Summary
En protokoll for å studere biologisk vev ved høy romlig oppløsning ved hjelp av ultrahøy feltmagnetisk resonansmikroskopi (MRM) ved hjelp av mikrokyler presenteres. Trinnvise instruksjoner er gitt for å karakterisere mikrospolene. Til slutt demonstreres optimalisering av bildebehandling på planterøtter.
Abstract
Denne protokollen beskriver et signal-til-støy-forhold (SNR) kalibrering og prøveforberedelsesmetode for magnetal mikrokyler kombinert med biologiske prøver, designet for høyoppløselig magnetisk resonansavbildning (MR), også referert til som MR-mikroskopi (MRM). Den kan brukes ved prekliniske MR-spektrometre, demonstrert på Medicago avkortularotprøver . Mikrokyler øker følsomheten ved å matche størrelsen på RF-resonatoren til størrelsen på utvalget av interesse, og dermed muliggjør høyere bildeoppløsninger i en gitt datainnsamlingstid. På grunn av den relativt enkle designen er magnetiske mikrokyler enkle og billige å konstruere og kan enkelt tilpasses prøvekravene. Systematisk forklarer vi hvordan vi kalibrerer nye eller hjemmebygde mikrokyler ved hjelp av en referanseløsning. Kalibreringstrinnene inkluderer: pulskraftbestemmelse ved hjelp av en nøttekurve; estimering av RF-felt homogenitet; og beregne et volum-normalisert signal-til-støy-forhold (SNR) ved hjelp av standard pulssekvenser. Viktige trinn i prøveforberedelsen for små biologiske prøver diskuteres, samt mulige begrensende faktorer som magnetiske følsomhetsforskjeller. Anvendelsene av en optimalisert solenoid spole er demonstrert ved høy oppløsning (13 x 13 x 13 μm3, 2,2 pL) 3D-avbildning av en rotprøve.
Introduction
Magnetisk resonansavbildning er et allsidig verktøy for å ikkeinvasivt bilde et bredt utvalg av biologiske prøver, alt fra mennesker tilenkeltceller 1,2,3. Mens MR-skannere for medisinske bildebehandlingsprogrammer vanligvis bruker magneter med en feltstyrke på 1,5 T til 3 T, blir enkeltcelleapplikasjoner avbildet ved mye høyere feltstyrker1,3,4. Studien av prøver ved oppløsninger under hundre mikrometer kalles magnetisk resonansmikroskopi (MRM)5. MRM lider imidlertid av et lavt signal-til-støy-forhold (SNR) sammenlignet med andre tilgjengelige mikroskopi- eller bildeteknikker (f.eks. optisk mikroskopi eller CT). Flere tilnærminger kan forfølges for å optimalisere SNR6. En tilnærming er å bruke en høyere magnetfeltstyrke, mens en komplementær tilnærming er å optimalisere signaldetektoren for individuelle prøver. For sistnevnte bør dimensjonene på detektoren justeres for å matche dimensjonene til utvalget av interesse. For små prøver som er ≈0,5-2 mm i diameter (f.eks. rotvev), mikrospoler er nyttige som SNR er omvendt proporsjonal med spolediameteren6,7. Oppløsninger så høyt som 7,8 x 7,8 x 15 μm3 har blitt oppnådd på dyreceller ved hjelp av dedikertemikrokyler 8. En rekke mikrospoletyper finnes, med planar og magnetspoler som oftest brukes, avhengig av påføring og vevgeometri9. Planar spoler har høy følsomhet nær overflaten, noe som er nyttig for applikasjoner på tynne skiver. For eksempel har en metode designet spesielt for avbildning av perfused vev blitt beskrevet for planar mikrospoler10. Planarspoler har imidlertid en høy falloff av følsomhet og ingen veldefinert referansepulskraft. Solenoid spoler, som er sylindriske, har et bredere bruksområde og er mer favorisert for tykkere prøver. Her beskriver vi egenskapene til solenoidspolen, en protokoll for å forberede prøver for mikrospole MR, samt kalibreringen av en solenoid mikrospole (figur 1A).
Den magnetspolen består av en ledende ledning kveilet, som en korketrekker, rundt en kapillær som holder prøven (figur 1B). Mikrospoleenheter kan konstrueres ved hjelp av bare emaljert kobbertråd, et utvalg av kondensatorer og en egnet base for lodde av komponentene (figur 1B). De viktigste fordelene er enkelheten og lave kostnader, kombinert med gode ytelsesegenskaper når det gjelder SNR per enhetsvolum og B1-felthomogenitet. Den enkle konstruksjonen muliggjør rask iterasjon av spoledesign og geometrier. De spesifikke kravene til solenoid mikrospole design og sonde karakterisering (det vil, teorien om elektronikk, arbeidsbenk målinger, og spektrometer målinger for en rekke spole geometrier) har blitt beskrevet mye andresteder 7,11,12,13,14.
En solenoid spole kan bygges ved å huske designregler for de ønskede dimensjonene i henhold til retningslinjene beskrevet andresteder 15,16. I dette spesifikke tilfellet ble en spole brukt med en indre diameter på 1,5 mm, laget av emaljert kobbertråd, 0, 4 mm i diameter, loopet rundt en kapillær på 1,5 mm ytre diameter. Denne magneten holdes på en bunnplate der en krets er laget, bestående av en tuning kondensator (2,5 pF), en variabel matchende kondensator (1,5-6 pF) samt kobber tilkoblingsledninger (figur 1A, 1C). Tuning kondensatoren er valgt for å oppnå ønsket resonansfrekvens på 950 MHz, mens den matchende kondensatoren er valgt for å oppnå maksimal signaloverføring med en impedans på 50 Ohm. Den større kondensatoren er variabel for å tillate finere justering. I vanlig drift utføres justering og matching ved hjelp av kondensatorer i probebasen. Den monterte mikrospolen må monteres på en sonde slik at den kan settes inn i magneten. En ekstra holder kan være nødvendig, avhengig av systemet. Her bruker vi en 22,3 T magnetkombinasjon med en Bruker Console Avance III HD i kombinasjon med en Micro5-sonde. I dette tilfellet brukte vi en modifisert støtteinnsats utstyrt med de nødvendige tilkoblingene for å koble til 1H-kanalen til sonden (figur 1A).
Den mottakelighetstilpassede utformingen av spolen inkluderer et reservoar med perfluorinert væske for å redusere følsomhetskonflikter, som oppstår som følge av at kobberspolen er i nærheten avprøven 17. Et reservoar ble laget av en plastsprøyte for å omslutte spolen og fylt med fomblin. Etter hvert som den perfluorerte væsken må omslutte spolen, reduseres den tilgjengelige diameteren for en prøve til en ytre diameter på 1 mm. For enkel prøveendring ble prøven tilberedt i en kapillær med en ytre diameter på 1 mm og en indre diameter på 700 μm. De nødvendige verktøyene for prøveklargjøring er vist i figur 2A.
Grunnleggende eksperimentelle MR-parametere er svært avhengig av maskinvaren i systemet som brukes, inkludert gradientsystem, feltstyrke og konsoll. Flere parametere kan brukes til å beskrive systemytelsen, hvorav 90° pulslengde og effekt, B1-homogenitet og SNR per enhetsvolum (SNR/ mm3),er de mest praktisk relevante. SNR/mm3 er nyttig for å sammenligne ytelsen til forskjellige spoler på samme system18. Selv om maskinvareforskjeller på tvers av systemer kan eksistere, forenkler den ensartede anvendelsen av en benchmarking-protokoll også sammenligningen av systemytelsen.
Denne protokollen fokuserer på kalibrering og prøveklargjøring. Den trinnvise karakteriseringen av ytelsen til solenoide mikrokyler er vist: kalibrere 90° pulslengde eller effekt; vurdere RF-feltet homogenitet; og beregning av SNR per enhetsvolum (SNR/mm3). En standardisert spin-ekko måling ved hjelp av et fantom er beskrevet for å lette en sammenligning av spole design, noe som gjør det mulig for optimalisering av forskjellige applikasjoner. Phantom og biologiske prøveprøvepreparater, spesifikke for mikrospoler, er beskrevet. Protokollen kan implementeres på en egnet smal boring (≤60 mm) vertikal magnet utstyrt med et kommersielt tilgjengelig mikroimagingssystem. For andre systemer kan den fungere som en retningslinje og kan brukes med noen justeringer.
Biologisk prøveforberedelse for MR-målinger er vanligvis ikke veldig omfattende siden prøven er avbildet så intakt som mulig. Luftrom i biologisk vev kan imidlertid forårsake bildeartefakter på grunn av forskjeller i magnetiskmottakelighet 19. Effekten øker med økende magnetfeltstyrke20. Dermed bør luftrommene unngås ved høye feltstyrker, og dette kan kreve nedsenking av prøven i en væske for å unngå luft rundt vevet og fjerning av luftrom i vevsstrukturene. Spesielt når mikrospoler er ansatt, kan det være nødvendig med utskjæring av ønsket prøvevev, etterfulgt av å senke det ned i en passende væske. Dette etterfølges av innsetting av prøven i en forhåndskuttet kapillær, og til slutt forsegle kapillær med kapillærvoks. Bruk av voks som tetningsmasse i stedet for lim, flammeforsegling eller alternativer, betyr at prøven lett kan ekstraheres. Denne prosedyren er demonstrert på roten av Medicago truncatula, en liten belgfrukter plante. En fordel med denne protokollen er potensialet for påfølgende samtidig registrering av MR-data med optisk mikroskopi, siden prøven ikke ødelegges under MR-målingen.
Den presenterte protokollen er egnet for høy romlig oppløsning i situ målinger, og mer forseggjorte design kan tillate bildebehandling in vivo prøver, der utfordringer knyttet til livet støttesystemer må løses.
Protocol
MERK: Denne protokollen beskriver prosedyrer for bruk og evaluering av spoleegenskaper for en 1,5 mm indre diameter (ID) solenoid spole (figur 1). Spolen som brukes til å demonstrere protokollen ligger i et mottakelighetsmatchende reservoar, men protokollen gjelder like mye for uovertruffen spoler. Protokollen kan tilpasses andre størrelser og forskjellige spektrometeroppsett.
1. Referanse prøve forberedelse
- For å forberede 100 ml følsomhetsreferanseløsning, oppløs 156,4 mg CuSO4 ∙ 5 H2O i 80 ml D2O som finnes i en 100 ml GL45 kolbe. Kobbersulfatet reduserer både T1 og T2 avslapningstid, noe som gir raskere målinger, mens D2O forhindrer strålingsdemping og metningseffekter. Rør manuelt til faste stoffer er fullstendig oppløst.
- Juster volumet til 100 ml ved hjelp av deionisert vann for en endelig konsentrasjon på 1 g/L CuSO4 (vannfri, 6,3 mM). Denne konsentrasjonen er tilstrekkelig til å forkorte T1 og T2 avslapning, men ikke for høy til å bli påvirket av nedbør. Forsegle referanseprøven for å unngå endring av forholdet mellom H2O: D2O.
- Eventuelt koble sonden til en nettverksanalysator, for å teste om spolen resonerer på ønsket resonansfrekvens. Utfør en S11-reflektortest for å måle frekvensområdet som oppnås ved å justere og for Q-faktormålinger som beskrevet i detalj av Haase et al.14. Koble mikrospolen til nettverksanalysatoren ved hjelp av en koaksialkabel. Bruk om nødvendig en BNC-adapterkabel.
- Sett senterfrekvensen på nettverksanalysatoren til ønsket resonansfrekvens, avhengig av den tiltenkte magnetfeltstyrken som spolen er utformet for. Deretter setter du feiebredden til 10 MHz. Juster den variable kondensatoren på mikrospoleenheten, hvis den finnes, til finjustere reflektordippen til ønsket frekvens.
- Registrer reflektorinivået ved senterfrekvensen og frekvensen f1 og f2 på -7 dB-nivå. Bruk disse til å beregne Q-faktoren på -7 dB-nivå i henhold til Haase et al.14
2. Prøve forberedelse
- Hvis du klargjør en referanseprøve for spolekalibrering, må du overføre 1 ml CuSO4-løsning til en klokkeglassrett under et stereomikroskop.
- Hvis du forbereder en biologisk prøve, overfører du 1 ml perfluorodekalin (PFD) til et klokkeglass under et stereomikroskop, som vil bli brukt til å senke prøven. PFD brukes som det kan fylle luftrom i prøven, uten å komme inn biologiske celler. Det er heller ikke observerbart av proton MR. Dekk umiddelbart urglasset med et petriskållokk for å forhindre fordampningstap, før PFD er nødvendig.
MERK: PFD er svært flyktig og en potent langsiktig klimagass21. Når dens oksygenoppløsende egenskaper og dens lave viskositet ikke er nødvendig, kan det erstattes med Fomblin, en perfluorether som heller ikke gir noe observerbart 1H-signal, men som ikke fordamper så raskt17. - Skjær kapilbær med egnet ytre diameter til størrelse, slik at den passer inn i diameteren på mikrospoleholderen (18 mm) og la det være mulig å flytte (figur 1C). Bruk en keramisk kutter for å gjøre et snitt hver 10-12 mm og bryte forsiktig på snittet punktet.
- Hvis du forbereder en referanseprøve, bruk pinsett og stereomikroskopet for å bringe en forhåndskuttet kapillær i kontakt med overflaten av CuSO4-løsningen inne i klokkeglasset, slik at kapillærhandling kan fylle kapillæren.
- Hvis du forbereder en biologisk prøve, bruk pinsett og et stereomikroskop, for å bringe en pre-cut kapillær i kontakt med overflaten av PFD inne i klokkeglasset, slik at kapillær handling for å fylle kapillæren fullt ut. Slipp kapillæren i klokkeglasset slik at det blir helt nedsenket.
- Trekk forsiktig ut et fem uker gammelt hele rotsystem fra vekstsubstratet, for eksempel en perlittjorderstatning. Rengjør rotprøven omhyggelig av rhizosheath. Fjern store jordpartikler ved hjelp av pinsett, og hvis mindre partikler er tilstede, fjern dem ved å vaske rotsystemet med destillert vann. Fotografi om nødvendig for fremtidig referanse. Velg og avgiftsdirektoratet en liten del av fibrøst rot fri for rhizosheath ved hjelp av en skalpell.
- For vakuumbehandling, plasser prøven i et 1,5 ml rør som inneholder en passende fikserende løsning. La rørhetten være av, og forsegle deretter røret med parafilm for å forsegle åpningen av røret. Deretter slår hull i filmen med et skarpt verktøy for å tillate ventilasjon av røret.
- Plasser prøverøret i et vakuumkammer, forsegle kammeret og koble en lab membran vakuumpumpe til kammeret. Utyd prøven for vakuumbehandling i opptil 30 minutter, for å redusere tilstedeværelsen av luftlommer i biologiske prøver. Stopp vakuumbehandlingen når det ikke blir sett luftbobler som rømmer fra prøven.
- Mens du ser gjennom et stereomikroskop, bruk pinsett for å senke prøven i infiltrasjonsmediet som er forberedt tidligere. Vask prøven av potensielle rusk.
- Sett prøven inn i kapillæren ved hjelp av pinsett, mens både kapillæren og prøven er helt nedsenket for å unngå inkludering av luftbobler. Bruk en mindre kapillær- eller sprøytepinnespiss som skyvestang (figur 2B).
- Ta prøvekapillæren fra det mellomstore klokkeglasset ved hjelp av pinsett. Når det gjelder PFD, dekk petriskållokket.
- Form vevspapiret til et fint punkt og bruk det til å fjerne ca. 1 mm væske fra begge ender av kapillæren.
- Smelt et lite volum kapillærvoks ved hjelp av en vokspenn. Påfør voks på begge sider. Voksen vil bli ugjennomsiktig når den stivner. Vær forsiktig med å utelukke luftbobler fra kapillæren (figur 2C).
MERK: Unngå overoppheting av voks eller kapillær, da dette kan føre til eksplosivkoking samt kavitasjonslommer når den ferdige prøven avkjøles. - Etterpå skraper du av overflødig voks fra utsiden av kapillæren ved hjelp av en skalpell og tørk av med fint vevpapir.
3. Montere prøven
- Plasser en mikrospole under stereomikroskopet og sett inn prøven ved hjelp av pinsett samtidig som mikrospolen holder mikrospolen stødig (figur 2D).
- Bruk en stang til å sentrere prøven i mikrospolen, ved å skyve kapillæren inne i solenoidspolen.
- Eventuelt påfør tape for å fikse posisjonen til kapillæren.
- Inspiser kapillæren for å sikre at ingen luftbobler er synlige inne i magnetspolen, for å unngå MR-signalødeleggelse forårsaket av følsomhetsforskjeller.
- Fest mikrospolen til kontakten på probebasen, samtidig som mikrospolen er stående (figur 3A,3B).
- Skyv forsiktig de treaksegradientspolene over mikrospolen mens de matcher vannkjølingskontaktene på gradienten til probebasen (figur 3C). Vri skruegjengen på probebasen for å fikse graderingen på plass.
MERK: Dette trinnet gjelder bare for en Micro5-sonde. Når det gjelder andre systemer som Micro2.5 eller Biospect, er gradientene på en egen stikkontakt enn spolen.
4. Bestemme spoleegenskaper
- Hvis spolen testes for første gang, kan du bruke referanseprøveløsningen til å lage en homogen prøve, som er nyttig for effektkalibrering og B1 homogenitetstester. Potensielle følsomhetsproblemer på grunn av spoleledningene kan testes enkelt med denne referanseprøven.
- Sett sonden inn i magneten og koble til de nødvendige kablene: RF-sende-/mottakskabel, vannkjøleledninger, termoelementkabel og luftkjølelinje.
- Still inn ønsket vannkjølingstemperatur (anbefalt 298 K) for vannkjøleenheten.
- Still inn måltemperaturen (298 K) og målgassstrømmen (300 l/t). Gassstrømmen kan være forskjellig for en annen spoledesign eller prøvevolum. Dette gjelder bare systemer med et temperaturkontrollsystem.
MERK: De neste trinnene er bare nødvendige når du tester nye (hjemmebygde) spoler. - Koble sonden ved hjelp av en 50 Ω-co-aksial kabel til en nettverksanalysator med en passende bred feiebredde (400 MHz), sentrert på den tiltenkte resonansfrekvensen.
- Vær oppmerksom på resonansmodiene ved å justere de variable matchende og tuning kondensatorene som finnes i probebasen.
- Still inn og match resonansmodusen til ønsket frekvens.
- Du kan eventuelt bestemme spolekvalitetsfaktoren (Q-faktor) på nettverksanalysatoren. En metode for å oppnå kvalitetsfaktoren er å bruke et koblingsnettverk og dele senterfrekvensen (fc) med bredden på refleksjonsdyppen ved -7 dB (det vil si Q = fc /(f1 - f2)14. Sett fc på magnetens driftsfrekvens, mens f1 og f2 er satt til henholdsvis -7 dB-punktet til venstre og høyre for f c. Noen nettverksanalysatorer har Q-faktor bestemmelse innebygd.
- Start en refleksjonstest på skanneren, vanligvis kalt en wobble kurve, og juster tuning og matching etter behov. Det anbefales å sette noen tuning og matchende kondensatorer til midtpunktet i sitt utvalg for nye spoler. Derfor starter du med en høy spektral feiebredde. I noen tilfeller kan det være mer praktisk å stille inn og matche spolen utenfor magneten på en nettverksanalysator.
- Velg en shimfil for den største volumspolen i bildeproben hvis den er tilgjengelig. Hvis du starter fra en spole som har blitt brukt tidligere, kan du bruke en tilgjengelig shim-fil. Hvis begge alternativene ikke er tilgjengelige, starter du med alle shim-verdiene satt til 0.
- Velg riktig spolekonfigurasjon for mikrospolen hvis den er tilgjengelig i bildeprogramvaren (det vil siParaVision). Ellers oppretter du en ny spolekonfigurasjon som samsvarer med spesifikasjonene til spolen (f.eks. enkelt innstilt eller dobbelt innstilt) i henhold til systemets håndboken. Beregninger for de sikre grensene for denne solenoid mikrospolen som brukes i denne forskningen med 1,5 mm indre diameter i størrelse er 1 ms ved 1 W toppeffekt og 1 mW kontinuerlig kraft.
FORSIKTIG: De små kondensatorene (vanligvis 1 mm i størrelse) som trengs for mikrospoler, er svært følsomme og lett skadet av høye spenninger. Automatisert pulskraftbestemmelse fungerer kanskje ikke med ikke-standard spoler, og for høye krefter kan forårsake skade på spolen eller andre deler av spektrometeret. Derfor anbefales manuelle justeringer. - Ta opp en mutterkurve for en ny spole for å få en indikasjon på riktig RF-effekt for spolen (figur 4). Hvis de sikre grensene for spolen er ukjente, start med 10 μs ved en lav pulseffekt på 0,6 W og øk pulslengdene langsomt med 1 μs om gangen til signalet vises.
- Ved hjelp av et FID-eksperiment i fravær av gradientkoding, varierer RF-pulslengden systematisk samtidig som pulskraften beholdes. Den ideelle pulslengden er pulslengden, hvor signalintensiteten når maksimum. Hvis du tester en ny spole, bruk en 10 μs puls med svært lav effekt først og begynn å øke pulskraften gradvis.
MERK: Hvis strømmen er mye høyere enn forventet for kombinasjonen av spoleegenskaper og spektrometer, er dette allerede en indikasjon på at feil resonansmodus er valgt. - For en spole med et homogent B1-felt,som en solenoid spole, bestemme 180 ° puls hvor signalintensiteten minker til null22.
- Ved hjelp av et FID-eksperiment i fravær av gradientkoding, varierer RF-pulslengden systematisk samtidig som pulskraften beholdes. Den ideelle pulslengden er pulslengden, hvor signalintensiteten når maksimum. Hvis du tester en ny spole, bruk en 10 μs puls med svært lav effekt først og begynn å øke pulskraften gradvis.
- Still inn den bestemte 90° pulskraften i justeringskortet til den opprettede studien. I ParaVision kan referansestrømjusteringskortet brukes til å angi den harde pulskraften.
- Bruk en lokalisatorskanning med 3 skiver, ett stykke i hver av de tre primære aksene, for å finne posisjonen til spolen i magneten. Hvis du vil gjøre dette, laster du inn en lokaliseringsskanning fra standardbiblioteket for spektrometeret. Fra og med et stort synsfelt uten forskyvning anbefales. Utfør en automatisk justering av mottakergevinsten og start målingen manuelt.
MERK: Hvis prøven er nøyaktig midt i graderingssystemet, viser lokaliseringsskanningen prøven. Hvis spolen eller prøven ikke er sentrert i bildeskiver eller mangler, må lokaliseringsskanningen justeres, og i så fall må trinn 4.12 utføres på nytt. - Alternativt kan du bruke en komplementær måte å finne riktig 90° puls basert på bildeevaluering. Når en omtrentlig pulskraft er funnet ved hjelp av mutterkurven,justerer du pulseffektene gradvis for å kontrollere bildet for B 1-felthomogenitet. For noen spoler med et inhomogen B1-felt kan 90° pulskraften som bestemmes ved hjelp av nøttekurven overvurderes, noe som fører til overtipping i det ønskede søte stedet i spolen. I dette tilfellet reduserer du referansepulseffekten og kontrollerer de nye bildene mot de forrige bildene (figur 5).
- Køl magnetfeltet manuelt basert på FID-signalet. En anbefalt bestilling for første skimming er Z-Z2-Z-X-Y-Z-Z2-Z-XY-XZ-YZ-Z. I tilfelle av en magnet er hovedsymmetriaksen i XY-flyet. Derfor kan shims i forskjellige retninger føre til en sterkere korreksjon av B0 homogenitet for denne spolekonfigurasjonen. Høyere rekkefølge shims har liten effekt og kan ignoreres.
- Beregn en volum-normalisert SNR for å tillate sammenligning av mikrospole egenskaper på tvers av ulike systemer, tilpasset fra produsentens protokoll18. For mikrospolene som brukes her, brukte vi en spin-ekkosekvens med følgende parametere: synsfelt (FOV) 6 mm x 6 mm, repetisjonstid (TR) 1000 ms, ekkotid (TE) 7 ms, Matrix 256 x 256 og skivetykkelse = 0,5 mm. Juster skivetykkelsen til mottakersynningen er enhetlig. Deretter justerer du antall stykker slik at skiver strekker seg utover regionen B1-felthomogenitet. Ta opp bildene uten signal snitt, hvis mulig.
- Bestem volumet normalisert SNR (SNR/mm3) i to trinn. Beregn først voxelvolumet (Vvoxel)(Eq. 1):
(1)
MERK: Enhetene for Dx, Dy og D-skive er i mm. Denne beregningen kan også utføres for en rekke skiver. - Velg interesseområdene for å bestemme signalintensiteten (μROI) for prøven, og signalintensiteten (μstøy) og standardavvik (σstøy) for et område utenfor prøven (det vil sistøyen). Gjennomsnittlig signal er hentet fra midten av bildet, mens støysignalet beregnes fra hjørnepatchene (figur 6). Enten kan spektrometerkontrollprogramvaren eller den generelle bildebehandlingsprogramvaren brukes til disse beregningene. Bruk en enkelt repetisjon hvis mulig, for å opprettholde sammenlignbarhet mellom forskjellige spoler.
- Bruk verdiene til å beregne et volum normalisert SNR (Eq. 2):
(2)
For spolen som brukes her i kombinasjon med referanseløsningen, resulterer bruk av Eq. 2 i følgende løsning:
(3)
MERK: Når du sammenligner SNR av spoler ved forskjellige magnetfeltstyrker, må avslapningsegenskapene til fantometmåles 23, med mindre en veldig lang repetisjonstid og svært kort ekkotid brukes.
- Bestem volumet normalisert SNR (SNR/mm3) i to trinn. Beregn først voxelvolumet (Vvoxel)(Eq. 1):
- Se etter følsomhetsproblemer på grunn av magnetfelt inhomogeniteter: last inn og kjør en multippel gradient-ekko (MGE) sekvens (figur 7). Magnetfelt inhomogeniteter på grunn av følsomhetsforskjeller er synlige i bildene med lengre ekkotider, da gradientekkoet ikke refokuserer spinn, som defaser på grunn av statiske felt inhomogeniteter. På denne måten kan inhomogeniteter i prøven visualiseres (på grunn av luftrom i prøven), samt B0-felt inhomogeniteter introdusert av spolematerialet. Bruk følgende parametere, som skal justeres avhengig av spesifikasjonene til spektrometeret og spolen som brukes: TR 200 ms, TE 3,5 ms med 48 ekko fordelt 3,5 ms fra hverandre, flip vinkel 30 grader. Matrix størrelse 128 x 128.
MERK: Hvis flere (potensielle) resonansmodimoduser eller refleksjonsfall ble observert i resonanskurven (wobble), gjentar du trinnene ovenfor for hver resonansmodus for å finne den mest følsomme. Avhengig av mikrospolen kan ulike deler av mikrospoleenheten være utsatt for utilsiktede resonansmoduser.
(1)
(2)
(3)5. Høyoppløselig bildebehandling
- Kjør et 3D-FLASH-eksperiment med følgende parametere: TR 70 ms, TE 2,5 ms, matrisestørrelse på 128 x 64 x 64, FOV 1,6 x 0,8 x 0,8 mm, flip-vinkel 30°, og mottakerbåndbredde 50 kHz.
- Utlede pulskreftene fra referansepulskraften som ble bestemt tidligere; dette er automatisk i de fleste bildebehandlingsprogramvare. Bestem mottakergevinsten ved hjelp av automatiske justeringer. Juster FOV om nødvendig, og dekk hele objektet i begge fasekodingsretningene for å unngå utjevning. Kjør en gradient plikt syklus simulering, hvis tilgjengelig på systemet, for å bekrefte at pliktsyklusen til eksperimentet forblir innenfor spesifikasjonene for gradientspolene.
MERK: Disse parametrene er spesifikke for spolen som brukes til demonstrasjon; det er viktig å optimalisere til de lokale systemspesifikke.
6. Gjenopprette prøver for videre studier eller lagring
- Fjern prøvekapillæren fra mikrospolen.
- Bruk pinsett, fjern vokspluggene under et stereomikroskop.
- Bruk en sprøyte til å vaske prøven ut av kapillæren med en løsning du ønsker. Alternativt kan du bruke en glasspusherstang til å løse ut prøven.
- For å forhindre dehydrering av prøven, oppbevar i et egnet medium for lagring.
Representative Results
Kveilet karakterisering
Ved vellykket justering og matching av en spole, kan ytelsen være preget av spole Q-faktor, 90 ° referansepuls, og SNR / mm3. For den 1,5 mm ID-mottakelighetstilpassede solenoidspolen som ble vist her, var den målte Q-faktoren (losset) 244, sammenlignet med 561 for en 5 mm fuglebursspole.
Referansen 90° puls var 12 μs ved et effektnivå på 0,6 W; jf. 5 μs ved 45 W for en 5 mm fugleburspole (figur 4 og figur 5). Dette tilsvarer en RF pulsfeltstyrke (B1), ved hjelp 
av 0,53 mT for mikrospolen og 1,17 mT for fuglebursspole14 hvor y er gyromagnetisk forhold, mens tau er pulsens varighet. Siden pulseffektnivåene (P) varierer, kan spoler sammenlignes når det gjelder overføringseffektivitet: 
henholdsvis 0,69 mT/W1/2 og 0,18 mT/W1/2 for henholdsvis mikrokyl ogfuglebur 14. Sammenlignet med en 90° puls, er mikrospolen funnet å være en faktor ≈ 4 ganger mer følsom enn fuglebursspolen.
Effekt av følsomhetsmatching
Ved ultrahøye feltstyrker blir prøve- og spolefølsomhet en dominerende faktor for bildekvalitet, sett i figur 7A,7B. Sammenlignet med en spole som mangler et mottakelighetsmatchende væskereservoar, beholdes signalet lengre og mer homogent i en referanseprøve. På grunn av følsomhetsreservoaret reduseres imidlertid de maksimale prøvedimensjonene med hensyn til spolen uten reservoaret.
Bildebehandling med høy oppløsning
En høy oppløsning på 13 x 13 x 13 μm3 av en Medicago avkortula rotprøve ble oppnådd i 20 timer og 23 minutter (figur 8). Fra bunnen av roten ses rotcortexen, sammen med litt gjenværende vann på utsiden av roten. Videre observeres xylem som et mørkt bånd som omslutter phloem. Noen luftlommer observeres som mørke flekker med fullstendig signaltap.
Symbiotiske rotknipper av M. truncatula kan også avbildes ved hjelp av denne protokollen (figur 9). Ved hjelp av en litt større uovertruffen spole (lengde ca. 3500 μm, indre diameter 1500 μm), ble bilder med en oppløsning på opptil 16 x 16 x 16 μm3 oppnådd på 33 minutter.
Figur 1: En solenoid mikrospole. (A)Solenoid spole design består av wire looped spiralically, vanligvis pakket rundt en kapillær. Geometrien til ledningen, for eksempel tykkelsen, diameteren, antall viklemer og trådavstand, påvirker spoleegenskapene. (B)En hjemmelaget solenoid mikrospole med et reservoar for mottakelighet matchende væske (Fomblin). Den består av et 0,4 mm tykt belagt kobbertrådsår seks ganger rundt kapillær med en ytre diameter på 1500 μm og en spolelengde på 3500 μm. Spolen er nedsenket i et reservoar som er laget av en sprøyte. Prøvekapillærer opp til en ytre diameter på 1000 μm kan settes inn. To kondensatorer brukes, en 1,5 pF kondensator i serie med induktoren og en annen variabel 1,5-6 pF kondensator plasseres parallelt med induktoren. Alle komponenter er loddet til et glassfiber bord (gul). Den er montert på en kommersiell holder (grå polymer) som er modifisert for å støtte reservoaret. (C) Solenoid spole design komponenter: 1. solenoid spole, 2. prøve kapillær, 3. 1,5 pF tuning kondensator, 4. variabel matchende kondensator, 5. glassfiber bunnplate, 6. kobbertrådledninger. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Prøveforberedelse under et stereomikroskop. (A) Elementer som trengs for fremstilling av mikrospoler. Fra venstre til høyre: 1. CuSO4 referanseløsning, 2. perfluorodekalin, 3. mikrospole, 4. skalpell, 5. positiv spenning pinsett, 6. pinsett, 7. kapillær ytre diameter = 1000 μm, 8. voks penn, 9. kapillærvoks, 10. nitrilhansker, 11. stereomikroskop, 12. klokkeglass med petriskåldeksel, 13. plantemateriale i vekstsubstrat. Ikke vist: 2 ml sprøyte med ø 0,8 x 40 mm kanyle og fint vevspapir. (B) Nærbilde av prøveinnsetting i en kapillær ved hjelp av pinsett, mens begge holdes nedsenket. (C) Tetting av kapillæren ved hjelp av smeltet voks. (D) Innsetting av det tilberedte kapillæret i mikrospolen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Komponenten i en mikroavbildningssonde. (A) Micro5 probe base, som inneholder alle nødvendige tilkoblinger for vannkjøling, oppvarming, temperatursensorer, gradient strøm, RF (co-aksial kontakt synlig) og eventuelt probe identifikasjon (PICS). Under probebasen er knotter som gjør det mulig å justere de variable tuning og matchende kondensatorer, samt feste skruer for å holde sonden på plass inne i spektrometeret. (B)Den hjemmebygde mikrospolemonteringen på toppen av probebasen. Legg merke til de variable kondensatorene (hvit keramikk) montert på probebasen som tillater justering og matching. (C) Integrert 3-aksial gradient montert på probebasen med vannkjølende beholdere og gullbelagte kontakter for jording av gradienten. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Mutterkurve. En nøttekurve er anskaffet for å bestemme referansepulskraften. Referansepulseffekten (90° puls) er definert som kombinasjonen av kraft- og pulslengde som trengs for å generere et B1-felt som vender all tilgjengelig magnetisering i z-retningen til det tverrgående planet. En serie puls registreres i fravær av gradientkoding. Med hver puls økes enten pulslengde eller pulskraft. Her er pulseffekten satt til 0,6 W, mens pulslengden økes med 1 μs hver gang. Maksimal signalintensitet indikerer 90° puls, rundt 12 μs. 180° pulsen kan også bestemmes på denne måten ved hjelp av minimumsintensiteten. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Visuell bestemmelse av 90° pulskraft. Når en omtrentlig referansepulskraft er funnet ved hjelp av en nøttekurve, kan den kontrolleres visuelt ved å variere pulslengden. Avhengig av spolen kan B1-feltet være mer eller mindre følsomt for endringer. (A) 11 μs pulslengde. (B) 12 μs pulslengde, optimal for denne spolen. (C) 13 μs pulslengde. (D) 20 μs pulslengde. Hvis pulskraften er innstilt for høy, kan over-tipping oppstå, og dermed redusere bildeintensiteten i midten av spolen (pilspiss). Det økte B1-feltet øker også spolens rekkevidde, som det kan observeres i bredden av bildet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Plassering av interesseområde. Områdene av interesse (ROI) for volumet normalisert SNR beregning kan sees. Gjennomsnittlig samplingsintensitet er hentet fra en avkastning som faller inn i referanseløsningsprøven. Gjennomsnittlig støy og standardavvik beregnes fra én eller flere roi som ligger i hjørnene av bildet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: RF homogenitet evaluert ved gradient ekkoavbildning. En multippel gradient ekko (MGE) sekvens brukes til å evaluere RF(B1 -Field) homogenitet ved hjelp av en rekke gradient ekko. Grunnleggende parametere var: repetisjonstid 200 ms, ekkotid 3,5 ms med antall ekko 48, ekkoavstand 3,5 ms, 64 gjennomsnitt, oppkjøpstid 27 m 18 s, flip vinkel 30°. Synsfelt var 5 x 5 mm, matrise 128 x 128, oppløsning 39 x 39 x 200 μm. (A) Følsomhetstilpasset spole. Følsomheten matchende væske (Fomblin) rundt RF-spolen reduserer følsomhetseffekter på grunn av spoleledningen. Små luftbobler forårsaker tap av signal etter hvert som ekkotiden øker. (B) En spole (ikke følsomhet matchet) med lik spolediameter. Ved lengre ekkotider observeres økende gjenstander forårsaket av B0-felt inhomogenitet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: 3D-avbildning av en Medicago-avkortningsrotseksjon. (Øverst) FLASH-bilde. Flere trekk ved rotseksjonen kan skilles ut, inkludert epidermis (e), cortex (c), phloem (ph) og xylem (xy). Luftlommer (a) i roten forårsaker fullstendig signaltap. Grunnleggende parametere var som følger: Repetisjonstid 70 ms, ekkotid 2,5 ms, 256 gjennomsnitt, oppkjøpstid 20 t 23 m. Oppløsning 13 x 13 x 13 μm3. Matrix størrelse var 128 x 64 x 64 og synsfelt 1,6 x 0,8 x 0,8 mm. Mottakerbåndbredde 50 kHz. (Nederst) MSME-bilde. Grunnleggende parametere var som følger: Repetisjonstid 500 ms, ekkotid 5,2 ms, 28 gjennomsnitt, oppkjøpstid 15 t 55 m. Oppløsning 13 x 13 x 13 μm3. Matrix størrelse var 128 x 64 x 64 og synsfelt 1,6 x 0,8 x 0,8 mm. Mottakerbåndbredde 70 kHz. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 9: 3D-avbildning av en Medicago-avkortel rotnoffel. (Øverst)Bilde med lav oppløsning. Grunnleggende parametere var som følger: Repetisjonstid 60 ms, ekkotid 2,3 ms, 4 gjennomsnitt, oppkjøpstid 4 m. Oppløsning 31 x 31 x 31 μm3. Matrix størrelse var 64 x 32 x 32 og synsfelt 2 x 1 x 1 mm. Mottakerbåndbredde 50 kHz. (Nederst) Høyoppløselig bilde. Grunnleggende parametere var som følger: Repetisjonstid 60 ms, ekkotid 2,3 ms, 8 gjennomsnitt, oppkjøpstid 33 m. Oppløsning 16 x 16 x 16 μm3. Matrix størrelse var 128 x 64 x 64 og synsfelt 2 x 1 x 1 mm. Mottakerbåndbredde 50 kHz. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Denne protokollen er best egnet til biologiske prøver, da mange materialer og geologiske prøver har betydelig kortere T2 avslapningstider, som ikke kan avbildes av sekvensene som brukes her. Selv noen biologiske vev, som viser høy prøve magnetisk følsomhet heterogenitet, kan være vanskelig å bilde på ultra-høyt felt som effektene er korrelert til feltet styrke24. Protokollen er ikke bare nyttig for nye spoler, men kan også hjelpe til med feilsøking og diagnose av potensielle problemer. Når du tester nye eller ukjente prøver, kan denne protokollen utføres på forhånd på referanseløsningen for å kontrollere at det eksperimentelle oppsettet fungerer i henhold til spesifikasjonene. Dette hjelpemidler i feilsøking siden spektrometeret kan utelukkes som en kilde til artefakter og funksjonsfeil. I tillegg setter dette tuning og matchende kondensatorer på sonden til verdier som er typiske for mikrospolen.
Når ingen signal registreres ved det første eksperimentet, kan synsfeltet for lokaliseringsskanningen forstørres for å sjekke om prøven vises. Deretter må du kontrollere om spolen er riktig innstilt og forsøke en annen lokaliseringsskanning. Det er mulig at spolen viser flere utilsiktede resonansmodimoduser, i så fall må den riktige bestemmes. Hvis det fortsatt ikke er noe bilde, fjerner du prøven for å kontrollere posisjonen i mikrospolenheten og kontrollerer at prøven er intakt (det vil si at det ikke er noen luftbobler eller lekkasjer i tetningene). Til slutt kan en prøve tilberedes med vann i stedet for PFD. Hvis prøven gir lite påvisbart signal i lokaliseringsskanningen, kan det omkringliggende vannet i kapillæren fortsatt oppdages.
Siden mikrospoler er ideelt svært nær prøven, kan de magnetiske følsomhetsforskjellene mellom luften og ledningen forårsake ekstra signaltap, som vist i figur 7B. Potensielle artefakter inkluderer romlig mismapping og uregelmessig signalintensitetsvariasjon. Spesielt gradient-ekko type pulssekvenser påvirkes av dette ikke-ensartede signaltapet. Av denne grunn presenterte vi en følsomhetsmatchet spole, ved å senke ledningen i fluorvæske (Fomblin eller FC-43). B1 estimeringsmetoden som inngår i denne protokollen, kan bidra til å avgjøre om B1-følsomhetsforskjellene garanterer inkludering av følsomhetsmatchingsstrategier i utformingen av spoleenheten. En alternativ tilnærming for å konstruere en mottakelighet matchet spole er å bruke mottakelighet-matchetwire 25. Videre er bare mottakelighetsproblemer på grunn av spolen adressert med denne tilnærmingen. Følsomhetskonflikter inne i prøven (f.eks. på grunn av luftrom) er fortsatt utfordrende.
Luftlommer eller bobler utgjør en eksperimentell utfordring som forårsaker omfattende signaltap, forårsaket av følsomhetsforskjeller i luftgrensesnittet og væsken ellerprøven 19 (figur 5A). Et kritisk aspekt ved vellykket prøveklargjøring er nedsenking av både prøve og kapillær. Imidlertid kan selv små bobler forårsake signaltap, spesielt for gradient ekko type sekvenser. Mobile luftbobler kan migrere gjennom kapillæren til de er i kontakt med prøven. Noen av disse effektene kan lindres ved litt vippe kapillær slik at den ene enden er høyere enn den andre. Tilting sikrer at potensielle luftbobler holdes på plass i den høyere enden, uten å forstyrre prøven. Det er også viktig å kontrollere at kapillærvoks danner en god forsegling, da dehydrering kan føre til at store luftbobler dannes.
For luftrommene inne i prøven ble PFD brukt til å fylle opp de intercellulære luftrommene mens de ikke penetrerte cellemembranene26. Men selv med denne tilnærmingen var vi ikke i stand til å fjerne alle luftrom. I tillegg betyr denne tilnærmingen at vi trenger en ekstra agent, som vanligvis ikke er foretrukket på grunn av ønsket om å studere et system så ikke-invasivt som mulig.
Den sylindriske formen på kapillærer betyr at perfusjonsoppsett skal være levedyktige, spesielt for vev som er sårbare for forfall, for eksempel biopsier eller studieprosesser i levende rotmateriale. To trinn kunne realisere et perfusjonsoppsett. Først ville det være tilstrekkelig å koble til et medium materør samt et avløpsrør på hver side av kapillæren til å lage en kjemostat. For det andre kan tillegg av en innrykk i prøvekapillæren holde prøven på plass mot strømningsretningen. Dette er analogt med en protokoll publisert for planar mikrospoler10.
Den ikke-invasive karakteren av MR-avbildning, kombinert med den inerte væsken som brukes i denne protokollen (PFD eller Fomblin) betyr etter ferdigstillelse av eksperimenter, prøver kan fjernes fra sine kapillærer for videre studier. Kombinasjoner inkluderer optisk eller elektronmikroskopi og andre destruktive bildeteknikker. Vi har nylig vist en kombinasjon med optisk mikroskopi på Medicago avkortula rotknipper27.
Vi har demonstrert en metode for bildeanleggsmateriale ved hjelp av dedikerte mikrospoler på et ultrahøyt felt-NMR-spektrometer. Relativt store utvalgsvolumer kan studeres ved høy oppløsning med god RF homogenitet. Videre kan spektroskopisk bildebehandling utføres ved høyere oppløsninger enn ellers mulig. Tilpasning av mikrospoledesign til prøver forenkles ved en effektiv metode for å bestemme spoleytelsesegenskaper. Den solenoid spole tilnærming kan også lett brukes på andre prøver enn planter, inkludert dyrevev.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Eksperimenter ved 950 MHz-instrumentet ble støttet av uNMR-NL, et NWO-finansiert nasjonalt veikart stort anlegg i Nederland (prosjekt 184.032.207). R.S. ble støttet av BioSolarCells konsortiumprosjektet U2.3. J.R.K. ble støttet av Nederlands Magnetic Resonance Research School (NMARRS) graduate school [022.005.029]. Vi takker Defeng Shen og Ton Bisseling for å ha levert Medicago-avkortulaprøvene. Vi takker videre Klaartje Houben, Marie Renault og Johan van der Zwan for teknisk støtte ved uNMR-NL-anlegget. Vi vil også takke Volker Lehmann, Henny Janssen og Pieter de Waard for teknisk hjelp. Vi uttrykker vår takknemlighet til Frank Vergeldt, John Philippi og Karthick B. Sai Sankar Gupta for deres råd. Til slutt takker vi Jessica de Ruiter for å ha gitt stemmen til videoen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reference solution preparation | |||
| CuSO4 | Sigma-aldrich | 469130 | Crystalline powder for creating reference solution |
| D2O | Sigma-aldrich | 151882 | Liquid used to prepare reference sample |
| Weigh Scale | Sartorius | PRACTUM513-1S | Scale for weighing compounds |
| Sample preparation | |||
| Capillary 1000 μm (Outer diameter) | Hilbenberg GmbH | 1408410 | Sample capillaries |
| Capillary wax | Hampton Research | HR4-328 | Solid wax used to seal samples |
| Disposable Scalpel | Swann-Morton | No. 11 | Used to excise samples |
| Perfluorodecalin | Sigma-aldrich | P9900 | Liquid used for submerging sample |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ40 | Tabletop binocular microscope |
| Syringe | Generic | - | Used to apply PFD and manipulate the sample |
| Vacuum Pump | Vacuubrand | MZ2C | Two-stage membrane vacuumpump used for removing air pockets from samples. |
| Wax pen | Hampton Research | HR4-342 | Handheld wax pen used to melt and apply capillary wax to samples |
| Imaging Hardware | |||
| 22.3 T Magnet | Bruker GmbH | 950 US2 | Narrowbore superconducting magnet |
| Air cooler | Bruker GmbH | - | Used to regulate probe temperature |
| Console | Bruker GmbH | Avance III HD | Controls operation of the spectrometer |
| Micro5 gradient coils | Bruker GmbH | Mic5 | Removable gradient coils mount on the Micro5 probe body |
| Micro5 Probe body | Bruker GmbH | Mic5 | Holds microcoils and gradient coils |
| RF microcoil | Home-built | - | contains Fomblin |
| Vector Network Analyzer | Copper Mountain Technologies | TR1300/1 | Used to perform S11 reflectance test, frequency range 300kHz to 1.3 GHz |
| Water cooler | Bruker GmbH | BCU-20 | Open loop watercooling to dissipate heat from gradient coil operation. |
References
- Ciobanu, L., Pennington, C. H. 3D micron-scale MRI of single biological cells. Solid State Nuclear Magnetic Resonance. 25 (1-3), 138-141 (2004).
- Aguayo, J. B., Blackband, S. J., Schoeniger, J., Mattingly, M. A., Hintermann, M. Nuclear magnetic resonance imaging of a single cell. Nature. 322, 190-191 (1986).
- Radecki, G., Nargeot, R., Jelescu, I. O., Le Bihan, D., Ciobanu, L. Functional magnetic resonance microscopy at single-cell resolution in Aplysia californica. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (23), 8667-8672 (2014).
- Lee, C. H., et al. Magnetic Resonance Microscopy (MRM) of Single Mammalian Myofibers and Myonuclei. Scientific Reports. 7 (1), 39496 (2017).
- Callaghan, P. T. Principles of nuclear magnetic resonance microscopy. , Oxford University Press. Oxford. (1994).
- Glover, P., Mansfield, S. P. Limits to magnetic resonance microscopy. Reports on Progress in Physics. 65 (10), 1489-1511 (2002).
- Peck, T. L., Magin, R. L., Lauterbur, P. C. Design and analysis of microcoils for NMR microscopy. Journal of Magnetic Resonance. Series B. 108, 114-124 (1995).
- Lee, C. H., Flint, J. J., Hansen, B., Blackband, S. J. Investigation of the subcellular architecture of L7 neurons of Aplysia californica using magnetic resonance microscopy (MRM) at 7.8 microns. Scientific Reports. 5, 11147 (2015).
- Fratila, R. M., Velders, A. H. Small-Volume Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. Annual Review of Analytical Chemistry. 4 (1), 227-249 (2011).
- Flint, J. J., Menon, K., Hansen, B., Forder, J., Blackband, S. J. Metabolic Support of Excised, Living Brain Tissues During Magnetic Resonance Microscopy Acquisition. Journal of Visualized Experiments. (128), 1-10 (2017).
- Minard, K. R., Wind, R. A. Solenoidal microcoil design. Part I: Optimizing RF homogeneity and coil dimensions. Concepts in Magnetic Resonance. 13 (2), 128-142 (2001).
- Vegh, V., Gläser, P., Maillet, D., Cowin, G. J., Reutens, D. C. High-field magnetic resonance imaging using solenoid radiofrequency coils. Magnetic Resonance Imaging. 30 (8), 1177-1185 (2012).
- Minard, K. R., Wind, R. A. Solenoidal microcoil design Part II: Optimizing winding parameters for maximum signal-to-noise performance. Concepts in Magnetic Resonance. 13 (3), 190-210 (2001).
- Haase, A., et al. NMR probeheads for in vivo applications. Concepts in Magnetic Resonance. 12, 361-388 (2000).
- Webb, A. G. Radiofrequency microcoils for magnetic resonance imaging and spectroscopy. Journal of Magnetic Resonance. 229, 55-66 (2013).
- Peck, T. L., Magin, R. L., Lauterbur, P. C. Design and Analysis of Microcoils for NMR Microscopy. Journal of Magnetic Resonance, Series B. 108 (2), 114-124 (1995).
- Olson, D. L., Peck, T. L., Webb, A. G., Magin, R. L., Sweedler, J. V High-Resolution Microcoil 1H-NMR for Mass-Limited, Nanoliter-Volume Samples. Science. 270 (5244), (1995).
- Oerther, T. Micro Imaging Manual for AV3 Systems. , Bruker Biospin GmbH. Rheinstetten, Germany. (2012).
- Callaghan, P. T. Susceptibility and Diffusion Effects in NMR Microscopy. Encyclopedia of Magnetic Resonance. , (2007).
- Donker, H. C. W., Van As, H., Snijder, H. J., Edzes, H. T. Quantitative 1H-NMR imaging of water in white button mushrooms (Agaricus bisporus). Magnetic Resonance Imaging. 15 (1), 113-121 (1997).
- Tsai, W. T. Environmental property modelling of perfluorodecalin and its implications for environmental fate and hazards. Aerosol and Air Quality Research. 11 (7), 903-907 (2011).
- Keifer, P. A. 90° pulse width calibrations: How to read a pulse width array. Concepts in Magnetic Resonance. 11 (3), 165-180 (1999).
- Vlaardingerbroek, M. T., den Boer, J. A. Magnetic Resonance Imaging: Theory and Practice. , Springer-Verlag. Berlin, Heidelberg. 05252-05255 (2003).
- Schenck, J. F. The role of magnetic susceptibility in magnetic resonance imaging: MRI magnetic compatibility of the first and second kinds. Medical Physics. 23 (6), 815-850 (1996).
- Kc, R., Henry, I. D., Park, G. H. J., Aghdasi, A., Raftery, D. New solenoidal microcoil NMR probe using zero-susceptibility wire. Concepts in Magnetic Resonance Part B: Magnetic Resonance Engineering. 37 (1), 13-19 (2010).
- Littlejohn, G. R., Gouveia, J. D., Edner, C., Smirnoff, N., Love, J. Perfluorodecalin enhances in vivo confocal microscopy resolution of Arabidopsis thaliana mesophyll. New Phytologist. 186 (4), 1018-1025 (2010).
- van Schadewijk, R., et al. Magnetic Resonance Microscopy at Cellular Resolution and Localised Spectroscopy of Medicago truncatula at 22.3 Tesla. Scientific Reports. 10 (1), 971 (2020).
