डी संस्कृतियों का उपयोग करके सेरिबेलर न्यूरॉन्स में इन भ्रूणीय सेरिबेलर ऑर्गेनॉइड की आगे परिपक्वता एक चुनौती बनी हुई है। कार्यात्मक सेरिबेलर न्यूरॉन्स का उत्पादन केवल विभिन्न स्रोतों 4 ,7,,15से कणिका कोशिकाओं के साथ कोक्यूल्चरिंग द्वारा प्राप्त किया गया था ।4 इस प्रोटोकॉल ने मानव आईपीएससी की सेरिबेलर प्रतिबद्धता को सफलतापूर्वक आगे किया; इसके अलावा, फीडर कोशिकाओं के साथ coculturing के बिना एक 3 डी संस्कृति प्रणाली में विभिन्न सेरिबेलर न्यूरॉन्स के भेदभाव के लिए यह पहला प्रोटोकॉल है। विशेष रूप से, निम्नलिखित कोशिका प्रकार हमारे गतिशील संस्कृति प्रणाली में उत्पादित किए जा सकते हैं: पुरकिंजे कोशिकाएं (कैल्बिन्डिन+),कणिका कोशिकाएं (पैक्स6+/MAP2+),एकध्रुवीय ब्रश कोशिकाएं (टीबीआर 2+),और डीप सेरिबेलर न्यूक्लियी प्रोजेक्शन न्यूरॉन्स (टीबीआर 1+),जिन्हें 3 महीने तक निलंबन में बनाए रखा गया था।

सेरिबेलर ऑर्गेनॉइड की स्केलेबल पीढ़ी सेरिबैलम के भ्रूणीय विकास और इस अंग के पतन में शामिल रोग मार्गों का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण का प्रतिनिधित्व करती है। इसके अलावा, सेरिबेलर फ़ंक्शन को बहाल करने वाले अणुओं के लिए उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग इस स्केलेबल सिस्टम के साथ प्राप्त ऑर्गेनॉइड का उपयोग करके की जा सकती है। कुल मिलाकर, यह विधि उच्च गुणवत्ता वाले सेरिबेलर ऑर्गेनॉइड के उत्पादन के लिए एक स्केलेबल प्रोटोकॉल की अपूरित आवश्यकता को संतुष्ट करती है जो विभिन्न प्रकार के बायोमेडिकल अनुप्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण हो सकती है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखक वाईएच और एसजे पीबीएस बायोटेक के कर्मचारी हैं। लेखक बीएल पीबीएस बायोटेक, इंक के सीईओ और सह-संस्थापक हैं । इन सहयोगी लेखकों ने पांडुलिपि में उपयोग किए जाने वाले बायोरिएक्टरों के विकास में भाग लिया। यह डेटा और सामग्री साझा करने पर पत्रिका की सभी नीतियों के लेखकों के पालन में परिवर्तन नहीं करता है । अन्य सभी लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं ।

Acknowledgments

इस काम को फंडाकाओ पैरा ए सिनेसिया ई ए टेक्नोलोजिया (एफसीटी), पुर्तगाल (यूआईडीबी/04565/2020 द्वारा प्रोग्रामा ओपेरानल रीजनल डी लिस्बोआ 2020, प्रोजेक्ट एन 007317, द्वारा समर्थित किया गया था। पीडी/बीडी/105773/2014 से टी.पी.एस.और पीडी/बीडी/128376/2017 को डी.ई.एन.), फेडर (POR Lisboa 2020- Programa Operacional क्षेत्रीय डी लिस्बोआ पुर्तगाल द्वारा सह-वित्त पोषित परियोजनाएं 2020) और एफसीटी अनुदान पीएसी के माध्यम से-सटीक लिस्बोआ-01-0145-फेडरर-016394 और सेरेबेलर ऑर्गेनॉइड की सेरेबेलर ऑर्गेनॉइड की सेरेबेलर जनरेशन एटैक्सिया रिसर्च ग्रांट लिस्बोआ-01-0145-फेडर-029298। ग्रांट एग्रीमेंट नंबर 739572-द डिस्कवरी सेंटर फॉर रिजेनरेटिव एंड प्रिसिजन मेडिसिन H2020-व्यापक-01-2016-2017 के तहत यूरोपियन यूनियन के क्षितिज २०२० रिसर्च एंड इनोवेशन प्रोग्राम से फंडिंग भी मिली थी ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3MM paper WHA3030861 Merck
Accutase A6964 - 500mL Sigma cell detachment medium
Anti-BARHL1 Antibody HPA004809 Atlas Antibodies
Anti-Calbindin D-28k Antibody CB28 Millipore
Anti-MAP2 Antibody M4403 Sigma
Anti-N-Cadherin Antibody 610921 BD Transduction
Anti-NESTIN Antibody MAB1259-SP R&D
Anti-OLIG2 Antibody MABN50 Millipore
Anti-PAX6 Antibody PRB-278P Covance
Anti-SOX2 Antibody MAB2018 R&D
Anti-TBR1 Antibody AB2261 Millipore
Anti-TBR2 Antibody ab183991 Abcam
Anti-TUJ1 Antibody 801213 Biolegend
Apo-transferrin T1147 Sigma
BrainPhys Neuronal Medium N2-A & SM1 Kit 5793 - 500mL Stem cell tecnhnologies
Chemically defined lipid concentrate 11905031 ThermoFisher
Coverslips 24x60mm 631-1575 VWR
Crystallization-purified BSA 5470 Sigma
DAPI 10236276001 Sigma
Dibutyryl cAMP SC- 201567B -500mg Frilabo
DMEM-F12 32500-035 ThermoFisher
Fetal bovine serum A3840001 ThermoFisher
Gelatin from bovine skin G9391 Sigma
Glass Copling Jar E94 ThermoFisher
Glutamax I 10566-016 ThermoFisher
Glycine MB014001 NZYtech
Ham’s F12 21765029 ThermoFisher
Human Episomal iPSC Line A18945 ThermoFisher iPSC6.2
IMDM 12440046 ThermoFisher
Insulin 91077C Sigma
iPS DF6-9-9T.B WiCell
Iso-pentane PHR1661-2ML Sigma
L-Ascorbic acid A-92902 Sigma
Matrigel 354230 Corning basement membrane matrix
Monothioglycerol M6154 Sigma
Mowiol 475904 Millipore mounting medium
mTeSR1 85850 -500ml Stem cell technologies
N2 supplement 17502048 ThermoFisher
Neurobasal 12348017 ThermoFisher
Paraformaldehyde 158127 Sigma
PBS-0.1 Single-Use Vessel SKU: IA-0.1-D-001 PBS Biotech
PBS-MINI MagDrive Base Unit SKU: IA-UNI-B-501 PBS Biotech
Recombinant human BDNF 450-02 Peprotech
Recombinant human bFGF/FGF2 100-18B Peprotech
Recombinant human FGF19 100-32 Peprotech
Recombinant human GDNF 450-10 Peprotech
Recombinant human SDF1 300-28A Peprotech
ROCK inhibitor Y-27632 72302 Stem cell technologies
SB431542 S4317 Sigma
Sucrose S7903 Sigma
SuperFrost Microscope slides 12372098 ThermoFisher adhesion microscope slides
Tissue-Tek O.C.T. Compound 25608-930 VWR
Tris-HCL 1M T3038-1L Sigma
Triton X-100 9002-93-1 Sigma
Tween-20 P1379 Sigma
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 15575020 ThermoFisher

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  2. Thomson, J. A. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  3. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  4. Ishida, Y., et al. Vulnerability of Purkinje Cells Generated from Spinocerebellar Ataxia Type 6 Patient-Derived iPSCs. Cell Reports. 17 (6), 1482-1490 (2016).
  5. Liu, Y., Zhang, S. C. Human stem cells as a model of motoneuron development and diseases. Annals of the New York Academy of Sciences. 1198, 192-200 (2010).
  6. Mariani, J., Coppola, G., Pelphrey, K. A., Howe, J. R., Vaccarino, F. M. FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/ Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders. Cell. 162 (2), 375-390 (2015).
  7. Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-Organization of Polarized Cerebellar Tissue in 3D Culture of Human Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).
  8. Qian, X., et al. Generation of human brain region-specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).
  9. Aubry, L., et al. Striatal progenitors derived from human ES cells mature into DARPP32 neurons in vitro and in quinolinic acid-lesioned rats. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (43), 16707-16712 (2008).
  10. Gunhanlar, N., et al. A simplified protocol for differentiation of electrophysiologically mature neuronal networks from human induced pluripotent stem cells. Molecular Psychiatry. 23 (5), 1336-1344 (2018).
  11. Hu, B. Y., Zhang, S. C. Differentiation of spinal motor neurons from pluripotent human stem cells. Nature Protocols. 4 (9), 1295-1304 (2009).
  12. Jo, J., et al. Midbrain-like Organoids from Human Pluripotent Stem Cells Contain Functional Dopaminergic and Neuromelanin-Producing Neurons. Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).
  13. Muguruma, K., et al. Ontogeny-recapitulating generation and tissue integration of ES cell-derived Purkinje cells. Nature Neurosciences. 13 (10), 1171-1180 (2010).
  14. Watson, L. M., Wong, M. M. K., Vowles, J., Cowley, S. A., Becker, E. B. E. A Simplified Method for Generating Purkinje Cells from Human-Induced Pluripotent Stem Cells. The Cerebellum. 17 (4), 419-427 (2018).
  15. Wang, S., et al. Differentiation of human induced pluripotent stem cells to mature functional Purkinje neurons. Science Reports. 5, 9232 (2015).
  16. Tao, O., et al. Efficient generation of mature cerebellar Purkinje cells from mouse embryonic stem cells. Journal of Neuroscience Research. 88 (2), 234-247 (2010).
  17. Croughan, M. S., Giroux, D., Fang, D., Lee, B. Novel Single-Use Bioreactors for Scale-Up of Anchorage-Dependent Cell Manufacturing for Cell Therapies. Stem Cell Manufacturing. , 105-139 (2016).
  18. Simunovic, M., Brivanlou, A. H. Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis. Development. 144 (6), 976-985 (2017).
  19. Lou, Y. R., Leung, A. W. Next generation organoids for biomedical research and applications. Biotechnology Advances. 36 (1), 132-149 (2018).
  20. Silva, T. P., et al. Design Principles for Pluripotent Stem Cell-Derived Organoid Engineering. Stem Cells International. 2019, 1-17 (2019).
  21. Silva, T. P., et al. Maturation of human pluripotent stem cell-derived cerebellar neurons in the absence of co-culture. Frontiers of Bioengineering and Biotechnology. , (2020).
  22. Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6 (4), 18293 (2011).
  23. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
  24. Smith, J. R., et al. Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm. Developmental Biology. 313 (1), 107-117 (2008).
  25. Yaguchi, Y., et al. Fibroblast growth factor (FGF) gene expression in the developing cerebellum suggests multiple roles for FGF signaling during cerebellar morphogenesis and development. Developmental Dynamics. 238 (8), 2058-2072 (2008).
  26. Fischer, T., et al. Fgf15-mediated control of neurogenic and proneural gene expression regulates dorsal midbrain neurogenesis. Developmental Biology. 350 (2), 496-510 (2011).
  27. Bagri, A., et al. The chemokine SDF1 regulates migration of dentate granule cells. Development. 129 (18), 4249-4260 (2002).
  28. Bardy, C., et al. Neuronal medium that supports basic synaptic functions and activity of human neurons in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (20), 2725-2734 (2015).
  29. Bauwens, C. L., et al. Control of Human Embryonic Stem Cell Colony and Aggregate Size Heterogeneity Influences Differentiation Trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
  30. Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation. Biotechnology Progress. 25 (1), 43-51 (2009).
  31. Miranda, C. C., et al. Spatial and temporal control of cell aggregation efficiently directs human pluripotent stem cells towards neural commitment. Biotechnology Journal. 10 (10), 1612-1624 (2015).
  32. Miranda, C. C., Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. Scaling up a chemically-defined aggregate-based suspension culture system for neural commitment of human pluripotent stem cells. Biotechnology Journal. 11 (12), 1628-1638 (2016).
  33. Bardy, J., et al. Microcarrier Suspension Cultures for High-Density Expansion and Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Neural Progenitor Cells. Tissue Engineering Part C Methods. 19 (2), 166-180 (2013).
  34. Rigamonti, A., et al. Large-Scale Production of Mature Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Three-Dimensional Suspension Culture System. Stem Cell Reports. 6 (6), 993-1008 (2016).
  35. Arora, N., et al. A process engineering approach to increase organoid yield. Development. 144 (6), 1128-1136 (2017).
  36. Gimeno, L., Martinez, S. Expression of chick Fgf19 and mouse Fgf15 orthologs is regulated in the developing brain by Fgf8 and Shh. Developmental Dynamics. 236 (8), 2285-2297 (2007).

Tags

बायोइंजीनियरिंग अंक 160 मानव प्रेरित प्लेरिपोटेंट स्टेम सेल सेरिबेलर भेदभाव गतिशील प्रणाली परिभाषित संस्कृति की स्थिति क्रायोस्ेक्शनिंग इम्यूनोस्टेटिंग
ह्यूमन प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल और इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा लक्षण वर्णन से परिपक्व सेरिबेलर ऑर्गेनॉइड की स्केलेबल जनरेशन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Silva, T. P., Fernandes, T. G.,… More

Silva, T. P., Fernandes, T. G., Nogueira, D. E. S., Rodrigues, C. A. V., Bekman, E. P., Hashimura, Y., Jung, S., Lee, B., Carmo-Fonseca, M., Cabral, J. M. S. Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining. J. Vis. Exp. (160), e61143, doi:10.3791/61143 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter