Summary
Detta protokoll ger ett steg-för-steg-förfarande för att analysera aterosklerotisk börda hos möss. Utredare kan använda detta protokoll för att jämföra överflöd, plats och storlek på aterosklerotiska lesioner hos olika djur.
Abstract
Apolipoprotein E (Apoe) - eller lågdensitetslipoproteinreceptor (Ldlr) -brist hyperlipidemiska möss är de två vanligaste modellerna för aterosklerosforskning. De används för att studera effekterna av olika genetiska faktorer och olika celltyper på aterosklerotisk lesionsbildning och samt testa utvecklingen av nya terapier. Isolering, excision av hela aortan och kvantifiering av oil red O-färgade aterosklerotiska lesioner är grundläggande morfometriska metoder som används för att utvärdera aterosklerotisk börda. Målet med detta protokoll är att beskriva en optimerad, steg-för-steg kirurgisk metod för att dissekera, perfuse-fix, isolera, fläcka, avbilda och analysera aterosklerotiska lesioner i musaortor med Oil Red O. Eftersom aterosklerotiska lesioner kan bildas var som helst i hela aortaträdet, har hela denna aorta Oil Red O-färgningsmetod fördelen att utvärdera lipidbelastade plack i hela aortan och alla grenar i en enda mus. Förutom Oil Red O-färgning kan färska isolerade hela aortor användas för olika in vitro- och in vivo-experiment och cellisoleringar.
Introduction
Kranskärlssjukdom, en ledande dödsorsak i USA, orsakas vanligtvis av åderförkalkning, en process som leder till uppbyggnad av plack inuti artärväggarna1. Hyperlipidemi-benägna Apoe- och Ldlr-bristfälliga möss är centrala för undersökningar av åderförkalkning och dess komplikationer och utveckling av terapier2,3,4,5. Kvantifiering av aterosklerotiska lesioner från en aorta med ansiktet är en viktig endpointanalys för att utvärdera effekterna av genetisk manipulation i olika celltyper. Det hjälper också till att studera nya terapier som är utformade för att påverka aterosklerotisk sjukdomsinitiering, progression och regression. Aterosklerotiska lesioner kan bildas var som helst i aortan och dess grenar (dvs. brachiocephalic, carotid och subclavian artärer i bröstet, liksom njur-, vanliga iliac- och lårbensartärer under membranet)6. En omfattande utvärdering av åderförkalkningsbördan och lämplig behandling kräver bedömning av sjukdomsbördan på olika platser, en utmaning som ofta förbises.
Detta protokoll beskriver hur man utför en omfattande analys av aterosklerotiska lesioner, som börjar med en oöppnad hel aorta och fortsätter till en ansiktsberedning, i en enda mus. Oöppnad hel aortaolja Röd O-färgning möjliggör snabb, kvalitativ bedömning av lipidbelastade plack i hela aortan och dess grenar, medan ansiktsberedning ger en kvantitativ bedömning av aterosklerotisk lesionsfördelning i musaortan.
Tekniken använder 8 veckor gamla möss med en glattmuskelcellspecifik TGFβR2-deletion på Apoe-/- hyperlipidemisk bakgrund (MYH11-CreERT2; Tgfbr2f/f;mT/mGf/f; Apoe-/-; nedan kallade TGFβR2iSMC-Apoe-möss) och kullkamrat Apoe-/- kontroller (MYH11-CreERT2;mT/mGf/f; Apoe-/-; nedan kallad Apoe-/- möss). Djuren hålls i 16 veckor på en HCHFD (High Cholesterol High Fat Diet) som studiematerial7. Vid studieavslutning färgas och avbildas de oöppnade hela aortorna (inklusive alla större grenar) med Oil Red O för kvalitativ bedömning av lipidbelastade plack. Aortorna skärs upp via en ansiktsberedning, och alla aterosklerotiska lesioner avbildas och kvantifieras. Detta protokoll kan användas för att studera aterosklerotisk lesionsutveckling i Apoe-/- eller Ldlr-/- hyperlipidemi mössmodeller och utvidgas till allmänna aortarelaterade vaskulära biologiska applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
mT / mG (lager nr 007676) och Apoe-/- (lager nr 002052) möss köptes från Jackson Laboratory. Myh11-CreERT2 möss var en gåva från Stefan Offermanns (tillgänglig från Jackson Laboratory som lager nr 019079). Tgfbr2fl / fl möss erhölls från Harold L. Moses (Vanderbilt University). Alla djurförsök utfördes med hjälp av protokoll som godkänts av Yale University Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Möss
- Producera MYH11-CreERT2;mT/mGf/f; Apoe-/- och MYH11-CreERT2; Tgfbr2f/f;mT/mGf/f; Apoe-/- möss som tidigare beskrivits7. Rasmutantstammar till C57BL / 6J-bakgrunden i mer än tio generationer.
MYH11-CreERT2 Cre-muslinjen ger ett kraftfullt verktyg för att studera glattmuskelcellernas roll i vaskulär homeostas och vaskulär patologi. Cre-allelen sätts in i Y-kromosomen; således uttrycker kvinnliga möss inte denna konstruktion.
2. Genotypning av mus, tamoxifeninduktion och dietmatning med högt kolesterol
- Utför musgenotypning med hjälp av musöra DNA och PCR-analys. Musörats DNA ska isoleras med hjälp av blod- och vävnads-DNA-isoleringssatsen (Table of Materials) enligt tillverkarens instruktioner. PCR-primers listas i tabell 1.
- Inducera Cre-Lox-rekombination genom tamoxifen injektion vid 1 mg/dag i.p. i 5 dagar i 6 veckor gamla MYH11-CreERT2;mT/mGf/f; Apoe-/- och MYH11-CreERT2; Tgfbr2f/f;mT/mGf/f; Apoe-/- hanmöss.
- Inducera ateroskleros genom att placera 8 veckor gamla hanmöss (2 veckor efter tamoxifenbehandling) på en HCHF-diet (40% kcalfett, 1,25% kolesterol, 0% kolsyra) i 16 veckor.
3. Beredning av reagenser och dissektionsverktyg
- Beredning av lagerolja Röd O-lösning: Lös upp 1 g olja röd O i 100 ml isopropylalkohol.
- Arbetsolja Red O lösningsberedning: Blanda 24 ml lager Oil Red O-lösning med 16 ml dH2O. Filtrera den utspädda Oil Red O med 0,45 μm sterila sprutfilter (lösningen är endast bra i 1-2 timmar).
- 60% isopropylalkoholberedning: Blanda 60 ml isopropylalkohol med 40 ml dH2O.
- 4% formaldehyd i 1x DPBS-beredning: späd 10 ml 16% formaldehyd i 30 ml 1x DPBS.
- Rengör alla dissektionsverktyg med 70% etanol (Figur 1).
4. Dödshjälp (figur 2A)
- Mät musens vikt före dödshjälp.
- Avliva musen genom intraperitoneal injektion av ketamin och xylazin (varje milliliter innehåller 10 mg / ml ketamin och 2 mg / ml xylazin).
- Placera musen i ryggläge (magen med framsidan uppåt).
5. Öppning av bröst- och bukhålan och hjärtperfusion (figur 2B)
- Förbered en 10 ml spruta med 10 ml 1x DPBS. Keps med en 25 G nål. Sprutan kommer att användas för att spola hjärtat.
- Håll upp huden med pincett (Stil 5) och skär med fin sax från bukens botten till toppen av nacken.
- Öppna bukväggen under bröstkorgen.
- Lyft bröstbenet med pincett (Stil 5) och skär membranet och skär sedan bort bröstkorgen för att exponera brösthålan.
- Gör ett litet snitt i hjärtats högra atrium.
- Perfusera genom den apikala vänstra ventrikulära punkteringen genom att långsamt injicera 10 ml 1x DPBS. En gång grundligt perfuserad blir levern och njuren ljusbrun i färg.
- Rengör bröstkaviteten från främmande blod och vätska genom att använda en non-woven svamp för att absorbera materialet.
6. Isolering av aorta och grenar (figur 2C)
- Ta bort organ (dvs. lunga, lever, mjälte och gastrointestinala och reproduktiva organ) och skär nyckelbenet med pincett (stil 5) och fin sax medan du lämnar hjärtat, njuren och aortan intakt på plats.
OBS: Se till att inte snöra hjärtat eller några större blodkärl. - Placera musen under ett stereomikroskop.
- Dissekera aorta- och aortagrenar inklusive brachiocephalic artärer, halspulsåder, subklaviska artärer, njurartärer, vanliga iliacartärer och lårbensartärer med pincett (Stil 4) och vårsax.
OBS: Täck aortan med en våt, non-woven svamp för att undvika uttorkning medan du dissekerar aortagrenarna. - Dissekera försiktigt och ta bort adventitial fett och bindväv runt aorta- och aortakreningarna med pincett (Stil 4) och vårsax.
OBS: Eftersom inflammation är framträdande i aneurysm hyperlipidemi musen, är det svårt att ta bort adventitia. Var försiktig så att du inte riva eller nicka aortan och aortan. Detta steg kräver övning och tålamod.
7. Fixering av hjärta och aorta (Figur 2D,E)
- Förbered en 10 ml spruta med 10 ml 4% formaldehyd i 1x DPBS. Keps med en 25 G nål.
VARNING: Formaldehyd är farligt. Läs MSDS innan du arbetar med denna kemikalie. Använd handskar och skyddsglasögon och producera utspädningslösningarna inuti en dragskåpa.
OBS: 4% formaldehydlösning bryts ned över tiden. Det är viktigt att använda nytillverkade 4% formaldehyd för fixering. - Fixa kärlträdet genom apikal vänster ventrikulär punktering genom att långsamt injicera 10 ml 4% formaldehyd.
OBS: Formaldehydfixering stör flera nedströms applikationer, såsom cellodling, FACS-analys och encells-RNA-sekvenseringsanalys. Hoppa över det här steget om aortan ska användas för något av dessa program. - Rengör bröstkaviteten i någon främmande vätska med en non-woven svamp för att absorbera materialet.
- Separera hjärtat från aortan genom att hålla hjärtat med pincett (Stil 4) och använda mikrodissekerande fjädersax.
OBS: För att utföra en ansikts oil red O-färgning efter detta steg rekommenderas att du skär aortan öppen på plats istället för ex vivo och fortsätter till avsnitt 8. Detta gör det enkelt för ansiktet aorta att ligga platt. - Isolera och punktskatta aortan och dess huvudämne från 1 mm ovanför halspulsådern till slutet av lårbensartären med pincett (stil 4) och fjädersax.
- Överför kärlet till en vax petriskål eller 1,5 ml mikrocentrifugrör och fyll med 1x DPBS tills det täcker aortan.
OBS: Protokollet kan pausas här.
8. Olja Röd O-färgning och avbildning av oöppnad hel aorta (Figur 3)
- Fäst kärlet på en vaxpetinskål med minutienstift (figur 3A).
- Skölj kärlet en gång med 1x DPBS.
- Häll 25 ml färsk olja röd O-lösning i petriskålen (figur 3B).
OBS: (1) Isopropanol är farligt och en brandfarlig vätska. Använd korrekt personlig skyddsutrustning. (2) Olja Röd O-lösning kan lätt fällas ut. De utfällda partiklarna kan störa efterföljande färgning. Det är viktigt att avlägsna fällningen genom att filtrera Oil Red O-lösningen genom ett 0,45 μm filter före användning. (3) Det är bäst att förbereda färsk olja Röd O-lösning och kassera alla oanvända lösningar. (4) Förutom Oil Red O är Sudan IV en annan kemisk förening som används för färgning av lipider, triglycerider och lipoproteiner. Olja Röd O har dock gradvis ersatt Sudan IV eftersom den röda färgen som produceras av Oil Red O är mer intensiv och därmed kan göra fett mycket lättare att se. - Fläck aortan i 60 min vid rumstemperatur (RT). Olja Röd O kommer att fläcka lipidrik plack röd, vilket lämnar andra icke-plack som innehåller områden bleka i färg.
- Tvätta en gång i 20 min med 60% isopropanol vid RT.
OBS: Översköljning kan kvarhålla placket. - Skölj aortan 3x med dH2O i 5 min för att ta bort isopropanol.
- Rengör försiktigt all vinkelrät fettvävnad runt aortan under ett stereomikroskop med pincett (stil 4) och fjädersax (figur 3C,D).
OBS: Det är viktigt att rengöra all vinkelrät fettvävnad runt aortan och dess grenar efter färgning, eftersom Oil Red O-stained perivascular adipose tissue kan ge falsk bakgrund och störa plackmorfometri och plackområdeskvantifiering. Se till att inte ta bort en del av aortaväggen. Fyll vaxskålen med dH2O tills den täcker den färgade aortan under rengöring. Detta steg kräver övning och tålamod. - Överför kärlet till en ren glasmikroskopbild.
- Skaffa digitala mikrografer med en kamera ansluten till ett ljusmikroskop. Spara högupplösta bilder, helst i taggat bildfilformat (TIFF) (figur 3E).
OBS: Protokollet kan pausas här. För att förhindra att aortan torkar, överför kärlet till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör och fyll med 1x DPBS tills det täcker aortan. Förvara vid 4 °C.
9. En face aorta montering (Figur 4, Figur 5)
- Överför kärlet till en vax petriskål och fyll med 1x DPBS tills det täcker aortan.
- Skär av halspulsådern, subklaviska artärerna i aortabågen och iliacartärerna i bukaortan 1-2 mm efter bifurkationer. Skär njurartärerna. (Figur 4A)
- Skär i längdriktningen upp aortapreparatet längs den inre krökningen (figur 4B1) och ensamma iliacartärer (figur 4B2) med mikrodissekerande fjädersax.
- Skär upp de tre grenarna av aortabågen (dvs. innominate, vänster vanlig halspulsåder, vänster subklavisk artär) längs den större krökningen tills basnivån för inre krökning (x-mark) (figur 4B3–B8) med mikrodissekerande fjädersax.
- Fäst aortan platt (lumensidan uppåt) i en vaxskål med minutienstift och applicera 1x DPBS tills den täcker aortan för att förhindra att den torkar (Figur 4C).
OBS: (1) Det är viktigt att göra den upprullade aortan platt och stifta den med ansiktet utan att sträcka sig. Detta steg kommer att ta några dagar beroende på svårighetsgraden av ateroskleros. (2) För aortor från Apoe-/- eller Ldlr-/- djur rekommenderas att fästa aortan platt i 24 timmar. (3) Protokollet kan pausas här. - Rengör glasmikroskopglasen med 70% etanol och känsliga uppgiftstorkare (figur 5A).
- Överför aortan till en ren glasmikroskopbild och lägg 15 droppar optimal skärtemperatur (OCT) -förening på en annan ren glasmikroskopbild (Figur 5B).
- Placera försiktigt glasmikroskopglaset med OCT-förening över aortan och undvik att fånga luftbubblor på bilden (figur 5C).
- Märk bilderna med exempelnamn (figur 5D).
OBS: De monterade aortarutschbanorna med ansiktet kan förvaras i fuktkammaren vid 4 ° C i flera månader.
10. Avbildning och lesionskvantifiering av en face aorta (Figur 6)
- Skaffa digitala mikrografer med en kamera ansluten till ett ljusmikroskop. Spara högupplösta bilder, helst i taggat bildfilformat (TIFF) (figur 6A).
- Överför bilder av en ansiktsfärgad hel aorta till en dator utrustad med ImageJ-programvara.
- I ImageJ väljer du verktyget "Freehand selection" och cirklar alla Oil Red O-färgade plack manuellt (intensiva röda fläckar) medan du trycker på "Alt" -tangenten (för Windows PC) eller "Shift" -tangenten (för Mac). Klicka sedan på "Mät" i menyn "Analysera" för att visa lesionsområden i resultatfönstret (Figur 6B vänster).
OBS: Det finns flera fallgropar i kvantifieringen av aterosklerotiska lesioner: (1) alla små bitar av färgat adventitialt fett som förblev fästa vid aortan från steg 8.7 kan ge falsk bakgrund och störa plackkvantifieringen; (2) att ta bort en del av aortaväggen eller skada aortan från steg 6.4 och 8.7 kan störa plackkvantifieringen; (3) bubblor och veck som bildas i aortan efter montering (steg 9.8) kan störa plackkvantifieringen; och (4) aterosklerotisk plack är ett 3D-fenomen, och mätningar som utförs i ett 2D-plan kanske inte återspeglar den verkliga omfattningen av placket. Förutom analys av aorta-plackområdet rekommenderas att analysera plackstorleken i aortaroten, brachiocephalicartären, stigande aorta och abdominal aorta separat8. - Cirkla den yttre kantlinjen för aortan och klicka på "Mät" i menyn "Analysera" för att visa aortan i resultatfönstret (Figur 6B höger).
- Exportera alla mätningar till en Excel-fil.
- Beräkna förhållandet mellan plackarea från det totala aortaområdet och normalisera värdet som procentandelen av den totala oljeröda O-ytan.
- Beräkna förhållandet mellan plackarea i 8–10 Apoe-/- och 8–10 TGFβR2iSMC-Apoe-möss. Presentera data som medelvärde ± SEM (figur 6C).
- Utför en oparad Studentens t-test för statistisk analys av förhållandet mellan plackområdesdata jämfört med en annan musgrupp. Betrakta skillnaderna i medelvärden som signifikanta vid p < 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I detta protokoll analyserades aterosklerotiska lesioner hos TGFβR2iSMC-Apoe-möss efter 4 månader på en HCHF-diet7. Förutom omfattande ateroskleros utvecklade dessa möss både bröst- och bukaortaaneurysm, som tidigare rapporterats. Jämfört med Apoe-/- möss visade TGFβR2iSMC-Apoe möss aortaväggar svår ateroskleros, vilket gjorde det svårt att dissekera lesionerna (Figur 2C, D, E). Dessutom är aneurysmerna särskilt omfattande under den suprarenala aortan, vilket i hög grad påminner om avancerade humana aortaaneurysmer.
En representativ oöppnad aortaolja Röd O-färgningsbild från HCHFD-matad TGFβR2iSMC-Apoe-mus visas i figur 3E. Bilden visar en TGFβR2iSMC-Apoe-mus som utvecklade både stigande och bukaortaaneurysm, och den visar accelererad aterosklerotisk lesionsbildning i aortagrenar (här brachiocephalic artär, halspulsådern, subklaviska artärer, iliacartärer, lårbensartärer och njurartärer).
Figur 6A visar en face Oil Red O-färgningsbild av Apoe-/- och TGFβR2iSMC-Apoe-möss. Jämfört med Apoe-/-gruppen uppvisade TGFβR2iSMC-Apoe-möss svår aneurysmal förstoring och markant förlängning av hela aortan.
Figur 1: Dissektionsverktyg som används i protokollet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Steg-för-steg-protokoll för excision av aorta från mus på HCHF-diet.
Detta är från en 24 veckor gammal TGFβR2iSMC-Apoe-mus som matas i 4 månader på en hchf-diet med högt kolesterol. (A) Mus under ketamin / xylenanestesi. Streckade linjer anger var du ska skära huden. (B) Dissektion av musen för att exponera bröstkorgen och bukhålorna. (C) Noggrant avlägsnande av de inre organen (dvs. lunga, lever, mjälte och gastrointestinala och reproduktiva organ) följt av exponering av musaortan under ett dissektionsmikroskop. (D) Försiktigt avlägsnande av bindväven längs aortan så rent som möjligt. (E) Bild av den isolerade hela aortan med grenar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Steg-för-steg-protokoll för oöppnad aortaolja Röd O-färgning och avbildning.
(A) Fästning av hela aortan med grenar på en vaxpetinkål. (B) Täckning av aortan med oljeröd O-färgningslösning. (C) Illustration av hela aortan efter oljeröd O-färgning. (D) Illustration av olja Röd O-färgad hel aorta efter rengöring. (E) Representativa fotomikrografer av oljeröd O-färgad hel aorta av TGFβR2iSMC-Apoe-möss efter 4 månader på en HCHF-diet. (a') Bild med hög förstoring av stigande aorta från (a) och (b') hög förstoringsbild av bukaorta från (b). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Steg-för-steg-protokoll för en ansikts aortaberedning.
(A,B) Det arteriella trädet färgat med olja röd O öppnas i längdriktningen för att platta ut aortan för avbildning. Prickade linjer längs kärlväggen och siffror indikerar sekventiella snitt som görs för att öppna upp fartygen. (C) Dela och fäst hel aorta i längdriktningen på en petriskål i vax i Y-form. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Steg-för-steg-protokoll för en face aorta-montering.
(A) Skonsam rengöring av glasmikroskopglasen med 70% etanol och torkning med rena laboratorieservetter. (B) Applicering av OCT-förening på ytan av en glasmikroskopglid och sedan spridning av en yta aorta platt på den andra glasmikroskopbilden. (C) Skonsam placering av glasmikroskopbilden med OCT-förening ovanpå aortaprovet. (D) Märkning av diabilden med provnamnet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Steg-för-steg-protokoll för aortaavbildning och aterosklerotisk lesionskvantifiering.
(A) Mikrofotografier av en face aortas från Apoe-/- och TGFβR2iSMC-Apoe möss efter 4 månader på en HCHF-diet och färgade med Oil Red O. (B) Bilder som illustrerar processen för datorassisterad kvantifiering av aterosklerotiska lesioner. (C) Kvantifiering av lesionsområdet: % lesionsarea avser oljeröd O-färgad som en % av den totala aortaytan. Alla data som visas som medelvärde ± SEM (***p < 0,001; oparade tvåsvansade studentens t-test; n = 9 för Apoe-/- möss och n = 9 för TGFβR2iSMC-Apoe-möss). Klicka här för att se en större version av denna figur.
| MYH11-CreERT2 | 5'-TGA CCC CAT CTC TTC ACT CC-3' | |
| 5'-AAC TCC ACG ACC ACC TCA TC-3' | ||
| 5'-AGT CCC TCA CAT CCT CAG GTT-3' | ||
| Tgfbr2fl/fl | 5'-TAA ACA AGG TCC GGA GCC CA-3' | |
| 5'-ACT TCT GCA AGA GGT CCC CT-3' | ||
| Apoe | 5'-GCC TAG CCG AGG GAG AGC CG-3' | |
| 5'-TGT GAC TTG GGA GCT CTG CAG C-3' | ||
| 5'-GCC GCC CCG ACT GCA TCT-3' | ||
Tabell 1: Genotypningsprimrar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Apolipoprotein E (Apoe) och lågdensitetslipoproteinreceptor (Ldlr) bristfälliga möss är användbara för att studera utveckling och behandling av ateroskleros. Utredare kan utvärdera effekterna av genetik och terapeutiska manipulationer på aterosklerosrelaterade sjukdomar initiering, progression och regression med hjälp av Oil Red O-färgning av hela aortan9. Aorta Oil Red O-färgning och lesionskvantifiering är guldstandardens slutpunkt för aterosklerosforskning. Denna teknik är billig och kräver ingen specialutrustning10. Det är emellertid inte lätt att få högkvalitativ olja röd O-färgad vävnad. Baserat på tidigare erfarenhet finns det tre kritiska steg i detta protokoll, och hela proceduren kräver övning och tålamod. Det första kritiska steget är förmågan att dissekera, ta bort och rengöra all vinkelrät fettvävnad runt aortan och dess grenar före och efter oil red O-färgning (figur 2D, figur 3C,D). Det andra viktiga steget är beredningen av nytillverkade och filtrerade Oil Red O-lösning. Slutligen är det viktigt att aortan ligger platt på en vaxskål innan den monteras på glasmikroskopglasen (figur 4C, figur 5B,C).
I jämförelse med andra Oil Red O-färgningsprotokoll ger denna metod kvalitativa och kvantitativa bedömningar av lipidbelastade plack i den oöppnade aortan och en face aorta från en enda mus. Den första kvalitativa bedömningen av den oöppnade Oil Red O-färgningen ger en allmän uppfattning om plackfördelningen och plackstorleken i aorta, liksom alla grenar före kvantifiering av en face aorta. Studiens begränsningar är att (1) 2D-jämförelse och analys av 3D-aterosklerotiska plack inte återspeglar den verkliga omfattningen av aterosklerotiska plackvolymer, (2) aterosklerotisk lesionskvantifiering är tidskrävande och (3) det kräver djuroffer.
Efter att aortan framgångsrikt har isolerats kan den användas för en mängd olika analyser för molekylära studier. Det kan till exempel användas för biomekaniska studier och histologisk analys för att karakterisera reginal aorta morfologi11. Dessutom kan användare isolera endotelceller och glatta muskelceller från nyisolerad hel aorta för cellodling, FACS-analys och encells-RNA-sekvenseringsanalys. Sammanfattningsvis ger detta protokoll ett steg-för-steg-förfarande för att analysera aterosklerotisk börda hos möss. Utredare kan använda detta protokoll för att jämföra aterosklerotisk lesion överflöd, plats och storlek mellan djur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av ett gemensamt biologiskt konsortium Microgrant som tillhandahölls under NIH-bidrag P30AR070253 (P.-Y.C.) och HL135582 (M.S.). Vi är tacksamma för R. Webber och L. Coon för att upprätthålla mössen som används i denna studie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Eppendorf tube | DENVILLE | C2170 | |
| 10 mL syringe | BD | 302995 | |
| 16% Formaldehyde | Polysciences | 18814-10 | |
| 70% ethanol | VWR | RC2546.70-5 | To clean the dissection tools |
| Black dissection wax | CR Scientific | C3541 | |
| Corn oil | Sigma | C8267 | Solvent for Tamoxifen |
| DNeasy Blood & Tissue kit | QIAGEN | 69506 | To isolate DNA from mouse ear |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (1X DPBS), pH 7.4 | Gibco | 14190-144 | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | To cut the mouse skin and open the ribcage |
| Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | |
| High cholesterol high fat diet | Research Diets | D12108 | To induce atherosclerosis |
| Imaging software | National Institutes of Health | Image J | Aortic lesion quantification |
| Isopropanol | VWR | JT9079-5 | |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | To clean the glass microscope slides |
| McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | ROBOZ | RS-5602 | To separate the heart and the aorta and to cut open the aorta and aorta branches |
| Microscope control software | Olympus | DP Controller | For aorta imaging |
| Minutien pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Needle-25G | BD | 305124 | |
| NonWoven Sponge | McKesson | 94442000 | |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | To stain the atherosclerosis lesions |
| Pall Acrodisc Sterile Syringe Filters with Super Membrane | VWR | 28143-312 | To filter working Oil Red O solution |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15021-15 | To dissect and clean the aorta |
| Statistical software | GraphPad | Prism 8 | Statical analysis |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | For aorta dissection |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | For aorta imaging |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | To induce Cre-loxP recombination |
| Tissue-Tek O.C.T Compound, Sakura Finetek | VWR | 25608-930 | |
| Tweezer Style 4 | Electron Microscopy Sciences | 0302-4-PO | To cut the mouse skin and open the ribcage |
| Tweezer Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 0302-5-PO | To dissect and clean the aorta |
References
- Lusis, A. J.
- Emini Veseli, B., et al.
- Plump, A. S., et al. Severe hypercholesterolemia and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice created by homologous recombination in ES cells. Cell. 71, 343-353 (1992).
- Zhang, S. H., Reddick, R. L., Piedrahita, J. A., Maeda, N. Spontaneous hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking apolipoprotein E. Science. 258, 468-471 (1992).
- Ishibashi, S., et al. Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery. Journal of Clinical Investigation. 92, 883-893 (1993).
- Nakashima, Y., Plump, A. S., Raines, E. W., Breslow, J. L., Ross, R. ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree. Arteriosclerosis Thrombosis. 14, 133-140 (1994).
- Chen, P. Y., et al. Smooth muscle cell reprogramming in aortic aneurysms. Cell Stem Cell. 26, 542-557 (2020).
- Andres-Manzano, M. J., Andres, V., Dorado, B. Oil Red O and Hematoxylin and Eosin Staining for Quantification of Atherosclerosis Burden in Mouse Aorta and Aortic Root. Methods in Molecular Biology. 1339, 85-99 (2015).
- Chen, P. Y., et al. Endothelial TGF-beta signalling drives vascular inflammation and atherosclerosis. Nature Metabolism. 1, 912-926 (2019).
- Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. Imaging of neutral lipids by oil red O for analyzing the metabolic status in health and disease. Nature Protocols. 8, 1149-1154 (2013).
- Ferruzzi, J., Madziva, D., Caulk, A. W., Tellides, G., Humphrey, J. D. Compromised mechanical homeostasis in arterial aging and associated cardiovascular consequences. Biomechanics and Modeling Mechanobiology. 17, 1281-1295 (2018).
