Summary
Qui vengono presentati i metodi per comprendere gli effetti anti-cancro del surnatante senza cellule di Lactobacillus (LCFS). Le linee cellulari del cancro del colon-retto mostrano decessi cellulari quando trattati con LCFS in colture 3D. Il processo di generazione degli sferoidi può essere ottimizzato a seconda dell'impalcatura e i metodi di analisi presentati sono utili per valutare le vie di segnalazione coinvolte.
Abstract
Questo manoscritto descrive un protocollo per valutare le morti delle cellule tumorali in sferoidi tridimensionali (3D) di tipi multicellulari di cellule tumorali utilizzando supernatanti da coltura cellulare di Lactobacillus fermentum , considerati come colture probiotiche. L'uso di colture 3D per testare il surnatante privo di cellule di Lactobacillus (LCFS) è un'opzione migliore rispetto al test in monostrati 2D, soprattutto perché L. fermentum può produrre effetti anti-cancro all'interno dell'intestino. L. fermentum supernatant è stato identificato per possedere un aumento degli effetti anti-proliferativi contro diverse cellule del cancro del colon-retto (CRC) in condizioni di coltura 3D. È interessante notare che questi effetti erano fortemente correlati al modello di coltura, dimostrando la notevole capacità di L. fermentum di indurre la morte delle cellule tumorali. Gli sferoidi stabili sono stati generati da diversi CRC (cellule tumorali del colon-retto) utilizzando il protocollo presentato di seguito. Questo protocollo di generazione di sferoidi 3D consente di risparmiare tempo ed è conveniente. Questo sistema è stato sviluppato per studiare facilmente gli effetti anti-cancro di LCFS in più tipi di sferoidi CRC. Come previsto, gli sferoidi CRC trattati con LCFS hanno fortemente indotto la morte cellulare durante l'esperimento ed espresso specifici marcatori molecolari di apoptosi analizzati mediante qRT-PCR, western blotting e analisi FACS. Pertanto, questo metodo è prezioso per esplorare la vitalità cellulare e valutare l'efficacia dei farmaci anti-cancro.
Introduction
I probiotici sono i microrganismi più vantaggiosi nell'intestino che migliorano l'omeostasi immunitaria e il metabolismo energetico dell'ospite1. I probiotici di Lactobacillus e Bifidobacterium sono i più avanzati del suo genere trovati nell'intestino2,3. Precedenti indagini hanno dimostrato che Lactobacillus ha effetti inibitori e antiproliferativi su diversi tumori, tra cui il cancro delcolon-retto 4. Inoltre, i probiotici prevengono le malattie infiammatorie intestinali, il morbo di Crohn e la colite ulcerosa5,6. Tuttavia, la maggior parte degli studi con probiotici sono stati eseguiti in monostrati bidimensionali (2D) che vengono coltivati su superfici solide.
I sistemi di coltura artificiale mancano di caratteristiche ambientali, il che non è naturale per le cellule tumorali. Per superare questa limitazione, sono stati sviluppati sistemi di coltura tridimensionali (3D)7,8. Le cellule tumorali in 3D mostrano miglioramenti in termini di meccanismi biologici di base, come la vitalità cellulare, la proliferazione, la morfologia, la comunicazione cellula-cellula, la sensibilità ai farmaci e la rilevanza in vivo9,10. Inoltre, gli sferoidi sono costituiti da tipi multicellulari di cancro del colon-retto e dipendono dalle interazioni cellula-cellula e dalla matrice extracellulare (ECM)11. Il nostro studio precedente ha riportato che il surnatante probiotico privo di cellule (CFS) prodotto utilizzando Lactobacillus fermentum ha mostrato effetti anti-cancro su colture 3D di cellule di cancro del colon-retto (CRC)12. Abbiamo proposto che la CFS sia una strategia alternativa adatta per testare gli effetti probiotici sugli sferoidi 3D12.
Qui, presentiamo un approccio che può ospitare tipi multicellulari di cancro del colon-retto 3D per l'analisi degli effetti terapeutici del surnatante probiotico senza cellule (CFS) su diversi sistemi di mimetismo del cancro del colon-retto 3D. Questo metodo fornisce un mezzo per l'analisi degli effetti probiotici e anti-cancro correlati in vitro.
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Protocol
1. Colture cellulari batteriche e preparazione di Lactobacillus cell-free surnatante (LCFS)
NOTA: I passaggi 1.2 – 1.9 sono condotti in una camera anaerobica.
- Preparare una piastra di agar MRS e un brodo contenente L-cisteina e sterilizzare in autoclave.
- Pre-incubare la piastra di agar MRS in camera anaerobica H2 mantenuta a 37 °C con 20 ppm di ossigeno.
- Scongelare lo stock batterico di Lactobacillus e inoculare la piastra di agar con la coltura batterica (Figura 1A (i)).
- Incubare i batteri per 2 - 3 giorni in camera anaerobica H2 a 37 °C e 20 ppm di ossigeno fino ad ottenere singole colonie batteriche.
- Lavare e asciugare il tubo di coltura anerobica di tipo Hungate. Autoclave del tubo di coltura a 121 °C per 15 min.
- Quindi incubare il tubo in camera anaerobica H2 a 37 °C e 20 ppm di ossigeno per rimuovere l'ossigeno.
- Posizionare 2 - 3 ml di brodo MRS nel tubo. Sigillare il tubo con un tappo di gomma butilica e avvitare il cappuccio.
- Ottenere una singola colonia con un anello e posizionarla nel tubo di coltura da 1,5 ml con 500 μL di 1x PBS. (Figura 1A (ii)).
- Sospendere la colonia utilizzando una siringa da 1 mL (Figura 1A (iii)). Farlo inserendo l'ago della siringa da 1 mL al centro del coperchio del tubo, aspirando la colonia sospesa e quindi riutilizzandola nel mezzo di brodo MRS. (Figura 1A (iv)).
- Incubare il mezzo di brodo MRS in un incubatore shaker per 2 giorni (37 °C, 5% CO2, 200 rpm).
- Misurare la densità ottica (OD) utilizzando uno spettrofotometro per monitorare le curve di crescita batterica fino a quando l'assorbanza a OD620 raggiunge 2.0.
- Separare il pellet batterico e il mezzo condizionato centrifugando a 1.000 x g per 15 min. Lavare i pellet batterici raccolti con 1x PBS e riconsesporre in 4 ml di RPMI 1640 integrato con il 10% di siero bovino fetale. Non includere antibiotici nel mezzo.
- Mantenere i pellet batterici in RPMI e incubare in un incubatore shaker per 4 ore a 37 °C con il 5% di CO2 ad una velocità di 100 rpm.
- Per la preparazione del surnatante probiotico, rimuovere il pellet batterico tramite centrifugazione a 1000 x g,per 15 min a 4 °C. Filtrare sterile il surnatante recuperato utilizzando un filtro da 0,22 μm e conservare a -80 °C fino all'uso.
2. Generazione di sferoidi
-
Preparazione delle linee cellulari del cancro del colon-retto
- Coltivare linee cellulari DLD-1, HT-29 e WiDr come monostrati fino al 70-80% di confluenza e incubare la piastra a 37 °C in un incubatore co2 al 5% (terreno di crescita: RPMI contenente il 10% di siero bovino fetale (FBS) e l'1% di penicillina-streptomicina).
- Per le cellule coltivate in una capsula di Petri da 100 mm, lavare la piastra due volte con 4 ml di 1x PBS. Aggiungere 1 mL di tripsina-EDTA allo 0,25% e incubare la capsula di Petri per 2 minuti a 37 °C in un incubatore a CO2 al 5% per dissociare le cellule.
- Dopo l'incubazione, verificare la dissociazione cellulare al microscopio e neutralizzare la tripsina-EDTA con 5 ml di terreno di coltura.
- Trasferire le cellule dissociate in un tubo conico da 15 ml e centrifugare per 3 minuti a 300 x g.
- Scartare il surnatante e risospentare delicatamente con 3 ml di terreno di crescita.
- Contare le cellule con tripano blu per determinare le cellule vitali usando un emocitometro. (Figura 1B (i))
-
Formazione sferoide
- In un tubo conico da 15 mL, diluire le cellule da 2.1.5 per ottenere 1 - 2 x 105 celle/mL (Figura 1B (ii))
- Aggiungere la concentrazione finale dello 0,6% di metilcellulosa alla sospensione cellulare e trasferire le cellule diluite in un serbatoio sterile.
NOTA: Per ogni linea cellulare, la quantità di metilcellulosa necessaria deve essere titolata e determinata di conseguenza. - Utilizzare una pipetta multicanale per erogare 200 μL di celle a ciascun pozzera di una micropiastra a fondo tondo a 96 pozzette con attacco ultra-basso. (Figura 1B (iii))
- Incubare la piastra a 37 °C in un incubatore a CO2 al 5% per 24 - 36 ore.
- Dopo 24 - 36 ore, osservare la piastra al microscopio ottico per garantire la formazione di sferoidi.
3. Trattamento delle cellule tumorali del colon-retto 3D con LCFS
- Generare sferoidi come descritto nei passaggi 2 e 3.
- Prima di eseguire il trattamento LCFS, scongelare l'LCFS congelato a temperatura ambiente (RT) per 10 - 20 min.
- Inoculare la soluzione stock LCFS in un mezzo di crescita. Diluire in serie al 25%, 12,5% e 6% nel mezzo di crescita (cioè 25% LCFS = 150 μL di terreno di crescita + 50 μL di LCFS).
- Estrai la piastra di coltura cellulare contenente sferoidi dall'incubatore e rimuovi il più possibile il mezzo di crescita da ciascun pozzo usando una pipetta da 200 μL.
- Aggiungere il mezzo di crescita con LCFS sulle cellule e incubare a 37 °C in un incubatore CO2 al 5% per 24 - 48 ore.
NOTA: il volume da utilizzare dipenderà dalla dimensione della piastra come segue: 2 ml per piastre di coltura cellulare a 6 pozzi; 200 μL per piastre di coltura cellulare a 96 pozzi.
4. Vitalità cellulare per sferoidi
- Preparare 8 - 10 sferoidi del cancro del colon-retto trattati con LCFS in piastre multi-pozzo a parete opaca (i saggi di vitalità cellulare vengono eseguiti 48 ore dopo il trattamento con LCFS).
- Scongelare il reagente di vitalità cellulare (vedi Tabella dei materiali)a 4 °C per la notte.
- Equilibrare il reagente di vitalità cellulare a temperatura ambiente prima dell'uso.
- Prima di eseguire il test, rimuovere il 50% dei mezzi di crescita dagli sferoidi.
- Aggiungere 100 μL di reagente di vitalità cellulare a ciascun pozzo.
NOTA: il volume da utilizzare dipenderà dalla dimensione della piastra come segue: 100 μL per piastre di coltura cellulare a 96 pozzi. - Mescolare vigorosamente il reagente per 5 minuti per promuovere la lisi cellulare.
- Incubare per 30 min – 2 h a 37 °C.
- Registrare la luminescenza.
5. Analisi quantitativa in tempo reale della reazione a catena della polimerasi per gli sferoidi
- Per ogni condizione, preparare 10 - 15 sferoidi in un tubo da 2 ml e centrifugare per 3 minuti a 400 x g.
- Scartare il surnatante e lavare gli sferoidi due volte in 1 mL di PBS 1x ghiacciato.
NOTA: Evitare la centrifugazione, lasciare che gli sferoidi si depositino. - Aspirare il più possibile il PBS 1x e isolare l'RNA utilizzando un kit disponibile in commercio.
- Sintetizzare cDNA da 1 μg di RNA utilizzando un kit disponibile in commercio secondo il protocollo del produttore.
- Preparare un mix principale per eseguire tutti i campioni in triplice copia (vedere Tabella 1 e Tabella 2).
- Eseguire l'amplificazione in un mix master di modelli da 20 μL in ogni piastra qPCR.
- Mescolare bene le reazioni e girare se necessario.
- Eseguire campioni secondo le raccomandazioni del produttore dello strumento (Tabella 3).
6. Western blotting da sferoidi
NOTA: Quando si raccolgono gli sferoidi, utilizzare una pipetta da 200 μL e tagliare l'estremità delle punte per evitare di disturbare la loro struttura.
- Per ogni condizione, preparare 30 - 40 sferoidi in un tubo da 2 ml.
- Posizionare il tubo sul ghiaccio e lasciare che gli sferoidi si depositino sul fondo del tubo da 2 ml.
- Scartare il surnatante e lavare gli sferoidi due volte in 1 mL di PBS ghiacciato 1x
NOTA: Evitare la centrifugazione, lasciare che gli sferoidi si depositino. - Aspirare il più possibile il PBS 1x e aggiungere il tampone RIPA con un cocktail inibitore della proteasi (10 sferoidi = 30 μL di tampone RIPA).
- Lisire le cellule tubando su e giù ed eseguire la sonicazione per 30 s con 30 s di riposo sul ghiaccio per 10 cicli.
- Centrifugare i laccio proteica a 15000 x g per 15 min a 4 °C.
- Determinare la concentrazione proteica per ogni lizzata cellulare.
- Prima del caricamento, far bollire ogni llisi cellulare in un tampone campione a 100 °C per 10 minuti.
- Caricare quantità uguali di proteine nei pozzi del gel SDS-PAGE ed eseguire il gel per 1 - 2 ore a 100 V.
- Trasferire la proteina dal gel alla membrana PVDF.
- Dopo il trasferimento, bloccare la membrana per 1 ora a temperatura ambiente utilizzando un tampone di blocco (5% di latte scremato + TBS con 0,05% di Tween-20).
- Incubare la membrana con 1:1.000 diluizioni di anticorpi primari(Tabella 4)in 1x TBST con tampone BSA al 5% a 4 °C durante la notte.
- Lavare la membrana tre volte con TBST, 15 minuti per ogni lavaggio.
- Incubare la membrana con 1:2.500 diluizioni di anticorpi secondari nel tampone bloccante a temperatura ambiente per 2 ore (vedi Tabella dei materiali).
- Lavare la membrana tre volte con TBST, 15 minuti per ogni lavaggio.
- Preparare la membrana per il rilevamento HRP con un substrato chemiluminescente.
- Acquisisci immagini chemiluminescenti.
7. Colorazione dello ioduro di propidio (PI) degli sferoidi
- Preparare 5-10 sferoidi come descritto nella fase 4.1 e posizionare gli sferoidi in un incubatore a 37 °C e 5% CO2.
- Diluire uno stock di 1 mg/mL di PI 1:100 in 1x PBS.
- Rimuovere il 50% del mezzo da ciascun pozzo della piastra a 96 pozzi.
- Aggiungere 100 μL della soluzione PI a ciascun pozzo e posizionare i pozzi in un incubatore a 37 °C e 5% CO2 per 10 - 15 min.
- Lavare la soluzione PI con 1x PBS.
- Aggiungi 200 μL di terreno di coltura e scatta un'immagine usando un microscopio a fluorescenza. Analizza l'intensità della fluorescenza usando l'immagine J per ottenere il conteggio di vitalità dello sferoide.
8. Analisi FACS degli sferoidi
- Generare sferoidi come descritto in precedenza.
- Per ogni condizione, preparare 30 - 40 sferoidi in un tubo FACS e centrifuga per 3 minuti a 400 x g e RT.
- Aspirare il surnatante e lavare gli sferoidi in 3 mL di 1x PBS, quindi centrifugare a 400 x g per 3 min a 4 °C.
- Aspirare il surnatante e aggiungere 200 μL di 0,25% di tripsina-EDTA, quindi incubare a RT per 2 -3 min.
NOTA: il tempo di incubazione dipende dalla dimensione dello sferoide e dal tipo di cella. - Aggiungere 1 mL di tampone FACS e dissociare delicatamente gli sferoidi utilizzando una pipetta da 200 μL.
- Centrifugare le cellule dissociate a 400 x g e 4 °C per 3 min.
NOTA: buffer FACS = 1x PBS + 2,5% FBS, filtrato utilizzando un filtro superiore da 0,22 μm. - Eliminare il surnatante e aggiungere il reagente 7-AAD/Annexin V (7AAD (5 μL), Annexin V (5 μL)/campione).
- Ruota delicatamente le cellule e incuba per 13 - 30 minuti a RT al buio.
- Aggiungere 500 μL di tampone FACS e filtrare le celle utilizzando provette di polistirene conico per rimuovere le celle aggregate.
- Centrifugare a 400 x g e 4 °C per 3 min.
- Aggiungere 500 μL di tampone legante Annexin V a ciascun tubo e sospendare.
- Analizzare utilizzando un citometro a flusso.
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Representative Results
Descriviamo il protocollo per ottenere sferoidi da diverse linee cellulari di cancro del colon-retto. L'integrazione con metilcellulosa è stata necessaria per generare sferoidi. Presentiamo anche un metodo di preparazione LCFS e presentiamo un modello per studiare la correlazione tra probiotici e cancro del colon-retto. I protocolli di formazione sferoide e di preparazione LCFS sono schematicamente illustrati in Figura 1A,B. Come mostrato nella Figura 2A,la concentrazione di metilcellulosa dello 0,6% trasforma le cellule tumorali in sferoidi compatti. Questo risultato indica che gli sferoidi possono essere generati da diversi tipi di cancro del colon-retto utilizzando il nostro protocollo metilcellulosa. Successivamente, gli sferoidi sono stati trattati con il 25% di LCFS e la morfologia è stata studiata dopo 48 ore utilizzando un microscopio ottico. Come mostrato nella Figura 3A,gli sferoidi dei gruppi trattati con LCFS hanno mostrato superfici interrotte. Per studiare gli effetti anti-cancro di LCFS a concentrazioni adeguate, gli sferoidi sono stati trattati per 48 ore con vari dosaggi di LCFS: 0 (controllo), 6%, 12,5% e 25%. Interruzioni nella morfologia sferoide sono state osservate in sferoidi trattati con LCFS al 25%, come mostrato nella Figura 3B. Inoltre, gli sferoidi sono stati trattati con LCFS al 25% per 24 ore e 48 ore e sono state osservate interruzioni nella morfologia sferoide dopo 48 ore di trattamento. Immagini microscopiche degli sferoidi sono mostrate in Figura 3C.
Dopo 48 ore, i campioni sono stati valutati con il test di vitalità cellulare e la morte delle cellule tumorali del colon-retto è stata osservata dopo il trattamento con LCFS in modo dose-dipendente, maggiore è la quantità di LCFS maggiore è la morte cellulare osservata (Figura 3D). Noi, quindi, abbiamo colorato i campioni con ioduro di propidio (PI) per osservare l'apoptosi. Come previsto, l'induzione dell'apoptosi dipendeva dalla dose di LCFS (Figura 4A,B,C). La RT-PCR è stata eseguita per rilevare i cambiamenti nei marcatori molecolari dell'apoptosi, cioè BAX, BAK e NOXA (Figura 5A, B). Infine, i marcatori di apoptosi sono stati studiati utilizzando western blotting e Annexin V/7AAD attraverso FACS (Figura 6A,B,C,D). Queste osservazioni mostrano che LCFS ha effettivamente indotto l'apoptosi nel modello 3D.
Figura 1: Rappresentazione schematica della formazione sferoide e preparazione LCFS.
(A) Le immagini di rappresentazione schematica del protocollo di generazione LCFS sono contrassegnate da (i-iv) (B) Gli schemi della formazione sferoide mediata da metilcellulosa sono contrassegnati da (i-iii). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Formazione sferoide mediata da metilcellulosa.
(A) Immagini rappresentative della formazione sferoide mediata dalla metilcellulosa di HT-29, DLD1 e WiDr. Le cellule sono state seminate in piastre di fondo rotonde a 96 pozzi di attacco ultra-basso con concentrazioni di metilcellulosa dello 0,1-1,2% per 48 ore. Scala bar 10 μm (n=3 per ogni esperimento). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Valutazione della concentrazione di LCFS e della morfologia sferoide.
(A) Immagini rappresentative di HT-29 trattate con LCFS per 48 ore. Scala bar 100 μm. (B) Sferoidi HT-29, DLD1 e WiDr trattati con dosi crescenti di LCFS per 48 ore. Tutti gli sferoidi avevano interrotto i bordi al 12,5-25% di LCFS. Scala bar 20 μm (n=3 per ogni esperimento) (C) Morfologie sferoidi di sferoidi HT-29, DLD1 e WiDr trattati con LCFS al 25% per 24 e 48 ore. Scala bar 20 μm (n = 3) (D) Vitalità cellulare misurata, indicata come media ± SEM. ***, P < 0,05 (n = 3 per ogni esperimento). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Colorazione allo ioduro di propidio degli sferoidi.
Immagini rappresentative della colorazione PI in (A) HT-29, (B) DLD1 e (C) WiDr sferoidi dopo 48 ore di trattamento LCFS. Le immagini sono state acquisite utilizzando un microscopio a fluorescenza e l'aumento dell'intensità PI è stato misurato utilizzando Image J. Scale bar 10 μm. Viene mostrata la ± SEM media. , P < 0,05 (n = 3 per ogni esperimento). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: I marcatori di apoptosi sono stati identificati utilizzando la qRT-PCR.
I marcatori di apoptosi, come BAX, BAK e NOXA, sono stati quantificati. La quantificazione dell'mRNA è presentata come un'espressione relativa normalizzata a (A) β-actina e (B) 18s rRNA. Viene mostrata la ± SEM media. , P < 0,05 (n=3 per ogni esperimento). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: I marcatori di apoptosi sono stati determinati tramite Western blotting e analisi FACS degli sferoidi.
Nella figura sono mostrati i western blots di (A) HT-29, (B) DLD1 e (C) cellule WiDr dopo il trattamento LCFS. SONO stati rilevati PARP1, BCL-XL e p-IκBα. β-actina è stato utilizzato come controllo interno. (D) Analisi FACS dell'apoptosi in sferoidi HT-29, DLD1 e WiDr incubati con LCFS. Le cellule apoptotiche sono state rilevate dall'aumento dell'intensità di fluorescenza dell'annexin V-FITC. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Reazione | Volume per singolo 20 μL |
| Mix qPCR 2X | 10 μL |
| Primer in avanti (10 pmols/μL) | 1 μL |
| Primer inverso (10 pmoli/μL) | 1 μL |
| cDNA (50 ng/μL) | 1 μL |
| Acqua di grado PCR | 7 μL |
Tabella 1: Miscela di reazione PCR.
| Abbecedario | Sequenza |
| BAX-Avanti | CCCGAGAGGTCTTTTTCCGAG |
| BAX-Reverse | CCAGCCCATGATGGTTCTGAT |
| BAK-Avanti | ATGGTCACCTTACCTCTGCAA |
| BAK-Reverse | TCATAGCGTCGGTTGATGTCG |
| NOXA-Avanti | ACCAAGCCGGATTTGCGATT |
| NOXA-Reverse | ACTTGCACTTGTTCCTCGTGG |
| 18s rRNA-Forward | GATGGGCGGCGGAAAATAG |
| 18s rRNA-Reverse | GCGTGGATTCTGCATAATGGT |
| β-Actin-Forward | TCCTGTGGCATCCACGAAACT |
| β-Actin-Reverse | GAAGCATTTGCGGTGGACGAT |
Tabella 2: Sequenze di primer utilizzate nell'analisi qRT-PCR.
| Palco | Temperatura (ºC) | Ore |
| Denaturazione iniziale | 95 | 10 minuti |
| 40 cicli: | ||
| Fase 1 | 95 | 15 secondi |
| Fase 2 | 60 | 60 secondi |
| Fase della curva di fusione | 95 | 15 secondi |
| 60 | 60 secondi | |
| 95 | 15 secondi | |
Tabella 3: Condizioni qRT-PCR.
| Anticorpo | Diluizione |
| PARP 1 (C2-10) | 1:1000 |
| BCL-XL (H-5) | 1:1000 |
| p-IκBα (B-9) | 1:1000 |
| β-actina (C4) | 1:1000 |
| Capra Anti-Mouse IgG (H + L) | 1:2500 |
| Capra Anti-Coniglio IgG (H+L) | 1:2500 |
Tabella 4: Anticorpi utilizzati nell'analisi western blot.
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Discussion
Il microambiente tissutale, comprese le cellule vicine e la matrice extracellulare (ECM), è fondamentale per la generazione dei tessuti e cruciale nel controllo della crescita cellulare e dello sviluppo dei tessuti13. Tuttavia, le colture 2D presentano diversi svantaggi, come l'interruzione delle interazioni cellulari, nonché alterazioni nella morfologia cellulare, ambienti extracellulari e l'approccio della divisione14. I sistemi di coltura cellulare 3D sono stati rigorosamente studiati per riprodurre meglio gli effetti in vivo e sono stati dimostrati come sistemi più precisi per i test in vitro del cancro15,16. È necessario che i sistemi modello prevedano con maggiore precisione le risposte personalizzate ai chemioterapici17.
L'impalcatura 3D è stata sviluppata per l'ingegneria tissutale. Agisce come una perdita surrogata di ECM, che rappresenta lo spazio disponibile delle cellule tumorali. Inoltre, l'impalcatura fornisce interazioni fisiche per l'adesione e la proliferazione cellulare e fa sì che le cellule formino appropriate distribuzioni spaziali e interazioni cellula-ECM o cellula-cellula18. Il polimero metilcellulosa (MC) è stato continuamente studiato per determinarne l'idoneità a generare sistemi di idrogel a base di MC per applicazioni nell'ingegneria delle colture cellulari 3D19,20. Tuttavia, l'incorporazione intatta di questi idrogel in biomateriali come le reti cellulari 3D rimane tecnicamente impegnativa21. Pertanto, il protocollo di formazione sferoide qui presentato raccomanda la titolazione delle concentrazioni di MC e l'ottimizzazione con vari punti temporali per ogni linea cellulare CRC. Le caratteristiche specifiche della linea cellulare, come l'aggregazione cellulare, la vitalità e la morte, possono influenzare in modo significativo ciascuna delle condizioni che abbiamo testato. Questo metodo può fornire un mezzo per generare sferoidi uniformi per testare LCFS sulle cellule tumorali.
I probiotici, che sono batteri benefici, producono metaboliti attivi che possono potenzialmente imitare gli effetti anti-cancro. Pertanto, il nostro studio è stato progettato per isolare i batteri dell'acido lattico (LAB) e testare gli effetti anti-cancro dei loro estratti metabolici da supernatanti privi di cellule (CFS). I nostri studi hanno fornito un metodo per osservare gli effetti dei supernatanti privi di cellule di L. fermentum che inducono la morte delle cellule apoptotiche nelle cellule tumorali del colon-retto in un sistema 3D. I livelli di mRNA dei marcatori di apoptosi coinvolti nelle vie apoptotiche sono drammaticamente indotti dopo l'esposizione a LCFS in condizioni 3D. Inoltre, livelli ridotti di PARP1 e BCL-XL sono stati espressi nel controllo sferoide 3D trattato con LCFS rispetto al controllo in Figura 4C, D,E. L'inibizione dell'attivazione di NF-κB è stata osservata anche in colture 3D dopo il trattamento con LCFS. Presi tutti insieme, i vantaggi di coltivare le cellule in 3D includono l'aumento delle interazioni cellula-cellula e le risposte alle molecole di segnalazione per imitare meglio i sistemi in vivo. Il western blotting con sferoidi può portare a intuizioni quantitative sullo stato di varie molecole di segnalazione.
Le linee cellulari hanno alcune limitazioni come modelli preclinici di ricerca sul cancro. Recentemente, gli organoidi del cancro sono stati utilizzati nella modellazione della terapia anti-cancro personalizzata22,23. Il trattamento di LCFS con probiotici in organoidi dovrebbe essere utilizzato come una potente piattaforma per testare gli effetti anti-cancro. Inoltre, abbiamo testato solo una delle specie di Lactobacillus tra i vari probiotici nel modello di cancro. Vari probiotici sono, inoltre, in fase di test per la prevenzione della sindrome metabolica, immunologica e disturbi neurologici24,25,26. LCFS delle specie Bifidobacterium, Saccharomyces, Streptococcus, Enterococcuse Akkermansia sono potenziali candidati per la sperimentazione dei benefici per la salute attraverso vari tipi di modelli di malattia27,28,29.
Sulla base di questo studio, si può concludere che la comprensione della segnalazione negli sferoidi e le varie risposte al trattamento LCFS nei modelli 3D possono essere utili per testare gli effetti anti-cancro utilizzando il metodo che abbiamo proposto. Inoltre, i modelli di cancro 3D possono fornire diversi vantaggi che non sono possibili con i tradizionali monostrati 2D.
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Disclosures
Gli autori non hanno informazioni finanziarie rilevanti.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata supportata dalla "Istituzione di standard di misurazione per la chimica e le radiazioni", numero di sovvenzione KRISS-2020-GP2020-0003, e "Sviluppo di standard di misurazione e tecnologia per biomateriali e convergenza medica", numero di sovvenzione KRISS-2020-GP2020-0004 programmi, finanziati dal Korea Research Institute of Standards and Science. Questa ricerca è stata sostenuta anche dal Ministero della Scienza e delle TIC (MSIT), dalla National Research Foundation of Korea (NRF-2019M3A9F3065868), dal Ministero della Salute e del Welfare (MOHW), dal Korea Health Industry Development Institute (KHIDI, HI20C0558), dal Ministero del Commercio, dell'Industria e dell'Energia (MOTIE) e dal Korea Evaluation Institute of Industrial Technology (KEIT, 20009350). ID ORCID (Hee Min Yoo: 0000-0002-5951-2137; Dukjin Kang: 0000-0002-5924-9674; Seil Kim: 0000-0003-3465-7118; Joo-Eun Lee: 0000-0002-2495-1439; Jina Lee: 0000-0002-3661-3701). Ringraziamo Chang Woo Park per l'assistenza con gli esperimenti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 15-well, 15 µl |
Biorad | 4561036 | Pkg of 10 |
| Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | 100 covers |
| 10x transfer buffer | Intron | IBS-BT031A | 1 L |
| 10X Tris-Glycine (W/SDS) | Intron | IBS-BT014 | 1 L |
| Axygen 2.0 mL MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube, Polypropylene, Clear, Nonsterile, 500 Tubes/Pack, 10 Packs/Case | Corning | SCT-200-C | 500 Tubes/Pack, 10 Packs/Case |
| BD Difco Bacto Agar | BD | 214010 | 500 g |
| BD Difco Lactobacilli MRS Broth | BD | DF0881-17-5 | 500 g |
| CellTiter-Glo 3D Cell viability assay | Promega | G9681 | 100μl/assay in 96-well plates |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11697498001 | vial of 20 tablets |
| Corning Phosphate-Buffered Saline, 1X without calcium and magnesium, PH 7.4 ± 0.1 | Corning | 21-040-CV | 500 mL |
| EMD Millipore Immobilon-P PVDF Transfer Membranes | fisher Scientific | IPVH00010 | 26.5cm x 3.75m roll; Pore Size: 0.45um |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | 25/Pack, 500/Case |
| Fetal Bovine Serum, certified, US origin | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | 500 mL |
| iScript cDNA Synthesis Kit, 25 x 20 µl rxns #1708890 | Biorad | 1708890 | 25 x 20 µL rxns |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Biorad | 1725121 | 5 x 1 mL |
| Lactobacillus fermentum | Korean Collection for Type Cultures | KCTC 3112 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | C6852-25G | 25 g |
| Methyl Cellulose (3500-5600mPa·s, 2% in Water at 20°C) | TCI | M0185 | 500 g |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL | Applied Biosystems | 4346906 | 20 plates |
| Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm, mixed cellulose esters, 33 mm, ethylene oxide sterilized | Millipore | SLGS033SB | 250 |
| PE Annexin V Apoptosis Detection Kit with 7-AAD | Biolegend | 640934 | 100 tests |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 mL |
| Propidium Iodide | Introgen | P1304MP | 100 mg |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | Thermo Fisher Scientific | 89901 | 250 mL |
| RNeasy Mini Kit (250) | Qiagen | 74106 | 250 |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-119 | 500 mL |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | 100 mL |
| Name of Materials/Equipment/Software | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| anti - p-IκBα (B-9) | Santa cruze | sc-8404 | 200 µg/mL |
| anti-BclxL (H-5) | Santa cruze | sc-8392 | 200 µg/mL |
| anti-PARP 1 (C2-10) | Santa cruze | sc-53643 | 50 µl ascites |
| anti-β-actin (C4) | Santa cruze | sc-47778 | 200 µg/mL |
| BD FACSVerse | BD Biosciences | San Diego, CA, USA | |
| Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader | BioT | S1LFA | |
| CO2 incubator | Thermo fisher | HERAcell 150i | |
| Conical tube 15 ml | SPL | 50015 | |
| Conical tube 50 ml | SPL | 50050 | |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Sigma-Aldrich | CLS7007 | |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Sigma-Aldrich | CLS3471 | |
| Costar 50 mL Reagent Reservoirs, 5/Bag, Sterile | Costar | 4870 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermofisher | C10228 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | invitrogen | AMQAF1000 | |
| EnSpire Multimode Reader | Perkin Elmer | Enspire 2300 | |
| Eppendorf Research Plus Multi Channel Pipette, 8-channel | Eppendorf | 3122000051 | |
| FlowJo software | TreeStar | Ashland, OR, USA | |
| Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson immunoresearch | 115-035-062 | 1.5 mL |
| Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson immunoresearch | 111-035-144 | 2.0 mL |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad Software | Inc., San Diego, CA, USA | |
| ImageJ | NIH | ||
| ImageQuant LAS 4000 mini | Fujifilm | Tokyo, Japan | |
| Incubated shaker | Lab companion | SIF-6000R | |
| Multi Gauge Ver. 3.0, | Fujifilm | Tokyo, Japan | |
| Optical density (OD)LAMBDA UV/Vis Spectrophotometers | Perkin Elmer | Waltham, MA, USA | |
| Phase-contrast microscope | Olympus | Tokyo, Japan | |
| SPL microcentrifuge tube 1.5mL | SPL | 60015 | |
| SPL Multi Channel Reservoirs, 12-Chs, PS, Sterile | SPL | 21012 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | Waltham, MA, USA | |
| Vibra-Cell Ultrasonic Liquid Processors | SONICS-vibra cell | VC 505 | 500 Watt ultrasonic processor |
| Vinyl Anaerobic Chamber | COY LAB PRODUCTS |
References
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