Summary
인간 자연 킬러 세포에서 치료 항체에 의한 FcγRIIIa 구동 이벤트를 연구하기 위한 프로토콜이 여기에 설명되어 있다. 이 인공 자극 플랫폼은 결합에 관여하는 항체의 FcγRIIa 및 Fc 부분에 의해 매개되는 디그라니션, 케모킨/사이토카인 생성, 시그널링 경로 와 같은 다운스트림 이펙터 기능의 심문을 허용합니다.
Abstract
치료 항체에 의한 임상 효능에 대한 작용의 한 가지 메커니즘은 자연 살인자(NK) 세포에 발현된 FcγRIIa(CD16)에 의해 구동되는 사이토카인 분비 및 세포 독성과 같은 면역 관련 기능의 촉진이다. 이러한 관측은 항체의 Fc 부분에서 발견되는 후코모티의 제거를 포함하는 Fc 수용체 중재 사건을 증가시키는 방법에 초점을 맞춘 연구를 주도하고 있다. 추가 연구는 신호에 기계적인 변화를 해명, 세포 과정, 그리고 세포 독성 특성 afu접제 된 항체와 ADCC 활동을 증가. 추가적으로, 그밖 연구 결과는 작은 분자 억제제와 조합에 있는 이 항체의 잠재적인 이득을 보여주었습니다. 이러한 실험은 조합 설정에서 양화 항체를 사용하는 이점의 근간을 이점하는 분자 및 세포 메커니즘을 입증하였다. 이러한 관측의 대부분은 인간 NK 세포에 대한 FcγRIIIa가 치료 항체에 의해 활성화된 인공 체외 활성화 분석법에 근거하였다. 이 분석은 사이토카인 생산 및 탈과화와 같은 다운스트림 이펙터 NK 셀 기능을 연구할 수 있는 유연성을 제공하였다. 또한, 이 분석체는 신호 경로를 심문하고 변조 또는 바이오마커로 사용될 수 있는 분자를 식별하는 데 사용되었습니다. 마지막으로, 다른 치료 분자(즉, 소분자 억제제)가 현재 임상 공간에서 필수적인 치료 항체와의 이러한 치료법의 조합에 대한 통찰력을 제공하기 위해 시스템에 첨가되었다. 이 원고는 이 인공 NK 세포 활성화 분석 작업을 수행하기 위한 기술적 기반을 제공하는 것을 목표로 합니다. 이 프로토콜은 기능 판독값에서 더 많은 기계형 관측에 이르기까지 셀 활성화를 위한 주요 단계뿐만 아니라 잠재적다운 스트림 응용 프로그램을 보여줍니다.
Introduction
지난 수십 년 동안, 항체를 사용하여 표적으로 한 암 치료를 개발에 엄청난 초점이 있었습니다. 트라스투주맙 및 리툭시맙과 같은 치료 항체는 신호 분자의 이압 방지 및 면역 계통1,2의동원을 포함한 다중 메커니즘을 통해 작동한다. 후자는 항체 의존세포 세포독성(ADCC)을 통해 달성되며, 천연 킬러(NK) 세포라고 불리는 림프구가 항체1,2에의해 표적 세포로 가져온다. 세포를 서로 근접하게 배치함으로써, NK 세포는 활성화되고 이펙터 분자3의분비를 통해 종양/표적 세포를 lyse수 있다.
분자 수준에서, 항체의 팹 부분은 종양 세포상에 발현된 그 코그탄 항원들을 결합하고, 그 fc 부분은 두 세포를 함께 가져오기 위해 NK 세포에 발현된 FcγRIIia를 결합한다1,2. FcγRIIa의 교전 후, 신호 경로(즉, MAPK 및 PI3K 통로)는 사이토스켈레탈 재배열, 사이토카인 생성 및 세포 독성4,5,6,7,8,9를구동한다. 따라서, ADCC는 NK 세포 및 항체에 의해 중재되는 FcγRIIIa 구동 이벤트이다.
ADCC는 이러한 치료 항체에 대한 작용 메커니즘으로 생각되었기 때문에 연구자들은 항체를 수정하여 ADCC를 증가시키는 방법을 모색했습니다. 한 가지 수정은 아스파라진(297)에 부착된 올리고당체인에 후코를 제거하여, 이는 FcγRIIa10,11,12에항체의 Fc 부분의 결합 친화성을 증가시킨다. 동물 연구에서, 양화된 항체를 수신하는 마우스는 그것의 fucosylated대응13로취급된 마우스에 비해 느린 종양 성장을 전시했습니다. 더 중요한 것은, obinutuzumab (예를 들어, Gazyva, 승인된 afucosylated 항체)는 만성 림프구성 백혈병 또는 여포 림프종14,15로진단된 환자에서 리툭시맙(예를 들어, 리툭산, 그것의 fucosylated 대응)에 대하여 더 나은 효능을 보였다.
최근까지, 근간이 되는 기구는 양두화 항체를 통해 증가한 ADCC는 알려지지 않았다. FcγRIIIa 구동 메커니즘을 사용하여 암세포를 표적으로 하는 치료 항체를 개발하는 수많은 연구 프로그램이 있다는 사실과 결합하여, 이러한 항체에 의해 촉진된 분자 및 세포 측면을 검사하는 시험관 내 연구를 개발하는 것이 필수적이다. 이것은 바이오 마커를 발견 할 수있는 가능성뿐만 아니라 행동의 메커니즘에 대한 근본적인 이해를 제공합니다. 이와 같이, 인공활성화 분석이 항체의존성 FcγRIIA-매개 기능을 연구하기 위해 개발되었다8. 이러한 연구를 통해, 아푸아게성 항체의 효능이 증가하는 기전은 세포 특성 및 세포독성 특성을 촉진하기 위해 신호가 증가하는 강화된 결합 친화성이 증가하는 것으로 입증되었다8.
임상 시험의 현재 추세는 치료분자(16)의조합의 사용이다. 가장 일반적으로 돌연변이된 통로 중 하나는 PI3K 통로이며, 이 경로의 구성 요소를 대상으로 하는 작은 분자 억제제 개발에 엄청난 노력을 불러 일으켰습니다17,18,19,20. 그러나, 이러한 분자가 치료 항체와 병용하여 작용하는 방식은 상대적으로 알려지지 않았으며, 특히 억제제가 치료 항체에 의해 구동되는 것과 같이 기능하기 위해 PI3K 통로를 필요로 하는 분자에 영향을 미칠 수 있는 조합에서 특히 알 수 없다.
이를 위해, 양두화 항체 연구에 사용되는 체외 분석체는 PI3K 억제제 및 치료 항체의 조합을 연구하기 위해서도 사용되어 왔다. 이러한 연구는 치료 항체 PI3K 구동 이벤트에 대한 PI3K 억제의 분자 특성을 정의하고 아푸아늑화 항체가 신호9의이러한 손실을 상쇄 할 수있는 방법을 설명했다. 이 사실 인정은 임상 시험을 디자인하기 위한 잠재적인 지도를 빌려주기 때문에 관련있습니다. 또한, 이러한 일련의 실험은 또한 잠재적바이오마커9로작용할 수 있는 체모킨/사이토카인 전사 및 생산을 조절하기 위한 PI3K 시그널링 경로의 운동 조절에 대한 첫 번째 설명된 관찰을 주도하였다.
전술한 신호 및 세포 특성을 정의하는 데 사용되는 인공 체외 활성화 분석체는 표적 세포의 부재 시 항체에 의해 중재된 NK 세포에서 FcγRIIIa 중심의 이벤트를 연구하도록 설계되었습니다. 시스템에 표적 세포가 없으면 관찰된 모든 신호 이벤트 및 기능은 NK 셀에 직접 기인할 수 있다. 제시된 분석에서, 항체는 정제된 NK 세포에 첨가되며, 이 시점에서 FcγRIIia를 결합하는 FcγRIIia. 이것은 인위적으로 세포를 자극하기 위하여 항인간 θ 광 사슬 항체를 사용하여 항체의 교차 연결에 선행됩니다. 항체의 교차 연결은 다운스트림 이벤트를 유도하는 신호 플랫폼을 생성하기 위해 표적 항원의 결합을 모방한다. 자극의 길이에 따라, 연구원은 신호, 세포 과정, 세포 독성 특성 및 이펙터 기능을 평가할 수 있습니다8,9. 유사하게, 이 분석법은 또한 항체가 그밖 분자와 결합될때 이 사건을 공부에 있는 융통성(9)를 제공한다.
함께, 이것은 작용기의 일환으로 그들의 FcγRIIa를 통해 NK 세포 반응을 유도하는 치료 항체를 연구하기 위하여 시험관 내 분석에 이상적이다. 이 프로토콜은 이 체외 활성화 분석의 성능을 설명하고 수행할 수 있는 다양한 판독에 대한 통찰력을 제공합니다.
Protocol
다음 의정서는 iQ 바이오사이언스의 인간 연구 윤리위원회의 지침에 따른 것입니다.
1. PBMC의 격리 및 NK 세포의 농축 /정제
참고: 말초 혈액 단핵세포(PBMC)의 분리및 농축/정제를 위한 다른 방법도 수행될 수 있다.
- 헤파린을 함유한 튜브로 조절된 조건하에서 200mL의 혈액을 그립니다.
- 다공성 장벽이 통합된 50mL 튜브에 밀도 그라데이션 배지 15mL을 추가합니다. 튜브를 1000 x g에서 30s로 회전합니다.
- 12.5mL의 혈액을 튜브에 넣고 또 다른 12.5mL의 PBS를 넣고 부드럽게 3배 반전시다. 실내 온도(RT)에서 15분 동안 800 x g로 튜브를 회전시아무런 휴식 없이 회전합니다.
- 세포가 회전하는 동안 다공성 장벽이있는 각 튜브에 대해 40 mL의 PBS가있는 50 mL 원콘 튜브를 준비하십시오.
- 조심스럽게 튜브를 제거하고 원심 분리 후 검사합니다. 다공성 장벽 위의 얇고 눈에 띄게 흰색 층인 50mL 튜브의 20mL와 25mL 경계 사이를 확인하십시오.
- 얇고 흰색 PBMC 층을 방해하지 않고 파이펫을 사용하여 상단에서 가능한 한 많은 액체를 조심스럽게 제거하십시오.
- 깨끗한 10mL 세로지컬 파이펫을 사용하여, 튜브의 필터까지 맑고 노란 액체 층 외에 PBMC 층을 부드럽게 제거합니다.
- 1.4단계에서 제조된 PBS를 포함하는 50mL 원형으로 PBMC와 액체를 추방한다. RT에서 튜브를 회전하고 300 x g는 5 분 동안 회전합니다.
- PBS 세척을 흡인하고 PBS의 추가 40mL를 추가합니다. RT에서 튜브를 회전하고 300 x g는 5 분 동안 회전합니다.
- 세척 후, 세포를 계산하고 1 x 107 세포 당 2 % BSA / PBS의 40 μL에서 다시 중단합니다.
- 선택의 방법을 사용하여 NK 세포의 격리로 진행합니다. 선택 사항에는 수동 또는 자동 자기 비드 기반 정렬9,21이포함됩니다. 형광 활성화 세포 분류도22를수행할 수 있다.
- 세포의 작은 알리쿼트를 제거하여 세포 측정을 유동하여 NK 세포의 순도를 결정합니다. 게이팅 전략에는 다음을 포함합니다: 전방 및 측면 산란 프로파일을 기반으로 라이브 셀에 게이트한 다음, 특정 라이브 모집단에서 NK 마커(예를 들어, CD3, CD56)에 기초한 순도를 평가한다. 일반적인 순도는 >95%입니다.
- 격리가 완료되면 RT에서 셀을 회전시키고 300 x g에서 5분 동안 스핀 셀을 펠릿과 흡인합니다.
- 영양분으로 RPMI 1640에서 1 x 107 세포/mL로 세포 펠릿을 재연하고, 10% 열 비활성화 FBS, 1mM 나트륨 피루바테, 55mM MM 2-ME 및 10mM HEPES(pH = 7.2).
2. FcγRIIa를 통해 NK 세포의 항체 매개 활성화
- 냉장 된 미세 원심 분리기를 4 °C로 설정합니다.
- 1 x 106 (100 μL의) NK 세포를 1.5mL 튜브로 재장제하고 얼음 위에 놓습니다.
참고: 수많은 샘플이 있는 경우 세포는 96개의 U-바닥 플레이트로 분배될 수 있습니다. - 샘플당 100 μg/mL 리툭시맙(또는 관심 있는 항체)의 1μL을 준비하고 1μg/mL 항체의 최종 농도를 위해 세포에 1 μL을 추가합니다.
참고: 다른 분자는 조합 효과의 평가를 위해 이 시점 또는 더 일찍 세포에 추가할 수 있습니다. 여기서, 리티수맙은 자극에 사용되었다. 이전 연구에서는, 작은 분자 억제제는 자극9에추가되었습니다. - 30 분 동안 얼음에 샘플을 배양. 인큐베이션 하는 동안, 50 μg/mL 항인간 θ 광 사슬 항체를 공판에 넣고 열 블록 또는 수조에서 37°C로 따뜻하게 준비합니다.
- 얼음에 세포를 배양 한 후, 얼음 차가운 매체의 1 mL을 추가하고 4 ° C에서 5 분 동안 135 x g에서 회전합니다. 얼음 냉간 매체 1mL로 다시 씻으십시오.
- 마지막 세척 후 수퍼내를 흡인시키고 2.5 단계에서 제조된 반인간 θ 라이트 체인 혼합물의 50 μL을 추가한다.
- 최종 사용자가 최종 사용자 결정 시점을 위한 시료를 열 블록또는 수조에서 즉시 배양합니다.
- 얼음 차가운 매체 1mL을 추가하여 자극을 멈추고 5 분 동안 135 x g의 냉장 원심분리기에서 샘플을 즉시 회전시하십시오. 얼음차가운 매체 1mL로 다시 한 번 씻으시다.
3. 다운스트림 응용 프로그램 및 판독
- 서부 블롯 분석에 의한 FcγRIIIa 자극NK 세포에서 신호 분자의 심문
참고: 상이한 단백질 분리 및 멤브레인 전달 장치가 사용될 수 있다.- 얼음-차가운 매체(2.8단계)로 마지막 세척 후, 인산염과 프로테아제 억제제가 함유된 RIPA 버퍼 20μL를 함유한 리세 세포는 얼음에서 30분 동안 섞입니다.
- 4°C에서 15분 동안 2100 x g에서 튜브를 회전시합니다. 깨끗한 1.5 mL 튜브로 용양을 옮기고 단백질 분리에 필요한 시약을 추가합니다.
- SDS-PAGE 젤에 단백질을 분리하고 표준 프로토콜에 따라 니트로셀룰로오스 또는 PVDF 멤브레인으로 전달합니다.
- 1차 검출 항체에 대한 제조업체의 데이터시트에 따른 멤브레인을 차단 및 프로브(here, pAKT, pPRAS 40 및 pERK1/2가 사용되었다).
- PVDF 멤브레인에 대한 제조업체의 권장 사항에 따라 HRP 컨쥬게이드 이차 항체 및 화학 발광 시약을 추가합니다. X선 필름 또는 검출 기기를 사용하여 시각화합니다(여기서 pAKT는 60kDa, pPRAS40에서 40kDa, pERK1/2에서 42kDa 및 44 kDa에서 검출되었습니다).
- mRNA의 분리 및 FcγRIIa 자극NK 세포의 유전자 발현 분석을 위한 준비(재료의 표)
- 자극의 시간점에 도달하면(2.7단계) 튜브를 얼음 위에 놓고 5분 동안 135 x g의 냉장 원심분리기에서 즉시 회전합니다(2.8단계와 유사).
- 상체를 제거하고 얼음 차가운 PBS 1mL로 2x를 세척하십시오.
- 과니듐 이소티오카네이트 RNA 추출(재료의 표)를사용하여 리세 세포. mRNA 1 μg를 사용하여 상용키트(재료 표)를사용하여 무작위 hexamers를 사용하여 역전사를 수행합니다.
참고: RNA 추출 또는 cDNA 합성의 모든 방법은9,23,24를사용할 수 있다. - 유전자 발현 분석이 될 때까지 cDNA를 -20°C에서 동결합니다.
- FcγRIIa 자극NK 세포에서 사이토셀레탈 재배열 평가
- 얼음 차가운 매체(2.8단계)로 마지막 세척 후, RT에서 10분 동안 50 μL의 파라포름알데히드로 셀 펠릿을 재놓습니다.
- PBS 1mL을 추가하고 RT에서 5 분 동안 135 x g에서 회전하십시오.
- 0.1% 트리톤 X-100/PBS의 100 μL을 5분 동안 추가하고, RT에서 5분 동안 135 x g에서 스핀 셀을 펠릿에 넣습니다.
- 5 단위 / mL AF488 라벨 남근의 100 μL을 1 % BSA / PBS로 희석하고 RT에서 20 분 동안 인큐베이션하십시오.
- PBS 1mL을 추가하고 RT에서 5 분 동안 135 x g에서 회전하여 씻습니다. 흐름 세포 측정 분석을 위해 원하는 부피에서 세포 펠릿을 다시 일시 중단합니다.
- CD107a 표면 염색을 사용하여 FcγRIIIa 자극 NK 세포의 탈과화 평가
- 2.1-2.4 단계에 설명된 바와 같이 얼음에 대한 관심 있는 항체로 세포를 배양한다. 인큐베이션 하는 동안, 샘플 당 항체 혼합물의 50 μL을 준비. 50 μg/mL 항인간 θ 광 사슬 항체 및 1 μg/mL 플루오크롬 라벨 CD107a의 최종 농도로 세포 매체에서 혼합물을 준비한다.
- 얼음에 세포를 잠복 한 후, 얼음 차가운 매체의 1 mL을 추가합니다. 4°C에서 5분 동안 135 x g로 회전한 다음 얼음 냉간 매체 1mL로 다시 씻습니다.
- 마지막 세척 후 수퍼네티를 흡인한 다음, 원하는 타임포인트에 대해 37°C에서 반인간 θ 라이트 체인 혼합물의 50 μL을 추가하고 배양한다.
- 원하는 시점에서 PBS 1mL을 추가하고 RT. Aspirate 수퍼나일트에서 5분 동안 135 x g로 회전하고 4% 파라포름알데히드의 100 μL을 추가합니다. 10 분 동안 RT에서 인큐베이션.
- PBS 1mL을 추가하고 RT에서 5 분 동안 135 x g에서 회전하여 씻습니다. 흐름 세포 측정 분석을 위해 원하는 부피에서 세포 펠릿을 다시 일시 중단합니다.
- FcγRIIa 자극 NK 세포에서 케모킨/사이토카인 생산 평가
참고: 다른 방법 및/또는 키트는 케모킨 및 사이토카인 생산의 평가에 사용될 수 있다.- 자극의 시점에 도달하면(2.7단계)에 도달하면 즉시 튜브를 얼음 위에 놓고 냉장 원심분리기에서 4°C에서 5분 동안 135xg으로 회전합니다.
- 상체를 깨끗한 용기로 옮기. 원하는 분석기를 사용하여 체모킨 또는 사이토카인 평가가 끝날 때까지 상체를 동결합니다.
참고: 세포 펠릿은 이제 얼음 차가운 PBS로 세척하고 신호, 유전자 발현 및 사이토켈레탈 재배열 연구를 위해 처리될 수 있습니다.
Representative Results
항체의 Fc 부분이 단핵구와 같은 다른 세포 유형에 발현된 FcγRIIIa를 결합할 수 있기 때문에 NK 세포 순도가 높는 것이 필수적이다. 순도가 높기 때문에, 이루어진 관측은 NK 세포에서 FcγRIIIa 구동 이벤트에 직접 기인할 수 있다. 여기서, NK 세포는 CD56 및 CD3얼룩(도 1)에기초하여 90% 이상의 순도를 가졌다. 또한, 생존력은 >95%였다. 생존 가능성이 낮은 격리를 사용할 때는 주의해야 합니다. 이벤트를 보장하기 위해 FCγRIIa, 인-AKT(pAKT), 인프라스40(pPRAS40), 인-ERK1/2(pERK1/2)용 서부 얼룩에 의해 구동되었으며, NK 세포가 1-5분 동안 활성화되었다. 도시된 바와 같이, 이들 분자의 축적이 관찰되었다(도2). 유사하게, 활성화된 NK 세포는 유전자 발현분석(도 3)에도시된 바와 같이 MIP-1α, MIP-1β, IFN-γ 및 TNF-α 발현하였다.
또한, 시토켈레탈 재배열은 활성화된세포(도 4)에서관찰되었다. 세포 표면에 CD107a를 발현한 4h에 자극된 NK 세포의백분율(도 5). 또한, IFN-γ, TNF-α, MIP-1α, MIP-1β 및 란테는 3h의 자극 후 상부체에서 검출되었다(도6). 이러한 판독은 활성화된 NK 세포가 이러한 인광 단백질뿐만 아니라 언급된 케모킨 및 사이토카인8,9의유전자 발현 및 생산을 가질 것으로 예상되는 것으로 발표된 연구에 기초하여 예상된다. 모든 실험에서 자극 조건은 항인간 θ 광 교차 연결 제어없이 항 인간 θ 광 체인 만 제어 및 항체를 포함해야합니다. 이러한 NK 세포는 어떤 인계 신호, 탈과란, 케모킨/사이토카인 생성, 또는 케모킨/사이토카인 유전자 발현을 표시해서는 안 된다.
그림 1: PBMC로부터 격리후 NK 셀 순도의 대표적인 흐름 프로파일. PBMC는 건강한 기증자의 혈액으로부터 분리되었고, 인간 NK 세포 격리를 위한 부정적인 선택 방법을 사용하여 NK 세포의농축(재료표)을사용하였다. 세포는 순도를 결정하기 위해 농축 전후CD56 및 CD3로 염색하였다. 분리 전후CD56 대 CD3의 대표적인 점 플롯입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: FcγRIIa 활성화 된 NK 세포는 인광 신호 분자를 나타낸다. 세포는 리툭시맙으로 2분 동안 자극되었고, 세포 용해는 프로토콜에 따라 만들어졌다. Lysates는 4%-12% 젤로 분리되었고, 그 다음에 PVDF 멤브레인으로 이송되었습니다. 멤브레인은 pAKT, pPRAS40, pERK1/2 및 액틴에 대한 항체로 조사되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: FcγRIIa 활성화 된 NK 세포는 케모킨 및 사이토카인 유전자를 발현한다. NK 세포는 0h, 0.5h 및 1h. mRNA를 위한 리툭시맙으로 자극되었고, 역전사, MIP-1α, MIP-1β, 란테, IFN-γ 및 TNF-α(재료표)에 대한 qPCR 분석을실시하였다. (A)각 시점에서 MIP-1α, MIP-1β 및 란테스의 상대적 발현. (B)각 시점에서 IFN-γ 및 TNF-α 상대적 표현. 값은 액틴 유전자로 정규화되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: FcγRIIa 활성화 된 NK 세포는 세포 골격 재배열을 나타낸다. NK 세포는 0분, 5분, 15분, 30분 동안 리툭시맙으로 자극되었고, 그 다음으로 프할로이딘 염색 및 유동 세포측정에 의한 사이토셀레탈 리배열에 대한 평가가 뒤따랐다. 리툭시맙(원, 고선) 또는 이차 항체(정사각형, 점선)로 자극된 NK 세포의 0시에 MFI에 대한 실험 적 시점에서 MFI의 비율. 막대는 4개의 복제의 SD를 나타냅니다. 별표는 두 꼬리가 짝을 이루는 학생의 t-test(*p < 0.05)를 기반으로 통계적 유의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: FcγRIIa 활성화 된 NK 세포는 CD107a를 발현한다. NK 세포는 CD107a및 유동 세포측정에 의한 탈과화에 대한 평가에 이어 4시간 동안 리툭시맙으로 자극하였다. (A)0h 및 4h.(B) CD107a MFI를 위한 리툭시맙(white bar) 또는 항인간 θ 광사슬 항체(gray bar)로 자극한 후 CD107a를 발현하는 NK 세포의 백분율은 hh 및 4h 치료 후 리툭시맙(white bar) 또는 항인간 θ 라이트 체인 항체(그레이 바)로 자극된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: FcγRIIa 활성화 된 NK 세포는 케모킨과 사이토카인을 분비합니다. NK 세포는 리툭시맙으로 0, 0.5, 1, 3 및 6시간 동안 자극하였다. 수퍼나탄트는 MIP-1α, MIP-1β, 란테스, IFN-γ 및 TNF-α 의 유량 및 비드 계 사이토카인 평가방법(재료표)의방출을 측정하기 위해 수집되었다. (A) MIP-1α, MIP-1β 및 란테스 생산은 각 시점에서 생성된다. (B)IFN-γ 및 TNF-α 각 시점에서 생산. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
이 프로토콜은 항체에 의해 매개되는 NK 세포에서 FcγRIIIa 중심의 사건을 연구하기 위한 방법을 설명합니다. 이러한 기술은 ADCC1,2로제안된 치료 항체의 작용의 잠재적 메커니즘의 평가를 허용한다. 특히, 이러한 방법은 ADCC를 담당하는 기본 분자 신호 경로 및 세포 프로세스를 연구하는 데 유연성을 제공합니다. 또한 케모킨 및 사이토카인 생산과 같은 다른 이펙터 기능을 관찰할 수 있습니다. 또한, 이러한 방법은 ADCC를 조절하기 위해 표적으로 할 수 있는 잠재적인 바이오마커 및 분자의 식별을 허용한다.
이 프로토콜의 기초는 표적 세포의 부재에서 항체를 가진 FcγRIIIa를 통해 NK 세포의 인공 자극이다. 항체 결합 표적 세포는 전형적으로 신호 및 다운스트림 효과를 구동하는 플랫폼을 형성하기 위해 Fc 수용체의 교차 연결을 촉진하는 역할을 한다. 대신, 교차 링크는 이 분석에서 항인간 θ 광 사슬 항체를 사용하여 달성되고, NK 세포를 자극하기 위한 표적 세포의 필요성을 우회한다. 표적 세포가 없으면, 결과 및 관측은 정제 과정이 성공적이라고 가정하여 NK 세포에 직접 기인할 수 있다.
중요한 것은, 항체를 교차연결하는 항인간 θ 광사슬 항체를 사용하여 FcγRIIIa에 대한 FcγRIIIa의 Fc 부분의 결합 친화성을 방해하지 않으며,반응10,11,12,13의강도를 지시하는 상호 작용이다. 실제로, 연구 결과에 따르면 후화된 항체는 FcγRIIa10,11,12,13에대한 선호도증가로 인해 ADCC를 증가시한다. 후속 연구는 이러한 증가친화는 항인간 θ 광사슬 이차 항체 대용에 의해 영향을 받지 않으며 증가된 ADCC8의기초를 연구하는 데 사용될 수 있음을 보여주었다. NK 세포가 항체의 교차 연결을 통해 자극되도록 하기 위해, 2개의 부정적인 대조군이 포함되어야 한다: 1) 이차 항인간 θ 광사슬 항체가 없는 치료 항체, 및 2) 이차 항인간 θ 광사슬 항체만이 포함되어야 한다. 두 경우 모두 신호 또는 이펙터 함수가 생성되지 않아야 합니다.
이 방법은 또한 작은 분자 억제제에 대한 치료 항체의 효과를 연구하기위한 유연성을 제공합니다. 억제제는 억제제가 표적을 교전할 시간이 있도록 이차 항체와 교차연결하기 전에 첨가될 수 있다. 그러나, 연구는 억제제 전치료의 최적의 시간을 결정하기 위해 수행되어야한다; 따라서, 억제제는 자극에 최대 효과를 갖는다. 즉, 연구원은 또한 자극 후 억제제의 효과 공부하도록 선택할 수 있습니다. 이 경우, 억제제는 이미 생성된 신호 및 공정에 미치는 영향을 연구하기 위해 교차 링크 후 첨가될 수 있다. 함께, 여기에 설명된 방법은 치료 항체와 다른 작은 분자 억제제의 조합 효과를 연구하는 최대의 유연성을 제공한다.
위에서 언급했듯이, 자극 후 다양한 판독을 수행할 수 있습니다. 웨스턴 블로팅은 다양한 벤더의 SDS-PAGE 및 멤브레인 이송 시스템을 사용하여 시그널링을 연구하기 위해 수행될 수 있습니다. 유사하게, 유전자 발현은 또한 각종 RNA 추출 방법, 역전사 시약 및 유전자 발현 기구를 사용하여 평가될 수 있다. 마지막으로, 세포내 또는 세포외 단백질에 대한 염색은 또한 다른 유동 세포계를 사용하여 샘플을 분석할 수 있는 수행될 수 있다. 세포 내 사이토카인 및 CD107a 염색(3.4단계, 동시에 평가할 수 있음)의 경우, 모넨신 및/또는 브레펠딘 A를 추가하여 신호를 최대화해야 합니다. 우리는 각 실험 목표에 대해 서로 다른 플랫폼을 사용했으며 여전히 유사한 결과를 관찰했습니다. 따라서, 연구는 연구에 따라 다양한 시약, 플랫폼 및 계측기로 보완될 수 있다.
자극을 위한 교차 연결 시간은 연구 결과의 목표에 달려 있습니다. 시그널링 연구가 바람직한 경우, 일반적인 교차 자극 시간은 2분에서 10분 사이입니다. pAKT, pPRAS40 및 pERK1/2 누적 피크는 2분에서 2분, 10분8,9후에 사라집니다. 기능성 연구(즉, 케모킨/사이토카인 생성과 관련된 연구)의 경우, 세포는마취제 9에따라 최소 30분 동안 자극되어야 한다. 유전자 발현 분석은 또한 전형적으로 자극9의30분이 필요합니다. RANTES mRNA 생성은 이미자극시단백질의 신속한 번역 및 방출을 위해 세포에 저장되기 때문에 RANTES 유전자 발현을 판독값으로 사용할 때주의가 실행되어야 한다. 반대로 분과분화는 적어도 3h의 자극이 필요합니다. 이러한 일반적인 관측에도 불구 하 고, 연구원은 관심의 특정 분자에 대 한 최적의 자극 시간을 결정 하기 위해 운동 연구를 수행 해야.
유사하게, 연구원은 서로 다른 특이성을 가진 항체가 동일한 동형인 경우에도 서로 다른 친화성을 가진 FcγRIIIia에 결합하기 때문에 최적의 농도를 결정하기 위하여 관심있는 항체를 적티레이트해야 합니다. 예를 들어, 리툭시맙과 트라스투주맙은 모두 IgG1 동형이지만 트라스투주맙은 리툭시맙(26,27)보다FcγRIIIa의 발린 다형성에 더 강하게 결합한다. 친화력의 차이는 출판된 연구8에서관찰된 바와 같이 탈과란과 같은 기능적 차이로 이어질 수 있다.
최적의 농도를 결정하는 것은 또한 FcγRIIia에 대한 항체의 Fc 부분이 낮은 친화성 때문에 중요하다. 이는 프로토콜이 Fc 수용체에 항체의 결합 후 세척 단계를 포함하기 때문에 항체를 세척하는 결과를 초래할 수 있다. 이 자극 후 CD107a 양성 세포의 낮은 비율에 의해 제안된 대로 분석서에 감도의 부족으로 이어질 수 있습니다(그림 5). 그러나 최적의 농도의 결정은 결과가 감도의 부족으로 인한 것이 아니라는 확신을 제공해야합니다. 또한, 세포는 단일 세포 판독과 반대로 벌크 세포를 사용하는 생화학 및 기능적 분석을 명확하게 활성화한다(도2, 도 3, 도 6).
프로토콜은 생리학적으로 발생하는 것을 완전히 모방하지 않기 때문에 제한적입니다. 사용되는 이차 항인간 K 항체는 세포에 발현된 표적 항원에 의해 생성된 교차 연결을 모방하는 것입니다. 여기서, 최대 반응을 생성하기 위해 이차 항체의 포화량이 첨가된다. 그러나, 뚜렷한 표적 세포는 교차 연결 및 반응에 영향을 미칠 항원의 상이한 수준을 표현할 것입니다. 현재, 이 플랫폼은 다른 항원 발현 수준의 효과를 모방하도록 최적화되지 않았습니다.
이 실험을 능력을 발휘할 때 고려해야 할 또 다른 요인은 개별 중 다른 유전 배경 및 면역학 적인 역사 때문에 기증자-기증자-기증자 가변성입니다. 따라서 동일한 애서에 걸쳐 다른 기증자의 NK 세포 반응을 비교할 때주의를 기울여야 합니다. 마찬가지로, 다른 기증자가 사용될 때 일반적인 결론만 이루어져야 합니다.
전부, 상기 기술된 방법은 NK 세포에서 항체 구동 FcγRIIA 중재 이벤트를 연구하기 위한 간단하고 유연한 자극 플랫폼이다. aDCC증가의 근거를 더 잘 이해하기 위해 사용되어 왔으며, 이는 아포액화된항체(8)로관찰된다. 이 방법은 또한 치료 항체와 PI3K 소분자 억제제9를결합한 연구에서도 사용되었다. 또한, pS6에 의해 조절된 케모킨 및 사이토카인 생산을 위한 이전에 알려지지 않은 메커니즘이확인되었다. 따라서, 이러한 인공 신호 플랫폼을 이용한 향후 연구는 FcγRIIa에 의해 구동되는 이펙터 기능에 대한 조절 메커니즘을 더욱 해명할 수 있다. 그것은 또한 잠재적으로 알려진 된 분자에 대 한 새로운 역할 뿐만 아니라 이러한 메커니즘에 대 한 중요 한 새로운 분자를 식별할 수 있습니다.
Disclosures
모든 저자는 iQ 바이오 사이언스의 직원 또는 컨설턴트이거나 있습니다.
Acknowledgments
저자는 이 원고의 의견과 편집에 대해 제임스 리와 크리스토퍼 Ng에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 50-980-487 | |
| Alexa Fluor 488 phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| anti-mouse HRP antibody | Cell Signaling Technologies | 7076 | |
| AutoMACS instrument | Miltenyi | NK cell isolation method; another isolation instrument may be used | |
| B-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V, fatty acid free | Millipore Sigma | 10775835001 | |
| CD107a APC antibody | Biolegend | 328620 | |
| Cytokine 30-Plex Human Panel | Thermo Fisher Scientific | LHC6003M | chemokine/cytokine method; another chemokine/cytokine analysis method may be used |
| FBS | Hyclone | SH30071.01 | |
| Goat anti-human κ light chain antibody | Millipore Sigma | AP502 | |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific | 78440 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | 4368814 | cDNA transcription method; used according to manufacturer's protocol |
| IFN-? primers | Thermo Fisher Scientific | Hs00989291_m1 | |
| Leukosep tube (50 ml conical with porous barrier) | Greiner | 227290 | |
| Lymphoprep (density gradient medium) | Stemcell | 7851 | |
| MIP-1? primers | Thermo Fisher Scientific | Hs00234142_m1 | |
| MIP-1β primers | Thermo Fisher Scientific | Hs99999148_m1 | |
| NK cell isolation kit | Miltenyi | 130-092-657 | NK cell isolation kit; another isolation kit may be used |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | another protein separation system may be used | |
| pAKT (S473) antibody | Cell Signaling Technologies | 4060 | |
| pERK1/2 antibody | Cell Signaling Technologies | 4370 | |
| pPRAS40 antibody | Cell Signaling Technologies | 13175 | |
| PVDF membrane | Thermo Fisher Scientific | nitrocellulose may be used | |
| RANTES primers | Thermo Fisher Scientific | Hs00982282_m1 | |
| RIPA buffer | Millipore Sigma | R0278 | |
| RPMI w/glutamax | Thermo Fisher Scientific | 61870 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| TNF-? primers | Thermo Fisher Scientific | Hs00174128_m1 | |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | 85111 | |
| TRIzol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | RNA isolation method; used according to manufacturer's protocol |
| Xcell Blot II Transfer Module | Thermo Fisher Scientific | another protein separation system may be used | |
| Xcell SureLock Protein Gel Electrophoresis Chamber System | Thermo Fisher Scientific | another protein separation system may be used | |
| β-actin HRP antibody | Abcam | ab6721 | |
| β-actin primers | Thermo Fisher Scientific | Hs00982282_m1 |
References
- Hudis, C. A. Trastuzumab - Mechanism of Action and Use in Clinical Practice. New England Journal of Medicine. 357 (1), 39-51 (2007).
- Weiner, G. J.
- Orange, J. S. Formation and function of the lytic NK-cell immunological synapse. Nature Reviews Immunology. 8 (9), 713-725 (2008).
- Bonnema, J. D., Karnitz, L. M., Schoon, R. A., Abraham, R. T., Leibson, P. J. Fc receptor stimulation of phosphatidylinositol 3-kinase in natural killer cells is associated with protein kinase C-independent granule release and cell-mediated cytotoxicity. The Journal of Experimental Medicine. 180 (4), 1427-1435 (1994).
- Jiang, K., et al. Pivotal role of phosphoinositide-3 kinase in regulation of cytotoxicity in natural killer cells. Nature Immunology. 1 (5), 419-425 (2000).
- Kanakaraj, P., et al. Phosphatidylinositol-3 kinase activation induced upon Fc gamma RIIIA-ligand interaction. The Journal of Experimental Medicine. 179 (2), 551-558 (1994).
- Orange, J. S., Harris, K. E., Andzelm, M. M., Valter, M. M., Geha, R. S., Strominger, J. L. The mature activating natural killer cell immunologic synapse is formed in distinct stages. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 14151-14156 (2003).
- Liu, S. D., et al. Afucosylated Antibodies Increase Activation of FcγRIIIa-Dependent Signaling Components to Intensify Processes Promoting ADCC. Cancer Immunology Research. 3 (2), 173-183 (2015).
- Romeo, V., Gierke, S., Edgar, K. A., Liu, S. D. Effects of PI3K Inhibition on Afucosylated Antibody-Driven FcγRIIIa Events and Phospho-S6 Activity in NK Cells. The Journal of Immunology. 203 (1), 137-147 (2019).
- Mössner, E., et al. Increasing the efficacy of CD20 antibody therapy through the engineering of a new type II anti-CD20 antibody with enhanced direct and immune effector cell-mediated B-cell cytotoxicity. Blood. 115 (22), 4393-4402 (2010).
- Shields, R. L., et al. Lack of fucose on human IgG1 N-linked oligosaccharide improves binding to human Fcgamma RIII and antibody-dependent cellular toxicity. The Journal of Biological Chemistry. 277 (30), 26733-26740 (2002).
- Shinkawa, T., et al. The absence of fucose but not the presence of galactose or bisecting N-acetylglucosamine of human IgG1 complex-type oligosaccharides shows the critical role of enhancing antibody-dependent cellular cytotoxicity. The Journal of Biological Chemistry. 278 (5), 3466-3473 (2003).
- Junttila, T. T., et al. Superior In vivo Efficacy of Afucosylated Trastuzumab in the Treatment of HER2-Amplified Breast Cancer. Cancer Research. 70 (11), 4481-4489 (2010).
- Goede, V., et al. Obinutuzumab (GA101) plus chlorambucil (Clb) or rituximab (R) plus Clb versus Clb alone in patients with chronic lymphocytic leukemia (CLL) and preexisting medical conditions (comorbidities): Final stage 1 results of the CLL11 (BO21004) phase III trial. Journal of Clinical Oncology. 31, 15_suppl 7004 (2013).
- Sehn, L. H., et al. Randomized Phase II Trial Comparing Obinutuzumab (GA101) With Rituximab in Patients with Relapsed CD20+ Indolent B-Cell Non-Hodgkin Lymphoma: Final Analysis of the GAUSS Study. Journal of Clinical Oncology. 33 (30), 3467-3474 (2015).
- Pons-Tostivint, E., Thibault, B., Guillermet-Guibert, J. Targeting PI3K Signaling in Combination Cancer Therapy. Trends in Cancer. 3 (6), 454-469 (2017).
- Engelman, J. A. Targeting PI3K signalling in cancer: opportunities, challenges and limitations. Nature Reviews. Cancer. 9 (8), 550-562 (2009).
- Fruman, D. A., Rommel, C. PI3K and cancer: lessons, challenges and opportunities. Nature Reviews. Drug Discovery. 13 (2), 140-156 (2014).
- Janku, F., Yap, T. A., Meric-Bernstam, F. Targeting the PI3K pathway in cancer: are we making headway. Nature Reviews. Clinical Oncology. 15 (5), 273-291 (2018).
- Samuels, Y., et al. High frequency of mutations of the PIK3CA gene in human cancers. Science. 304 (5670), New York, N.Y. 554 (2004).
- Kanevskiy, L. M., Telford, W. G., Sapozhnikov, A. M., Kovalenko, E. I. Lipopolysaccharide induces IFN-γ production in human NK cells. Frontiers in Immunology. 4, (2013).
- Romagnani, C., et al. Activation of human NK cells by plasmacytoid dendritic cells and its modulation by CD4+ T helper cells and CD4+ CD25hi T regulatory cells. European Journal of Immunology. 35 (8), 2452-2458 (2005).
- Sivori, S., et al. CpG and double-stranded RNA trigger human NK cells by Toll-like receptors: Induction of cytokine release and cytotoxicity against tumors and dendritic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (27), 10116-10121 (2004).
- Hanna, J., et al. Novel Insights on Human NK Cells' Immunological Modalities Revealed by Gene Expression Profiling. The Journal of Immunology. 173 (11), 6547-6563 (2004).
- Swanson, B. J., Murakami, M., Mitchell, T. C., Kappler, J., Marrack, P. RANTES production by memory phenotype T cells is controlled by a posttranscriptional, TCR-dependent process. Immunity. 17 (5), 605-615 (2002).
- Jo, M., Kwon, H. S., Lee, K. H., Lee, J. C., Jung, S. T. Engineered aglycosylated full-length IgG Fc variants exhibiting improved FcγRIIIa binding and tumor cell clearance. mAbs. 10 (2), 278-289 (2018).
- Isoda, Y., et al. Importance of the Side Chain at Position 296 of Antibody Fc in Interactions with FcγRIIIa and Other Fcγ Receptors. PLoS ONE. 10 (10), 0140120 (2015).
