Summary
Este protocolo descreve um sistema de cultura dinâmica para produzir agregados de tamanho controlado de células-tronco pluripotentes humanas e estimular ainda mais a diferenciação em organoides cerebelares sob condições quimicamente definidas e livres de alimentadores usando um bioreator de uso único.
Abstract
O cerebelo desempenha um papel crítico na manutenção do equilíbrio e coordenação motora, e um defeito funcional em diferentes neurônios cerebelares pode desencadear disfunção cerebelar. A maior parte do conhecimento atual sobre fenótipos neuronais relacionados à doença é baseado em tecidos pós-morte, o que dificulta a compreensão da progressão e desenvolvimento da doença. Modelos animais e linhas celulares imortalizadas também têm sido usados como modelos para distúrbios neurodegenerativos. No entanto, eles não recapitulam totalmente a doença humana. As células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs) têm grande potencial para modelagem de doenças e fornecem uma fonte valiosa para abordagens regenerativas. Nos últimos anos, a geração de organoides cerebrais a partir de iPSCs derivados do paciente melhorou as perspectivas de modelagem de doenças neurodegenerativas. No entanto, faltam protocolos que produzam um grande número de organoides e um alto rendimento de neurônios maduros em sistemas de cultura 3D. O protocolo apresentado é uma nova abordagem para a geração reprodutível e escalável de organoides derivados do iPSC humanos em condições quimicamente definidas usando bioreatores escaláveis de uso único, nos quais os organoides adquirem identidade cerebelar. Os organoides gerados são caracterizados pela expressão de marcadores específicos tanto no nível mRNA quanto no nível da proteína. A análise de grupos específicos de proteínas permite a detecção de diferentes populações de células cerebelares, cuja localização é importante para a avaliação da estrutura organoide. Criosectioning organoide e imunostaining de fatias organoides são usados para avaliar a presença de populações específicas de células cerebelares e sua organização espacial.
Introduction
O surgimento de células-tronco pluripotentes humanas (PSCs) representa uma excelente ferramenta para a medicina regenerativa e modelagem de doenças, pois essas células podem ser diferenciadas na maioria das linhagens celulares do corpo humano1,,2. Desde sua descoberta, a diferenciação do PSC utilizando diversas abordagens tem sido relatada para modelar diferentes doenças, incluindo distúrbios neurodegenerativos3,,4,5,6.
Recentemente, houve relatos de culturas 3D derivadas de PSCs semelhantes a estruturas cerebrais humanas; estes são chamados organoides cerebrais3,,7,,8. A geração dessas estruturas a partir de PSCs saudáveis e específicos para o paciente fornece uma oportunidade valiosa para modelar o desenvolvimento humano e distúrbios neurodesenvolvimentos. No entanto, os métodos utilizados para gerar essas estruturas cerebrais bem organizadas são difíceis de aplicar para sua produção em larga escala. Para produzir estruturas grandes o suficiente para recapitular a morfogênese tecidual sem necrose dentro dos organoides, os protocolos contam com o compromisso neural inicial em condições estáticas, seguido pelo encapsulamento em hidrogéis e cultura subsequente em sistemas dinâmicos3. No entanto, tais abordagens podem limitar a potencial escala da produção organoide. Embora tenham sido feitos esforços para direcionar a diferenciação do PSC para regiões específicas do sistema nervoso central, incluindo neurônios cortical, estriatal, midbrain e medula espinhal9,10,,11,12, a geração de regiões cerebrais específicas em condições dinâmicas ainda é um desafio. Em particular, a geração de neurônios cerebelares maduros em estruturas 3D ainda não foi descrita. Muguruma et al. foram pioneiros na geração de condições culturais que recapitulam o desenvolvimento cerebelar precoce13 e recentemente relataram um protocolo que permite que células-tronco embrionárias humanas gerem uma estrutura polarizada que lembra o cerebelo do primeiro trimestre7. No entanto, o amadurecimento dos neurônios cerebelares nos estudos relatados requer a dissociação dos organoides, a classificação de progenitores cerebelares e a cocultura com células alimentadoras em um sistema de cultura monocamada7,,14,,15,,16. Portanto, a geração reprodutível dos organoides cerebelares desejados para modelagem de doenças em condições definidas ainda é um desafio associado à cultura e à variabilidade da fonte alimentador.
Este protocolo apresenta condições ideais de cultura para expansão 3D e diferenciação eficiente de PSCs humanos em neurônios cerebelares usando bioreatores de roda vertical de uso único (ver Tabela de Materiais para especificações), a partir de agora chamados bioreatores. Os bioreatores são equipados com um grande propulsor vertical, que em combinação com um fundo em forma de U, fornecem uma distribuição mais homogênea de tesoura dentro do vaso, permitindo uma mistura suave, uniforme e suspensão de partículas com velocidades de agitação reduzidas17. Com este sistema, podem ser obtidos agregados celulares controlados por tamanho e tamanho, o que é importante para uma diferenciação mais homogênea e eficiente. Além disso, um número maior de organoides derivados do iPSC pode ser gerado de forma menos trabalhosa.
A principal característica dos organoides, que são estruturas multicelulares 3D geralmente formadas a partir de células-tronco, é a auto-organização de diferentes tipos de células que formam formas específicas como as vistas na morfogênese humana18,,19,,20. Portanto, a morfologia organoide é um critério importante a ser avaliado durante o processo de diferenciação. A crioseção de organoides e a imunostenção de fatias organoides com um conjunto específico de anticorpos permitem a visualização espacial de marcadores moleculares para analisar a proliferação celular, diferenciação, identidade populacional celular e apoptose. Com este protocolo, por meio de crioseções organoides imunossumunas, observa-se um compromisso neural inicial eficiente pelo7º dia de diferenciação. Durante a diferenciação, são observadas diversas populações celulares com identidade cerebelar. Após 35 dias neste sistema dinâmico, o neuroepithelium cerebelar organiza-se ao longo de um eixo apicobasal, com uma camada apical de progenitores proliferadores e neurônios pós-metóticos localizados basicamente. Durante o processo de maturação, dos dias 35 a 90 de diferenciação, podem ser vistos tipos distintos de neurônios cerebelares, incluindo células Purkinje (Calbindin+), células de grânulo (PAX6+/MAP2+), células Golgi (Neurogranin+), células de escova unipolar (TBR2+), e neurônios de projeção de núcleos cerebelares profundos (TBR1+). Além disso, uma quantidade não significativa de morte celular é observada nos organoides cerebelares gerados após 90 dias na cultura.
Neste sistema, organoides derivados do iPSC humano amadurecem em diferentes neurônios cerebelares e sobrevivem por até 3 meses sem a necessidade de dissociação e cocultura alimentador, fornecendo uma fonte de neurônios cerebelares humanos para modelagem de doenças.
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Protocol
1. Passagem e manutenção de iPSCs humanos na cultura monocamadas
- Preparação de placas
- Descongele a matriz de membrana do porão (ver Tabela de Materiais) estocar a 4 °C e preparar alíquotas de 60 μL. Congele as alíquotas a -20 °C.
- Para revestir os poços de uma placa de 6 poços, descongele uma alíquota da matriz de membrana do porão no gelo. Uma vez descongelado adicione 60 μL a 6 mL de DMEM-F12. Levemente resuspend por pipetting para cima e para baixo.
- Adicione 1 mL de solução de matriz de membrana de porão diluída a cada poço de uma placa de 6 poços e incubar na RT por pelo menos 1 h antes de passar ou armazenar a 4 °C por até 1 semana.
- Passagem de colônias iPSC com EDTA
- Mantenha iPSCs na cultura monocamadas em 6 placas de poço na incubadora a 37 °C, 95% de umidade e 5% de CO2.
NOTA: Neste protocolo, foram utilizadas três linhas iPSC humanas distintas: F002.1A.1321, linha iPSC episômica humana (iPSC6.2)22e obtida comercialmente iPS-DF6-9-9T.B (ver Tabela de Materiais). - Antes da passagem, incubar as placas armazenadas (etapa 1.1) em temperatura ambiente (RT) por 15 minutos e preparar o meio mTesR1(Tabela 1).
- Aspire a solução da placa usando uma pipeta sorológica e adicione imediatamente 0,5 mL de mTeSR1 médio a cada poço.
- Aspire o meio gasto do poço contendo iPSCs e lave uma vez usando 1 mL de 0,5 mM EDTA por poço.
- Adicione 1 mL de 0,5 mM EDTA a cada poço e incubar na RT por 5 min.
- Aspire EDTA e remova as células dos poços adicionando suavemente mTeSR1 médio e pipetting as colônias usando uma micropipette P1000. Colete as células em um tubo cônico.
NOTA: Não encoste as células para cima e para baixo mais de 3x. - Adicione 1 mL de suspensão celular (diluído 1:4) a cada poço para que cada poço contenha 1,5 mL de meio após a suspensão da célula ser adicionada. Volte as células para a incubadora a 5% de CO2, 37 °C.
- Substitua o médio gasto diariamente e a cada 3 dias, quando 75%-80% de confluência é alcançada.
- Mantenha iPSCs na cultura monocamadas em 6 placas de poço na incubadora a 37 °C, 95% de umidade e 5% de CO2.
2. Semeadura de iPSCs humanos no bioreator
- Incubar iPSCs cultivados como monocamadas em mTeSR1 suplementados com 10 μM de inibidor de ROCHA Y-27632 (ROCKi). Adicione 1 mL de meio suplementado a cada poço a partir de uma placa de cultura de tecido de 6 poços e incubar por 1h a 37 °C, 95% de umidade e 5% de CO2.
NOTA: O ROCKi é usado para proteger iPSCs dissociados da apoptose23. - Após 1h de incubação, aspire o meio gasto de cada poço e lave 1x com 1 mL de 1× PBS por poço.
- Adicione 1 mL do meio de desprendimento celular (ver Tabela de Materiais) a cada poço de uma placa de 6 poços e incubar a 37 °C por 7 minutos até que as células se desprendem facilmente dos poços com suave agitação.
- Pipeta o desprendimento celular médio para cima e para baixo com uma micropipette P1000 até que as células se desprendem e dissociam em células únicas. Adicione 2 mL de cultura celular completa a cada poço para inativar a digestão enzimática e pipetar as células suavemente em um tubo cônico estéril.
- Centrífuga a 210 × g por 3 min e remova o supernaspe.
- Resuspenque a pelota celular em meio de cultura (ou seja, mTeSR1 suplementado com 10 μM de ROCKi) e conte os iPSCs com um hemócito usando corante azul trypan.
- Semente 15 × 106 células únicas no bioreator (volume máximo de 100 mL) com 60 mL de mTeSR1 suplementado com 10 μM de ROCKi a uma densidade celular final de 250.000 células/mL.
- Insira o vaso contendo os iPSCs na unidade base universal colocada na incubadora a 37 °C, 95% de umidade e 5% de CO2.
NOTA: A agitação do bioreator é mantida por 24 horas, definindo o controle universal da unidade base para 27 rpm para promover a agregação de iPSC.
3. Diferenciação e maturação de agregados derivados do iPSC humanos em organoides cerebelares
- Defina o dia da semeadura de células únicas como o dia 0.
- No primeiro dia, coletar 1 mL da amostra de agregados do iPSC utilizando uma pipeta sorológica. Mantenha o bioreator sob agitação como antes, colocando a unidade base universal com o bioreator contendo os agregados em um fluxo estéril antes da coleta da amostra. Aplaque a suspensão da célula em uma placa de 24 poços de fixação ultra-baixa. Verifique se os agregados derivados do iPSC são formados.
- Adquira imagens com um microscópio óptico usando uma ampliação total de 40x ou 100x para medir o diâmetro agregado.
- Meça a área dos agregados em cada imagem usando o software FIJI.
- Selecione "Analisar | Defina medidas" da barra de menu e clique em "Área" e "OK".
- Selecione "Arquivo | Abra" na barra de menu para abrir um arquivo de imagem armazenado. Selecione a ferramenta de seleção de linha apresentada na barra de ferramentas e crie uma linha reta sobre a barra de escala apresentada na imagem. Selecione "Analisar | Definir escala" a partir da barra de menu.
- Em "Distância conhecida"adicione a extensão da barra de escala da imagem em μm. Defina a "Unidade de comprimento" como μm. Clique em "Global" para manter as configurações e "OK". Selecione Seleção Oval na barra de ferramentas.
- Para cada agregado delineie a área com a ferramenta oval. Selecione "Analisar | Medida". Calcule seu diâmetro com base na área medida, considerando que os agregados são aproximadamente esféricos usando
com A como área do agregado.
- Quando o diâmetro médio dos agregados for de 100 μm, substitua 80% do meio gasto por mTeSR1 fresco sem ROCKi. Quando os agregados atingirem 200-250 μm de diâmetro, substitua todo o meio gasto por gfCDM (Tabela 1), permitindo que os organoides se instalem na parte inferior do bioreator.
NOTA: Se o diâmetro agregado médio exceder 350 μm não iniciar o protocolo de diferenciação. Repita a semeadura de células únicas. Geralmente, leva cerca de 1 dia para o agregado atingir um diâmetro médio de 100 μm. - Insira o bioreator contendo os agregados na unidade base universal colocada na incubadora a 37 °C, 95% de umidade e 5% de CO2.
- Diminua a agitação do bioreator para 25 rpm.
- No dia 2, repita as etapas 3.2, 3.3 e 3.4 para avaliar o diâmetro agregado. Adicione 30 μL de FGF2 (concentração final, 50 ng/mL) e 60 μL de SB431542 (concentração final, 10 μM) a 60 mL de meio de diferenciação gfCDM(Tabela 1). Substitua todo o meio gasto do bioreator pelo gfCDM suplementado. Repita o passo 3.6.
NOTA: SB431542 é crucial para inibir a diferenciação mesemndodérmica, induzindo a diferenciação neural24. FGF2 é usado para promover a caudalização do tecido neuroepiteliol25. - No dia 5, repetimos as etapas 3.2, 3.3, 3.4 e 3.8.
NOTA: O tamanho agregado deve aumentar durante o protocolo de diferenciação. No entanto, o diâmetro só é crítico quando a diferenciação começa, pois esse parâmetro pode influenciar a eficácia da diferenciação. - No dia 7, repetimos as etapas 3.2, 3.3 e 3.4. Diluir FGF2 e SB431542 a 2/3: Adicionar 20 μL de FGF2 e 40 μL de SB431542 a 60 mL de meio de diferenciação gfCDM. Substitua todo o meio gasto do bioreator por gfCDM suplementado. Repita o passo 3.6 e aumente a agitação do bioreator para 30 rpm.
- No dia 14, repetimos as etapas 3.2, 3.3 e 3.4. Adicione 60 μL de FGF19 (concentração final, 100 ng/mL) a 60 mL de meio de diferenciação gfCDM. Substitua todo o meio gasto do bioreator por gfCDM complementado com FGF19. Repita o passo 3.6.
NOTA: O FGF19 é usado para promover a polarização das estruturas de cérebro médio26. - No dia 18, repetimos as etapas 3.2, 3.3, 3.4 e 3.11.
- No dia 21, repetimos as etapas 3.2, 3.3 e 3.4. Substitua todo o meio gasto do bioreator por meio neurobásal completo(Tabela 1). Repita o passo 3.6.
NOTA: O meio neurobásal é um meio basal utilizado para manter a população celular neuronal dentro do organoide7. - No dia 28, repetimos as etapas 3.2, 3.3 e 3.4. Adicione 180 μL de SDF1 (concentração final, 300 ng/mL) a 60 mL de meio neurobásal completo. Substitua todo o meio gasto do bioreator por meio neurobásal completo complementado com SDF1. Repita o passo 3.6.
NOTA: O SDF1 é usado para facilitar a organização de camadas celulares distintas27. - No dia 35, repetimos as etapas 3.2, 3.3 e 3.4. Substitua todo o meio gasto do bioreator por meio brainphys completo(Tabela 1). Repita o passo 3.6.
NOTA: BrainPhys é um meio neuronal que suporta neurônios sinapticamente ativos28. - Substitua 1/3 do volume total a cada 3 dias por meio brainphys completo até o dia 90 de diferenciação.
4. Preparação de organoides para criosectioning e imunohistoquímica
- Coleta de organoides para imunossuagem
- Coletar 1 mL de amostra de organoides médios contendo uma pipeta sorológica do bioreator a um tubo cônico de 15 mL.
NOTA: Os organoides devem ser coletados em diferentes momentos para avaliar a eficácia da diferenciação, incluindo os dias 7, 14, 21, 35, 56, 70, 80 e 90. - Retire o supernatante e lave uma vez com 1 mL de 1× PBS.
NOTA: Não centrifugar os organoides. Deixe os organoides se estabelecerem na parte inferior do tubo pela gravidade. - Remova o supernasce e adicione 1 mL de 4% de paraformaldeído (PFA). Incubar a 4 °C por 30 min. Remova o PFA gasto e adicione 1 mL de 1× PBS.
- Armazene os organoides em 1 mL de 1× PBS a 4 °C até o processamento para criosectioning.
NOTA: Armazene os organoides em 1x PBS por no máximo 1 semana após a fixação.
- Coletar 1 mL de amostra de organoides médios contendo uma pipeta sorológica do bioreator a um tubo cônico de 15 mL.
- Preparação de organoides para criosectioning
- Remova o supernatante dos organoides armazenados. Adicione 1 mL de sacarose de 15% (w/v, diluída em 1× PBS), misture bem por um giro suave e incubar durante a noite a 4 °C.
- Prepare uma solução de 15% de sacarose/7,5% de gelatina(Tabela 2) e mantenha a 37 °C durante a preparação para evitar que a gelatina se solidifique.
- Retire a solução de 15% de sacarose, adicione 1 mL de 15% de sacarose/7,5% de gelatina aos organoides e misture rapidamente por redemoinho suave. Incubar a 37 °C por 1 h.
- Adicione 15% de solução de sacarose/7,5% de gelatina a um recipiente plástico até a metade do seu volume. Aguarde a solidificação na RT.
- Após uma incubação de 1 h, coloque cuidadosamente uma gota de sacarose/gelatina contendo os organoides na gelatina solidificada com uma pipeta Pasteur. Deixe solidificar na RT por cerca de 15 minutos. Certifique-se de evitar a formação de bolhas.
- Coloque 15% de sacarose/7,5% de gelatina em cima dos organoides até que o recipiente esteja cheio. Aguarde a solidificação completa na RT.
- Após a solidificação, incubar 20 min a 4 °C.
- Corte a gelatina em um cubo contendo os organoides no centro e fixe o cubo de gelatina em um pedaço de papelão com uma gota de composto O.C.T.
- Coloque 250 mL de isopentane em um copo de 500 mL e encha um recipiente apropriado com nitrogênio líquido. Usando fórceps e luvas grossas, coloque cuidadosamente o copo contendo isopentane na superfície do nitrogênio líquido e esfrie a isopine a -80 °C.
- Quando -80 °C for atingido, coloque o cubo de gelatina no copo contendo isopentane até congelar, mantendo a temperatura em -80 °C. Dependendo do tamanho do cubo, pode levar de 1 a 2 min.
NOTA: Evite temperaturas abaixo de -80 °C ou tempo de congelamento excessivo, pois pode causar rachaduras no cubo. - Quando congelado, armazene rapidamente o cubo de gelatina a -80 °C e armazene até que a criosectioning.
- Criosectioning de organoides
- Ligue o criostat e defina as temperaturas de espécime (OT) e criocâmara (TC) a -25 °C.
- Quando ambas as temperaturas estabilizarem, fixe o cubo de gelatina contendo os organoides na amostra usando composto O.C.T.
- Defina a espessura da seção a 12 μm.
- Corte o cubo e colete 3-4 fatias em slides de microscópio de adesão (ver Tabela de Materiais).
- Armazenar a -20 °C até usar.
- Imunostaining de fatias organoides
- Coloque os slides do microscópio contendo seções organoides em um frasco de copling com 50 mL de PBS 1x pré-armado, segurando até 10 slides de costas para trás.
NOTA: Todas as seções organoides devem ser submersas com líquido. - Incubar por 45 min a 37 °C para degelatinizar slides.
- Lave 1x com 50 mL de 1× PBS por 5 min na RT: Transfira os slides para um frasco de copling contendo PBS fresco de 1×.
- Transfira os slides para um frasco de copling contendo 50 mL de glicina recém-preparada(Tabela 2) e incubar por 10 minutos na RT.
- Transfira os slides para um frasco de copling contendo 50 mL de triton de 0,1%(Tabela 2) e permeabilize por 10 min na RT.
- Lave com 1× PBS por 5 min 2x.
- Prepare o prato de imunostaining com papel 3 mm embebido em PBS de 1×. Seque lâminas com um tecido ao redor das fatias e coloque-as em papel de 3 mm. Com uma pipeta Pasteur, cubra toda a superfície dos slides com solução de bloqueio(Tabela 2) com ~0,5 mL por slide. Incubar por 30 min na RT.
- Remova a solução de bloqueio em excesso e seque as lâminas com um tecido ao redor das fatias. Coloque 50 μL do anticorpo primário(Tabela 3) diluído na solução de bloqueio sobre as seções e cubra com as tampas. Coloque as fatias em um prato de imunostaining previamente preparado. Incubar durante a noite a 4 °C.
- Transfira os slides para um frasco de copling com 50 mL de TBST (Tabela 2),deixe as tampas caírem e lave com TBST por 5 min 3x.
- Coloque 50 μL do anticorpo secundário diluído na solução de bloqueio sobre as seções e cubra com as tampas. Coloque as fatias no prato de imunostaining previamente preparado. Incubar por 30 min no RT, protegido da luz.
- Transfira os slides para um frasco de copling novamente e lave com 50 mL de TBST por 5 min 3x.
- Seque as lâminas com um tecido ao redor das fatias e coloque as fatias em um prato de imunossuagem previamente preparado. Adicione 0,5 mL de solução DAPI sobre toda a superfície dos slides com uma pipeta Pasteur. Incubar por 5 min na RT.
- Repita o passo 4.4.9.
- Seque cuidadosamente as lâminas com um tecido. Adicione 50 μL de montagem média gota por gota ao longo do slide e, em seguida, abaixe cuidadosamente uma mancha de cobertura em cada slide, dobrando-a ligeiramente para evitar bolhas.
- Coloque os slides do microscópio contendo seções organoides em um frasco de copling com 50 mL de PBS 1x pré-armado, segurando até 10 slides de costas para trás.
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Representative Results
O protocolo foi iniciado pela promoção da agregação celular utilizando os bioreatores 0,1 L (Figura 1A). Foi realizada a inoculação de célula única dos iPSCs, com 250.000 células/mL semeadas em 60 mL de médio com velocidade de agitação de 27 rpm. Isso foi definido como o dia 0. Após 24 h, as células formaram eficientemente agregados em forma de esfóide (dia 1, Figura 1B), e a morfologia foi bem mantida até o dia 5, com um aumento gradual de tamanho, demonstrando um alto grau de homogeneidade na morfologia agregada e tamanho ao longo do tempo. (Figura 1B). Uma análise quantitativa por microscopia também revelou distribuição normal dos tamanhos agregados até o dia 1 (Figura 1C). O tamanho agregado é um importante parâmetro físico capaz de levar as células a se diferenciarem para diferentes linhagens29,30. Por essa razão, com base no tamanho agregado relatado em estudos anteriores para induzir um compromisso neural eficiente31,,32 e cerebelar21, os agregados gerados foram mantidos no mTeSR1 médio a 25 rpm até atingirem o diâmetro desejado antes de iniciar a diferenciação (~200 μm). No dia 2, o diâmetro médio foi de 221,0 ± 54,4 μm (média ± SD) para a linha celular F002.1A.13 e 212,1 ± 42,1 μm para a linha celular iPSC6.2. Como tal, ambas as linhas celulares atingiram o tamanho agregado ideal neste ponto de tempo (Figura 1C).
Definindo o dia em que a semeadura dos iPSCs foi realizada como dia 0, no dia 2, após atingir o diâmetro agregado desejado, o compromisso neural foi induzido pelo uso simultaneamente de SB431542, FGF2 e insulina, promovendo diferenciação neuroectodérmica, bem como uma caudalização moderada necessária para a padronização do cérebro médio. Posteriormente, FGF19 e SDF1 foram adicionados à cultura nos dias 14 e 28, respectivamente, para promover a geração de diferentes progenitores cerebelares. Para os primeiros dias de indução neural, foi utilizada uma velocidade de rotação de 25 rpm, que foi aumentada para 30 rpm após 7 dias para evitar o acúmulo e a aglomeração de agregados maiores(Figura 2A). Durante a diferenciação, os organoides apresentaram uma epitelização mais pronunciada semelhante às estruturas semelhantes a tubos neurais com espaço luminal(Figura 2B). Além disso, a avaliação da distribuição do diâmetro organoide demonstrou uma distribuição de tamanho homogênea durante o compromisso cerebelar inicial até o dia 14 (Figura 2B).
A análise da imunofluorescência sustenta que um compromisso neural eficiente dos organoides derivados do iPSC já é alcançado até o dia 7 de diferenciação após a adição de FGF2 e SB431542. As crioseções de organoides revelaram muitas estruturas que lembram a coloração do tubo neural para PAX6 e NESTIN, com a maioria das células dentro dos organoides expressando o marcador progenitor NESTIN nos dias 7 e 14 de diferenciação(Figura 2C). Posteriormente, FGF19 e SDF1 promoveram a geração de camadas progenitoras contínuas proliferadoras (PAX6+) e uma diferenciação neuronal eficiente foi alcançada, como demonstrado pela expressão de TUJ1, beta-tubulina de classe III específica do neurônio, nos dias 21 e 35(Figura 2C). Além disso, também foi observada uma diferenciação cerebelar eficiente após 21 dias nos bioreatores 0,1 L VW, demonstrados pela presença de duas populações celulares diferentes: progenitores de células de granulo (células BARLH1+ células, Figura 3A) e progenitores de células Purkinje (células OLIG2+ células, Figura 3B). Após 35 dias na cultura, diferentes populações celulares dentro dos organoides pareciam estar organizadas em camadas distintas. Várias estruturas planas-ovais dentro dos organoides foram observadas com progenitores cerebelares BARHL1+ dorsal como uma camada contínua no lado superficial do organoide (Figura 3C,D) e SOX2+ na região luminal dessas estruturas ovais(Figura 3D). Além disso, os neurônios tuj1+ recém-nascidos pareciam migrar em direção à superfície, restabelecendo o alinhamento radial na superfície externa do organoide(Figura 3E).
Após a geração de progenitores cerebelares, foi promovida uma maturação adicional utilizando-se o BrainPhys médio28 complementado com fatores neurotróficos BDNF e GDNF. A coloração de imunofluorescência de crioseções organoides foi usada para detectar subtipos distintos de neurônios cerebelares. As células purkinje, neurônios GABAérgicos que expressam o calbindin de proteína de ligação de cálcio (CALB, Figura 3F),foram detectadas nos organoides cerebelares após o protocolo de maturação. Além disso, outro grande tipo neuronal cerebelar, as células de grânulo, foi identificado como um subconjunto de células coexpressas PAX6 e MAP2 (Figura 3G). Curiosamente, um pool de progenitores PAX6+ que não expressavam MAP2 foi mantido até 80 dias de diferenciação. Outros tipos de neurônios cerebelares também foram detectados, incluindo células de escova unipolar expressando TBR2 (Figura 3H), e neurônios de projeção de núcleos cerebelares profundos expressando TBR1 (Figura 3I). Além da diferenciação e maturação cerebelar eficiente, este sistema de cultura dinâmica 3D utilizando os bioreatores PBS 0.1 L VW permitiu que os organoides permanecessem viáveis por até 90 dias, sem morte celular significativa e necrose(Figura 3J).
Figura 1: Geração de agregados controlados por tamanho usando bioreatores escaláveis. (A) Características de design do bioreator. (B) Fotomicrograph Brightfield mostrando agregados de duas linhas iPSC diferentes nos dias 1, 2 e 5. Barra de escala = 100 μm. (C) A distribuição de tamanho de agregados flutuantes de diferentes linhas iPSC nos bioreatores. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Geração de organoides derivados do iPSC humanos usando bioreatores 0,1 L. (A) Representação esquemática do procedimento cultural para induzir a diferenciação de iPSCs aos organoides cerebelares. As células foram semeadas a uma densidade de 250.000 células/mL e uma velocidade de agitação de 27 rpm foi usada para promover a agregação celular. Durante os primeiros dias de diferenciação, os agregados foram mantidos a uma velocidade de agitação de 25 rpm. Posteriormente, para evitar o acúmulo de agregados maiores, a velocidade de agitação foi aumentada para 30 rpm. (B) Caracterização da forma e tamanho organoides. Fotomicógrafos brightfield mostrando organoides derivados do iPSC durante a diferenciação cerebelar nos bioreatores 0.1 L VW. Barra de escala = 100 μm. A distribuição dos diâmetros organoides demonstra que a cultura manteve tamanhos organoides homogêneos ao longo do protocolo de diferenciação. (C) Indução neural eficiente em organoides derivados do iPSC. Imunofluorescência para NESTIN, PAX6 e TUJ1 durante a diferenciação cerebelar. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Diferenciação e maturação cerebelar eficientes em organoides derivados do iPSC humano. (A-E) Compromisso cerebelar eficiente. Análise de imunostaining para marcadores BARHL1, SOX2, OLIG2, NCAD e TUJ1 nos pontos de tempo indicados do protocolo de diferenciação cerebelar. (F-I) Maturação eficiente de organoides cerebelares derivados do iPSC humanos. Imunofluorescência mostrando diferentes tipos de neurônios cerebelares, incluindo células Purkinje (CALB, F), células de grânulo (PAX6 e MAP2, G), células de escova unipolar (TBR2) e núcleos cerebelares profundos de neurônios (TBR1). (J) Alta viabilidade celular após a maturação cerebelar. Manchas vivas/mortas (calcein-AM, verde e propidium iodida, vermelho) mostraram alta viabilidade celular e nenhuma evidência de áreas necrosas após 80 dias nos bioreatores. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Preparação da mídia |
mTeSR1 Volume final: 500 mL |
1. Descongele mTeSR1 5× suplemento à temperatura ambiente (RT) ou a 4 °C durante a noite e misture com meio basal 2. Armazene o meio mTeSR1 completo a 4 °C por até 2 semanas ou prepare alíquotas de 40 mL e armazene a -20 °C 3. MTeSR1 completo pré-quente no RT antes de usar |
|
gfCDM (meio quimicamente definido sem fator de crescimento) Volume final: 60 mL |
F12 do Presunto de 30 mL IMDM de 30 mL 600 μL concentrado lipídudo quimicamente definido (1 % v/v) 2,4 μL monothioglicerol (450 μM) 30 μL apo-transferrin (solução de estoque a 30 mg/mL na água, concentração final: 15 μg/mL) BSA purificado de cristalização de 300 mg (5 mg/mL) Insulina de 42 μL (concentração de estoque a 10 mg/mL, concentração final: 7 μg/mL) 300 μL P/S (0,5% v/v, penicilina U/ml/50 μg/ml streptomycin) |
|
|
Neurobásal Volume final: 60 mL |
60 mL de meio neurobásal Suplemento 600 μL N2 600 μL Glutamax I 300 μL P/S (0,5 % v/v). |
|
|
BrainPhys completo Volume final: 60 mL |
60mL de BrainPhys Suplemento neuronal NeuroCult SM1 de 1,2 mL Suplemento 600 μL N2 12 μL BDNF (concentração final: 20 ng/mL) 12 μL GDNF (concentração final: 20 ng/mL) 300 μL Dibutyryl-cAMP (concentração de estoque: 100 mg/mL na água, concentração final: 1 mM) 42 μL ácido ascórbico (concentração de estoque: 50 μg/mL na água, concentração final: 200 nM) |
|
| Soluções de estoque de fatores de crescimento e pequenas moléculas |
Fator básico de crescimento do fibroblasto (bFGF/FGF2) Concentração de estoque: 100 μg/mL |
1. Reconstituir em 5 mM Tris, pH 7.6, a uma concentração de 10 mg/mL 2. Diluir com 0,1 % BSA em PBS (v/v) para uma concentração final de estoque de 100 μg/mL |
|
Fator derivado de células estromas 1 (SDF1) Concentração de estoque: 100 μg/mL |
1. Reconstituir na água a uma concentração de 10 mg/mL 2. Diluir com 0,1 % BSA (v/v) em PBS para uma concentração final de estoque de 100 μg/mL. |
|
|
Fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) Concentração de estoque: 100 μg/mL |
||
|
Fator neurotrófico derivado de células gliais (GDNF) Concentração de estoque: 100 μg/mL |
||
|
Fator de crescimento do fibroblasto 19 (FGF19) Concentração de estoque: 100 μg/mL |
1. Reconstituir em fosfato de sódio de 5 mM, pH 7.4, a uma concentração de 10 mg/mL 2. Diluir com 0,1 % BSA em PBS (v/v) para uma concentração final de estoque de 100 μg/mL |
|
|
Inibidor de ROCHA Y-27632 Concentração de estoque: 10mM |
Reconstituir em DMSO a uma concentração de 10 mM. | |
|
SB431542 Concentração de estoque: 10mM |
||
|
Insulina Concentração de estoque: 10 mg/mL |
1. Reconstituir 10 mg de insulina em 300 μL de 10 mM NaOH 2. Adicione cuidadosamente 1 M NaOH até que a solução se torne transparente 3. Encha até 1 mL com água estéril. |
Tabela 1: Soluções de estoque e preparação de mídia. Listados estão todos os componentes e volumes utilizados para preparar mídia para o protocolo de manutenção e diferenciação de iPSCs, bem como soluções de estoque de fatores de crescimento e pequenas moléculas. Para soluções de estoque, todas as concentrações de estoque e protocolos de reconstituição estão listados.
|
Gelatina/Sacarose Concentração final: 7,5%/15% w/w |
1. Pese 15 g de sacarose e 7,5 g de gelatina em uma garrafa de vidro estéril Schott e misture bem 2. Pré-aqueça o PBS 1× a 65 °C 3. Adicione PBS pré-aquecido 1× a um peso final de 100 g e misture bem 4. Coloque a garrafa de vidro Schott em uma placa de aquecimento a 65 °C e agite até que a gelatina derreta 5. Incubar a 37 °C até que a solução se estabilize |
|
Glicina Concentração final: 0,1 M |
Adicione 0,37 g de glicina a 50 mL de PBS 1× recém-preparada. |
|
Solução triton Concentração final: 0,1 % c/v |
1. Prepare um estoque triton X-100 de 10 %: 5 g de Triton X-100 em 50 mL de PBS 1× 2. Adicione 0,5 mL de estoque Triton X-100 a 50 mL de PBS 1×. |
|
Tbst 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 0,05 % w/v Tween-20 |
20 mL Tris 1 M 30 mL NaCl 5 M 5 mL Tween-20 (10 % de estoque: 5 g de Tween-20 em 50 mL de água) Encha até 1 L com água. |
| Solução de bloqueio | Adicione 5 mL de soro bovino fetal (FBS, concentração final: 10 % v/v) a 50 mL de TBST. |
| Solução DAPI | Adicione 15 μL de solução de estoque DAPI (1 mg/mL) a 10 mL de água destilada |
| Mowiol | 1. Adicione 2,4 g de Mowiol a 6 g de glicerol e agite por 1h em uma placa pré-aquecida a 50 °C 2. Adicione 6 mL de água destilada e agite por 2h 3. Adicione 12 mL de Tris 200 mM (pH 8.5) e agite por 10 min 4. Centrífuga a 5.000 × g por 15 min 5. Aliquot e armazenar a -20 °C. |
Tabela 2: Soluções para preparação de organoides para criosectioning e imunostaining. Listados estão todos os componentes e volumes utilizados para preparar as soluções utilizadas na preparação de organoides para criosectioning e imunostaining.
| Anticorpo | Espécies hospedeiras | Diluição |
| BARHL1 | Coelho | 1/500 |
| CALBINDIN | Coelho | 1/500 |
| MAP2 | Mouse | 1/1000 |
| N-CADHERIN | Mouse | 1/1000 |
| NESTIN | Mouse | 1/400 |
| OLIG2 | Coelho | 1/500 |
| PAX6 | Coelho | 1/400 |
| SOX2 | Mouse | 1/200 |
| TBR1 | Coelho | 1/200 |
| TBR2 | Coelho | 1/200 |
| TUJ1 | Mouse | 1/1000 |
Tabela 3: Anticorpos primários. Os anticorpos primários, clones e diluições otimizadas usadas para imunossuagem estão listados.
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Discussion
A necessidade de grandes números de células, bem como condições de cultura definidas para gerar tipos de células específicas para triagem de medicamentos e aplicações de medicamentos regenerativos tem impulsionado o desenvolvimento de sistemas de cultura escalável. Nos últimos anos, vários grupos relataram a geração escalável de progenitores neurais e neurônios funcionais32,,33,34, proporcionando avanços significativos no desenvolvimento de novos modelos para distúrbios neurodegenerativos. No entanto, ainda falta a recapitulação de alguns eventos críticos de desenvolvimento embrionário, e a manutenção dos neurônios funcionais gerados em suspensão por longos períodos de tempo ainda não foi alcançada34. Apresentado aqui é um sistema de cultura 3D dinâmico capaz de gerar organoides neurais derivados do iPSC com identidade cerebelar, e promover ainda mais a maturação em neurônios cerebelares funcionais sob condições quimicamente definidas e livres de alimentadores na cultura dinâmica.
Antes de iniciar a diferenciação cerebelar, é fundamental manter a qualidade dos iPSCs humanos. Assim, para não comprometer a diferenciação, não mais do que três passagens de iPSCs devem ser realizadas a partir do descongelamento à inoculação bioreatorial. Um passo importante no protocolo de diferenciação é avaliar o tamanho agregado. O tamanho agregado tem um papel crítico na indução da diferenciação para uma linhagem celular específica29. Além disso, há um limite de tamanho mínimo que parece favorecer a diferenciação35. Como já relatado, o diâmetro agregado derivado do iPSC ideal para promover um compromisso neural eficiente31,,32 e diferenciação cerebelar21 é um diâmetro de ~200 μm.
Além disso, neste protocolo dinâmico, a velocidade de agitação utilizada nos primeiros dias de cultura é crucial para controlar o diâmetro agregado e a indução neural. A cultura começou a 27 rpm, o que é suficiente para promover a agregação de iPSCs e evitar a formação de agregados maiores (diâmetros acima de 350 μm devem ser evitados). A agitação usada para promover a agregação celular após a semeadura de células únicas poderia ser aumentada para 30 rpm sem afetar a viabilidade celular; no entanto, espera-se que velocidades de agitação mais altas produzam agregados menores. Dependendo da linha iPSC, 24 h após a semeadura celular usando 27 rpm, dois cenários diferentes são esperados: os agregados formados apresentam diâmetros menores (<200 μm) ou atingiram uma faixa de tamanhos entre 200-300 μm. Se os agregados forem maiores que 350 μm a 24 h após a semeadura celular, a diferenciação não deve ser realizada, e a semeadura celular deve ser repetida, pois a eficiência da diferenciação será muito baixa. Se os agregados forem menores que 200 μm, o meio gasto deve ser substituído pelo meio de manutenção iPSC, e a velocidade de agitação reduzida para 25 rpm. Com esse ajuste, espera-se que o diâmetro agregado aumente do dia 1 ao dia 2, provavelmente devido à fusão de agregados individuais promovidos pela diminuição da velocidade de agitação. No caso de agregados com tamanhos entre 200 e 300 μm, o meio gasto deve ser substituído por meio de diferenciação, e a indução neural com FGF2 deve ser iniciada após 2 dias na cultura. Neste ponto, a velocidade de agitação também deve ser ligeiramente reduzida para evitar o excesso de morte celular, pois as células são mais sensíveis ao estresse de tesoura na presença de meio de diferenciação. Além disso, a homogeneidade populacional poderia ser analisada utilizando-se o coeficiente de variação (CV), que mede a variabilidade correlacionando o desvio padrão com a média dos diâmetros agregados, segundo a equação
em que δ representa o desvio padrão do diâmetro agregado e μ é o diâmetro médio. Nesse sistema dinâmico, a média observada cv foi de 12,5 ± 3,3% (média ± SD) para a linha celular F002.1A.13 e 19,0 ± 0,37% para a linha celular iPSC6.2 no dia 2. Assim, nesse sistema, deve-se esperar uma população de tamanho homogêneo com cv abaixo de 0,2 (< 20% de variação). Após 7 dias de diferenciação, o diâmetro agregado médio variou de 300 a 360 μm, e a velocidade de agitação foi aumentada para 30 rpm para evitar que os agregados se instalassem na parte inferior do bioreator 0,1 L VW.
A diferenciação de organoides cerebelares até o dia 35 e a análise do tamanho agregado em condições estáticas foram recentemente relatadas21. Os autores mostraram que os agregados 3D formados e mantidos em placas (por exemplo, Aggrewell) até o 7º dia de diferenciação eram homogêneos em tamanho e forma21. No entanto, após a transferência dos agregados para o anexo ultra-baixo 6 placas de cultura de poço, os agregados começaram a variar em tamanho e morfologia21. No dia 35, em condições estáticas, alguns dos agregados 3D atingiram 1.000 μm para diferentes linhas celulares, o que limitou a difusão de nutrientes e oxigênio. Em contrapartida, utilizando nossas condições dinâmicas, os agregados não atingiram mais de 800 μm de diâmetro até o dia 35, com melhor transferência de massa devido à constante agitação do meio promovida pela roda vertical. Além disso, os tamanhos agregados foram mantidos até o final do processo de maturação, mostrando um diâmetro agregado de 646,6 ± 104,2 μm até o dia 90, a cultura mais longa realizada em bioreatores 0,1 L VW.
A indução cerebelar eficiente foi induzida pela adição sequencial de SB431542, FGF2, FGF19 e SDF1 neste sistema dinâmico 3D. O protocolo começa com a combinação de SB431542, que é um fator de crescimento transformador beta (TGF-ß)-receptor que inibe a diferenciação mesemodérmica, e FGF2, que tem um grande efeito na caudalização do tecido neuroepitelial25. Portanto, a adição dessas duas moléculas durante os primeiros dias de cultura é essencial para promover a diferenciação celular para o cérebro médio, o território que dá origem ao tecido cerebelar. Após a indução inicial ao tecido de cérebro médio, é necessário adicionar FGF19 para promover a geração espontânea de estruturas de cérebro médio com polaridade dorsal-ventral, bem como a geração de diferentes progenitores cerebelares36,26. O SDF1 facilita a organização de camadas distintas de progenitores cerebelares, como visto no estágio de desenvolvimento em que ocorre a neurogênese cerebelar27. Até o dia 35, essas moléculas podem promover a organização de organoides cerebelares que podem recapitular o desenvolvimento cerebelar humano, que corresponde ao cerebelo do primeiro trimestre. Após a organização de progenitores cerebelares em diferentes camadas, foi utilizado um meio neuronal definido para promover sua maturação28. Outras mídias usadas para manter células neuronais também poderiam ser testadas, mas menores eficiências são previstas. Assim, neste protocolo, a BrainPhys foi utilizada para promover a diferenciação de células comprometidas com cerebelares em neurônios cerebelares, pois tem sido relatado para melhor imitar o ambiente neuronal saudável e apoiar a atividade neurofisiológica dos neurônios gerados28.
Usando essas condições dinâmicas, uma difusão mais eficiente de nutrientes, oxigênio e fatores de crescimento pode ser alcançada. No entanto, algumas limitações estão associadas à agitação utilizada no protocolo de diferenciação. Algum estresse de tesoura pode ser introduzido pelo processo de agitação, que pode afetar a sobrevivência, a proliferação e a diferenciação das células. Portanto, durante a etapa de maturação, na qual as células são mais sensíveis, a cultura deve ser cuidadosamente monitorada.
A diferenciação de organoides cerebelares que lembram o desenvolvimento cerebelar embrionário humano já foi relatada7. No entanto, a maturação adicional desses organoides cerebelares embrionários em neurônios cerebelares usando culturas 3D continua sendo um desafio. A geração de neurônios cerebelares funcionais só foi alcançada através da coculturação com células de grânulo de várias fontes4,,7,,15. Este protocolo conseguiu elevar o compromisso cerebelar dos iPSCs humanos; além disso, este é o primeiro protocolo para a diferenciação de diferentes neurônios cerebelares em um sistema de cultura 3D sem cocultura com células alimentador. Especificamente, os seguintes tipos de células podem ser produzidos em nosso sistema de cultura dinâmica: células Purkinje (Calbindin+),células de grânulo (PAX6+/MAP2+), células de escova unipolar (TBR2+), e neurônios de projeção de núcleos cerebelares profundos (TBR1+), que foram mantidos em suspensão por até 3 meses.
A geração escalável de organoides cerebelares representa uma ferramenta valiosa para estudar o desenvolvimento embrionário do cerebelo e as vias patológicas envolvidas na degeneração deste órgão. Além disso, a triagem de alto rendimento para moléculas que restauram a função cerebelar pode ser realizada usando organoides obtidos com este sistema escalável. No geral, este método satisfaz uma necessidade não atendida de um protocolo escalável para a geração de organoides cerebelares de alta qualidade que podem ser importantes para uma variedade de aplicações biomédicas.
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Disclosures
Os autores YH e SJ são funcionários da PBS Biotech. O autor BL é CEO e co-fundador da PBS Biotech, Inc. Esses autores colaboradores participaram do desenvolvimento dos bioreatores utilizados no manuscrito. Isso não altera a adesão dos autores a todas as políticas da revista sobre o compartilhamento de dados e materiais. Todos os outros autores não declaram conflito de interesses.
Acknowledgments
Este trabalho contou com o apoio da Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), Portugal (UIDB/04565/2020 através do Programa Operacional Regional de Lisboa 2020, Projeto Nº 007317, PD/BD/105773/2014 para T.P.S e PD/BD/128376/2017 para D.E.S.N.), projetos co-financiados pelo FEDER (POR Lisboa 2020 —Programa Operacional Regional de Lisboa PORTUGAL 20 2020) e FCT através da concessão PAC-PRECISE LISBOA-01-0145-FEDER-016394 e CEREBEX Geração de Organoides Cerebelares para Ataxia Research grant LISBOA-01-0145-FEDER-029298. O financiamento também foi recebido do Programa de Pesquisa e Inovação Horizon 2020 da União Europeia, sob o Acordo de Subvenção nº 739572 — O Centro de Descobertas para Medicina Regenerativa e de Precisão H2020-WIDESPREAD-01-2016-2017.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3MM paper | WHA3030861 | Merck | |
| Accutase | A6964 - 500mL | Sigma | cell detachment medium |
| Anti-BARHL1 Antibody | HPA004809 | Atlas Antibodies | |
| Anti-Calbindin D-28k Antibody | CB28 | Millipore | |
| Anti-MAP2 Antibody | M4403 | Sigma | |
| Anti-N-Cadherin Antibody | 610921 | BD Transduction | |
| Anti-NESTIN Antibody | MAB1259-SP | R&D | |
| Anti-OLIG2 Antibody | MABN50 | Millipore | |
| Anti-PAX6 Antibody | PRB-278P | Covance | |
| Anti-SOX2 Antibody | MAB2018 | R&D | |
| Anti-TBR1 Antibody | AB2261 | Millipore | |
| Anti-TBR2 Antibody | ab183991 | Abcam | |
| Anti-TUJ1 Antibody | 801213 | Biolegend | |
| Apo-transferrin | T1147 | Sigma | |
| BrainPhys Neuronal Medium N2-A & SM1 Kit | 5793 - 500mL | Stem cell tecnhnologies | |
| Chemically defined lipid concentrate | 11905031 | ThermoFisher | |
| Coverslips 24x60mm | 631-1575 | VWR | |
| Crystallization-purified BSA | 5470 | Sigma | |
| DAPI | 10236276001 | Sigma | |
| Dibutyryl cAMP | SC- 201567B -500mg | Frilabo | |
| DMEM-F12 | 32500-035 | ThermoFisher | |
| Fetal bovine serum | A3840001 | ThermoFisher | |
| Gelatin from bovine skin | G9391 | Sigma | |
| Glass Copling Jar | E94 | ThermoFisher | |
| Glutamax I | 10566-016 | ThermoFisher | |
| Glycine | MB014001 | NZYtech | |
| Ham’s F12 | 21765029 | ThermoFisher | |
| Human Episomal iPSC Line | A18945 | ThermoFisher | iPSC6.2 |
| IMDM | 12440046 | ThermoFisher | |
| Insulin | 91077C | Sigma | |
| iPS DF6-9-9T.B | WiCell | ||
| Iso-pentane | PHR1661-2ML | Sigma | |
| L-Ascorbic acid | A-92902 | Sigma | |
| Matrigel | 354230 | Corning | basement membrane matrix |
| Monothioglycerol | M6154 | Sigma | |
| Mowiol | 475904 | Millipore | mounting medium |
| mTeSR1 | 85850 -500ml | Stem cell technologies | |
| N2 supplement | 17502048 | ThermoFisher | |
| Neurobasal | 12348017 | ThermoFisher | |
| Paraformaldehyde | 158127 | Sigma | |
| PBS-0.1 Single-Use Vessel | SKU: IA-0.1-D-001 | PBS Biotech | |
| PBS-MINI MagDrive Base Unit | SKU: IA-UNI-B-501 | PBS Biotech | |
| Recombinant human BDNF | 450-02 | Peprotech | |
| Recombinant human bFGF/FGF2 | 100-18B | Peprotech | |
| Recombinant human FGF19 | 100-32 | Peprotech | |
| Recombinant human GDNF | 450-10 | Peprotech | |
| Recombinant human SDF1 | 300-28A | Peprotech | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | 72302 | Stem cell technologies | |
| SB431542 | S4317 | Sigma | |
| Sucrose | S7903 | Sigma | |
| SuperFrost Microscope slides | 12372098 | ThermoFisher | adhesion microscope slides |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | 25608-930 | VWR | |
| Tris-HCL 1M | T3038-1L | Sigma | |
| Triton X-100 | 9002-93-1 | Sigma | |
| Tween-20 | P1379 | Sigma | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | 15575020 | ThermoFisher |
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