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Biology

एक स्वचालित इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके आईपीएससी के संगम को मापना।

Published: June 10, 2020 doi: 10.3791/61225
Automatic Translation
1,2, 3, 2, 3, 1, 1
1Genetics and Rare Diseases Research Division, Ospedale Pediatrico Bambino Gesù, IRCCS, 2Department of Science, University Roma Tre, 3Department of Onco-hematology, Gene and Cell Therapy, Ospedale Pediatrico Bambino Gesù, IRCCS

Summary

प्रोटोकॉल का लक्ष्य विभिन्न बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) कोटिंग स्थितियों की तुलना करना है ताकि यह आकलन किया जा सके कि विभेदक कोटिंग प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं (आईपीएससी) की वृद्धि दर को कैसे प्रभावित करती है। विशेष रूप से, हम आईपीएससी संस्कृतियों के इष्टतम विकास को प्राप्त करने के लिए स्थितियां स्थापित करने का लक्ष्य रखते हैं।

Abstract

यह अध्ययन यह समझने पर केंद्रित है कि विभिन्न ईसीएम कोटिंग सब्सट्रेट्स पर बढ़ते आईपीएससी सेल संगम को कैसे प्रभावित कर सकते हैं। वास्तविक समय में आईपीएससी संगम का आकलन करने के लिए एक प्रोटोकॉल स्थापित किया गया है, जिसमें किसी भी विकास गड़बड़ी से बचने के लिए एकल सेल निलंबन में कोशिकाओं की गणना करने की आवश्यकता नहीं है। स्वचालित तरीके से समय के साथ 4 अलग-अलग ईसीएम पर आईपीसीएस संगम का आकलन करने के लिए एक उच्च-सामग्री छवि विश्लेषण प्रणाली का उपयोग किया गया था। अनुयायी आईपीएससी के सेल संगम का आकलन करने के लिए विभिन्न विश्लेषण सेटिंग्स का उपयोग किया गया था और केवल एक मामूली अंतर (लैमिनिन के साथ 24 और 48 घंटे पर) देखा गया है कि क्या 60, 80 या 100% मास्क लगाया गया था। हम यह भी दिखाते हैं कि लैमिनिन मैट्रिगेल, विट्रोनेक्टिन और फाइब्रोनेक्टिन की तुलना में सबसे अच्छा संगम का कारण बनता है।

Introduction

प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) दैहिक कोशिकाओं से प्राप्त किए जाते हैं और उन्हें विभिन्न सेल प्रकारों में विभेदित किया जा सकता है। वे अक्सर रोग रोगजनन को मॉडल करने या दवा स्क्रीनिंग करने के लिए एक प्रणाली के रूप में उपयोग किए जाते हैं, और व्यक्तिगत चिकित्सा के संदर्भ में उपयोग किए जाने की क्षमता भी प्रदान करते हैं। चूंकि आईपीएससी में बड़ी क्षमता है, इसलिए एक विश्वसनीय मॉडल प्रणाली के रूप में उपयोग के लिए उन्हें पूरी तरह से चिह्नित करना महत्वपूर्ण है। हमने पहले हाइपोक्सिक वातावरण में बढ़ते आईपीएससी के महत्व को दिखाया था क्योंकि ये कोशिकाएं ग्लाइकोलाइसिस पर भरोसा करती हैं और एक एरोबिक वातावरण रेडॉक्स असंतुलन का कारण बन सकताहै। आईपीएससी अन्य संस्कृति स्थितियों, विशेष रूप से बाह्य वातावरण के प्रति भी संवेदनशील हैं। संस्कृति की स्थिति का अनुकूलन उन्हें स्वस्थ रखने और प्रसार करने के लिए एक महत्वपूर्ण मुद्दा है। एक स्वस्थ आईपीएससी संस्कृति स्वस्थ विभेदित कोशिकाओं को जन्म देगी जो आम तौर पर विशिष्ट मानव विकारों या सेलुलर प्रक्रियाओं की आणविक, सेलुलर और कार्यात्मक विशेषताओं को समझने के लिए उपयोग किए जाने वाले मॉडल का समापन बिंदु हैं।

इस अध्ययन में, अलग-अलग कुओं में विभिन्न कोटिंग स्थितियों का उपयोग करके आईपीएससी के संगम का परीक्षण करने के लिए एक सरल प्रोटोकॉल का उपयोग किया गया है। आईपीएससी को ठीक से संलग्न करने के लिए मुराइन भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट्स (एमईएफ) की फीडर परत की आवश्यकता होती है, लेकिन आईपीएससी और एमईएफ के सह-अस्तित्व से आरएनए या प्रोटीन निष्कर्षण जैसे विश्लेषण करना मुश्किल हो जाता है क्योंकि कोशिकाओं की दो आबादी मौजूद होती है। फीडर परत से बचने के लिए, बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) से संबंधित विभिन्न प्रोटीनों का उपयोग प्राकृतिक सेल आला को फिर से बनाने और फीडर मुक्त आईपीएससी संस्कृति के लिए किया गया है। विशेष रूप से, मैट्रिगेल एंगेलब्रेथ-होल्म-स्वार्म (ईएचएस) माउस सारकोमा से निकाला गया एक घुलनशील तहखाने झिल्ली तैयारी है, जो बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन (यानी, लैमिनिन, कोलेजन IV, हेपरन सल्फेट प्रोटीओग्लाइकेन्स, एंटैक्टिन / निडोजन, और विकास कारकों) में समृद्ध है। अन्य उपयोग की जाने वाली कोटिंग स्थितियां ईसीएम के निर्माण में ज्ञात प्रासंगिकता के साथ शुद्ध प्रोटीन हैं: लैमिनिन -521 को भ्रूण के आंतरिक कोशिका द्रव्यमान में मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं (एचपीएससी) द्वारा स्रावित किया जाता है और यह जन्म के बाद शरीर में सबसे आम लैमिनिन में से एक है 4,5,6,7,8,9, 10,11; विट्रोनेक्टिन एक क्सीन-मुक्त सेल कल्चर मैट्रिक्स है जो एचपीएससी 12,13,14,15,16 के विकास और भेदभाव का समर्थन करने के लिए जाना जाता है; फाइब्रोनेक्टिन एक ईसीएम प्रोटीन है जो कशेरुक विकास और प्लुरिपोटेंट अवस्था 17,18,19,20,21,22,23,24,25 में भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के लगाव और रखरखाव के लिए महत्वपूर्ण है। चूंकि विभिन्न कोटिंग स्थितियां उपलब्ध हैं, इसलिए हम आईपीएससी के संगम पर उनके प्रभाव के संदर्भ में उनकी तुलना करते हैं।

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Protocol

1. 96 वेल प्लेटों को कोटिंग

नोट: एक ही प्लेट में विभिन्न कोटिंग्स का परीक्षण किया गया था लेकिन अलग-अलग कुओं ( पूरक फ़ाइल देखें)।

  1. DMEM में मैट्रिगेल 1:100 को पतला करें। 96 अच्छी प्लेटों में 100 μL प्रति कुएं जोड़ें और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। इसके बाद, घोल को हटा दें और 100 μL DMEM के साथ कुओं को दो बार धोएं।
  2. पीबीएस (कैल्शियम और मैग्नीशियम के साथ) में पतला लैमिनिन (20 μg / mL, LN-521)। कुएं में 100 μL जोड़ें और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। अगले दिन कोशिकाओं को बीज देने से पहले डीएमईएम के साथ दो धोएँ करें।
  3. तनुकरण बफर में पतला विट्रोनेक्टिन (10 μg / mL)। 96 वेल प्लेट में 100 μL प्रति कुएं जोड़ें और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। कोशिकाओं को चढ़ाने से पहले पीबीएस (कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना) के साथ कुओं को धोएं।
  4. डीडीएच2ओ में एचयू-फाइब्रोनेक्टिन (30 μg / mL) को पतला करें। कुओं में 100 μL जोड़ें और 45 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। इसके बाद, कोशिकाओं को बीज देने से पहले कुओं को माध्यम से धो लें।

2. संस्कृति में आईपीएससी का रखरखाव

नोट: आईपीएससी व्यावसायिक रूप से खरीदे गए थे। आईपीएससी स्वस्थ मानव फाइब्रोब्लास्ट से प्राप्त किए गए थे और एपिसोमल तकनीक का उपयोग करके पुन: प्रोग्राम किए गए थे।

  1. -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर या तरल नाइट्रोजन से, क्रायोसंरक्षित आईपीएससी को 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में पिघलाएं। जैविक सुरक्षा कैबिनेट में ले जाने से पहले 70% इथेनॉल के साथ कोशिकाओं वाली शीशी को साफ करें।
  2. सेल सस्पेंशन को 5 एमएल प्री-वार्म्ड सेल कल्चर मीडिया (जैसे, एमटीईएसआर 1) में 15 एमएल बाँझ शंक्वाकार ट्यूब में 1000 μL पिपेट के साथ ड्रॉप-बाय ड्रॉप जोड़ें।
  3. कमरे के तापमान (आरटी) पर 5 मिनट के लिए 304 x g पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें।
  4. मीडिया को हटा दें और सेल कल्चर माध्यम के 4 एमएल में सेल पेलेट को फिर से निलंबित करें।
  5. सेल सस्पेंशन को 6 वेल प्लेटों के दो कुओं में प्लेट करें (105 आईपीएससी प्रति 6-वेल सेल कल्चर डिश), जहां माउस भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट (एमईएफ) को पहले चढ़ाया गया है। डीएमईएम में 2.4 x10 4/सेमी 2 के घनत्व पर आईपीएससी चढ़ाने से दो दिन पहले बीज एमईएफ (जिसमें 10% भ्रूण बोवाइन सीरम, 1% एल-ग्लूटामाइन और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन शामिल हैं)।
  6. सीडिंग के बाद, रॉक अवरोधक वाई -27632 के 10 μM के साथ सेल मीडिया को पूरक करें।
  7. पहले 4-5 सप्ताह के लिए एमईएफ पर आईपीएससी उगाएं और फिर फीडर मुक्त स्थिति (एमईएफ मुक्त स्थिति) में, एमटीईएसआर 1 में रुचि के कोटिंग (चरण 1 और तालिका 1 देखें) का उपयोग करके।
  8. जब आईपीएससी 70-80% कंफ्लुएंट होते हैं, तो आरटी पर 3-5 मिनट के लिए 0.5 एमएम ईडीटीए उपचार का उपयोग करके 1: 4 को पारित करें। 6 वेल प्लेट (या अन्य प्रकार की प्लेटों के लिए आनुपातिक मात्रा) के लिए 0.5 एमएम ईडीटीए का 1 एमएल जोड़ें। फीडर-मुक्त परिस्थितियों में नए कुओं में स्थानांतरित करें और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2, 20% ओ2 पर इनक्यूबेट करें।
  9. हर दिन ताजा mTeSR1 के साथ मीडिया को बदलें और हर 2 दिनों में कोशिकाओं को विभाजित करें।

3. कोशिका संगम का लक्षण वर्णन

  1. प्रयोगों के लिए 96 अच्छी प्लेटों का उपयोग करें।
  2. फीडर मुक्त स्थिति में कम से कम 1 महीने की खेती के बाद प्रति कुएं बीज 10,000 कोशिकाएं ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि एमईएफ पारित नहीं हुए थे। ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के साथ कोशिकाओं की गणना करने के लिए डिस्पोजेबल गिनती स्लाइड का उपयोग करें।
  3. प्रयोगों को तीन प्रतियों में निष्पादित करें। इसलिए, तीन कुओं में प्रत्येक बीजारोपण की स्थिति का परीक्षण करें।
  4. ब्राइट-फील्ड मोड में साइटोमीटर का उपयोग करके सीडिंग के बाद दिन 1 से स्वचालित छवि अधिग्रहण करें। 5 दिनों के लिए हर 24 घंटे में स्वचालित छवि अधिग्रहण करें। प्रयोगात्मक मापदंडों पर विस्तृत जानकारी के लिए, पूरक फ़ाइल देखें।
  5. कोशिकाओं को बेहतर ढंग से विज़ुअलाइज़ करने के लिए ऑटो-कंट्रास्ट और ऑटो-एक्सपोज़र का उपयोग करें।
  6. कुओं की सीमा पर प्रकाश अपवर्तन के कारण फोकस में परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए, संगम विश्लेषण के लिए विश्लेषण सेटिंग ( पूरक फ़ाइल देखें) सेट करें, ताकि 60%, 80% और 100% प्रति अच्छी तरह से मुखौटा लगाया जा सके। प्रत्येक समय बिंदु पर सेल संगम का विश्लेषण करने के लिए ऊपर उल्लिखित विभिन्न मास्क विश्लेषण सेटिंग का उपयोग करें।

4. सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. माध्य (एसईएम) ± मानक त्रुटि के साधन के रूप में मात्रात्मक परिणामों की रिपोर्ट करें।
  2. विभिन्न कोटिंग स्थितियों के समग्र अंतर की तुलना करने के लिए, एक ही नमूने का उपयोग करके डेटा प्राप्त करें और छात्र के युग्मित-नमूना टी-परीक्षण करें। 0.05 से कम पी मान सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माने जाते हैं, और सभी रिपोर्ट किए गए पी-मान दो तरफा होते हैं।

5. साइटोस्केलेटल माइक्रोफिलामेंट्स का लक्षण वर्णन

  1. आरटी में 10 मिनट के लिए पीबीएस में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (4% पीएफए) के साथ कोशिकाओं को ठीक करें, इसके बाद पीबीएस में दो वॉश (कुल 10 मिनट)।
  2. आरटी पर 1 घंटे के लिए प्रत्येक कुएं में ब्लॉकिंग समाधान का 100 μL (5% बीएसए, पीबीएस में 0.1% ट्राइटन द्वारा निर्मित) जोड़ें।
  3. ब्लॉकिंग समाधान को हटा दें और नमूने को 10 मिनट के लिए पीबीएस के साथ दो बार धोएं।
  4. प्रति नमूने फेलोइडिन-संयुग्म कार्य समाधान के 100 μL जोड़ें और RT पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  5. कोशिकाओं को पीबीएस के साथ दो बार धोएं (आरटी में 10 मिनट)।
  6. होचस्ट 33342 के साथ स्टेन नाभिक आरटी में 10 मिनट के लिए पीबीएस में 1: 10000 पतला होता है।
  7. होचस्ट समाधान को हटा दें और कोशिकाओं को पीबीएस के साथ हर बार 10 मिनट के लिए दो बार धोएं।
  8. नमूने को एच2ओ के साथ धोएं और एक रासायनिक हुड के नीचे सूखने दें।
  9. कोशिकाओं को कवर करने और नमूनों की प्रतिदीप्ति को संरक्षित करने के लिए माउंटिंग मीडिया (यानी पीबीएस: ग्लिसरॉल, 1: 1) के 100 μL जोड़ें।
  10. एक सफेद प्रकाश लेजर (डब्ल्यूएलएल) स्रोत और 405 एनएम डायोड लेजर से लैस लेजर-स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर एक्स / ईएम 493/517 एनएम पर सेल का निरीक्षण करें। HC PLAPO 40x तेल-विसर्जन उद्देश्य का उपयोग करके अनुक्रमिक कॉन्फोकल छवियां प्राप्त करें। सभी जांच किए गए नमूनों के लिए एक ही लेजर पावर, बीम स्प्लिटर्स, फिल्टर सेटिंग्स, पिनहोल व्यास और स्कैन मोड का उपयोग करें।

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Representative Results

इस अध्ययन में, हमने विभिन्न कोटिंग स्थितियों पर उगाए जाने पर आईपीएससी संगम की जांच की। साइटोमीटर का उपयोग करके, हम 5 दिनों में तीन प्रतियों में आसानी से सूचनात्मक परिणाम प्राप्त करने में सक्षम थे। चूंकि आईपीएससी शायद ही प्लास्टिक के जहाजों से जुड़ते हैं और उनके प्रसार का समर्थन करने के लिए एक कोटिंग आवश्यक है, इसलिए हमने मानव आईपीएससी के संगम की निगरानी करने का फैसला किया क्योंकि यह सेल संस्कृति के स्वास्थ्य का संकेत है और यह उनकी भेदभाव क्षमता को प्रतिबिंबित कर सकता है। इन विट्रो विस्तार के बाद, हमने विभिन्न ईसीएम सब्सट्रेट्स पर आईपीएससी को बीज दिया और कोशिकाओं का विश्लेषण उज्ज्वल-क्षेत्र में प्राप्त नमूना छवियों के अवलोकन द्वारा और नलोइडिन धुंधलापन (एक्टिन फिलामेंट्स, जिसे एफ-एक्टिन के रूप में भी जाना जाता है) का उपयोग करके किया ताकि वाहिकाओं के लिए उनके आसंजन को समझा जा सके (चित्रा 1)। वास्तव में, फेलोइडिन धुंधला पोत की सतह पर सेल आसंजन की डिग्री के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है और इसलिए पोत के लिए उपयोग की जाने वाली विशिष्ट कोटिंग के लिए। कोटिंग के अनुयायी कोशिकाओं ने ध्वस्त माइक्रोफिलामेंट्स के बजाय स्पष्ट रूप से दिखाई देने वाले साइटोस्केलेटल माइक्रोफिलामेंट्स दिखाए। फेलोइडिन धुंधला होने के साथ संयोजन में ब्राइटफील्ड का अवलोकन लेपित सतह पर आईपीएससी के आसंजन के अच्छे स्तर का दस्तावेजीकरण करता है।

संगम की जांच करने के लिए, हमने आईपीएससी को मैट्रिगेल, एलएन -521, विट्रोनेक्टिन और हू-फाइब्रोनेक्टिन के साथ तीन प्रतियों में बीज दिया, और तीन बार प्रयोग किया। कुएं के किनारे के कारण प्रकाश अपवर्तन से बचने के लिए, हमने 60, 80 और 100% के मुखौटे के साथ तीन प्रकार की विश्लेषण सेटिंग लागू की, और देखा कि वे कोशिकाओं को चुनने और पृष्ठभूमि से बचने में समान हैं (चित्रा 2)। प्राप्त परिणामों से पता चलता है कि एलएन -521 पर बीजित आईपीएससी समय के दौरान रैखिक फैशन में सेल प्रसार की उच्च दर दिखाते हैं, इसकी तुलना अन्य कोटिंग्स के साथ करते हैं और ये अंतर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण हैं ( चित्रा 3ए-सी में तारांकन)। मैट्रिगेल, विट्रोनेक्टिन या हू-फाइब्रोनेक्टिन पर बीजित कोशिकाएं पहले 96 घंटों में एक रैखिक प्रसार दर दिखाती हैं, लेकिन वे पिछले 24 घंटों में संगम वक्र की बढ़ी हुई ढलान भी दिखाती हैं (उपयोग किए गए मास्क से स्वतंत्र रूप से, 60%, 80% या 100%, चित्रा 3ए-सी)। चूंकि विभिन्न कोटिंग्स के लिए 24 घंटे पर प्रारंभिक अंतर सेल अटैचमेंट में अंतर के कारण हो सकता है, इसलिए सेल वृद्धि को बाद के समय बिंदुओं (48 से 120 घंटे तक) के लिए 24 घंटे तक सामान्यीकृत किया गया है (चित्रा 3डी-एफ)। 60, 80 और 100% मास्क का उपयोग करके प्राप्त ग्राफ से पता चलता है कि विभिन्न कोटिंग्स के बीच संगम के संदर्भ में कोई अंतर मौजूद नहीं है और एलएन -521 के साथ देखे गए अंतर संभवतः पारित होने पर इस कोटिंग का पालन करने के लिए आईपीएससी की बढ़ी हुई क्षमता के कारण हैं।

Figure 1
चित्र 1. 3 दिनों के बाद विभिन्न ईसीएम कोटिंग्स पर बीजित आईपीएससी के प्रतिनिधि उज्ज्वल-क्षेत्र चित्र और फैलोइडिन धुंधला होना। उज्ज्वल-क्षेत्र छवियां दिखाती हैं कि कोशिकाएं उपयोग की जाने वाली कोटिंग पर स्वस्थ हैं और वे वाहिकाओं से अच्छी तरह से जुड़ी हुई हैं जैसा कि फेलोइडिन स्टेनिंग द्वारा प्रलेखित है जो स्पष्ट रूप से दिखाई देने वाले साइटोस्केलेटल माइक्रोफिलामेंट्स दिखा रहा है। स्केल पट्टी: 25 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2. संगम विश्लेषण करने के लिए उपयोग किए जाने वाले मास्क के लिए तीन अलग-अलग विश्लेषण सेटिंग दिखाने वाली प्रतिनिधि उज्ज्वल-क्षेत्र छवियां। मोज़ेक ने उज्ज्वल-क्षेत्र छवियों (96 वेल प्लेट से 16 छवियां / कुआं) का उपयोग करके साइटोमीटर के साथ प्राप्त किया। हरे रंग में विश्लेषण विभाजन स्पष्ट रूप से कुएं के गोल किनारे से बचने या शामिल करने के लिए लगाए गए विभिन्न मास्क (60, 80 100%) को प्रदर्शित करता है। स्केल पट्टी: 500 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3. अलग-अलग लेपित जहाजों पर बीजित आईपीएससी का सेल संगम विश्लेषण। अलग-अलग लेपित जहाजों पर बीजित आईपीएससी के सेल संगम का प्रतिनिधित्व करने वाला ग्राफ। 5 दिनों (120 घंटे) के लिए (ए) 60% मास्क (बी) 80% (सी) 100% का उपयोग करके उपयुक्त सॉफ्टवेयर के साथ अधिग्रहण के बाद डेटा का विश्लेषण किया गया था। 48 घंटे से 120 घंटे के समय बिंदुओं के संगम का सामान्यीकरण पहले समय बिंदु (24 घंटे) में दिखाया गया है (डी, ई, एफ)। डेटा तीन स्वतंत्र प्रयोगों से प्राप्त किया गया था। डेटा को SEM. n = 3 * p<0.05 के माध्य ± रूप में दर्शाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

कोटिंग यौगिक प्रारंभिक एकाग्रता अंतिम एकाग्रता
एचयू-फाइब्रोनेक्टिन 1 mg/mL 10 μg/cm2
लैमिनिन 521 100 μg/ml 20 μg/mL
Matrigel * 0.111111111
विट्रोनेक्टिन एक्सएफ 250 μg/ 10 μg/mL

तालिका 1. संगम का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किए जाने वाले कोटिंग यौगिकों की सूची। उपयोग किए गए विभिन्न कोटिंग्स के नाम, प्रारंभिक और अंतिम एकाग्रता की सूचना दी जाती है। * बैच के आधार पर मैट्रिगेल की प्रारंभिक एकाग्रता परिवर्तनशील है।

पूरक फ़ाइल. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

रोग मॉडलिंग और भविष्य की दवा स्क्रीनिंग के लिए आईपीएससी का उपयोग सटीक चिकित्सा में उनके संभावित अनुप्रयोग के साथ मिलकर इसे बहुत प्रासंगिकता की तकनीक बनाता है और इस कारण से हम मानते हैं कि इन विट्रो संवर्धन स्थिति को स्पष्ट रूप से समझना आवश्यक है जो भ्रूण स्टेम कोशिकाओं की शारीरिक स्थिति से बेहतर मिलता जुलता है। इस संदर्भ में, हमने उन स्थितियों को समझने के लिए जंगली प्रकार के आईपीएससी का उपयोग करके विभिन्न ईसीएम कोटिंग्स का परीक्षण किया जो कोशिकाओं को स्वस्थ और उदासीन स्थिति में रहने की अनुमति देते हैं। इसके अलावा, एक महत्वपूर्ण बिंदु एमईएफ और मैट्रिगेल के ज़ेनोजेनिक घटकों में आईपीएससी की खेती है जो तीन प्रतियों के बीच प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता के लिए जिम्मेदार हो सकता है और यह यंत्रवत अध्ययन करने की क्षमता में बाधा डालताहै।

इस अध्ययन में, हमने एक उच्च सामग्री छवि विश्लेषक साइटोमीटर का उपयोग करके ज़ेनोजेनिक-मुक्त सब्सट्रेट्स (यानी, एलएन -521, विट्रोनेक्टिन, हू-फाइब्रोनेक्टिन) पर आईपीएससी के संगम का परीक्षण किया। स्वचालित छवि-विश्लेषण प्रणाली का उपयोग करने का कारण इस तथ्य के कारण है कि ट्राइपैन ब्लू बहिष्करण विधि का उपयोग करके कोशिकाओं की गिनती करने के लिए एकल सेल निलंबन बनाने की आवश्यकता होगी और आईपीएससी में हेरफेर करते समय इसकी सिफारिश नहीं की जाती है क्योंकि उन्हें सेल मृत्यु से बचने के लिए सेल क्लस्टर में प्रचारित किया जाना चाहिए। उच्च-सामग्री छवि-विश्लेषण के साथ प्राप्त डेटा हमें कोशिकाओं को परेशान किए बिना सेल संगम का पालन करने की अनुमति देता है क्योंकि वे केवल 5 दिनों के लिए हर दिन चित्रित होते हैं। इस तकनीक को आईपीएससी लाइनों को चिह्नित करने के लिए चुनाव विधि के रूप में माना जा सकता है और इसे मानव आईपीएससी के गुणवत्ता नियंत्रण पैनलों को करने के लिए शामिल किया जा सकता है। जबकि हमने एक वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर पैकेज का उपयोग किया, यहां वर्णित पद्धति का उपयोग समकक्ष उच्च-सामग्री / उच्च-थ्रूपुट छवि विश्लेषण प्लेटफार्मों और समान विश्लेषणात्मक सॉफ़्टवेयर पैकेजों के माध्यम से सफलतापूर्वक किया जा सकता है। प्राप्त आंकड़ों से पता चलता है कि एलएन -521 पर बीजित आईपीएससी कोशिकाओं को विभाजित किए बिना संस्कृति में 5 दिनों के दौरान एक रैखिक संगम प्रस्तुत करते हैं और इसलिए इस अध्ययन में परीक्षण किया गया सबसे अच्छा ज़ेनोजेनिक-मुक्त सब्सट्रेट है। इस प्रोटोकॉल की एक सीमा यह है कि प्राप्त परिणामों को विभिन्न सब्सट्रेट्स के लिए आईपीएससी लगाव में अंतर पर विचार करने के लिए पहली बार सामान्यीकृत करने की आवश्यकता है। दिलचस्प बात यह है कि प्राप्त डेटा संभवतः एलएन -521 के लिए आईपीएससी की बढ़ी हुई सेल अटैचमेंट दर से प्रेरित हैं। वास्तव में, पहली बार परिणामों को सामान्य करते समय, विभिन्न सब्सट्रेट्स के बीच कोई अंतर नहीं देखा जाता है।

अध्ययन के साथ प्राप्त परिणामों के आधार पर, प्रमुख सेल सतह रिसेप्टर्स को जानने के संदर्भ में प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं के जीव विज्ञान को बेहतर ढंग से समझना दिलचस्प होगा जो सेल-ईसीएम संपर्कों को मध्यस्थ करते हैं और जो विशिष्ट सेल प्रकारों में सहज भेदभाव के बजाय उनकी आत्म-नवीकरण क्षमता के रखरखाव के लिए जिम्मेदार हो सकते हैं। दिलचस्प बात यह है कि ऐसे अध्ययन हैं जो दिखाते हैं कि संस्कृति की सतह की मैट्रिक्स लोच ने विभिन्न सेल प्रकारों की ओर भेदभाव को प्रभावित किया और यह संभवतः सेल-ईसीएम इंटरैक्शन पर निर्भर है जो सेल-प्रकार विशिष्ट भेदभाव 27 के लिए प्रासंगिक कुछ इंट्रासेल्युलर सेल-सिग्नलिंग मार्ग को सक्रियकरता है। इसके अलावा, विजिलेंट एट अल .28 ने जीन अभिव्यक्ति और सेल जीवविज्ञान डेटासेट के साथ कम्प्यूटेशनल दृष्टिकोण के संयोजन से आईपीएससी व्यवहार में परिवर्तन के लिए आनुवंशिक योगदान का पता लगाया। इसलिए, विजिलेंट एट अल .28 का काम आनुवंशिक भिन्नता को फेनोटाइपिक भिन्नता के लिए मैप करने के प्रयास में एक बड़ी प्रगति है। इन अध्ययनों से क्लीनिकों में उनके भविष्य के संभावित उपयोग के प्रकाश में आईपीएससी प्रयोगों को करने के लिए उपयोग किए जाने वाले मानकीकृत तरीकों का विकास हो सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

अध्ययन को फोंडाज़ियोन बाम्बिनो गेसो और राइसर्का कोरेन्टे (इतालवी स्वास्थ्य मंत्रालय) से सीसी को अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।  हम डॉ एनरिको बर्टिनी (न्यूरोसाइंस विभाग, न्यूरोमस्कुलर और न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों की इकाई, आणविक चिकित्सा प्रयोगशाला, बैम्बिनो गेसो चिल्ड्रन रिसर्च हॉस्पिटल), डॉ स्टेफानिया पेट्रिनी (कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी कोर सुविधा, अनुसंधान प्रयोगशालाएं, बैम्बिनो गेसो चिल्ड्रन रिसर्च हॉस्पिटल), गिउलिया पेरिकोली (ऑन्को-हेमेटोलॉजी विभाग, जीन और सेल थेरेपी विभाग, बच्चों के अनुसंधान अस्पताल बैम्बिनो गेसो) को धन्यवाद देना चाहते हैं। और रॉबर्टा फेरेटी (ऑन्को-हेमेटोलॉजी, जीन और सेल थेरेपी विभाग, बच्चों के अनुसंधान अस्पताल बैम्बिनो गेसो) वैज्ञानिक चर्चा और तकनीकी सहायता के लिए। मारिया विंची "कैंसर यूके फैलोशिप के साथ बच्चों" की प्राप्तकर्ता हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile Corning 4488 Tool
15 mL high-clarity polypropylene (PP) conical centrifuge tubes Falcon 352097 Tool
1x PBS (With Ca2+; Mg2+) Thermofisher 14040133 Medium
1x PBS (without Ca2+; Mg2+) Euroclone ECB4004L Medium
5 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile Corning 4487 Tool
Cell culture microplate, 96 WELL, PS, F-Bottom Greiner Bio One 655090 Support
Cell culture plate, 6 well Costar 3516 Support
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium- high glucose) Sigma D5671 Medium
EDTA Sigma ED4SS-500g Reagent
Epi Episomal iPSC Reprogramming Kit Invitrogen A15960 Reagent
FAST - READ 102 Biosigma BVS100 Tool
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 10270106 Medium
Fibronectin Merck FC010 Coating
Glycerol Sigma G5516 Reagent
H2O MILLIQ
Hoechst Thermofisher 33342 Reagent
Laminin 521 Stem Cell Technologies 77003 Coating
L-Glutamine (200 mM) Gibco LS25030081 Reagent
Matrigel Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix 354277 Coating
Mouse embryonic fibroblasts (MEF) Life Technologies A24903 Coating
MTESR1 Medium Stem Cell Technologies 85851 Medium
MTESR1 Supplement Stem Cell Technologies 85852 Medium
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140122 Reagent
Phalloidin Sigma P1951 Reagent
Vitronectin Stem Cell Technologies 7180 Coating
Y-27632 Sigma Y0503 Reagent

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References

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Magliocca, V., Vinci, M., Persichini, T., Locatelli, F., Tartaglia, M., Compagnucci, C. Measuring the Confluence of iPSCs Using an Automated Imaging System. J. Vis. Exp. (160), e61225, doi:10.3791/61225 (2020).

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