Summary
Her presenteres metoder for å forstå antikrefteffekter av Lactobacillus cellefri supernatant (LCFS). Kolorektal kreftcellelinjer viser celledødsfall når de behandles med LCFS i 3D-kulturer. Prosessen med å generere sfæroider kan optimaliseres avhengig av stillaset, og analysemetodene som presenteres er nyttige for å evaluere de involverte signalveiene.
Abstract
Dette manuskriptet beskriver en protokoll for å evaluere kreftcelledødsfall i tredimensjonale (3D) sfæroider av multicellulære typer kreftceller ved hjelp av supernatanter fra Lactobacillus fermentumcellekultur , betraktet som probiotiske kulturer. Bruk av 3D-kulturer for å teste Lactobacillus cellefrie supernatant (LCFS) er et bedre alternativ enn testing i 2D-monolayers, spesielt ettersom L. fermentum kan produsere antikrefteffekter i tarmen. L. fermentum supernatant ble identifisert å ha økte anti-proliferative effekter mot flere kolorektal kreft (CRC) celler i 3D kulturforhold. Interessant nok var disse effektene sterkt relatert til kulturmodellen, og demonstrerte L. fermentums bemerkelsesverdige evne til å indusere kreftcelledød. Stabile sfæroider ble generert fra forskjellige CRCer (kolorektal kreftceller) ved hjelp av protokollen presentert nedenfor. Denne protokollen for å generere 3D-sfæroid er tidsbesparende og kostnadseffektiv. Dette systemet ble utviklet for å enkelt undersøke anti-kreft effekter av LCFS i flere typer CRC sfæroider. Som forventet, CRC sfæroider behandlet med LCFS sterkt indusert celledød under eksperimentet og uttrykte spesifikke apoptose molekylære markører som analysert av qRT-PCR, western blotting, og FACS analyse. Derfor er denne metoden verdifull for å utforske celle levedyktighet og evaluere effekten av anti-kreftmedisiner.
Introduction
Probiotika er de mest fordelaktige mikroorganismer i tarmen som forbedrer immun homeostase og vert energi metabolisme1. Probiotika fra Lactobacillus og Bifidobacterium er de mest avanserte av sitt slag som finnes i tarmen2,3. Tidligere undersøkelser har vist at Lactobacillus har hemmende og antiproliferative effekter på flere kreftformer, inkludert kolorektal kreft4. Videre forhindrer probiotika inflammatoriske tarmsykdommer, Crohns sykdom og ulcerøs kolitt5,6. Imidlertid ble de fleste studier med probiotika utført i todimensjonale (2D) monolayers som dyrkes på faste overflater.
Kunstige kultursystemer mangler miljøegenskaper, noe som ikke er naturlig for kreftceller. For å overvinne denne begrensningen er tredimensjonale (3D) kultursystemer utviklet7,8. Kreftceller i 3D viser forbedringer når det gjelder grunnleggende biologiske mekanismer, for eksempel celle levedyktighet, spredning, morfologi, cellecellekommunikasjon, legemiddelfølsomhet og in vivo relevans9,10. Videre er sfæroider laget av multicellulære typer kolorektal kreft og er avhengige av cellecelleinteraksjoner og den ekstracellulære matrisen (ECM)11. Vår forrige studie har rapportert at probiotisk cellefri supernatant (CFS) produsert ved hjelp av Lactobacillus fermentum viste anti-kreft effekter på 3D-kulturer av kolorektal kreft (CRC) celler12. Vi foreslo at CFS er en passende alternativ strategi for testing av probiotiske effekter på 3D-sfæroider12.
Her presenterer vi en tilnærming som kan imøtekomme multicellulære typer 3D-kolorektal kreft for analyse av terapeutiske effekter av probiotisk cellefri supernatant (CFS) på flere 3D-kolorektale kreftimileringssystemer. Denne metoden gir et middel for analyse av relaterte probiotiske og anti-kreft effekter in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bakterielle cellekulturer og tilberedning av Lactobacillus cellefri supernatant (LCFS)
MERK: Trinn 1.2 – 1.9 utføres i et anaerobt kammer.
- Forbered en MRS agarplate og buljong som inneholder L-cystein og steriliser ved autoklavering.
- Pre-inkuber MRS agarplaten i H 2 anaerobtkammer opprettholdt ved 37 °C med 20 ppm oksygen.
- Tine Lactobacillus bakteriell bestand og inokuler agarplaten med bakteriekulturen (Figur 1A (i)).
- Inkuber bakterier i 2 - 3 dager i H2 anaerobt kammer ved 37 °C og 20 ppm oksygen til enkle bakteriekolonier er oppnådd.
- Vask og tørk Hungate type anerob kulturrør. Autoklaver kulturrøret ved 121 °C i 15 minutter.
- Inkuber deretter røret i H2 anaerobt kammer ved 37 °C og 20 ppm oksygen for å fjerne oksygen.
- Plasser 2 - 3 ml MRS kjøttkraft inn i røret. Forsegle røret med en butylgummipropp og skru hetten.
- Få en enkelt koloni med en løkke og legg den i 1,5 ml kulturrør med 500 μL 1x PBS. (Figur 1A (ii)).
- Suspender kolonien med en 1 ml sprøyte (Figur 1A (iii)). Gjør dette ved å sette inn nålen på 1 ml sprøyten i midten av rørlokket, aspirere den suspenderte kolonien og deretter gjenopplive den tilbake i MRS-kjøttkraftmediet. (Figur 1A (iv)).
- Inkuber MRS-kjøttkraftmediene i en shaker-inkubator i 2 dager (37 °C, 5 % CO2, 200 o/min).
- Mål den optiske tettheten (OD) ved hjelp av et spektrofotometer for å overvåke bakterielle vekstkurver til absorbansen ved OD620 når til 2,0.
- Skill bakteriepellets og betingede medier ved sentrifugering på 1000 x g i 15 min. Vask de oppsamlede bakterielle pelletsene med 1x PBS og resuspend i 4 ml RPMI 1640 supplert med 10% foster bovint serum. Ikke inkluder antibiotika i mediet.
- Vedlikehold bakteriepellets i RPMI og inkuber i en shaker inkubator i 4 timer ved 37 °C med 5% CO2 med en hastighet på 100 rpm.
- For fremstilling av det probiotiske supernatantet, fjern bakteriell pellet via sentrifugering ved 1000 x g, i 15 min ved 4 °C. Sterilfilteret gjenvinnes supernatant ved hjelp av et filter på 0,22 μm og oppbevares ved −80 °C til bruk.
2. Generering av sfæroider
-
Forbereder kolorektal kreftcellelinjer
- Voks DLD-1, HT-29 og WiDr cellelinjer som monolayers til 70-80% samløp og inkuber platen ved 37 °C i en 5% CO2 inkubator (Vekstmedium: RPMI som inneholder 10% foster bovint serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin).
- For celler som vokser i 100 mm Petri-tallerken, vask platen to ganger med 4 ml 1x PBS. Tilsett 1 ml 0,25% trypsin-EDTA og inkuber Petri-parabolen i 2 min ved 37 °C i en 5 % CO 2-inkubator for å fjerne cellene.
- Etter inkubasjon, se etter celledissosiasjon under et mikroskop og nøytraliser trypsin-EDTA med 5 ml vekstmedium.
- Overfør de dissosierte cellene til et konisk rør på 15 ml og sentrifuger i 3 minutter ved 300 x g.
- Kast supernatanten og resuspend forsiktig med 3 ml vekstmedier.
- Tell cellene med trypan blå for å bestemme levedyktige celler ved hjelp av et hemocytometer. (Figur 1B (i))
-
Sfæroiddannelse
- I et konisk rør på 15 ml fortynnes cellene fra 2,1,5 for å oppnå 1 - 2 x 105 celler/ml (figur 1B (ii))
- Tilsett endelig konsentrasjon på 0,6% metylcellulose til celleopphenget og overfør de fortynnede cellene til et sterilt reservoar.
MERK: For hver cellelinje bør mengden metylcellulose som trengs titreres og bestemmes deretter. - Bruk en flerkanals pipette til å dispensere 200 μL celler til hver brønn i en ultra-lav feste 96-brønns rund bunnmikroplate. (Figur 1B (iii))
- Inkuber platen ved 37 °C i en 5 % CO 2-inkubator i 24 –36 timer.
- Etter 24 - 36 timer, følg platen under et lett mikroskop for å sikre sfæroiddannelse.
3. Behandling av 3D-kolorektal kreftceller med LCFS
- Generer sfæroider som beskrevet i trinn 2 og 3.
- Før du utfører LCFS-behandlingen, tine den frosne LCFS ved romtemperatur (RT) i 10 - 20 min.
- Inokuler LCFS-lagerløsningen til et vekstmedium. Fortynn serielt til 25 %, 12,5 % og 6 % i vekstmediet (dvs. 25 % LCFS = 150 μL vekstmedium + 50 μL LCFS).
- Ta ut cellekulturplaten som inneholder sfæroider fra inkubatoren og fjern så mye av vekstmediet som mulig fra hver brønn ved hjelp av en 200 μL pipette.
- Tilsett vekstmediet med LCFS på cellene og inkuber ved 37 °C i en 5 % CO 2-inkubator i 24 –48 timer.
MERK: Volumet som skal brukes vil avhenge av platestørrelsen som følger: 2 ml for 6-brønns cellekulturplater; 200 μL for 96-brønns cellekulturplater.
4. Celle levedyktighet for sfæroider
- Forbered 8- 10 LCFS-behandlede kolorektal kreftsfæroider i ugjennomsiktigveggede multibrønnplater (celle levedyktighetsanalyser utføres 48 timer etter LCFS-behandling).
- Tine celle levedyktighetsreagenset (se Materialtabellen) ved 4 °C over natten.
- Likevekt celle levedyktighet reagens til romtemperatur før bruk.
- Før du utfører analysen, fjern 50% av vekstmediene fra sfæroidene.
- Tilsett 100 μL celle levedyktighetsreagens til hver brønn.
MERK: Volumet som skal brukes vil avhenge av platestørrelsen som følger: 100 μL for 96-brønns cellekulturplater. - Bland reagenset kraftig i 5 min for å fremme cellelys.
- Inkuber i 30 min – 2 timer ved 37 °C.
- Registrer lysstyrken.
5. Kvantitativ sanntids polymerasekjedereaksjonsanalyse for sfæroider
- For hver tilstand, lag 10 - 15 sfæroider i et 2 ml rør og sentrifuge i 3 min ved 400 x g.
- Kast supernatanten og vask sfæroidene to ganger i 1 ml iskald 1x PBS.
MERK: Unngå sentrifugering, la sfæroidene slå seg ned. - Aspirer så mye av 1x PBS som mulig og isoler RNA ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig sett.
- Syntetiser cDNA fra 1 μg RNA ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig sett i henhold til produsentens protokoll.
- Klargjør en hovedblanding for å kjøre alle prøvene i triplikat (se tabell 1 og tabell 2).
- Utfør forsterkningen i en 20 μL av malmesterblandingen i hver qPCR-plate godt.
- Bland reaksjoner godt og spinn om nødvendig.
- Kjør prøver i henhold til anbefalingene fra instrumentprodusenten (tabell 3).
6. Vestlig blotting fra sfæroider
MERK: Når du samler sfæroider, bruk en 200 μL pipette og kutt enden av spissene for å unngå å forstyrre strukturen.
- For hver tilstand, lag 30 - 40 sfæroider i et 2 ml rør.
- Plasser røret på isen og la sfæroidene slå seg ned til bunnen av 2 ml-røret.
- Kast supernatanten og vask sfæroidene to ganger i 1 ml iskald 1x PBS
MERK: Unngå sentrifugering, la sfæroidene slå seg ned. - Aspirer så mye av 1x PBS som mulig og tilsett RIPA-buffer med en proteasehemmercocktail (10 sfæroider = 30 μL RIPA-buffer).
- Lyse cellene ved pipettering opp og ned og utføre sonikering i 30 s med 30 s hvile på is i 10 sykluser.
- Sentrifuger proteinet lyser ved 15000 x g i 15 min ved 4 °C.
- Bestem proteinkonsentrasjonen for hver cellelysat.
- Før lasting, kok hver celle lysat i en prøvebuffer ved 100 °C i 10 minutter.
- Last like mengder protein inn i brønnene på SDS-PAGE gelen og kjør gelen i 1 - 2 timer ved 100 V.
- Overfør proteinet fra gelen til PVDF-membranen.
- Etter overføring, blokker membranen i 1 time ved romtemperatur ved hjelp av en blokkeringsbuffer (5% skummet melk + TBS med 0,05% Tween-20).
- Inkuber membranen med 1:1000 fortynninger av primært antistoff (Tabell 4) i 1x TBST med 5% BSA buffer ved 4 °C over natten.
- Vask membranen tre ganger med TBST, 15 min for hver vask.
- Inkuber membranen med 1:2500 fortynninger av sekundært antistoff i blokkeringsbufferen ved romtemperatur i 2 timer (se Materialtabell).
- Vask membranen tre ganger med TBST, 15 min for hver vask.
- Forbered membranen for HRP-deteksjon med et chemiluminescent substrat.
- Skaff deg chemiluminescent bilder.
7. Propidiumjodid (PI) farging av sfæroider
- Forbered 5-10 sfæroider som beskrevet i trinn 4.1 og legg sfæroidene i en inkubator ved 37 °C og 5 % CO2.
- Fortynn en 1 mg/ml lager av PI 1:100 i 1x PBS.
- Fjern 50% av mediet fra hver brønn på 96-brønnsplaten.
- Tilsett 100 μL av PI-oppløsningen til hver brønn og legg brønnene i en inkubator ved 37 °C og 5 % CO2 i 10 –15 minutter.
- Vask ut PI-oppløsningen med 1x PBS.
- Tilsett 200 μL vekstmedium og ta et bilde ved hjelp av et fluorescensmikroskop. Analyser fluorescensintensiteten ved hjelp av bilde J for å få levedyktighetsantallet til sfæroidet.
8. FACS analyse av sfæroider
- Generer sfæroider som beskrevet tidligere.
- For hver tilstand, lag 30 - 40 sfæroider i et FACS-rør og sentrifuge i 3 min ved 400 x g og RT.
- Aspirer supernatanten og vask sfæroidene i 3 ml 1x PBS, og sentrifuger deretter ved 400 x g i 3 minutter ved 4 °C.
- Aspirer supernatanten og tilsett 200 μL 0,25% Trypsin-EDTA, og inkuber deretter på RT i 2 -3 min.
MERK: Inkubasjonstiden avhenger av sfæroidstørrelsen og celletypen. - Tilsett 1 ml FACS-buffer og fjern forsiktig sfæroidene ved hjelp av en 200 μL pipette.
- Sentrifuger de dissosierte cellene ved 400 x g og 4 °C i 3 minutter.
MERK: FACS-buffer = 1x PBS + 2,5 % FBS, filtrert med et toppfilter på 0,22 μm. - Kast supernatanten og tilsett 7-AAD/Annexin V-reagenset (7AAD (5 μL), annexin V (5 μL)/sample).
- Virvel cellene forsiktig og inkuber i 13 - 30 min på RT i mørket.
- Tilsett 500 μL FACS-buffer og filtrer cellene ved hjelp av koniske polystyren-reagensrør for å fjerne aggregerte celler.
- Sentrifuge ved 400 x g og 4 °C i 3 minutter.
- Tilsett 500 μL annexin V bindingsbuffer i hvert rør og resuspend.
- Analyser ved hjelp av et strømningscytometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi beskriver protokollen for å skaffe sfæroider fra forskjellige kolorektal kreftcellelinjer. Tilskudd med metylcellulose var nødvendig for å generere sfæroider. Vi presenterer også en metode for LCFS-forberedelse og presenterer en modell for å studere sammenhengen mellom probiotika og kolorektal kreft. Sfæroiddannelse og LCFS-forberedelsesprotokoller er skjematisk illustrert i figur 1A,B. Som vist i figur 2Aforvandler metylcellulosekonsentrasjonen på 0,6% kreftcellene til kompakte sfæroider. Dette resultatet indikerer at sfæroider kan genereres fra flere typer kolorektal kreft ved hjelp av vår metylcelluloseprotokoll. Deretter ble sfæroidene behandlet med 25% LCFS og morfologien ble studert etter 48 timer ved hjelp av et lysmikroskop. Som vist i figur 3Aviste sfæroidene til gruppene som ble behandlet med LCFS, forstyrrede overflater. For å undersøke antikrefteffektene av LCFS ved passende konsentrasjoner, ble sfæroidene behandlet i 48 timer med ulike doser av LCFS: 0 (kontroll), 6%, 12,5% og 25%. Forstyrrelser i sfæroidmorfologien ble observert hos sfæroider behandlet med 25% LCFS, som vist i figur 3B. I tillegg ble sfæroidene behandlet med 25% LCFS i 24 timer og 48 timer, og forstyrrelser i sfæroid morfologi ble observert etter 48 timers behandling. Mikroskopiske bilder av sfæroidene er vist i figur 3C.
Etter 48 timer ble prøvene vurdert med celle levedyktighetsanalyse, og kolorektal kreftcelledød ble observert ved behandling med LCFS på en doseavhengig måte, høyere LCFS-mengden høyere observert celledød (Figur 3D). Vi farget deretter prøvene med propidiumjodid (PI) for å observere apoptose. Som forventet var induksjonen av apoptose avhengig av LCFS-dosen (figur 4A, B, C). RT-PCR ble utført for å oppdage endringene i molekylære markører av apoptosedvs. Til slutt ble apoptosemarkører studert ved hjelp av vestlig blotting og annexin V/7AAD gjennom FACS (Figur 6A, B, C, D). Disse observasjonene viser at LCFS effektivt induserte apoptose i 3D-modellen.
Figur 1: Skjematisk representasjon av sfæroiddannelse og LCFS-tilberedning.
(A) Skjematiske representasjonsbilder av LCFS-genereringsprotokollen er merket med (i-iv) (B) Skjemaer for metylcellulosemediert sfæroiddannelse er merket med (i-iii). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Metylcellulosemediert sfæroiddannelse.
(A) Representative bilder av metylcellulosemediert sfæroiddannelse av HT-29, DLD1 og WiDr. Celler ble sådd i ultra-lav vedlegg 96-brønns runde bunnplater med metylcellulosekonsentrasjoner på 0,1-1,2% i 48 timer. Skalastang 10 μm (n=3 for hvert eksperiment). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Evaluering av LCFS-konsentrasjon og sfæroid morfologi.
(A) Representative bilder av HT-29 behandlet med LCFS i 48 timer. Skala bar 100 μm. (B) HT-29, DLD1 og WiDr sfæroider behandlet med økende doser LCFS i 48 timer. Alle sfæroider hadde forstyrret kantene på 12,5-25% LCFS. Skalastang 20 μm (n = 3 for hvert eksperiment) (C) Sfæroid morfologier av HT-29, DLD1 og WiDr sfæroider behandlet med 25% LCFS i 24 og 48 timer. Skalastang 20 μm (n = 3) (D) Målt celle levedyktighet, vist som gjennomsnittlig ± SEM. ***, P < 0,05 (n = 3 for hvert eksperiment). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Propidiumjodfarging av sfæroidene.
Representative bilder av PI farging i (A) HT-29, (B) DLD1, og (C) WiDr sfæroider etter 48 h av LCFS behandling. Bildene ble anskaffet ved hjelp av et fluorescensmikroskop og økningen i PI-intensitet ble målt ved hjelp av Image J. Scale bar 10 μm. Gjennomsnittlig ± SEM vises. , P < 0,05 (n = 3 for hvert eksperiment). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Apoptosemarkører ble identifisert ved hjelp av qRT-PCR.
Apoptosemarkører, som BAX, BAK og NOXA, ble kvantifisert. mRNA-kvantifisering presenteres som et relativt uttrykk normalisert til (A) β-aktin og (B) 18s rRNA. Gjennomsnittlig ± SEM vises. , P < 0,05 (n=3 for hvert eksperiment). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Apoptosemarkører ble bestemt via vestlig blotting og FACS-analyse av sfæroidene.
Vist i figuren er vestlige flekker av (A) HT-29, (B) DLD1, og (C) WiDr celler etter LCFS behandling. PARP1, BCL-XL og p-IκBα ble oppdaget. β-aktin ble brukt som internkontroll. (D) FACS analyse av apoptose i HT-29, DLD1 og WiDr sfæroider inkubert med LCFS. Apoptotiske celler ble oppdaget av økningen i fluorescensintensiteten til Annexin V-FITC. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Reaksjon | Volum per enkelt 20 μL |
| 2X qPCR-blanding | 10 μL |
| Foroverprimer (10 pmols/μL) | 1 μL |
| Omvendt primer (10 pmols/μL) | 1 μL |
| cDNA (50 ng/μL) | 1 μL |
| PCR-klasse vann | 7 μL |
Tabell 1: PCR reaksjonsblanding.
| Grunning | Sekvens |
| BAX - fremover | CCCGAGAGGTCTTTTTTCCGAG |
| BAX - omvendt | CCAGCCCATGATGGTTCTGAT |
| BAK- Fremover | ATGGTCACCTTACCTCTGCAA |
| BAK- Omvendt | TCATAGCGTCGGTTGATGTCG |
| NOXA - Fremover | ACCAAGCCGGATTTGCGATT |
| NOXA- Omvendt | ACTTGCACTTGTTCCTCGTGG |
| 18 rRNA-forover | GATGGGCGGCGGAAAATAG |
| 18s rRNA-Revers | GCGTGGATTCTGCATAATGGT |
| β-Actin-Forward | TCCTGTGGCATCCACGAAACT |
| β-Actin-Reverse | GAAGCATTTGCGGTGGACGAT |
Tabell 2: Primersekvenser brukt i qRT-PCR-analyse.
| Stadium | Temperatur (ºC) | Tid |
| Innledende denaturering | 95 | 10 min |
| 40 sykluser: | ||
| Trinn 1 | 95 | 15 sek |
| Trinn 2 | 60 | 60 sek |
| Smeltekurvestadium | 95 | 15 sek |
| 60 | 60 sek | |
| 95 | 15 sek | |
Tabell 3: qRT-PCR-forhold.
| Antistoff | Fortynning |
| PARP 1 (C2-10) | 1:1000 |
| BCL-XL (H-5) | 1:1000 |
| p-IκBα (B-9) | 1:1000 |
| β-aktin (C4) | 1:1000 |
| Geit antimus IgG (H +L) | 1:2500 |
| Geit Anti-Kanin IgG (H +L) | 1:2500 |
Tabell 4: Antistoffer brukt i vestlig blotanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vevsmikromiljøet, inkludert nærliggende celler og den ekstracellulære matrisen (ECM), er grunnleggende for vevsgenerering og avgjørende for kontroll av cellevekst og vevsutvikling13. 2D-kulturer har imidlertid flere ulemper, for eksempel forstyrrelse av cellulære interaksjoner, samt endringer i cellemorfologi, ekstracellulære miljøer og tilnærmingen til divisjon14. 3D-cellekultursystemer har blitt grundig studert for bedre å reprodusere in vivo-effekter, og har blitt bevist som mer presise systemer for in vitro kreft testing15,16. Det er behov for at modellsystemer mer nøyaktig forutsier personlige svar på kjemoterapeutisk17.
3D stillas ble utviklet for vevsteknikk. Det fungerer som et surrogattap av ECM, som representerer den tilgjengelige plassen til tumorceller. I tillegg gir stillaset fysiske interaksjoner for celleadhesjon og spredning og fører til at celler danner passende romlige fordelinger og celle-ECM eller cellecelleinteraksjoner18. Metylcellulose (MC)-polymeren er kontinuerlig studert for å fastslå egnetheten til å generere MC-baserte hydrogelsystemer for applikasjoner i 3D-cellekulturteknikk19,20. Imidlertid er intakt innlemmelse av disse hydrogelene i biomaterialer som 3D-cellenettverk fortsatt teknisk utfordrende21. Derfor anbefaler sfæroiddannelsesprotokollen som presenteres her titrering av MC-konsentrasjoner og optimalisering med forskjellige tidspunkter for hver CRC-cellelinje. Cellelinjespesifikke egenskaper, for eksempel celleaggregering, levedyktighet og død, kan ha betydelig innvirkning på hver av betingelsene vi testet. Denne metoden kan gi et middel til å generere ensartede sfæroider for testing av LCFS på kreftceller.
Probiotika, som er gunstige bakterier, produserer aktive metabolitter som potensielt kan etterligne antikrefteffekter. Dermed ble studien vår designet for å isolere melkesyrebakterier (LAB) og teste antikrefteffektene av deres metabolske ekstrakter fra cellefrie supernatanter (CFS). Våre studier ga en metode for å observere effekten av L. fermentumcellefrie supernatanter som induserer apoptotisk celledød i kolorektal kreftceller i et 3D-system. MRNA-nivåene av apoptosemarkører involvert i apoptotiske veier blir dramatisk indusert etter LCFS-eksponering under 3D-forhold. Videre ble reduserte nivåer av PARP1 og BCL-XL uttrykt i den LCFS-behandlede 3D-sfæroidkontrollen sammenlignet med kontrollen i figur 4C, D,E. Hemming av NF-κB-aktivering ble også observert i 3D-kulturer etter behandling med LCFS. Samlet sett inkluderer fordelene ved å dyrke celler i 3D økende cellecelleinteraksjoner og respons på signalmolekyler for bedre å etterligne in vivo-systemer. Vestlig blotting ved hjelp av sfæroider kan føre til kvantitativ innsikt i tilstanden til ulike signalmolekyler.
Cellelinjer har visse begrensninger som prekliniske modeller for kreftforskning. Nylig har kreftorganoider blitt brukt i modellering av personlig anti-kreftbehandling22,23. Behandlingen av LCFS med probiotika i organoider forventes å bli brukt som en kraftig plattform for å teste antikrefteffekter. Videre testet vi bare en av Lactobacillus-artene blant de forskjellige probiotika i kreftmodellen. Ulike probiotika blir også testet for forebygging av metabolsk syndrom, immunologiske og nevrologiske lidelser24,25,26. LCFS fra Bifidobacterium, Saccharomyces, Streptococcus, Enterococcusog Akkermansia arter er potensielle kandidater for testing av helsemessige fordeler gjennom ulike typer sykdomsmodeller27,28,29.
Basert på denne studien kan det konkluderes med at forståelsen av signalering i sfæroider og de ulike responsene på LCFS-behandling i 3D-modeller kan være gunstig for å teste antikrefteffekter ved hjelp av metoden vi foreslo. I tillegg kan 3D kreftmodeller gi flere fordeler som ikke er mulig med tradisjonelle 2D-monolayers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen relevante økonomiske opplysninger.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av "Etablering av målestandarder for kjemi og stråling", tilskuddsnummer KRISS-2020-GP2020-0003, og "Utvikling av målestandarder og teknologi for biomaterialer og medisinsk konvergens", tilskuddsnummer KRISS-2020-GP2020-0004 programmer, finansiert av Korea Research Institute of Standards and Science. Denne forskningen ble også støttet av Vitenskaps- og IKT-departementet (MSIT), National Research Foundation of Korea (NRF-2019M3A9F3065868), Helse- og velferdsdepartementet (MOHW), Korea Health Industry Development Institute (KHIDI, HI20C0558), Nærings- og energidepartementet (MOTIE) og Korea Evaluation Institute of Industrial Technology (KEIT, 20009350). ORCID ID (Hee Min Yoo: 0000-0002-5951-2137; Dukjin Kang: 0000-0002-5924-9674; Seil Kim: 0000-0003-3465-7118; Joo-Eun Lee: 0000-0002-2495-1439; Jina Lee: 0000-0002-3661-3701). Vi takker Chang Woo Park for hjelp med eksperimenter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 15-well, 15 µl |
Biorad | 4561036 | Pkg of 10 |
| Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | 100 covers |
| 10x transfer buffer | Intron | IBS-BT031A | 1 L |
| 10X Tris-Glycine (W/SDS) | Intron | IBS-BT014 | 1 L |
| Axygen 2.0 mL MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube, Polypropylene, Clear, Nonsterile, 500 Tubes/Pack, 10 Packs/Case | Corning | SCT-200-C | 500 Tubes/Pack, 10 Packs/Case |
| BD Difco Bacto Agar | BD | 214010 | 500 g |
| BD Difco Lactobacilli MRS Broth | BD | DF0881-17-5 | 500 g |
| CellTiter-Glo 3D Cell viability assay | Promega | G9681 | 100μl/assay in 96-well plates |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11697498001 | vial of 20 tablets |
| Corning Phosphate-Buffered Saline, 1X without calcium and magnesium, PH 7.4 ± 0.1 | Corning | 21-040-CV | 500 mL |
| EMD Millipore Immobilon-P PVDF Transfer Membranes | fisher Scientific | IPVH00010 | 26.5cm x 3.75m roll; Pore Size: 0.45um |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | 25/Pack, 500/Case |
| Fetal Bovine Serum, certified, US origin | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | 500 mL |
| iScript cDNA Synthesis Kit, 25 x 20 µl rxns #1708890 | Biorad | 1708890 | 25 x 20 µL rxns |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Biorad | 1725121 | 5 x 1 mL |
| Lactobacillus fermentum | Korean Collection for Type Cultures | KCTC 3112 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | C6852-25G | 25 g |
| Methyl Cellulose (3500-5600mPa·s, 2% in Water at 20°C) | TCI | M0185 | 500 g |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL | Applied Biosystems | 4346906 | 20 plates |
| Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm, mixed cellulose esters, 33 mm, ethylene oxide sterilized | Millipore | SLGS033SB | 250 |
| PE Annexin V Apoptosis Detection Kit with 7-AAD | Biolegend | 640934 | 100 tests |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 mL |
| Propidium Iodide | Introgen | P1304MP | 100 mg |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | Thermo Fisher Scientific | 89901 | 250 mL |
| RNeasy Mini Kit (250) | Qiagen | 74106 | 250 |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-119 | 500 mL |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | 100 mL |
| Name of Materials/Equipment/Software | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| anti - p-IκBα (B-9) | Santa cruze | sc-8404 | 200 µg/mL |
| anti-BclxL (H-5) | Santa cruze | sc-8392 | 200 µg/mL |
| anti-PARP 1 (C2-10) | Santa cruze | sc-53643 | 50 µl ascites |
| anti-β-actin (C4) | Santa cruze | sc-47778 | 200 µg/mL |
| BD FACSVerse | BD Biosciences | San Diego, CA, USA | |
| Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader | BioT | S1LFA | |
| CO2 incubator | Thermo fisher | HERAcell 150i | |
| Conical tube 15 ml | SPL | 50015 | |
| Conical tube 50 ml | SPL | 50050 | |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Sigma-Aldrich | CLS7007 | |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Sigma-Aldrich | CLS3471 | |
| Costar 50 mL Reagent Reservoirs, 5/Bag, Sterile | Costar | 4870 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermofisher | C10228 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | invitrogen | AMQAF1000 | |
| EnSpire Multimode Reader | Perkin Elmer | Enspire 2300 | |
| Eppendorf Research Plus Multi Channel Pipette, 8-channel | Eppendorf | 3122000051 | |
| FlowJo software | TreeStar | Ashland, OR, USA | |
| Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson immunoresearch | 115-035-062 | 1.5 mL |
| Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson immunoresearch | 111-035-144 | 2.0 mL |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad Software | Inc., San Diego, CA, USA | |
| ImageJ | NIH | ||
| ImageQuant LAS 4000 mini | Fujifilm | Tokyo, Japan | |
| Incubated shaker | Lab companion | SIF-6000R | |
| Multi Gauge Ver. 3.0, | Fujifilm | Tokyo, Japan | |
| Optical density (OD)LAMBDA UV/Vis Spectrophotometers | Perkin Elmer | Waltham, MA, USA | |
| Phase-contrast microscope | Olympus | Tokyo, Japan | |
| SPL microcentrifuge tube 1.5mL | SPL | 60015 | |
| SPL Multi Channel Reservoirs, 12-Chs, PS, Sterile | SPL | 21012 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | Waltham, MA, USA | |
| Vibra-Cell Ultrasonic Liquid Processors | SONICS-vibra cell | VC 505 | 500 Watt ultrasonic processor |
| Vinyl Anaerobic Chamber | COY LAB PRODUCTS |
References
- Bron, P. A., Van Baarlen, P., Kleerebezem, M. Emerging molecular insights into the interaction between probiotics and the host intestinal mucosa. Nature Reviews Microbiology. 10 (1), 66-78 (2012).
- Ruiz, L., Delgado, S., Ruas-Madiedo, P., Sánchez, B., Margolles, A. Bifidobacteria and their molecular communication with the immune system. Frontiers in Microbiology. 8, 1-9 (2017).
- Sanders, M. E., Merenstein, D. J., Reid, G., Gibson, G. R., Rastall, R. A. Probiotics and prebiotics in intestinal health and disease: from biology to the clinic. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 16 (10), 605-616 (2019).
- Pandey, K. R., Naik, S. R., Vakil, B. V. Probiotics, prebiotics and synbiotics- a review. Journal of Food Science and Technology. 52 (12), 7577-7587 (2015).
- Harish, K., Varghese, T.
- Routy, B., et al. The gut microbiota influences anticancer immunosurveillance and general health. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (6), 382-396 (2018).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. Most of the cell-based data-harvesting efforts that drive the integration of cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
- Jong, B. K. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 365-377 (2005).
- Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 6, 19103 (2016).
- Anton, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-dimensional cell culture: A breakthrough in vivo. International Journal of Molecular Sciences. 16 (3), 5517-5527 (2015).
- Lee, J. E., et al. Characterization of the Anti-Cancer Activity of the Probiotic Bacterium Lactobacillus fermentum Using 2D vs. 3D Culture in Colorectal Cancer Cells. Biomolecules. 9 (10), 557 (2019).
- Koledova, Z. 3D cell culture: An introduction. Methods in Molecular Biology. 1612, (2017).
- Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
- Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 1-14 (2018).
- Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: The missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
- Mazzocchi, A. R., Rajan, S. A. P., Votanopoulos, K. I., Hall, A. R., Skardal, A. In vitro patient-derived 3D mesothelioma tumor organoids facilitate patient-centric therapeutic screening. Scientific Reports. 8, 2886 (2018).
- Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).
- Thirumala, S., Gimble, J., Devireddy, R. Methylcellulose Based Thermally Reversible Hydrogel System for Tissue Engineering Applications. Cells. 2 (3), 460-475 (2013).
- Chandrashekran, A., et al. Methylcellulose as a scaffold in the culture of liver-organoids for the potential of treating acute liver failure. Cell and Gene Therapy Insights. 4 (11), 1087-1103 (2018).
- Lee, W., Park, J. 3D patterned stem cell differentiation using thermo-responsive methylcellulose hydrogel molds. Scientific Reports. 6, 1-11 (2016).
- Fan, H., Demirci, U., Chen, P. Emerging organoid models: Leaping forward in cancer research. Journal of Hematology and Oncology. 12 (1), 1-10 (2019).
- Drost, J., Clevers, H.
- Liou, C. S., et al. A Metabolic Pathway for Activation of Dietary Glucosinolates by a Human Gut Symbiont. Cell. 180 (4), 717-728 (2020).
- Sherwin, E., Bordenstein, S. R., Quinn, J. L., Dinan, T. G., Cryan, J. F.
- Honda, K., Littman, D. R. The microbiota in adaptive immune homeostasis and disease. Nature. 535 (7610), 75-84 (2016).
- Bárcena, C., et al. Healthspan and lifespan extension by fecal microbiota transplantation into progeroid mice. Nature Medicine. 25 (8), 1234-1242 (2019).
- Michalovich, D., et al. Obesity and disease severity magnify disturbed microbiome-immune interactions in asthma patients. Nature Communications. 10, 5711 (2019).
- Ansaldo, E., et al. Akkermansia muciniphila induces intestinal adaptive immune responses during homeostasis. Science. 364 (6446), 1179-1184 (2019).
