Summary
هنا ، نصف طريقة مفصلة لتحرير الجينات السلس في الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات باستخدام بلازميد متبرع قائم على الخنزير وطفرة Cas9 nickase. تم إدخال طفرات نقطتين في إكسون 8 من موضع العامل النووي للخلايا الكبدية 4 ألفا (HNF4α) في الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs).
Abstract
تتيح نوكلياز الداخلية المصممة خصيصا ، مثل التكرارات العنقودية المتداخلة بانتظام (CRISPR) -Cas9 الموجهة بالحمض النووي الريبي ، تحرير الجينوم الفعال في خلايا الثدييات. هنا نصف الإجراءات التفصيلية لتحرير الجينوم بسلاسة لموضع العامل النووي للخلايا الكبدية 4 ألفا (HNF4α) كمثال في الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات. من خلال الجمع بين بلازميد متبرع قائم على الخنزير ومتحولة نيكاز CRISPR-Cas9 في اختيار جيني من خطوتين ، نظهر الاستهداف الصحيح والفعال لموضع HNF4α.
Introduction
تمثل الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) مصدرا غير محدود للخلايا الجسدية للبحث أو العيادة1. يوفر استهداف الجينات في hPSCs طريقة قوية لدراسة وظيفة الجينات أثناء مواصفات الخلية وفهم آليات المرض. على الرغم من وجود طرق فعالة لتحرير الجينوم ، إلا أن تعديل الجينات في hPSCs لا يزال يمثل تحديا تقنيا. يحدث الاستهداف الجيني القياسي عن طريق إعادة التركيب المتماثل في hPSCs بتردد منخفض أو حتى لا يمكن اكتشافه في بعض الجينات 2 ، وبالتالي فإن الاستهداف الجيني المحفز لكسر الحمض النووي المزدوج (DSB) (يسمى تحرير الجينات) ضروري في هذه الخلايا 2,3. بالإضافة إلى ذلك ، فإن نقل hPSCs والاستنساخ اللاحق لخلية واحدة ليس فعالا للغاية ، على الرغم من أنه يمكن تقليل موت الخلايا المبرمج المرتبط بخلية واحدة من خلال استخدام مثبط بروتين كيناز المرتبط ب Rho (ROCK)4. وأخيرا، يمكن أن تكون الطفرات المحتملة على الهدف وغير المستهدف في الجين محل الاهتمام مشكلة أيضا. وبالتالي ، فإن البروتوكول الموثوق به ضروري لإجراء تغييرات جينية مخصصة في hPSCs.
تعد تقنية CRISPR الموجهة بالحمض النووي الريبي (التكرارات العنقودية القصيرة المتباعدة بانتظام) وتقنية البروتين 9 المرتبط ب CRISPR (Cas9) الآن أداة راسخة في تحرير الجينات. يشكل الحمض النووي الريبي المكتوب كريسبر (crRNA) والحمض النووي الريبي المنشط (tracrRNA) الحمض النووي الريبي الموجه الفردي (sgRNA) ، والذي يتجمع مع بروتين Cas9 مما يسمح بالانقسام النوعيللجين 5. نظام CRISPR / Cas9 قابل للبرمجة ، عن طريق تغيير تسلسل دليل 20 بت في 20 بت من sgRNA ، مما يعني أنه يمكن تحرير أي موضع تقريبا يفي بمتطلبات الشكل المجاور للمسافة الأولية (PAM). ومع ذلك ، يمكن للنوع البري Cas9 تحمل بعض عدم التطابق بين تسلسل الدليل وهدف الحمض النووي ، مما قد يتسبب في تأثيرات غير مرغوب فيها خارج الهدف. لتحسين خصوصيته ، تم تطوير متحولة نيكاز (Cas9n). يمتلك Cas9n الذي يحتوي على طفرة D10A أو N863A مجالا وظيفيا واحدا فقط للنيوكلياز ونتيجة لذلك يمكنه فقط شق الحمض النووي على شريط واحد. يمكن لزوج من Cas9n متباعدة وموجهة بشكل مناسب أن يحفز بشكل فعال DNA DSB ويتم تقليل التأثيرات خارج الهدف بشكل كبير6. لضمان تعديل Cas9n الفعال ، فقد ثبت أنه يجب وضع اثنين من Cas9n-sgRNA بشكل مثالي مع إزاحة -4 إلى 20 نقطة أساس وإنشاء دائما 5 'متدلية6.
يمكن استخدام DSB الناجم عن Cas9 (n) -sgRNA لتحرير الجينوم في hPSCs 7,8. يمكن أن يخلق ضربة قاضية للجين عن طريق إصلاح الانضمام النهائي غير المتماثل ، أو إدخال تعديل الجينات من خلال الإصلاح الموجه بالتماثل (HDR) إذا كان قالب الحمض النووي للمتبرع موجودا. يستخدم البروتوكول الموصوف هنا بلازميد مانح قائم على ناقل الحركة (أو ناقل استهداف) ل HDR ، حيث يتم إحاطة علامة مقاومة الأدوية بالتكرارات المقلوبة للترانسبوزون. تشمل ميزة هذا النهج الفحص الفعال والتحرير الجيني السلس كما هو موضح أولا بواسطة Yusa et al.9,10. يسمح شريط اختيار الدواء بإثراء الخلايا بالناقل المتكامل ، والذي يتم فحصه لاحقا بواسطة PCR الوصلة لتحديد تلك المشتقة من HDR. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن وضع شريط اختيار الدواء ليحل محل التسلسلات المستهدفة لانقسام Cas9 (n) ، لذلك لا يحدث مزيد من كسر الحمض النووي بعد HDR ، وبالتالي القضاء على الطفرات المستهدفة "على" الناتجة عن إعادة الانقسام Cas9 (n). علاوة على ذلك ، من خلال استغلال الاستئصال الدقيق الذي يحفزه ناقلة نقل الخنازير ، يتم بعد ذلك استئصال علامة الاختيار من الجينوم دون ترك ندبة. يبقى فقط تسلسل TTAA الأصلي الداخلي لإدخال الخنزير بعد إزالة علامة اختيار الدواء9. حتى إذا كان لا بد من إنشاء مواقع TTAA عن طريق إدخال بدائل ، فإن فرص العناصر التنظيمية المزعجة تقل مقارنة بالطرق الأخرى10.
هنا نصف الإجراءات التفصيلية لتنفيذ تحرير الجينوم السلس في hPSCs. من خلال الجمع بين بلازميد متبرع قائم على الخنزير ومتحور نيكاز CRISPR-Cas9 في اختيار جيني من خطوتين ، قدمنا طفرتين نقطيتين محددتين مسبقا في جين العامل النووي 4 ألفا (HNF4α)11. هذا النهج موثوق وفعال ، وقد سمح بإجراء تحليلات متعمقة للأدوار المهمة التي يلعبها HNF4α في مواصفات الأديم الباطن وخلايا الكبد من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات11.
Protocol
1. تصميم وبناء بلازميدات تعبير CRISPR / Cas9n-sgRNA
- ابحث عن تسلسلات دليل 20 بت مباشرة في اتجاه المنبع لأي 5'-NGG بالقرب من الموقع المراد تعديله. هناك حاجة إلى زوج من الحمض النووي الريبي أحادي الدليل (sgRNAs) عند استخدام Cas9 nickase (Cas9n) من العقدية المقيحة . يجب أن يكون زوج sgRNAs قادرا على توليد 5 بوصات متدلية عند الوخز مع إزاحة -4 إلى 20 نقطة أساس6.
- ترتيب oligos اللازمة و pSpCas9n-2A-puro المتجهات.
- استنساخ sgRNA في متجه pSpCas9n للتعبير المشترك مع Cas9n باتباع البروتوكولالمنشور 12.
2. تصميم وبناء ناقل استهداف قائم على الخنزير
- قم بتنزيل تسلسل الجينات المستهدفة وابحث عن موقع TTAA بالقرب من الموقع المراد تعديله.
ملاحظة: يجب أن تكون المسافة بين موقع TTAA والموقع المراد تعديله صغيرة قدر الإمكان. إذا كان ضمن تسلسل الترميز ولا يوجد موقع TTAA على مسافة 100 نقطة أساس ، فمن الضروري إدخال واحد عن طريق إجراء بدائل نيوكليوتيدات مترادفة. - تصميم أذرع التماثل (HAs) ودمج طفرات النقطة المرغوبة في HAs. يجب أن يكون الطول الأمثل ل HAs حوالي 500 - 1200 نقطة أساس.
ملاحظة: يوصى بإدخال بدائل نيوكليوتيدات مترادفة لتحور تسلسل PAM من أجل تجنب إعادة الانقسام المحتمل ل Cas9n. - إنشاء ناقل الاستهداف النهائي باتباع البروتوكولالمعمول به 10.
ملاحظة: في متجه الاستهداف المستخدم هنا ، يحيط بشريط اختيار puro-deltaTK المدفوع بمروج PGK تكرارات مقلوبة بالترانسبوزون.
3. التحرير الجيني للخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات
- الحفاظ على الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 على الأسطح المطلية ب laminin 521 المؤتلف (5 ميكروغرام / مل) في وسط mTeSR113. يجب أن تصل الخلايا إلى 70-85٪ من التقاء بعد 72 ساعة بعد نسبة انقسام 1: 3.
ملاحظة: في حالة وجودها، قم بإزالة الخلايا المتمايزة تلقائيا قبل تغيير الوسط اليومي عن طريق شفطها برفق. - في يوم النقل ، قم بتغطية ما يكفي من الآبار من صفيحة 24 بئرا ب 300 ميكرولتر من محلول laminin 521 (5 ميكروغرام / مل) عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة على الأقل.
- قم بإزالة محلول الطلاء برفق وأضف 300 ميكرولتر من وسط mTeSR1 الطازج المكمل بمثبط 10 ميكرومتر ROCK إلى كل بئر ، ثم أعد اللوحة إلى الحاضنة لاستقبال الخلايا.
ملاحظة: لا تدع الألواح تجف في أي وقت عند إزالة محلول طلاء اللامينين. - انقل hPSCs المخزنة من الحاضنة ، وقم بإزالة الوسط المستهلك ، ثم اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 1 مل من 1x DPBS المعقمة.
- أضف 1 مل من كاشف تفكك الخلايا اللطيف إلى كل بئر من صفيحة مكونة من 6 آبار واحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 6-8 دقائق لفصل الخلايا.
ملاحظة: اضغط برفق على اللوحة وتحقق مما إذا كانت الخلايا يمكن فصلها بسهولة لتحديد ما إذا كانت عملية الهضم طويلة بما يكفي. - ماصة برفق لأعلى ولأسفل باستخدام طرف P1000 لرفع جميع hPSCs.
- قم بإنهاء التفكك بإضافة 2 مل من وسط mTeSR1 الطازج المكمل بمثبط 10 μM ROCK (Y-27632) إلى تعليق الخلية.
- تخلط جيدا ونقل التعليق أحادي الخلية إلى أنبوب 50 مل ، وأجهزة الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا جيدا في وسط mTeSR1 الطازج سعة 2 مل مع مثبط 10 ميكرومتر ROCK.
- عد الخلايا القابلة للحياة باستخدام مقياس الدم. استخدم Trypan Blue لتلطيخ الخلايا الميتة واستبعادها.
- انقل 8 × 10 5 إلى 1 × 106 خلايا حية إلى أنبوب سعة1.5 مل لكل تفاعل نيوكليوفوفيكشن وأجهزة طرد مركزي بمعدل 200 × جم لمدة 3 دقائق. ثم يستنشق بعناية طاف الأسنان.
- امزج 3 ميكروغرام من بلازميدات تعبير Cas9n-sgRNA المقترنة و 5 ميكروغرام من بلازميد ناقل الاستهداف في 100 ميكرولتر من محلول / مكمل النواة المختلط من مجموعة نواة الخلايا الجذعية البشرية. استخدم بلازميد التحكم GFP من المجموعة وقم بإعداد مزيج بلازميد التحكم GFP أيضا.
ملاحظة: من المهم عمل تحضير ماكسي لجميع البلازميدات لتقليل تلوث السموم الداخلية قبل nucleofection. يجب أن يكون تركيز البلازميدات حوالي 1 ميكروغرام / ميكرولتر. - استخدم مزيج الحمض النووي (الحجم ~ 111 ميكرولتر) لإعادة تعليق الخلايا المحضرة ونقلها إلى كفيت التثقيب الكهربائي (المزود بمجموعة النواة) ، وتجنب أي فقاعات.
- قم بتزويد الخلايا بالكهرباء باستخدام جهاز nucleofection عن طريق اختيار الظروف المثلى للخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات.
ملاحظة: في حالة استخدام مجموعة nucleofection للخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات لأول مرة ، فمن الضروري اختبار برنامج التثقيب الكهربائي واختيار البرنامج الأكثر كفاءة. - أضف على الفور 500 ميكرولتر من وسط طازج ودافئ إلى 37 درجة مئوية mTeSR1 وسط مكمل بمثبط 10 ميكرومتر ROCK إلى الخلايا المثقوبة بالكهرباء. انقل المزيج إلى بئرين من صفيحة مكونة من 24 بئرا محضرة من الخطوتين 3.2 و 3.3.
- أعد اللوحة بسرعة إلى حاضنة 37 درجة مئوية / 5٪ CO2 واسمح للخلايا بالتعافي.
- 12-16 ساعة في وقت لاحق ، تغيير وسط صيانة الخلية. إذا أنشأت الخلايا اتصالا بالخلية ، فقم بسحب مثبط ROCK ، وإذا لم يكن كذلك ، فاستمر في استكمال الوسط بالمانع.
- بين 24-48 ساعة ، تحقق من كفاءة nucleofection عن طريق فحص تعبير GFP في خلايا التحكم. يجب أن تكون الخلايا الإيجابية GFP 30 بالمائة على الأقل.
- بعد 48 ساعة من nucleofection ، ابدأ في اختيار الخلايا عن طريق استكمال وسط mTeSR1 ب 1 ميكروغرام / مل بوروميسين.
- بعد 72 ساعة من النواة ، استكمل وسط mTeSR1 ب 0.5 ميكروغرام / مل بوروميسين. إذا كان التقاء الخلية أقل من 30٪ ، فقم أيضا بتكملة الوسط بمثبط 10 ميكرومتر ROCK.
- بعد 4-6 أيام من النواة ، قم بتمرير الخلايا المقاومة للبوروميسين إلى ألواح بئر 10-15 × 96 بتركيز 0.8 خلية / بئر.
ملاحظة: من الضروري استكمال الوسط بمثبط 10 ميكرومتر روك و 0.5 ميكروغرام / مل بوروميسين. - حافظ على هذه الخلايا عند 37 درجة مئوية / 10٪ CO2 لمدة 10-12 يوما لتشكيل مستعمرات مشتقة من خلية واحدة. قم بتعبئة متوسطة مرة واحدة بعد 7 أيام من البذر.
ملاحظة: زيادة مستوى CO2 يساعد hPSCs واحدة لتشكيل مستعمرات من تجربتنا. - ضع علامة على الآبار التي تحتوي على مستعمرة واحدة واستبدل الوسط بوسط mTeSR1 طازج يحتوي على 0.5 ميكروغرام / مل من البوروميسين ولكن بدون مثبط ROCK.
ملاحظة: من هذه النقطة فصاعدا ، ستنمو الخلايا تحت 37 درجة مئوية / 5٪ CO2. - بعد يومين ، قم بتغيير الوسيط للآبار التي تحتوي على مستعمرات غير متمايزة. استكمل الوسط بمثبط 10 ميكرومتر روك و 0.5 ميكروغرام / مل بوروميسين.
ملاحظة: في بعض الآبار ، قد تكون الخلايا متمايزة وتحتاج إلى التخلص منها. - استخدم أطراف ماصة P2 لكشط المستعمرات برفق. نقل تعليق الخلية المشتقة من مستعمرة واحدة إلى 2 آبار جديدة على لوحات منفصلة 96 بئر ، واستخدام واحد للتنميط الجيني وواحد للصيانة.
ملاحظة: من المهم الحفاظ على المستعمرات بعناية والحفاظ على مستوى التمايز التلقائي إلى الحد الأدنى. - خذ الصفيحة التي تحتوي على خلايا للتنميط الجيني بمجرد وصول التقاء معظم الآبار إلى 50٪ أو أعلى. تفريغ الوسط المستهلك ثم غسل الخلايا مرة واحدة مع DPBS.
- قم بتحليل الخلايا في البئر باستخدام محلول تحلل برادلي وعزل الحمض النووي الجينومي من كل بئر في اللوحة باتباع البروتوكول المرتبط (https://mcmanuslab.ucsf.edu/protocol/dna-isolation-es-cells-96-well-plate).
- استخدم طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل ثلاثية الوصلات للنمط الجيني لكل من أذرع التماثل اليمنى واليسرى بشكل مستقل10.
ملاحظة: يتم عرض مخطط يوضح طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل في الشكل 2. - أرسل منتجات PCR للتقاطع لكل من أذرع التماثل من 4-5 مستعمرات لتسلسل سانجر واحصل على التسلسلات.
ملاحظة: تظهر نتيجة التسلسل لمستعمرتين قائمتين في الشكل 3أ. - احتفظ بالمستعمرات ذات النمط الجيني الصحيح وتجاهل الباقي.
- قم بتوسيع المستعمرات الصحيحة تحت اختيار البوروميسين المستمر وتجميدها في أقرب وقت ممكن.
4. إزالة الترانسبوزون من الخلايا الجذعية البشرية المستهدفة متعددة القدرات
- الحفاظ على مستعمرة واحدة مع النمط الجيني الصحيح تحت 0.5 ميكروغرام / مل اختيار البوروميسين.
- نيوكليوفيكت 8 × 10 5 إلى 1 × 106 خلايا مع5 ميكروغرام ترانسبوزاز مفرط النشاط (pCMV-hyPBase) كما هو موضح أعلاه (القسم 3 ، الخطوات 3.4-3.18). قم بإجراء نواة تحكم GFP بالتوازي.
ملاحظة: يجب إزالة Puromycin من وسط mTeSR1 مباشرة بعد نواة هذه الخلايا. - قم بزراعة الخلايا وفحصها باستخدام شريط اختيار puro-deltaTK الذي تمت إزالته باتباع الإجراءات المنشورة10.
ملاحظة: من المهم اتباع الإجراءات الأصلية بعناية. تم استخدام FIAU ، أو 1- (2-deoxy-2-fluoro-β-d-arabinofuranosyl) -5-iodouracil) ، كنظير ثيميدين للاختيار السلبي القائم على فيروس الهربس البسيط ثيميدين كيناز (HSV-tk). - تسلسل المنطقة المعدلة لتأكيد إزالة transposon.
ملاحظة: تظهر نتيجة التسلسل ل 3 مستعمرات قائمة في الشكل 3ب. - احتفظ بالمستعمرات ذات النمط الجيني الصحيح وقم بتوسيعها لمزيد من الاستخدام.
- إجراء توصيف علامات تعدد القدرات في المستعمرات المختارة قبل استخدامها لمزيد من التحليل.
ملاحظة: يظهر توصيف مستعمرتين راسختين في الشكل 4.
Representative Results
استهداف استراتيجية الضربة القاضية القائمة على المتجهات
تم اختيار جين العامل النووي للخلايا الكبدية 4 ألفا (HNF4α) لتحرير الجينوم المستهدف لإدخال طفرات نقطتين في إكسون 8. تم تصميم زوج من Cas9n-sgRNA مع إزاحة 11 نقطة أساس بالقرب من الموقع المراد تعديله. عمل ناقل الاستهداف المستند إلى الخنزير كقالب إصلاح موجه بالتماثل لإدخال طفرات النقطة المطلوبة. تم تضخيم 967 bp 5'-HA و 1142 bp 3'-HA التي تتضمن بدائل نيوكليوتيدات مترادفة أو طفرات النقطة المرغوبة واستنساخها في ناقل الاستهداف النهائي. كان موقع إدخال الخنزير على بعد 16 نقطة أساس و 22 نقطة أساس من الطفرات المرغوبة. تم اختيار المستعمرات التي تحتوي على كاسيت اختيار puro-deltaTK مع puromycin في الجولة الأولى. بمجرد إزالة شريط الاختيار عن طريق استئصال transposase في الجولة الثانية ، تم تعديل الموقع المستهدف بسلاسة مع الطفرات النقطية المرغوبة فقط المدمجة في الجين (الشكل 1).
التحرير الجيني في الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات
لفحص الخلايا المستهدفة بشكل صحيح ، تم استخدام طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل القائمة على ثلاثة برايمر للتنميط الجيني (الشكل 2). تم إجراء تسلسل سانجر لتأكيد نتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل (الشكل 3أ). بعد إزالة شريط الاختيار ، تم تسلسل المنطقة المعدلة مرة أخرى لتأكيد الإدخال الصحيح لطفرات النقطة المرغوبة (الشكل 3ب).
إنشاء مستعمرة وتوصيف الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات المحررة
تم اختيار المستعمرات ذات النمط الجيني الصحيح وتوسيعها حسب الحاجة. يجب توصيف المستعمرات المنشأة قبل استخدامها لمزيد من التحليل. تمتلك الخلايا المحررة نفس مورفولوجيا الخلايا الأبوية (الشكل 4أ). كما أنها تعبر عن علامات الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات التمثيلية ، بما في ذلك عوامل النسخ NANOG و OCT4 (الشكل 4 ب) ، بالإضافة إلى علامات سطح الخلية SSEA4 و TRA-1-60 (الشكل 4ج).
الشكل 1: استهداف استراتيجية الضربة القاضية القائمة على المتجهات11. تم استخدام زوج من بلازميدات تعبير Cas9n-sgRNA للحث على كسر الحمض النووي المزدوج في إكسون 8 من جين HNF4α. تم استخدام متجه استهداف مع شريط اختيار لإدخال طفرات نقطية محددة مسبقا تقع على بعد 16 نقطة أساس و 22 نقطة أساس. تم احتواء شريط الاختيار هذا داخل ناقل الخنزير ، الذي يتكون من علامة اختيار إيجابية سلبية (puro-deltaTK) مدفوعة بمروج نشط بشكل أساسي (PGK). عبر مسار الإصلاح الموجه بالتماثل ، قامت الخلايا المستهدفة بدمج شريط التحديد. ينتج عن استئصال الترانسبوزون بوساطة الترانسبوزاز تعديل سلس مع وجود طفرات نقطية فقط. يشير الصليب الأحمر إلى موقع طفرات النقطة المطلوبة. HA = ذراع التماثل ؛ PB = أصبع ؛ PM = طفرة نقطة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: طريقة PCR ثلاثية تعتمد على التمهيدي. لفحص الخلايا المستهدفة للجينات ، تم استخدام التنميط الجيني القائم على تفاعل البوليميراز المتسلسل. تم استخدام ثلاثة بادئات ، LA-F1 و -R1 و -R2 لتضخيم منطقة ذراع التماثل الأيسر. بشكل مستقل ، تم استخدام RA-F1 و -F2 و -R1 لتضخيم منطقة ذراع التماثل الأيمن. بناء على نتيجة الرحلان الكهربائي الهلامي ، تم تمييز الخلايا غير المستهدفة والخلايا غير المتجانسة ومتماثلة الزيجوت عن بعضها البعض. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: نتائج تسلسل الخلايا المعدلة وراثيا11. تم تسلسل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل من نسختين وتأكيد الإدخال الصحيح لشريط الاختيار في الموضع المستهدف (A). 5 'و 3' أصبع مقلوب التكرارات الطرفية (ITR) كانت محاطة بالتكرارات المباشرة TTAA. تم تسلسل ثلاث نسخ مستنسخة بعد استئصال الترانسبوزون (B). تم استخدام زوج من Cas9n-sgRNA مع إزاحة 11 bp لإدخال كسر الحمض النووي المزدوج الجديلة. تم إدخال طفرتين محددتين مسبقا (من A إلى G ومن A إلى C) في الجين. تم إدخال طفرة مرادفة واحدة لتحور الشكل المجاور للمسافة الأولية (PAM) ، وأخرى لإنشاء موقع TTAA الضروري لاستئصال الخنزير . الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: توصيف الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات المحررة. مورفولوجيا خطين من الخلايا المحررة والخلايا الأبوية (A) ، شريط المقياس = 100 ميكرومتر. تم فحص التعبير عن علامات الخلايا الجذعية متعددة القدرات NANOG و OCT4 عن طريق التلوين المناعي (B ، شريط المقياس = 50 ميكرومتر) ، بالإضافة إلى SSEA4 و TRA-1-60 عن طريق قياس التدفق الخلوي (C) في خطين من الخلايا المعدلة والخلايا الأبوية. تم استخدام IgG كعنصر تحكم سلبي. تم استخدام DAPI لتلطيخ النواة. تم حساب النسب المئوية كمتوسط لثلاث تجارب مستقلة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Discussion
يمكن استخدام البروتوكول الموصوف هنا لإدخال طفرات نقطية محددة مسبقا في موضع داخلي المنشأ في hPSCs. أثبت الجمع بين ناقل الاستهداف القائم على الخنزير وبلازميدات التعبير CRISPR / Cas9n المزدوجة أنه موثوق وفعال11. بعد تحرير الجينات HNF4α ، تم استهداف 12 من أصل 43 نسخة مستنسخة تم تحليلها بشكل صحيح على النحو الذي يحدده فحص PCR للوصلة. على وجه التحديد ، كانت كفاءة الاستهداف biallelic حوالي 21٪ (9/43) وكانت كفاءة الاستهداف أحادي الأليل حوالي 7٪ (3/43).
بعد تجارب الاستهداف ، من الأهمية بمكان الحفاظ على اختيار البوروميسين للحفاظ على الموضع المستهدف في متناول الخنزير transposase خلال الجولة الأولى من الفحص. سيؤدي ذلك إلى تقليل إسكات شريط اختيار puro-deltaTK الذي يحركه مروج PGK وتقليل الخلفية في الجولة الثانية من الفحص10. أظهر تقرير حديث أن مروج CAG أكثر مقاومة للإسكات من مروج PGK في hPSCs14. وبالتالي فإن تغيير المروج لشريط الاختيار يمكن أن يحسن هذا النظام في المستقبل. من المهم أيضا مقارنة عدد المستعمرات المقاومة من الخلايا المنقولة hyPBase و GFP. عند الإزالة الناجحة للترانسبوزون ، يجب أن يكون هناك المزيد من المستعمرات الباقية من hyPBase- أكثر من الخلايا المنقولة GFP. بالإضافة إلى تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل لاستئصال الترانسبوزون ، يلزم التسلسل المباشر للمنطقة المعدلة لتأكيد دقة الختان.
استنادا إلى استراتيجية ناقل الاستهداف9،10 القائمة على ناقل الحمولة 9،10 من Yusa ، ركزت الإجراءات المفصلة أعلاه على تحسين نواة hPSCs وكفاءة استنساخ الخلية الواحدة. تم تحسين كثافة بذر الخلايا لتقليل احتمالية تكوين مستعمرة غير متجانسة. استخدمنا أيضا استزراع لمدة 10-12 يوما أقل من 10٪ CO2 لتعزيز إنتاج المستعمرة لفحص النمط الوراثي. في تجربتنا ، يمكن الحصول على حوالي 20 مستعمرة من كل لوحة 96 بئر. على الرغم من أن هذه الخطوة قد تستغرق وقتا أطول من الطرق الأخرى ، إلا أنها موثوقة وعالية الكفاءة.
بناء على الحاجة ، يمكن تصميم ناقلات الاستهداف لإدخال أو تصحيح طفرات النقاط ، لإنشاء خطوط خلايا مراسلة ، بالإضافة إلى التعبير الجيني بالضربة القاضية. في الختام ، يعد الجمع بين نظام CRISPR / Cas9 (n) وناقل الاستهداف طريقة فعالة لتقديم أنواع مختلفة من hPSCs المعدلة وراثيا.
Disclosures
DCH هو مؤسس مشارك ومساهم ومدير شركة Stemnovate Limited.
Acknowledgments
نشكر Kosuke Yusa على مشاركة بلازميدات pMCS-AAT_PB-PGKpuroTK و pCMV-hyPBase. نشكر جيا يين يانغ وكارامجيت سينغ دولت على المناقشات المفيدة حول تحرير الجينوم. يتم دعم مختبر DCH بجائزة من مكتب كبير العلماء (TC / 16/37) ومنصة الطب التجديدي في المملكة المتحدة (MR / L022974 / 1). تم دعم YW من خلال منحة دكتوراه ممولة من مجلس المنح الدراسية الصيني وجامعة إدنبرة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Human SSEA4 PE | eBioscience | 12-8843-42 | |
| Anti-Human TRA-1-60 PE | eBioscience | 11-0159-42 | |
| DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| DPBS with calcium and magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14040133 | |
| FIAU | Moravek | M251 | |
| Gentle cell dissociation reagent | Stem Cell Technologies | 07174 | |
| H9 human embryonic stem cells | WiCell | WA09 | |
| Human NANOG antibody | R&D systems | AF1997 | |
| Human OCT4 antibody | Abcam | AB19857 | |
| Human stem cell Nucleofector kit 1 | Lonza | VPH-5012 | |
| Mouse IgG3 isotype control PE | eBioscience | 12-4742-41 | |
| mTeSR1 medium | Stem Cell Technologies | 85850 | |
| Nucleofector 2b device | Lonza | AAB-1001 | |
| pCMV-hyPBase | Wellcome Trust Sanger Institute | N/A | |
| pMCS-AAT_PBPGKpuroTK | Wellcome Trust Sanger Institute | N/A | |
| pSpCas9n(BB)-2A-Puro (PX462) | Addgene | PX462 | |
| Puromycin dihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | A11138-03 | |
| QIAprep spin maxiprep kit | Qiagen | 12162 | |
| QIAprep spin miniprep kit | Qiagen | 27106 | |
| Recombinant laminin 521 | BioLamina | LN521 | |
| Trypan blue solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Y-27632(Dihydrochloride) | Millipore | SCM075 |
References
- Rashidi, H., et al. 3D human liver tissue from pluripotent stem cells displays stable phenotype in vitro and supports compromised liver function in vivo. Archives of Toxicology. 92 (10), 3117-3129 (2018).
- Hockemeyer, D., et al. Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases. Nature Biotechnology. 27 (9), 851-857 (2009).
- Porteus, M. H., Baltimore, D. Chimeric nucleases stimulate gene targeting in human cells. Science. 300 (5620), 763 (2003).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-822 (2012).
- Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-824 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Yusa, K., et al. Targeted gene correction of α1-antitrypsin deficiency in induced pluripotent stem cells. Nature. 478 (7369), 391-394 (2011).
- Yusa, K. Seamless genome editing in human pluripotent stem cells using custom endonuclease-based gene targeting and the piggyBac transposon. Nature Protocols. 8 (10), 2061-2078 (2013).
- Wang, Y., et al. Multiomics Analyses of HNF4α Protein Domain Function during Human Pluripotent Stem Cell Differentiation. iScience. 16, 206-217 (2019).
- Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Wang, Y., et al. Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (121), 1-8 (2017).
- Eggenschwiler, R., et al. Improved bi-allelic modification of a transcriptionally silent locus in patient-derived iPSC by Cas9 nickase. Scientific Reports. 6, 1-14 (2016).
