Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

चिकित्सीय एंटीबॉडी की उपस्थिति में FcγRIIIa सगाई से प्रेरित मानव प्राकृतिक हत्यारा सेल घटनाओं का आकलन

Published: May 22, 2020 doi: 10.3791/61144
Automatic Translation
1, 2, 1, 2, 1, 1, 1
1Department of Research and Development, iQ Biosciences, 2Department of Cellular Products, iQ Biosciences

Summary

मानव प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं में चिकित्सीय एंटीबॉडी द्वारा FcγRIIIa संचालित घटनाओं का अध्ययन करने के लिए एक प्रोटोकॉल यहां वर्णित है । यह कृत्रिम उत्तेजना मंच डाउनस्ट्रीम प्रभावकारक कार्यों जैसे डिग्रेनुलेशन, केमोकिन/साइटोकिन उत्पादन, और बाइंडिंग में शामिल एंटीबॉडी के FcγRIIIa और एफसी भागों द्वारा मध्यस्थता किए गए संकेत रास्ते की अनुमति देता है।

Abstract

चिकित्सीय एंटीबॉडी द्वारा नैदानिक प्रभावकारिता के लिए कार्रवाई का एक तंत्र प्रतिरक्षा से संबंधित कार्यों को बढ़ावा देना है, जैसे साइटोकिन स्राव और साइटोटॉक्सिटी, प्राकृतिक हत्यारा (एनके) कोशिकाओं पर व्यक्त FcγRIIIa (सीडी 16) द्वारा संचालित। इन टिप्पणियों के कारण एफसी रिसेप्टर-मध्यस्थता की घटनाओं को बढ़ाने के तरीकों पर ध्यान केंद्रित किया गया है, जिसमें एंटीबॉडी के एफसी हिस्से पर पाए जाने वाले फ्यूकोस मोज़िटी को हटाना शामिल है। इसके अलावा के अध्ययनों ने सिग्नलिंग, सेलुलर प्रक्रियाओं और साइटोटॉक्सिक विशेषताओं में मशीनी परिवर्तनों को स्पष्ट किया है जो afucosylated एंटीबॉडी के साथ एडीसीसी गतिविधि को बढ़ाते हैं। इसके अतिरिक्त, अन्य अध्ययनों ने छोटे अणु अवरोधकों के साथ संयोजन में इन एंटीबॉडी के संभावित लाभों को दिखाया है। इन प्रयोगों ने संयोजन सेटिंग्स में afucosylated एंटीबॉडी का उपयोग करने के लाभों को अंतर्निहित आणविक और सेलुलर तंत्र का प्रदर्शन किया। इनमें से कई टिप्पणियां एक कृत्रिम इन विट्रो एक्टिवेशन परख पर आधारित थीं जिसमें मानव एनके कोशिकाओं पर FcγRIIIa चिकित्सकीय एंटीबॉडी द्वारा सक्रिय किया गया था। इस परख ने डाउनस्ट्रीम इफेक्टर एनके सेल कार्यों का अध्ययन करने की छूट प्रदान की, जैसे साइटोकिन उत्पादन और डिग्रेनुलेशन। इसके अलावा, इस परख का उपयोग सिग्नलिंग रास्तों से पूछताछ करने और उन अणुओं की पहचान करने के लिए किया गया है जिन्हें संग्राहक या बायोमार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। अंत में, अन्य चिकित्सीय अणुओं (यानी, छोटे अणु अवरोधक) को सिस्टम में जोड़ा गया है ताकि चिकित्सीय एंटीबॉडी के साथ इन चिकित्सीय के संयोजन में अंतर्दृष्टि प्रदान की जा सके, जो वर्तमान नैदानिक अंतरिक्ष में आवश्यक है। इस पांडुलिपि का उद्देश्य इस कृत्रिम मानव एनके सेल सक्रियण परख के प्रदर्शन के लिए एक तकनीकी आधार प्रदान करना है। प्रोटोकॉल सेल सक्रियण के साथ-साथ संभावित डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण चरणों को दर्शाता है जो कार्यात्मक रीडआउट से लेकर अधिक मशीनी टिप्पणियों तक होते हैं।

Introduction

पिछले कुछ दशकों में, एंटीबॉडी का उपयोग कर लक्षित कैंसर चिकित्सा के विकास पर जबरदस्त ध्यान दिया गया है । ट्रैप्यूटिक एंटीबॉडी, जैसे ट्रास्टुज़ुमाब और रिटक्सीमैब, कई तंत्रों के माध्यम से काम करते हैं, जिसमें संकेत अणुओं के डामरीकरण की रोकथाम और प्रतिरक्षा प्रणाली1,2का जुड़ाव शामिल है। उत्तरार्द्ध एंटीबॉडी-निर्भर सेलुलर साइटोटॉक्सिकिटी (एडीसीसी) के माध्यम से पूरा किया जाता है, जिसमें प्राकृतिक हत्यारा (एनके) कोशिकाओं नामक लिम्फोसाइट्स को एंटीबॉडी1, 2द्वारा एक लक्ष्य कोशिका में लायाजाताहै। कोशिकाओं को एक दूसरे के साथ निकटता में रखकर, एनके सेल सक्रिय हो जाता है और प्रभावक अणुओं के स्राव के माध्यम से ट्यूमर/लक्ष्य कोशिका को लाइसे कर सकता है3।

आणविक स्तर पर, एंटीबॉडी का फैब हिस्सा ट्यूमर कोशिकाओं पर व्यक्त किए गए अपने कॉग्नेट एंटीजन को बांधता है, जबकि इसका एफसी हिस्सा एनके कोशिकाओं पर व्यक्त FcγRIIIa को दो कोशिकाओं को एक साथ लाने के लिए1,2संलग्न करता है। FcγRIIIa की सगाई के बाद, सिग्नलिंग पाथवे (यानी, एमएपीके और पीई 3के रास्ते) साइटोस्केलेल पुनर्व्यवस्था, साइटोकिन उत्पादन, औरसाइटोटॉक्सीसिटी4,5,6,7,8,9ड्राइव करते हैं। इस प्रकार, एडीसीसी एनके कोशिकाओं और एंटीबॉडी द्वारा मध्यस्थता की गई एक FcγRIIIa-चालित घटना है।

क्योंकि एडीसीसी को इन चिकित्सीय एंटीबॉडी के लिए कार्रवाई का तंत्र माना जाता था, शोधकर्ताओं ने एंटीबॉडी को संशोधित करके एडीसीसी को बढ़ाने के तरीकों की खोज की । एक संशोधन शतावरी 297 से जुड़ी ओलिगोसैकराइड चेन पर फ्यूकोस को हटाना था, जो एंटीबॉडी के एफसी हिस्से की बाध्यकारी आत्मीयताको10, 11,12FcγRIIIa तक बढ़ाता है। पशु अध्ययनों में, afucosylated एंटीबॉडी प्राप्त चूहों अपने fucosylated समकक्ष13के साथ इलाज चूहों की तुलना में धीमी ट्यूमर वृद्धि का प्रदर्शन किया । इससे भी महत्वपूर्ण बात, ओबिनुतुजुमाब (उदाहरण के लिए, गजिवा, एक अनुमोदित अफ्यूकोसिलेटेड एंटीबॉडी) ने क्रोनिक लिम्फोसाइटिक ल्यूकेमिया या कूप लिम्फोमा14, 15के साथ निदान रोगियों में rituximab (उदाहरण के लिए, Rituxan, इसके fucosylated समकक्ष) के सापेक्ष बेहतर प्रभावकारिता दिखाई।

हाल ही में जब तक, अंतर्निहित तंत्र afucosylated एंटीबॉडी के माध्यम से एडीसीसी में वृद्धि अज्ञात थे । इस तथ्य के साथ संयुक्त कि कैंसर कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए FcγRIIIa-चालित तंत्रों का उपयोग करने के लिए चिकित्सीय एंटीबॉडी विकसित करने के लिए कई शोध कार्यक्रम हैं, इन एंटीबॉडी द्वारा प्रचारित आणविक और सेलुलर पहलुओं की जांच करने वाले विट्रो परख में विकसित करना जरूरी है। यह कार्रवाई के तंत्र के साथ-साथ बायोमार्कर की खोज करने की क्षमता की मौलिक समझ प्रदान करता है। इस प्रकार, सिग्नलिंग और सेलुलर विशेषताओं के अलावा एंटीबॉडी पर निर्भर FcγRIIIa-मध्यस्थता कार्यों का अध्ययन करने के लिए एक कृत्रिम सक्रियण परख विकसितकीगई थी। इन अध्ययनों के माध्यम से, afucosylated एंटीबॉडी की बढ़ी हुई प्रभावकारिता अंतर्निहित तंत्र को स्पष्ट किया गया है जिसमें बढ़ी हुई बाध्यकारी आत्मीयता सेलुलर गुणों और साइटोटॉक्सिक विशेषताओं को बढ़ावा देने के लिए संकेत बढ़ाती है8।

नैदानिक परीक्षणों में वर्तमान प्रवृत्ति चिकित्सीय अणुओं के संयोजन का उपयोग है16. सबसे अधिक उत्परिवर्तित मार्गों में से एक PI3K मार्ग है, जिसने छोटे अणु अवरोधकों को विकसित करने में जबरदस्त प्रयास किया है जो इसमार्ग17, 18,19,20के घटकों को लक्षित करते हैं। फिर भी, ये अणु चिकित्सीय एंटीबॉडी के साथ संयोजन में कैसे कार्य करते हैं, विशेष रूप से उन संयोजनों में, जहां अवरोधक अणुओं को प्रभावित कर सकता है जिन्हें कार्य करने के लिए PI3K मार्ग की आवश्यकता होती है, जैसे चिकित्सीय एंटीबॉडी द्वारा संचालित।

इस उद्देश्य के लिए, afucosylated एंटीबॉडी अध्ययन के लिए नियोजित इन विट्रो परख का उपयोग PI3K अवरोधकों और चिकित्सीय एंटीबॉडी के संयोजन का अध्ययन करने के लिए भी किया गया है। इन अध्ययनों ने चिकित्सीय एंटीबॉडी PI3K-संचालित घटनाओं पर PI3K निषेध की आणविक विशेषताओं को परिभाषित किया और बताया कि कैसे afucosylated एंटीबॉडी9संकेत के इस नुकसान की भरपाई कर सकते हैं । ये निष्कर्ष प्रासंगिक हैं क्योंकि वे नैदानिक परीक्षणों को डिजाइन करने के लिए संभावित मार्गदर्शन देते हैं। इसके अलावा, प्रयोगों की इस श्रृंखला ने केमोकिन/साइटोकिन ट्रांसक्रिप्शन और उत्पादन को मिलाना करने के लिए PI3K सिग्नलिंग मार्ग के गतिज विनियमन के लिए पहली बार वर्णित टिप्पणियों का भी नेतृत्व किया, जो संभावित बायोमार्कर9के रूप में काम कर सकता है।

ऊपर वर्णित सिग्नलिंग और सेलुलर विशेषताओं को परिभाषित करने के लिए उपयोग की जाने वाली कृत्रिम इन विट्रो सक्रियण परख को लक्ष्य कोशिकाओं के अभाव में एंटीबॉडी द्वारा मध्यस्थता की गई एनके कोशिकाओं में FcγRIIIa-चालित घटनाओं का अध्ययन करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। सिस्टम में लक्षित कोशिकाओं के बिना, देखे गए सभी सिग्नलिंग घटनाओं और कार्यों को सीधे एनके कोशिकाओं के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। प्रस्तुत परख में, एंटीबॉडी शुद्ध एनके कोशिकाओं में जोड़ा जाता है, जिस बिंदु पर एफसी भाग FcγRIIIa बांधता है। इसके बाद कोशिकाओं को कृत्रिम रूप से उत्तेजित करने के लिए एंटी-ह्यूमन एन लाइट चेन एंटीबॉडी का उपयोग करके एंटीबॉडी को क्रॉसलिंकिंग किया जाता है। एंटीबॉडी की क्रॉसलिंकिंग लक्ष्य एंटीजन के बाध्यकारी की नकल करता है ताकि एक सिग्नलिंग प्लेटफॉर्म उत्पन्न किया जा सके जो डाउनस्ट्रीम घटनाओं को प्रकाश में तांडव करता है। उत्तेजना की लंबाई के आधार पर, शोधकर्ता संकेत, सेलुलर प्रक्रियाओं, साइटोटॉक्सिक विशेषताओं, और प्रभावक कार्यों का आकलन कर सकते हैं8,9। इसी प्रकार, यह परख इन घटनाओं का अध्ययन करने में भी लचीलापन प्रदान करती है जब एंटीबॉडी को अन्य अणुओं के साथ जोड़ा जाता है9।

साथ में, यह चिकित्सीय एंटीबॉडी का अध्ययन करने के लिए विट्रो परख में एक आदर्श है जो कार्रवाई के तंत्र के हिस्से के रूप में एनके सेल प्रतिक्रियाओं को उनके FcγRIIIa के माध्यम से प्रकाश में लाना है। यह प्रोटोकॉल इस इन विट्रो एक्टिवेशन परख के प्रदर्शन का वर्णन करता है और विभिन्न readouts कि प्रदर्शन किया जा सकता है में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है।

Protocol

निम्नलिखित प्रोटोकॉल आईक्यू बायोसाइंस की मानव अनुसंधान आचार समिति के दिशानिर्देशों के अनुसार है।

1. पीबीएमसी का अलगाव और एनके कोशिकाओं का संवर्धन/शुद्धिकरण

नोट: परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमएमसी) और संवर्धन/शुद्धिकरण के अलगाव के लिए अन्य तरीके भी किए जा सकते हैं ।

  1. विनियमित परिस्थितियों में रक्त के 200 एमएल को हेपरिन युक्त ट्यूब में ड्रा करें।
  2. एक असुरक्षित बाधा के साथ एक 50 एमएल ट्यूब में घनत्व ढाल माध्यम के 15 एमएल जोड़ें। 30 एस के लिए 1000 x ग्राम पर ट्यूब स्पिन करें।
  3. ट्यूब में 12.5 एमएल रक्त जोड़ें और इसके बाद पीबीएस का एक और 12.5 मिलियन हो, और धीरे-धीरे 3x उलटा हो। कोई टूटता के साथ कमरे के तापमान (आरटी) पर 15 मिनट के लिए ८०० x ग्राम पर ट्यूब स्पिन ।
  4. एक असुरक्षित बाधा के साथ प्रत्येक ट्यूब के लिए पीबीएस के 40 एमएल के साथ एक 50 एमएल शंकु नली तैयार करें, जबकि कोशिकाएं घूम रही हैं।
  5. ध्यान से ट्यूबों को हटा दें और अपकेंद्रित्र के बाद निरीक्षण करें। 50 एमएल ट्यूब पर 20 एमएल और 25 एमएल सीमांकन के बीच, असुरक्षित बाधा के ऊपर पीबीएमसी की एक पतली, दिख रही सफेद परत की जांच करें।
  6. पतले, सफेद पीबीएमसी परत को परेशान किए बिना एक पिपेट का उपयोग करके ऊपर से जितना संभव हो उतना तरल निकालें।
  7. एक साफ 10 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट के साथ, ट्यूब के फिल्टर के नीचे स्पष्ट, पीले रंग की तरल परत के अलावा पीबीएमसी परत को धीरे से हटा दें।
  8. पीबीएमसी और तरल को 50 एमएल शंकुधारी पीबीएस युक्त चरण 1.4 में निष्कासित करें। आरटी में स्पिन ट्यूब और 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम।
  9. पीबीएस धोने और PBS के एक अतिरिक्त 40 एमएल जोड़ें। आरटी में स्पिन ट्यूब और 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम।
  10. धोने के बाद, कोशिकाओं की गणना करें और उन्हें 1 x 107 कोशिकाओं के अनुसार 2% बीएसए/पीबीएस के 40 माइक्रोन में पुनर्व्यवसाय करें।
  11. पसंद की विधि का उपयोग कर एनके कोशिकाओं के अलगाव के लिए आगे बढ़ें। विकल्पों में मैनुअल या स्वचालित चुंबकीय मनका आधारित छंटाई9,21शामिल हैं। फ्लोरेसेंस-सक्रिय सेल छंटाई भी22किया जा सकता है।
  12. प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा एनके कोशिकाओं की शुद्धता निर्धारित करने के लिए कोशिकाओं के एक छोटे से aliquot निकालें। गेटिंग रणनीति में निम्नलिखित शामिल हैं: फॉरवर्ड बनाम साइड स्कैटर प्रोफाइल के आधार पर लाइव कोशिकाओं पर गेट, फिर विशिष्ट लाइव आबादी में एनके मार्कर (जैसे, सीडी 3, सीडी 56) के आधार पर शुद्धता का आकलन करें। विशिष्ट शुद्धता >95% है।
  13. अलगाव पूरा होने के बाद, आरटी में स्पिन कोशिकाएं और 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम गोली और एस्पिरेट करने के लिए।
  14. कोशिका गोली को 1 x 107 कोशिकाओं/एमएल में रम्पुलित करें आरपीएमआई 1640 में पोषक तत्वों के साथ, 10% गर्मी-निष्क्रिय एफबीएस, 1 एमएम सोडियम पाइरुवेट, 55 एमएम 2-एमई, और 10 एमएम एचईपी (पीएच = 7.2)।

2. FcγRIIIa के माध्यम से एनके कोशिकाओं की एंटीबॉडी-मध्यस्थता सक्रियण

  1. 4 डिग्री सेल्सियस तक एक रेफ्रिजरेटेड माइक्रोसेंट्रफ्यूज सेट करें।
  2. 1 x 106 (100 माइक्रोन) को 1.5 एमएल ट्यूब (एस) में फिर से निलंबित करें और बर्फ पर रखें।
    नोट: कोशिकाओं को एक ९६ अच्छी तरह से यू नीचे थाली में तिरस्कृत किया जा सकता है अगर वहां कई नमूने हैं ।
  3. प्रति नमूना 100 μg/mL rituximab (या ब्याज की एंटीबॉडी) के 1 μL तैयार करें और 1 μg/mL एंटीबॉडी की अंतिम एकाग्रता के लिए कोशिकाओं में 1 μL जोड़ें।
    नोट: अन्य अणुओं को संयोजन प्रभावों के आकलन के लिए इस बिंदु पर या पहले कोशिकाओं में जोड़ा जा सकता है। यहां उत्तेजना के लिए ऋतिकुमाब का इस्तेमाल किया गया। पूर्व अध्ययनों में, छोटे अणु अवरोधकों को उत्तेजना9में जोड़ा गया है ।
  4. 30 मिनट के लिए बर्फ पर नमूना इनक्यूबेट। इनक्यूबेशन के दौरान, मीडिया में प्रति नमूना 50 माइक्रोन/एमएल एंटी-ह्यूमन चेन एंटीबॉडी तैयार करें और हीट ब्लॉक पर या पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
  5. बर्फ पर कोशिकाओं की इनक्यूबेशन के बाद, बर्फ के 1 मिलीएल-ठंडे मीडिया जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 135 x ग्राम पर स्पिन करें। बर्फ ठंड मीडिया के 1 मिलील के साथ फिर से धोएं।
  6. अंतिम धोने के बाद सुपरनेट को एस्पिरेट करें और चरण 2.5 में तैयार एंटी-ह्यूमन एंक लाइट चेन मिश्रण के 50 माइक्रोन जोड़ें।
  7. हीट ब्लॉक पर या पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर अंत उपयोगकर्ता निर्धारित टाइमपॉइंट के लिए तुरंत नमूनों को इनक्यूबेट करें।
  8. बर्फ-ठंडे मीडिया के 1 एमएल जोड़कर उत्तेजना बंद करें और तुरंत 5 मिनट के लिए 135 x ग्राम पर एक रेफ्रिजरेटेड अपकेंद्रित्र में नमूनों को स्पिन करें। बर्फ-ठंडे मीडिया के 1 एमएल के साथ एक बार और धोएं।

3. डाउनस्ट्रीम एप्लिकेशन और रीडआउट

  1. पश्चिमी दाग विश्लेषण द्वारा FcγRIIIa उत्तेजित एनके कोशिकाओं में संकेत अणुओं की पूछताछ
    नोट: विभिन्न प्रोटीन जुदाई और झिल्ली हस्तांतरण उपकरणों का उपयोग किया जा सकता है।
    1. बर्फ-ठंडे मीडिया (चरण 2.8) के साथ अंतिम धोने के बाद, रिपा बफर के 20 माइक्रोन के साथ lyse कोशिकाओं जिसमें फॉस्फेट और प्रोटीज़ अवरोधक बर्फ पर 30 मिनट के लिए मिश्रण करते हैं।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 2100 x ग्राम पर स्पिन ट्यूब। lysate को एक साफ 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें और प्रोटीन पृथक्करण के लिए आवश्यक अभिकर् थ जोड़ें।
    3. एसडीएस-पेज जेल पर अलग प्रोटीन और मानक प्रोटोकॉल के बाद एक नाइट्रोसेल्यूलोस या पीवीडीएफ झिल्ली पर स्थानांतरित करें।
    4. प्राथमिक पहचान एंटीबॉडी के लिए निर्माता की डेटाशीट के अनुसार झिल्ली को ब्लॉक और जांच करें (यहां, पीकेटी, पीपीआरएएस 40, और पीआरके1/2 का उपयोग किया गया था)।
    5. पीवीडीएफ झिल्ली पर निर्माता की सिफारिशों के अनुसार एचआरपी संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी और केमिल्यूमिनेसेंस रिएजेंट जोड़ें। कल्पना करने के लिए एक्स-रे फिल्म या डिटेक्शन इंस्ट्रूमेंट का उपयोग करें (यहां, 60 केडीए में पीकेएटी, 40 केडीए पर pPRAS40, और 42 केडीए और 44 केडीए पर pERK1/2) का पता चला था।
  2. एमआरएनए का अलगाव और FcγRIIIa-उत्तेजित एनके कोशिकाओं के जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण की तैयारी(सामग्री की तालिका)
    1. उत्तेजना के लिए समय बिंदु (चरण 2.7) तक पहुंचने के बाद, ट्यूब को बर्फ पर रखें और तुरंत 5 मिनट (चरण 2.8 के समान) के लिए 135 x ग्राम पर एक रेफ्रिजरेटेड सेंट्रलाइज में स्पिन करें।
    2. सुपरनेट निकालें और बर्फ-ठंडे पीबीएस के 1 एमएल के साथ 2x धोएं।
    3. ग्वानिडियम आइसोथियोसायनेट आरएनए निष्कर्षण(सामग्री की तालिका) काउपयोग करके Lyse कोशिकाएं। एक वाणिज्यिक किट(सामग्रीकी तालिका) के साथ यादृच्छिक हेक्सामर्स का उपयोग करके रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन करने के लिए 1 माइक्रोग्राम एमआरएनए का उपयोग करें।
      नोट: आरएनए निष्कर्षण या सीडीएनए संश्लेषण की किसी भी विधि का उपयोग9,23,24किया जा सकता है ।
    4. जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण तक -20 डिग्री सेल्सियस पर सीडीएनए फ्रीज करें।
  3. FcγRIIIa-उत्तेजित एनके कोशिकाओं में साइटोस्केलेल पुनर्व्यवस्था मूल्यांकन
    1. बर्फ-ठंडे मीडिया (चरण 2.8) के साथ अंतिम धोने के बाद, सेल पेलेट को आरटी में 10 मिनट के लिए 3.7% पैराफॉर्मलडिहाइड के 50 माइक्रोन के साथ फिर से उठाया।
    2. पीबीएस का 1 एमएल जोड़ें और आरटी में 5 मिनट के लिए 135 x ग्राम पर स्पिन करें। इस धोने को एक बार फिर दोहराएं।
    3. कोशिकाओं को पार करने के लिए 5 मिनट के लिए 0.1% ट्राइटन एक्स-100/पीबीएस के 100 माइक्रोन जोड़ें, और आरटी टू पेलेट में 5 मिनट के लिए 135 x ग्राम पर स्पिन कोशिकाएं।
    4. 1% बीएसए/पीबीएस में पतला 5 इकाइयों/एमएल AF488-लेबल वाले फालोलिन के 100 माइक्रोन जोड़ें और आरटी में 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    5. पीबीएस के 1 एमएल जोड़ें और धोने के लिए आरटी में 5 मिनट के लिए 135 x ग्राम पर स्पिन करें। प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए वांछित मात्रा में सेल पेलेट को फिर से रीसुस्ट करें।
  4. CD107a सतह धुंधला का उपयोग कर FcγRIIIa उत्तेजित एनके कोशिकाओं के degranulation का आकलन
    1. चरण 2.1-2.4 में वर्णित बर्फ पर ब्याज की एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के दौरान, प्रति नमूना एंटीबॉडी मिश्रण के 50 माइक्रोन तैयार करें। 50 μg/mL विरोधी मानव ο light चेन एंटीबॉडी और 1 μg/mL फ्लोरोक्रोम-लेबल CD107a की अंतिम एकाग्रता के साथ सेल मीडिया में मिश्रण तैयार करें ।
    2. बर्फ पर कोशिकाओं की इनक्यूबेशन के बाद, बर्फ-ठंडे मीडिया के 1 एमएल जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 135 x ग्राम पर स्पिन करें, फिर बर्फ ठंड-मीडिया के 1 एमएल के साथ फिर से धोएं।
    3. अंतिम धोने के बाद सुपरनेट को एस्पिरेट करें, फिर वांछित समय बिंदुओं के लिए एंटी-ह्यूमन लाइट चेन मिश्रण के 50 माइक्रोन जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    4. वांछित समय बिंदुओं पर, आर टी में 5 मिनट के लिए 135 x ग्राम पर पीबीएस और स्पिन के 1 एमएल जोड़ें। एस्पिरेट सुपरनेटेंट और 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के 100 माइक्रोन जोड़ें। 10 मिनट के लिए आरटी में इनक्यूबेट ।
    5. पीबीएस के 1 एमएल जोड़ें और धोने के लिए आरटी में 5 मिनट के लिए 135 x ग्राम पर स्पिन करें। प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए वांछित मात्रा में सेल पेलेट को फिर से रीसुस्ट करें।
  5. FcγRIIIa-उत्तेजित एनके कोशिकाओं से केमोकिन/साइटोकिन उत्पादन का आकलन
    नोट: विभिन्न तरीकों और/या किट केमोकीन और साइटोकिन उत्पादन के आकलन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    1. उत्तेजना के लिए समय बिंदु (चरण 2.7) तक पहुंचने के बाद, तुरंत ट्यूब को बर्फ पर रखें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 135 x ग्राम पर एक रेफ्रिजरेटेड सेंट्रलाइज में स्पिन करें।
    2. सुपरनेट को एक साफ बर्तन में स्थानांतरित करें। वांछित परख का उपयोग करके केमोकिन या साइटोकिन आकलन तक सुपरनेट को फ्रीज करें।
      नोट: सेल छर्रों अब बर्फ ठंड PBS के साथ धोया जा सकता है और संकेत, जीन अभिव्यक्ति, और साइटोस्केलेटल पुनर्व्यवस्था अध्ययन के लिए संसाधित ।

Representative Results

यह आवश्यक है कि एनके सेल शुद्धता अधिक है क्योंकि एंटीबॉडी का एफसी हिस्सा मोनोसाइट्स जैसे अन्य सेल प्रकारों पर व्यक्त FcγRIIIa को बांध सकता है। उच्च शुद्धता के साथ, की गई टिप्पणियों को एनके कोशिकाओं में FcγRIIIa-चालित घटनाओं के लिए सीधे जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। यहां, एनके कोशिकाओं में सीडी 56 और सीडी 3 दाग(चित्रा 1)के आधार पर 90% से अधिक शुद्धता थी। इसके अलावा फिजिबिलिटी >95% रही। कम व्यवहार्यता के साथ अलगाव का उपयोग करते समय देखभाल का उपयोग किया जाना चाहिए। यह सुनिश्चित करने के लिए FcγRIIIa द्वारा संचालित किया गया था, फॉस्फो-AKT (pAKT), फॉस्फो-PRAS40 (pPRAS40), और फॉस्फो-ERK1/2 (pERK1/2) के लिए पश्चिमी दाग प्रदर्शन किया गया, जिसमें एनके कोशिकाओं को 1-5 मिनट के लिए सक्रिय किया गया । जैसा कि दिखाया गया है, इन अणुओं का संचय(चित्र 2)देखा गया था । इसी तरह, सक्रिय एनके कोशिकाओं ने जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण(चित्रा 3)द्वारा दिखाए गए एमआईपी-1α, एमआईपी-1, आईएफएन-γ और टीएनएफ-α को व्यक्त किया।

इसके अतिरिक्त, सक्रिय कोशिकाओं(चित्र 4)में साइटोस्केलेटल पुनर्व्यवस्था देखी गई। एनके कोशिकाओं का एक प्रतिशत 4 घंटे के लिए उत्तेजित कोशिका की सतह पर CD107a व्यक्त(चित्रा 5)। इसके अतिरिक्त, आईएफएन-γ, टीएनएफ-α, एमआईपी-1α, एमआईपी-1, और RANTES को उत्तेजना के 3 घंटे(चित्रा 6)के बाद सुपरनेट में पाया गया। इन रीडआउट्स को प्रकाशित अध्ययनों के आधार पर अपेक्षित किया जाता है क्योंकि सक्रिय एनके कोशिकाओं में ये फॉस्फोरिलेटेड प्रोटीन होंगे, साथ ही जीन अभिव्यक्ति और उल्लिखित केमोकिन्स और साइटोकिन्स8,9का उत्पादन होगा। सभी प्रयोगों में, उत्तेजना की स्थिति में एक मानव विरोधी प्रकाश श्रृंखला केवल नियंत्रण और एंटीबॉडी के बिना एंटी-ह्यूमन एन लाइट क्रॉसलिंकिंग नियंत्रण शामिल होना चाहिए। इन एनके कोशिकाओं को कोई फॉस्फो-सिग्नलिंग, डिग्रेनुलेशन, केमोकिन/साइटोकिन उत्पादन, या केमोकिन/साइटोकिन जीन एक्सप्रेशन नहीं दिखाना चाहिए ।

Figure 1
चित्रा 1: पीबीएमएमसी से अलगाव के बाद एनके सेल शुद्धता के प्रतिनिधि प्रवाह प्रोफाइल। पीबीएमसी को एक स्वस्थ दाता के रक्त से अलग किया गया था, जिसके बाद मानव एनके सेल अलगाव(सामग्रीकी तालिका) के लिए नकारात्मक चयन विधि का उपयोग करके एनके कोशिकाओं का संवर्धन किया गया था। कोशिकाओं को शुद्धता निर्धारित करने के लिए संवर्धन से पहले और बाद में CD56 और सीडी 3 के साथ दाग थे। अलगाव से पहले और बाद में CD56 बनाम सीडी 3 के प्रतिनिधि डॉट भूखंड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: FcγRIIIa सक्रिय एनके कोशिकाएं फॉस्फोरिलेटेड सिग्नलिंग अणुओं का प्रदर्शन करती हैं। कोशिकाओं को 2 मिनट के लिए rituximab के साथ उत्तेजित किया गया था, और सेल lysates प्रोटोकॉल के अनुसार किए गए थे । Lysates को 4%-12% जेल पर अलग किया गया था, जिसके बाद पीवीडीएफ झिल्ली पर स्थानांतरण किया गया था। झिल्ली pAKT, pPRAS40, pERK1/2, और actin के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ जांच की थी । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: FcγRIIIa सक्रिय एनके कोशिकाएं केमोकिन और साइटोकिन जीन व्यक्त करती हैं। एनके कोशिकाओं को 0 घंटे, 0.5 घंटे के लिए rituximab के साथ उत्तेजित किया गया था, और 1 घंटे mRNA एकत्र किया गया था, रिवर्स लिखित, और एमआईपी-1α, एमआईपी-1, RANTES, IFN-γ, और TNF-α(सामग्री की मेज) केलिए qPCR विश्लेषण के अधीन । (A)प्रत्येक समय बिंदु पर एमआईपी-1α, एमआईपी-1, और RANTES की सापेक्ष अभिव्यक्ति। (ख)हर समय बिंदु पर आईएफएन-γ और टीएनएफ-α की सापेक्ष अभिव्यक्ति । मानों को ऐक्टिन जीन में सामान्यीकृत किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: FcγRIIIa सक्रिय एनके कोशिकाओं साइटोस्केलेटल पुनर्व्यवस्था का प्रदर्शन । एनके कोशिकाओं को 0 मिनट, 5 मिनट, 15 मिनट और 30 मिनट के लिए रिटक्सीमैब के साथ उत्तेजित किया गया था, जिसके बाद फॉलोइडिन स्टेनिंग और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा साइटोस्केलेल पुनर्व्यवस्था के लिए मूल्यांकन किया गया था। एनके कोशिकाओं के समय 0 में एमएफआई के लिए प्रायोगिक समय बिंदु पर एमएफआई का अनुपात rituximab (सर्कल, ठोस रेखा) या माध्यमिक एंटीबॉडी अकेले (वर्ग, बिंदीदार रेखा) के साथ उत्तेजित होता है। बार चार प्रतिकृति के एसडी का प्रतिनिधित्व करते हैं। एस्टरिस्क दो पूंछ वाले अकर्पित छात्र के टी-टेस्ट (*p < 0.05) के आधार पर सांख्यिकीय महत्व का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: FcγRIIIa सक्रिय एनके कोशिकाओं एक्सप्रेस CD107a । एनके कोशिकाओं को 4 घंटे के लिए रिटक्सीमैब के साथ उत्तेजित किया गया था जिसके बाद सीडी 107ए और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा डिग्रेनुलेशन के लिए मूल्यांकन किया गया था। (A)0 घंटे के लिए rituximab (सफेद सलाखों) या एंटी-ह्यूमन लाइट चेन एंटीबॉडी (ग्रे बार) के साथ उत्तेजना के बादCD107a व्यक्त करने वाली एनके कोशिकाओं का प्रतिशत 0 घंटे और 4 घंटे के उपचार के बाद रिटक्सीमब (सफेद बार) या एंटी-ह्यूमन एंक् लाइट चेन एंटीबॉडी (ग्रे बार) के साथ उत्तेजित होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: FcγRIIIa सक्रिय एनके कोशिकाएं केमोकिन और साइटोकिन्स को स्रावित करती हैं। एनके कोशिकाओं को रिटक्सीमैब के साथ 0, 0.5, 1, 3 और 6 घंटे के लिए प्रेरित किया गया था। सुपरनेट को एमआईपी-1α, एमआईपी-1, रणेट्स, आईएफएन-γ और टीएनएफ-α की रिहाई को मापने के लिए एक प्रवाह और मनका आधारित साइटोकिन मूल्यांकन विधि(सामग्री की तालिका)द्वारा एकत्र किया गया था। (क) प्रत्येक समय बिंदु पर एमआईपी-1α, एमआईपी-1, और आरएटीईएस उत्पादन। (ख)आईएफएन-γ और टीएनएफ-α उत्पादन प्रत्येक समय बिंदु पर । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

यह प्रोटोकॉल एंटीबॉडी द्वारा मध्यस्थता एनके कोशिकाओं में FcγRIIIa संचालित घटनाओं का अध्ययन करने के तरीकों का वर्णन करता है। ये तकनीकें चिकित्सीय एंटीबॉडी की कार्रवाई के संभावित तंत्रों के मूल्यांकन की अनुमति देती हैं, जिन्हें एडीसीसी1, 2होने का सुझाव दियाजाताहै। विशेष रूप से, ये विधियां अंतर्निहित आणविक सिग्नलिंग रास्तों और सेलुलर प्रक्रियाओं का अध्ययन करने में लचीलापन प्रदान करती हैं जो एडीसीसी के लिए जिम्मेदार हैं। वे अन्य प्रभावकार कार्यों जैसे कि केमोकिन और साइटोकिन उत्पादन के अवलोकन की भी अनुमति देते हैं। इसके अलावा, ये विधियां संभावित बायोमार्कर और अणुओं की पहचान की अनुमति देती हैं जिन्हें एडीसीसी को मिलाना लक्षित किया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल का आधार लक्ष्य कोशिकाओं के अभाव में एंटीबॉडी के साथ FcγRIIIa के माध्यम से एनके कोशिकाओं की कृत्रिम उत्तेजना है। एंटीबॉडी-बाउंड लक्ष्य कोशिकाएं आमतौर पर एफसी रिसेप्टर्स के क्रॉसलिंकिंग को बढ़ावा देने के लिए एक मंच बनाने की सेवा करती हैं जो सिग्नलिंग और डाउनस्ट्रीम प्रभावों को चलाती है। इसके बजाय, एनके कोशिकाओं को प्रोत्साहित करने के लिए लक्ष्य कोशिकाओं की आवश्यकता को दरकिनार करते हुए, इस परख में एक एंटी-ह्यूमन एन लाइट चेन एंटीबॉडी का उपयोग करके क्रॉसलिंकिंग पूरा किया जाता है। लक्ष्य कोशिकाओं के बिना, परिणाम और टिप्पणियों को सीधे एनके कोशिकाओं के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है, यह मानते हुए कि शुद्धिकरण प्रक्रिया सफल है।

महत्वपूर्ण बात यह है कि एंटीबॉडी को क्रॉसलिंक करने के लिए एंटी-ह्यूमन एन लाइट चेन एंटीबॉडी का उपयोग करना FcγRIIIa के लिए एफसी भाग की बाध्यकारी आत्मीयता में हस्तक्षेप नहीं करता है, एक बातचीत जो प्रतिक्रिया10, 11,12, 13की ताकत को तय करती है। वास्तव में, अध्ययनों से पता चला है कि 10 , 11 ,12,13FcγRIIIa के लिए उनकी बढ़ी हुई आत्मीयता के कारण Afucosylated एंटीबॉडी एडीसीसी में वृद्धि होती है । बाद के अध्ययनों से पता चला है कि यह बढ़ी हुई आत्मीयता मानव विरोधी प्रकाश श्रृंखला माध्यमिक एंटीबॉडी विकल्प से अप्रभावित है और इसका उपयोग एडीसीसी8में वृद्धि के आधार का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। यह सुनिश्चित करने के लिए कि एनके सेल को एंटीबॉडी के क्रॉसलिंकिंग के माध्यम से उत्तेजित किया जाता है, दो नकारात्मक नियंत्रणों को शामिल किया जाना चाहिए: 1) केवल माध्यमिक एंटी-ह्यूमन एन लाइट चेन एंटीबॉडी के बिना चिकित्सीय एंटीबॉडी, और 2) माध्यमिक एंटी-ह्यूमन एन लाइट चेन एंटीबॉडी केवल। दोनों ही मामलों में, कोई सिग्नलिंग या प्रभावक कार्य उत्पन्न नहीं किया जाना चाहिए।

यह विधि छोटे अणु अवरोधकों पर चिकित्सीय एंटीबॉडी के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए लचीलापन भी प्रदान करती है। अवरोधक को माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ क्रॉसलिंकिंग से पहले जोड़ा जा सकता है ताकि अवरोधक के पास अपने लक्ष्य को संलग्न करने का समय हो। हालांकि, अवरोधक पूर्व उपचार के इष्टतम समय को निर्धारित करने के लिए अध्ययन किए जाने चाहिए; इस प्रकार, अवरोधक उत्तेजना पर एक अधिकतम प्रभाव पड़ता है। के साथ कि कहा, शोधकर्ताओं ने भी उत्तेजना के बाद एक अवरोधक के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए चुन सकते हैं । इस मामले में, अवरोधक को यह अध्ययन करने के लिए क्रॉसलिंकिंग के बाद जोड़ा जा सकता है कि यह पहले से उत्पन्न संकेतों और प्रक्रियाओं को कैसे प्रभावित करता है। साथ में, यहां वर्णित विधि चिकित्सीय एंटीबॉडी के साथ विभिन्न छोटे अणु अवरोधकों के संयोजन प्रभावों का अध्ययन करने में अधिकतम लचीलापन प्रदान करती है।

जैसा कि ऊपर बताया गया है, उत्तेजना के बाद विभिन्न प्रकार के रीडआउट किए जा सकते हैं। विभिन्न विक्रेताओं से एसडीएस-पेज और झिल्ली हस्तांतरण प्रणालियों का उपयोग करके सिग्नलिंग का अध्ययन करने के लिए पश्चिमी ब्लॉटिंग किया जा सकता है। इसी तरह, जीन अभिव्यक्ति का मूल्यांकन विभिन्न आरएनए निष्कर्षण विधियों, रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन रिएजेंट्स और जीन अभिव्यक्ति उपकरणों का उपयोग करके भी किया जा सकता है। अंत में, इंट्रासेलुलर या एक्सट्रासेलुलर प्रोटीन के लिए धुंधला भी किया जा सकता है जिसमें नमूनों का विश्लेषण विभिन्न प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग करके किया जा सकता है। इंट्रासेलुलर साइटोकिन और सीडी 107ए धुंधला (चरण 3.4, जिसका मूल्यांकन एक साथ किया जा सकता है) के लिए, सिग्नल को अधिकतम करने के लिए मोनेंसिन और/या ब्रेफेल्डिन ए जोड़ा जाना चाहिए। हमने प्रत्येक प्रयोगात्मक लक्ष्य के लिए विभिन्न प्लेटफार्मों का उपयोग किया है और अभी भी समान परिणाम देखे हैं। इसलिए, अध्ययन के आधार पर विधि को विभिन्न अभिकर् ती, प्लेटफार्मों और उपकरणों के साथ पूरित किया जा सकता है।

उत्तेजना के लिए क्रॉसलिंकिंग समय अध्ययन के लक्ष्य पर निर्भर करेगा। यदि सिग्नलिंग अध्ययन वांछित हैं, तो विशिष्ट क्रॉसलिंकिंग उत्तेजना समय 2 मिनट और 10 मिनट के बीच है। pAKT, pPRAS40, और pERK1/2 संचय चोटियों पर 2 मिनट और 10 मिनट8, 9के बाद गायब होजाताहै। कार्यात्मक अध्ययनों के लिए (यानी, केमोकिन/साइटोकिन उत्पादन से जुड़े लोग), कोशिकाओं को कम से कम 30 मिनट के लिए उत्तेजित किया जाना चाहिए, जो विश्लेषण9पर निर्भर करता है। जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण भी आम तौर पर उत्तेजना9के 30 मिनट की आवश्यकता है । एक readout के रूप में RANTES जीन अभिव्यक्ति का उपयोग करते समय सावधानी बरती जानी चाहिए, क्योंकि RANTES mRNA उत्पादन ट्रांसक्रिप्शनल सक्रियण से स्वतंत्र है क्योंकि यह पहले से ही उत्तेजना25पर प्रोटीन के त्वरित अनुवाद और रिहाई के लिए कोशिकाओं में संग्रहीत किया जाता है। इसके विपरीत, डेग्रेशन को कम से कम 3 घंटे की उत्तेजना की आवश्यकता होती है। इन सामान्य टिप्पणियों के बावजूद, शोधकर्ताओं को ब्याज के विशेष अणुओं के लिए इष्टतम उत्तेजना समय निर्धारित करने के लिए गतिज अध्ययन करना चाहिए।

इसी तरह, शोधकर्ताओं को इष्टतम एकाग्रता निर्धारित करने के लिए ब्याज की एंटीबॉडी को कम करना चाहिए क्योंकि विभिन्न विशिष्टताओं वाले एंटीबॉडी विभिन्न समानताओं के साथ FcγRIIIa के लिए बाध्य करते हैं, भले ही वे एक ही आइसोटाइप के हों। उदाहरण के लिए, रिटक्सीमाब और ट्रास्टुज़ुमाब दोनों एक इग्जी 1 आइसोटाइप हैं लेकिन ट्रास्टुज़ुमाब रितुक्सीमाब26, 27की तुलना में FcγRIIIa के वलिन बहुरूपता के लिए अधिक दृढ़ता से बांधता है। आत्मीयता में यह अंतर कार्यात्मक मतभेदों का कारण बन सकता है, जैसे कि डीग्रेनुलेशन, जैसा कि प्रकाशित अध्ययनों में8में देखा गया है।

इष्टतम एकाग्रता का निर्धारण करना भी महत्वपूर्ण है क्योंकि एंटीबॉडी के एफसी हिस्से में FcγRIIIa के लिए कम आत्मीयता है। इसके परिणामस्वरूप एंटीबॉडी को धोना पड़ सकता है क्योंकि प्रोटोकॉल में एफसी रिसेप्टर को एंटीबॉडी के बाध्यकारी होने के बाद धोने के कदम शामिल हैं। यह तो परख में संवेदनशीलता की कमी के रूप में उत्तेजना के बाद CD107a सकारात्मक कोशिकाओं के कम प्रतिशत द्वारा सुझाव दिया जासकता है (चित्रा 5)। हालांकि, इष्टतम एकाग्रता के निर्धारण को विश्वास प्रदान करना चाहिए कि परिणाम संवेदनशीलता की कमी के कारण नहीं हैं। इसके अलावा, कोशिकाओं को जैव रासायनिक और कार्यात्मक परख में स्पष्ट रूप से सक्रिय किया जाता है जो एकल सेल रीडआउट(चित्रा 2, चित्र 3, चित्र 6)के विपरीत थोक सेल का उपयोग करते हैं।

प्रोटोकॉल भी सीमित है क्योंकि यह पूरी तरह से नकल नहीं करता है जो शारीरिक रूप से होता है। माध्यमिक मानव विरोधी कश्मीर एंटीबॉडी का उपयोग कोशिकाओं पर व्यक्त लक्ष्य एंटीजन द्वारा उत्पन्न क्रॉसलिंकिंग की नकल करना है। यहां, अधिकतम प्रतिक्रिया उत्पन्न करने के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी की संतृप्त राशि जोड़ी जाती है। हालांकि, अलग लक्ष्य कोशिकाएं एंटीजन के विभिन्न स्तरों को व्यक्त करेंगी, जो क्रॉसलिंकिंग और प्रतिक्रिया को प्रभावित करेंगी । वर्तमान में, इस प्लेटफ़ॉर्म को विभिन्न एंटीजन अभिव्यक्ति स्तरों के प्रभावों की नकल करने के लिए अनुकूलित नहीं किया गया है।

इन प्रयोगों को करते समय विचार करने वाला एक अन्य कारक व्यक्तियों के बीच विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि और प्रतिरक्षात्मक इतिहास के कारण दाता-से-दाता परिवर्तनशीलता है। इसलिए, एक ही परक में विभिन्न दानदाताओं से एनके सेल प्रतिक्रियाओं की तुलना करते समय देखभाल की जानी चाहिए। इसी प्रकार, जब विभिन्न दानदाताओं का उपयोग किया जाता है तो केवल सामान्य निष्कर्ष दिए जाने चाहिए ।

कुल मिलाकर, वर्णित विधि एनके कोशिकाओं में एंटीबॉडी संचालित FcγRIIIa-मध्यस्थता घटनाओं का अध्ययन करने के लिए एक सरल और लचीला उत्तेजना मंच है। इसका उपयोग बढ़ी हुई एडीसीसी और अफ्यूकोसिलेटेड एंटीबॉडी 8 के साथ देखी गई प्रभावकारिता के आधार को बेहतरढंगसे समझने के लिए किया गया है । इस विधि को चिकित्सीय एंटीबॉडी और PI3K छोटे अणु अवरोधकों के संयोजन के अध्ययन में भीनियोजितकिया गया था । इसके अतिरिक्त, PS6 द्वारा विनियमित केमोकिन और साइटोकिन उत्पादन के लिए पहले से अज्ञात तंत्र की पहचानकीगई थी। इसलिए, इस कृत्रिम सिग्नलिंग प्लेटफॉर्म का उपयोग करके भविष्य के अध्ययन FcγRIIIa द्वारा संचालित प्रभावकार कार्यों के लिए विनियमन के तंत्र को और स्पष्ट कर सकते हैं। यह भी संभावित इन तंत्रों के लिए महत्वपूर्ण नए अणुओं के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ज्ञात अणुओं के लिए नई भूमिकाओं की पहचान कर सकते हैं ।

Disclosures

सभी लेखक हैं या iQ जैव विज्ञान के लिए कर्मचारी या सलाहकार रहे हैं।

Acknowledgments

लेखक इस पांडुलिपि की टिप्पणियों और संपादन के लिए जेम्स ली और क्रिस्टोफर एनजी का शुक्रिया अदा करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16% paraformaldehyde Thermo Fisher Scientific 50-980-487
Alexa Fluor 488 phalloidin Thermo Fisher Scientific A12379
anti-mouse HRP antibody Cell Signaling Technologies 7076
AutoMACS instrument Miltenyi NK cell isolation method; another isolation instrument may be used
B-mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific 21985023
Bovine Serum Albumin Fraction V, fatty acid free Millipore Sigma 10775835001
CD107a APC antibody Biolegend 328620
Cytokine 30-Plex Human Panel Thermo Fisher Scientific LHC6003M chemokine/cytokine method; another chemokine/cytokine analysis method may be used
FBS Hyclone SH30071.01
Goat anti-human κ light chain antibody Millipore Sigma AP502
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail Thermo Fisher Scientific 78440
HEPES Thermo Fisher Scientific 15630080
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Thermo Fisher Scientific 4368814 cDNA transcription method; used according to manufacturer's protocol
IFN-? primers Thermo Fisher Scientific Hs00989291_m1
Leukosep tube (50 ml conical with porous barrier) Greiner 227290
Lymphoprep (density gradient medium) Stemcell 7851
MIP-1? primers Thermo Fisher Scientific Hs00234142_m1
MIP-1β primers Thermo Fisher Scientific Hs99999148_m1
NK cell isolation kit Miltenyi 130-092-657 NK cell isolation kit; another isolation kit may be used
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels Thermo Fisher Scientific another protein separation system may be used
pAKT (S473) antibody Cell Signaling Technologies 4060
pERK1/2 antibody Cell Signaling Technologies 4370
pPRAS40 antibody Cell Signaling Technologies 13175
PVDF membrane Thermo Fisher Scientific nitrocellulose may be used
RANTES primers Thermo Fisher Scientific Hs00982282_m1
RIPA buffer Millipore Sigma R0278
RPMI w/glutamax Thermo Fisher Scientific 61870
Sodium pyruvate Thermo Fisher Scientific 11360070
TNF-? primers Thermo Fisher Scientific Hs00174128_m1
Triton X-100 Thermo Fisher Scientific 85111
TRIzol Thermo Fisher Scientific 15596018 RNA isolation method; used according to manufacturer's protocol
Xcell Blot II Transfer Module Thermo Fisher Scientific another protein separation system may be used
Xcell SureLock Protein Gel Electrophoresis Chamber System Thermo Fisher Scientific another protein separation system may be used
β-actin HRP antibody Abcam ab6721
β-actin primers Thermo Fisher Scientific Hs00982282_m1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hudis, C. A. Trastuzumab - Mechanism of Action and Use in Clinical Practice. New England Journal of Medicine. 357 (1), 39-51 (2007).
  2. Weiner, G. J. Rituximab: mechanism of action. Seminars inHhematology. 47 (2), 115-123 (2010).
  3. Orange, J. S. Formation and function of the lytic NK-cell immunological synapse. Nature Reviews Immunology. 8 (9), 713-725 (2008).
  4. Bonnema, J. D., Karnitz, L. M., Schoon, R. A., Abraham, R. T., Leibson, P. J. Fc receptor stimulation of phosphatidylinositol 3-kinase in natural killer cells is associated with protein kinase C-independent granule release and cell-mediated cytotoxicity. The Journal of Experimental Medicine. 180 (4), 1427-1435 (1994).
  5. Jiang, K., et al. Pivotal role of phosphoinositide-3 kinase in regulation of cytotoxicity in natural killer cells. Nature Immunology. 1 (5), 419-425 (2000).
  6. Kanakaraj, P., et al. Phosphatidylinositol-3 kinase activation induced upon Fc gamma RIIIA-ligand interaction. The Journal of Experimental Medicine. 179 (2), 551-558 (1994).
  7. Orange, J. S., Harris, K. E., Andzelm, M. M., Valter, M. M., Geha, R. S., Strominger, J. L. The mature activating natural killer cell immunologic synapse is formed in distinct stages. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 14151-14156 (2003).
  8. Liu, S. D., et al. Afucosylated Antibodies Increase Activation of FcγRIIIa-Dependent Signaling Components to Intensify Processes Promoting ADCC. Cancer Immunology Research. 3 (2), 173-183 (2015).
  9. Romeo, V., Gierke, S., Edgar, K. A., Liu, S. D. Effects of PI3K Inhibition on Afucosylated Antibody-Driven FcγRIIIa Events and Phospho-S6 Activity in NK Cells. The Journal of Immunology. 203 (1), 137-147 (2019).
  10. Mössner, E., et al. Increasing the efficacy of CD20 antibody therapy through the engineering of a new type II anti-CD20 antibody with enhanced direct and immune effector cell-mediated B-cell cytotoxicity. Blood. 115 (22), 4393-4402 (2010).
  11. Shields, R. L., et al. Lack of fucose on human IgG1 N-linked oligosaccharide improves binding to human Fcgamma RIII and antibody-dependent cellular toxicity. The Journal of Biological Chemistry. 277 (30), 26733-26740 (2002).
  12. Shinkawa, T., et al. The absence of fucose but not the presence of galactose or bisecting N-acetylglucosamine of human IgG1 complex-type oligosaccharides shows the critical role of enhancing antibody-dependent cellular cytotoxicity. The Journal of Biological Chemistry. 278 (5), 3466-3473 (2003).
  13. Junttila, T. T., et al. Superior In vivo Efficacy of Afucosylated Trastuzumab in the Treatment of HER2-Amplified Breast Cancer. Cancer Research. 70 (11), 4481-4489 (2010).
  14. Goede, V., et al. Obinutuzumab (GA101) plus chlorambucil (Clb) or rituximab (R) plus Clb versus Clb alone in patients with chronic lymphocytic leukemia (CLL) and preexisting medical conditions (comorbidities): Final stage 1 results of the CLL11 (BO21004) phase III trial. Journal of Clinical Oncology. 31, 15_suppl 7004 (2013).
  15. Sehn, L. H., et al. Randomized Phase II Trial Comparing Obinutuzumab (GA101) With Rituximab in Patients with Relapsed CD20+ Indolent B-Cell Non-Hodgkin Lymphoma: Final Analysis of the GAUSS Study. Journal of Clinical Oncology. 33 (30), 3467-3474 (2015).
  16. Pons-Tostivint, E., Thibault, B., Guillermet-Guibert, J. Targeting PI3K Signaling in Combination Cancer Therapy. Trends in Cancer. 3 (6), 454-469 (2017).
  17. Engelman, J. A. Targeting PI3K signalling in cancer: opportunities, challenges and limitations. Nature Reviews. Cancer. 9 (8), 550-562 (2009).
  18. Fruman, D. A., Rommel, C. PI3K and cancer: lessons, challenges and opportunities. Nature Reviews. Drug Discovery. 13 (2), 140-156 (2014).
  19. Janku, F., Yap, T. A., Meric-Bernstam, F. Targeting the PI3K pathway in cancer: are we making headway. Nature Reviews. Clinical Oncology. 15 (5), 273-291 (2018).
  20. Samuels, Y., et al. High frequency of mutations of the PIK3CA gene in human cancers. Science. 304 (5670), New York, N.Y. 554 (2004).
  21. Kanevskiy, L. M., Telford, W. G., Sapozhnikov, A. M., Kovalenko, E. I. Lipopolysaccharide induces IFN-γ production in human NK cells. Frontiers in Immunology. 4, (2013).
  22. Romagnani, C., et al. Activation of human NK cells by plasmacytoid dendritic cells and its modulation by CD4+ T helper cells and CD4+ CD25hi T regulatory cells. European Journal of Immunology. 35 (8), 2452-2458 (2005).
  23. Sivori, S., et al. CpG and double-stranded RNA trigger human NK cells by Toll-like receptors: Induction of cytokine release and cytotoxicity against tumors and dendritic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (27), 10116-10121 (2004).
  24. Hanna, J., et al. Novel Insights on Human NK Cells' Immunological Modalities Revealed by Gene Expression Profiling. The Journal of Immunology. 173 (11), 6547-6563 (2004).
  25. Swanson, B. J., Murakami, M., Mitchell, T. C., Kappler, J., Marrack, P. RANTES production by memory phenotype T cells is controlled by a posttranscriptional, TCR-dependent process. Immunity. 17 (5), 605-615 (2002).
  26. Jo, M., Kwon, H. S., Lee, K. H., Lee, J. C., Jung, S. T. Engineered aglycosylated full-length IgG Fc variants exhibiting improved FcγRIIIa binding and tumor cell clearance. mAbs. 10 (2), 278-289 (2018).
  27. Isoda, Y., et al. Importance of the Side Chain at Position 296 of Antibody Fc in Interactions with FcγRIIIa and Other Fcγ Receptors. PLoS ONE. 10 (10), 0140120 (2015).

Tags

इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 159 एनके कोशिकाओं FcγRIIIa सगाई चिकित्सीय एंटीबॉडी छोटे अणुओं जीन अभिव्यक्ति degranulation साइटोकिन रिलीज संकेत
चिकित्सीय एंटीबॉडी की उपस्थिति में FcγRIIIa सगाई से प्रेरित मानव प्राकृतिक हत्यारा सेल घटनाओं का आकलन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Petriello, A., Becerra, J. A., Lay,… More

Petriello, A., Becerra, J. A., Lay, J., Husaini, R., Windler, S. L., Duramad, O., Liu, S. D. Assessment of Human Natural Killer Cell Events Driven by FcγRIIIa Engagement in the Presence of Therapeutic Antibodies. J. Vis. Exp. (159), e61144, doi:10.3791/61144 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter