Summary
骨転移モデルは、一様に転移を発症したり、発生率が100%であったりすることはありません。骨内腫瘍細胞を直接注射すると、肺の塞栓術を引き起こす可能性があります。固形腫瘍移植による骨への移植を用いて原発性骨腫瘍と骨転移をモデル化し,再現性のある生着と成長に導く技術を紹介します。
Abstract
原発性骨腫瘍または固形腫瘍からの骨転移は、痛みを伴う骨溶解性、骨芽細胞性、または混合骨溶解性/骨芽細胞性病変をもたらします。これらの病変は骨構造を損ない、病的骨折のリスクを高め、患者に限られた治療選択肢を残します。原発性骨腫瘍は遠隔臓器に転移し、一部のタイプは他の骨格部位に広がる可能性があります。しかし、最近の証拠は、多くの固形腫瘍では、骨に転移した癌細胞が、最終的に他の臓器系に転移する細胞の主要な供給源である可能性があることを示唆しています。原発性骨腫瘍のほとんどの同系または異種移植マウスモデルは、腫瘍細胞懸濁液の骨内(同所性)注射を伴う。固形腫瘍からの骨格転移の一部の動物モデルも直接骨注入に依存していますが、他のモデルでは、細胞を血管内または原発腫瘍の臓器に注入することにより、骨転移カスケードの追加ステップを再現しようとします。しかし、これらのモデルはいずれも、確実に、または100%の発生率で骨転移を発症しません。さらに、腫瘍細胞の直接骨内注射は、肺の潜在的な腫瘍塞栓術と関連していることが示されている。これらの塞栓性腫瘍細胞は生着しますが、転移性カスケードを再現しません。今回われわれは,新鮮または凍結保存された腫瘍片(腫瘍細胞と間質からなる)を低侵襲手術を用いて近位脛骨に直接移植した骨肉腫のマウスモデルについて報告した。これらの動物は、再現可能な生着、成長、そして時間の経過とともに、骨溶解および肺転移を発症した。この技術は、固形腫瘍の骨転移をモデル化するために使用できる汎用性を備えており、光学的または高度なイメージングによって追跡できる1つまたは複数の細胞型、遺伝子組み換え細胞、患者由来の異種移植片、および/または標識細胞からなる移植片を容易に使用できます。本稿では,骨への固形腫瘍移植を用いて原発性骨腫瘍と骨転移をモデル化し,この手法を実証する.
Introduction
ヒトおよび動物の疾患のマウスモデルは、生物医学研究においてますます人気が高まっています。この文脈でマウスを使用することの有用性は、それらの解剖学的構造と生理学が人間に非常に似ているということです。それらは、成熟を達成するための出生後の生活における妊娠期間と期間が比較的短く、開発または購入のコストの増加は、遺伝子組み換え、免疫不全、および/またはヒト化の程度が高いことに関連していますが、比較的低コストと住居の容易さに大きく関連しています1。近交系株を使用すると、研究に含める前に、ほぼ均一な動物集団が得られます。それらのゲノムの完全な知識は、ヒトとの高度な類似性を示唆しています。多くの疾患プロセスのオーソログ分子標的がマウスゲノムで同定されており、現在、容易に入手できるマウス特異的試薬の広範なライブラリがあります。したがって、それらは、より大きな動物モデルと比較して、より迅速かつ安価な方法で比較的ハイスループット分析の機会を提供します1。さらに、特定の遺伝子の過剰発現または欠失をグローバルに、または細胞型特異的に、および/または構成的または誘導可能な方法で可能にする遺伝子編集戦略の出現により、それらはヒトおよび動物の病気の研究のための非常に生物学的に有用なモデルシステムを表しています2。
がんは、マウスモデルが大きな有用性を持つ分野の1つです。がんの遺伝子マウスモデルは、細胞が発癌性形質転換を受けるために、単独または組み合わせて、癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子のいずれかの発現の調節に依存しています。マウスへの初代または確立された腫瘍細胞株の注射も行われる。ヒトまたはマウスを含む他の動物種からの細胞株または組織のいずれかの導入は、依然としてin vivoで最も広く使用されている癌のモデルである。免疫不全マウスにおける異種(異種移植片)由来の細胞および組織の使用は、最も一般的に行われている2。しかしながら、宿主およびレシピエントの両方が同じ種のものである同種移植腫瘍細胞または組織の使用は、同系系において同じ宿主マウス系統と組み合わされたときに無傷の免疫系との相互作用を可能にする3。
原発性骨腫瘍または固形腫瘍からの骨転移は、痛みを伴う溶骨性、骨芽細胞性、または混合骨溶解性/骨芽細胞性病変をもたらします3,4。これらの腫瘍は骨構造を損ない、病的骨折のリスクを高め、患者に限られた治療選択肢を残します。原発性骨腫瘍は遠隔臓器に転移し、一部のタイプは他の骨格部位に広がる可能性があります。乳がん患者では、骨は最初の転移の最も一般的な部位であり、転移性疾患の最も頻繁な最初の症状部位です5,6。さらに、播種性腫瘍細胞(DTC)は、他の臓器の転移の診断前に骨髄に存在し、その発症を予測します7。したがって、骨に存在する癌細胞は、最終的に他の臓器系に転移する細胞の源であると考えられています。固形腫瘍転移の多くのマウスモデルが存在し、主に肺およびリンパ節に転移を発症し、腫瘍の種類および注射技術によっては、潜在的に他の臓器系3。しかし、骨転移のマウスモデルは、マウスが原発腫瘍量または他の臓器への転移からの早期除去基準に達する前に、部位特異的な骨格転移を確実に再現可能に生じ、骨転移を発症するモデルを欠いている。我々は、マウスの近位脛骨への固形腫瘍同種移植の外科的移植に依存する原発性骨腫瘍骨肉腫のモデルを報告した8。骨腫瘍はマウスの100%で形成され、88%が肺転移を発症しました。この転移の発生率は、臨床的に一般的に報告されているもの(~20-50%)を超えていますが、肺が骨肉腫の最も一般的な転移部位であるため、非常に興味深いものです9,10,11。このモデルは原発性骨腫瘍のモデリングに有利ですが、乳房、肺、前立腺、甲状腺、肝臓、腎臓、胃腸腫瘍などの他の骨刺激性固形腫瘍からの骨転移のモデリングにも大きな有用性があります。
このモデルの開発の理論的根拠は、原発性骨腫瘍または骨転移をモデル化するために、典型的には近位脛骨または遠位大腿骨への従来の骨内注射に代わるものを開発することでした12。私たちの主な目標は、この技術の既知の制限、すなわち肺の腫瘍塞栓術を軽減することでした。これは、これらの塞栓性腫瘍細胞の生着と、肺に転移する確立された原発性骨腫瘍からの完全な転移カスケードを再現しない「人工性転移」をもたらします8,13。これは、確立された骨転移が離れた部位に広がる場合の状況でもあります。さらに、この技術は、同所性または血管内注射技術と比較して、骨内および均一な部位での腫瘍の生着および成長の発生率を高める骨転移のモデルを作成するためにも開発されました。このモデルには、これらの説明されている手法に比べて明確な利点があります。このモデルには、骨への腫瘍細胞の制御された一貫した送達が含まれます。また、肺塞栓術後の人工肺転移を回避し、ベースラインの均一な研究集団を確立します。このモデルでは、原発腫瘍や他の臓器への転移に起因する早期除去基準のリスクなしに、部位特異的腫瘍の利点があります。最後に、このモデルは、患者由来の異種移植片の使用を含む、変更のための大きな有用性を有する。
提示されたモデルは、外科的アプローチの後に骨に直接細胞懸濁液注入を行い、その後皮質を介して注入するか、皮質に小さな欠陥を作った後に骨髄腔に送達するのと類似しています(髄腔のリーマ化の有無にかかわらず)8,14,15,16,17 .ただし、腫瘍同種移植片の移植により、この手法は明らかに異なります。したがって、このレポートの目的は、前述のモデルの多くの制限を克服する原発性骨腫瘍と固形腫瘍からの骨転移のこのモデルを実証することでした。細胞培養、マウスモデル、マウス麻酔と手術、マウス解剖学の経験を持つ研究グループは、マウスの原発性骨腫瘍または骨転移をモデル化する技術を再現するための設備が整っています。
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Protocol
記載されているすべての動物実験は、英国ケンブリッジのケンブリッジ大学の施設動物管理および使用委員会によって承認されました。
1. 細胞株の調製
- 従来の細胞培養またはマウスへの注射のためのラボの標準的な細胞培養プロトコルに従って細胞株を増殖させます。ここで使用される標準プロトコルは、10%ウシ胎児血清(FBS)、L-グルタミン、およびペニシリン/ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地(以下、完全増殖培地と呼びます)での増殖です。
注:この実験では、エイブラムス骨肉腫細胞をBalb / c Foxn1 nu / nu マウスで使用しました。乳がん研究では、Balb / cマウスの4T1細胞とC57BL / 6マウスのEO771細胞が使用されます。 - 通気組織培養フラスコまたは6ウェル組織培養プレートのいずれかで、5%CO2中で37°Cで細胞を増殖させます。
- 目的の細胞株を継代し、細胞がマウスへのこれらの細胞の注射で一般的に使用されるコンフルエントに達したら、注射用の細胞を準備します。
2.動物
- 皮下腫瘍の生成に少なくとも6〜8週齢のBalb / c Foxn1 nu / nu マウスを使用して、動物が急速な成長段階を超え、成体期および骨格の成熟を達成していることを確認します。
- オスまたはメスのマウスを使用してください。ホルモン応答性細胞株(例えば、雌マウスの乳癌細胞および雄マウスの前立腺癌細胞)を選択するときは例外を設けてください。
- 異種移植片の実験には、通常の条件下では無傷のマウス免疫系と互換性がないことに基づいて、免疫不全の無胸腺ヌードマウスを使用します。
- マウス細胞株を用いた同種移植実験では、異なるマウスの遺伝的背景と免疫的背景に基づいて、これも推奨されます。しかしながら、同系実験のためには、目的の細胞株と同じ株の動物を使用する。
- 施設の飼育方針に応じた標準的な密度で動物を飼育します。
3.皮下腫瘍
- トリプシン処理によって培養物から細胞株を回収し、滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に再懸濁します。
- 細胞の生存率を評価し、トリパンブルー排除法によって細胞密度を決定します。血球計算盤または自動セルカウンターを使用して細胞をカウントします。90%の最小細胞生存率は、皮下腫瘍を作成するためのマウスへの注射に使用されます。
- 細胞密度を調整して、1〜2 x 105 個の細胞を0.1〜0.15 mL(100〜150 μL)の滅菌PBSの最終容量に注入します。注射まで細胞を氷上に保ちます。
- あるいは、800 x g で5分間遠心分離することにより、細胞をペレット化します。上清を廃棄し、ペレット化した細胞を希釈していない滅菌基底膜マトリックス培地に再懸濁して、最終容量0.1〜0.15 mL(100〜150 μL)の1〜2 x 105 細胞を得ます。さらに使用するまで細胞を氷上に保管してください。
- 酸素麻酔でイソフルランによる皮下腫瘍増殖に使用するマウスを麻酔する。2 L /分の酸素中に5%イソフルランの誘導用量を使用し、2 L /分の酸素中に2〜3%イソフルランの維持用量を使用します。.先に進む前に、まばたきやペダルの反射神経がないかどうかを確認してください。
注:イソフルランは吸入麻酔薬です。.イソフルランは、適切な掃気および遊離ガス収集システムを備えた換気の良い場所で使用してください。麻酔の導入、維持、および監視の計画を策定するために施設の獣医スタッフと相談し、検査室のスタッフが麻酔モニタリングと吸入麻酔薬の取り扱いについて適切なトレーニングを受けていることを確認してください。 - 麻酔をかけたマウスの胸部または腹部の背側領域から脱毛液または電気バリカンで毛髪を除去する。脱毛溶液は、皮膚への潜在的な外傷を最小限に抑えるために好ましい。無胸腺ヌードマウスを使用する場合は、この手順をスキップしてください。
- 細胞懸濁液を注入する前に、調製した領域を70%エタノール綿棒で洗浄する。
- 27 Gの針が付いた1 mLのツベルクリン注射器を使用して、肩甲骨の動きの影響を受けないように、胸部または腹部の背部に細胞を皮下注射します。あるいは、市販の細胞外マトリックスに懸濁液として細胞を皮下注射する。
注:市販の細胞外マトリックスへの注射は、これらのマトリックスが室温で固化するため、皮下空間での細胞懸濁液の移動を制限します。 - 歩行可能になるまで、個々のケージの加熱パッドでマウスを回収します。その後、マウスは清潔で乾いた寝具を備えた通常のケージに入れることができます。
- 背胸部または腹部を覆う皮下腫瘍のサイズをノギスで監視し、毎週体重を測定して、皮下腫瘍が潰瘍化していないこと、またはマウスが施設の動物管理および使用委員会によって確立された早期除去基準を満たしていることを確認します。皮膚潰瘍や中枢性腫瘍壊死のリスクを減らすために、任意の寸法で最大15 mmの腫瘍サイズが推奨されます。
注:地域のガイドラインを参照して、最大許容腫瘍サイズ/体積を決定してください。 - 3〜4週間後に皮下腫瘍を有するマウスをCO2 吸入とそれに続く頸部脱臼により安楽死させる。マウスの安楽死に関する機関の許容可能な方針に従ってください。
- 無菌手術技術を使用して皮下腫瘍を採取します。脱毛後、以前と同様に腫瘍の上にある皮膚を70%エタノールで滅菌します(該当する場合)。#15メスの刃(メスの刃のハンドルの有無にかかわらず)で腫瘍の上にある皮膚を切開します。滅菌外科用ハサミで周囲の付着軟部組織から腫瘍を鋭く解剖します。
- 腫瘍を完全増殖培地を含む6ウェル組織培養プレートに入れ、#15メス刃(メス刃ハンドルの有無にかかわらず)で、事前に決定されたサイズ(~0.6 mm x 0.6 mm x 0.6 mm – 0.25 mm、3、最大1 mm x 1 mm x 1 mm– 1 mm3)の複数の小さな断片に細刻します。
- 脛骨内移植時まで、室温で滅菌完全増殖培地中の腫瘍断片を維持します。ルシフェラーゼまたは蛍光レポーター遺伝子を有する細胞株の場合、マウスへの脛骨内移植の前に、ex vivo生物発光または蛍光イメージングを使用して腫瘍の生存率を確認します。
- 凍結保存のために、20%FBSおよび10%ジメチルスルホキシド(DMSO)を添加した完全増殖培地中の同じクライオバイアルに複数のフラグメントを配置します。市販の凍結保存システムを使用して–80°Cで徐々に凍結し、液体窒素で長期間保存します。液体窒素浸漬を使用した急速凍結により、その後の分析のために腫瘍断片を保存しますが、将来の移植のためには保存しません。これらの凍結腫瘍断片は、–80°Cで長期間保管してください。
注:スナップ凍結腫瘍はin vivoで生着および成長しないことが以前に報告されています8。
4.皮下腫瘍片の外科的移植
- 外科的移植の前に、皮下腫瘍の新鮮なまたは凍結保存された断片を完全な増殖培地で室温に戻します。
- 目的の系統のマウスを、セクション3に記載される酸素麻酔でイソフルランを使用して麻酔する。先に進む前に、ペダル反射の欠如を確認してください。術期鎮痛を提供するために、0.02〜0.05 mg / kgの用量で皮下ブプレノルフィンを投与します。.必要に応じて、術後の期間に6〜8時間ごとにこれを繰り返すことができます。
- 皮膚への潜在的な外傷を最小限に抑えるために、脱毛液で右膝関節と後肢の近位脛骨の毛を取り除きます。
- 準備した部分を外科用消毒剤でこすります。最初に70%エタノール綿棒でスクラブし、次にクロルヘキシジンと生理食塩水スクラブを交互にスクラブします。
- 近位脛骨を、関節を曲げたり伸ばしたりしながら、膝関節のすぐ遠位にある領域として視覚化します。
- #15メスの刃(メスの刃のハンドルの有無にかかわらず)を使用して、四肢の内側の近位脛骨のレベルで3〜4 mmの切開を作成します。皮膚と皮下組織を切開して、近位脛骨の内側皮質を露出させます。
- 25Gの針の先端で軽く圧力をかけ、先端を回転させて、近位脛骨の内側皮質に小さな穴を開けます。この穴を、頭蓋脛骨皮質と尾脛骨皮質の間の等距離の点で膝関節から約2 mm遠位にします。腫瘍片の大きさに応じて針の大きさを選択してください。
- 滅菌鉗子を使用して腫瘍片を拾い上げ、近位脛骨の髄腔に挿入します。27〜30 Gの針を使用して、腫瘍断片を髄管に操作します。腫瘍断片のサイズに応じて、各脛骨に最小0.5 mm3 の総腫瘍体積を移植します。これは、作成された腫瘍断片のサイズに応じて、1つ以上の腫瘍断片の移植を必要とする場合がある。
注:骨の外側への移植片の変位を防止または制限するための変更は、骨欠損部への骨ワックスまたは骨セメントの配置、または骨の穴へのゲルフォームまたは皮下脂肪移植のいずれかです。 - 滅菌液体組織接着剤または単一の皮膚縫合糸で皮膚の端を任命します。このサイトでは傷付きクリップを使用しないでください。術後に蛍光イメージングを使用する場合は、組織接着剤と縫合糸の両方が蛍光を発する可能性があるため、注意してください。
- 歩行可能になるまで、個々のケージの加熱パッドでマウスを回収します。
5. シリアルおよびエンドポイント評価
- 前述のように酸素麻酔でイソフルランを使用してマウスを麻酔する。
- 毎週のデジタルX線撮影、生物発光、または蛍光イメージング(ルシフェラーゼまたは蛍光レポーター遺伝子を発現する細胞を使用する場合)のいずれかによって、脛骨腫瘍の成長を非侵襲的に評価します。移植部位における四肢のキャリパー測定は、覚醒マウスにおいても行うことができる。
- 担癌マウスの従来のモニタリング(体重、活動レベル、呼吸数、グルーミング、姿勢、メンテーション、および行動)に加えて、後肢の跛行、腫脹、および手術部位感染の兆候についてマウスを毎週監視します。
- 皮膚の創傷が治癒するまで、最初の10〜14日間、過度の発赤、腫れ、排液、および創傷裂開がないか、皮膚の外科的創傷を監視します。4〜5週間後、生存または安楽死後の研究結果評価に従ってマウスを評価する。
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Representative Results
肯定的な結果は、腫瘍の生着と時間の経過に伴う進行性の腫瘍の成長に関連しています。腫瘍の種類によっては、骨内腫瘍の成長が進行性後肢の跛行と関連している可能性がありますが、多くの腫瘍は付随する骨疾患の兆候にもかかわらず跛行を引き起こしません。生着の成功は高度なイメージングで文書化され、目的の細胞株の骨表現型(溶骨性、骨芽細胞性、または混合骨溶解性/骨芽細胞性転移)に関連する近位脛骨に進行性のX線写真、μCT、またはμMRIの変化があります(図1)8。前回の報告では,移植後1週間で近位脛骨に皮質欠損が認められた(図1A)。2週目までに、皮質欠損に隣接して目に見える骨溶解および骨リモデリングがあった。2〜5週目から、進行性の骨破壊と、腫瘍の生着と成長に関連する新しい骨の形成がありました(図1B-E)。レポーター遺伝子を持つ細胞株の場合、骨の変化は、時間の経過に伴う蛍光または生物発光イメージング出力の増加を伴います。急性跛行は、差し迫ったまたは実際の病理学的骨折の指標となる可能性があり、マウスの即時かつ慎重なX線写真評価、およびおそらく研究からの早期除去が必要です。研究対象の腫瘍細胞株によっては、転移のかなり前に骨破壊が急速に起こることがあります。これは、臨床的に関連する転移、すなわち肺への転移の発症前にマウスを研究から除去しなければならない可能性があるため、原発性骨腫瘍を含む研究において特に重要である。これらの場合、以前に報告したように、原発性骨腫瘍を使用する場合、最小限の残存病変とその後の転移の研究を可能にするために、担癌肢の外科的切断が推奨されます4,8。人の後肢完全切断は通常行われませんが、これは獣医学の標準治療であり、ヒトと犬の骨肉腫の臨床的および分子的特徴の類似性は十分に文書化されています。したがって、マウスの後肢切断は、多くの動物細胞株に関連しています。さらに、切断は、マウスなどの小さなげっ歯類では達成できないため、人に使用される四肢温存手順がマウスで実行可能な治療法です。原発性骨腫瘍を有するマウスでは、食欲不振、進行性の体重減少、一般的な体調不良および呼吸困難(速度または努力の増加)は、肺および他の臓器への腫瘍転移の発生を示す可能性がある。転移の確認には生物発光画像、μCT、またはμMRI画像による確認が推奨され、影響を受けた動物は安楽死させる必要があります。
移植された脛骨のX線撮影またはμCT検査で進行性変化(研究対象の細胞株に応じて、溶骨性、骨芽細胞性、または混合骨溶解性/骨芽細胞性病変)の証拠がない場合は、腫瘍生着の欠如に起因する可能性が最も高い陰性結果が疑われるはずです。レポーター遺伝子を持つ細胞株の場合、光学イメージングによる経時的な蛍光または生物発光シグナル伝達の増加の欠如も、腫瘍が生着に失敗したという結論を支持するであろう。生着の欠如または貧弱さは、手術部位の感染に関連している可能性があります。ただし、これは、発赤、腫れ、退院などの特定の臨床徴候を、術後初期(手術後最初の1〜2週間)に最も一般的に示します。動物はまた、潜在的に熱性であり、手術部位の感染のために術後早期に活動の欠如または腰を下ろした姿勢を示す可能性があります。準備中の無菌条件下で同種移植片を収穫および維持し、四肢の適切な無菌調製、無菌術中技術、および完全な創傷閉鎖により、感染および腫瘍生着の失敗をもたらす術後外科的創傷合併症の可能性を最小限に抑えることができます。
前回の報告8では、報告されたパイロット研究と決定的研究の両方を含めると、骨肉腫の断片を移植した16匹のマウスのうち16匹(100%)が溶骨病変に進行し、これら16匹のうち14匹(88%)が転移を発症しました。すべての転移は肺に観察され、移植後3週間という早い時期に組織学によって診断されました8。移植後1週間(n = 2)および2週間(n = 2)に剖検された追加の動物は、肺転移の証拠を明らかにしませんでした。.
図1:シリアルX線撮影。 連続X線撮影(順番に)は、原発性骨腫瘍細胞株(骨肉腫)を用いた皮下腫瘍同種移植片の脛骨内移植の5週間後に(A)1、(B)2、(C)3、(D)4、および(E)で毎週行われる。時間が経つにつれて、進行性の骨破壊と腫瘍の生着と成長に関連する新しい骨の形成がありました。この図は、参考文献8の許可を得て修正されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このレポートは、腫瘍同種移植片の脛骨内移植後の原発性骨腫瘍または骨転移を作成するためのモデルを文書化しています。このプロセスにはいくつかの重要なステップがあると考えています。腫瘍細胞懸濁液の皮下注射と得られた腫瘍断片の脛骨内埋入の両方について、安全な麻酔面を確立する必要があります。皮下同種移植片の除去および同種移植片の脛骨内埋入の両方のための手術部位の滅菌調製物があるべきである。腫瘍同種移植片の断片は、その後の脛骨内移植のために均一に作成する必要があります。腫瘍片の移植のために、近位脛骨に適切なサイズの欠陥を作成する必要があります。術後の創傷合併症のリスクを減らすために、外科的皮膚創傷を完全に閉じる必要があります。最後の重要なステップは、皮下注射用の腫瘍細胞懸濁液の一部として細胞外マトリックスを使用する場合、注射前の懸濁液の固化を避けるために、メーカーが推奨する取り扱い指示書を使用する必要があることです。四肢の適切な滅菌準備、滅菌術中技術、および完全な創傷閉鎖により、術後の外科的創傷合併症の可能性が最小限に抑えられます。
移植された腫瘍の特徴と外科的技術は、研究集団に組み込むための成功し再現性のある結果を得るために重要です。最初に、腫瘍異種移植片/同種移植片が脛骨の髄腔に直接移植され、腫瘍組織が完全に骨の内側にあることを確認する必要があります。骨の外側への移植片の変位を防止または制限するための変更は、最初は、骨欠損部への骨ワックスまたは骨セメントの配置、または骨の穴へのゲルフォームまたは皮下脂肪移植のいずれかです。別の方法は、脳脛骨筋の下に作成された近位脛骨の外側の穴を通して腫瘍同種移植片を挿入することである。脳脛骨筋の存在は、骨欠損の生物学的カバーとして機能し、腫瘍同種移植片の潜在的な変位を制限します。しかし、これはより積極的な外科的アプローチであり、近位脛骨の外側に神経筋外傷を引き起こす可能性があります。移植前に腫瘍同種移植片が均一なサイズになるように注意する必要があります。そうは言っても、移植時に移植片に直接即時の血管供給が提供されていない場合、どの生物学的システムでも腫瘍サイズが大きいほど小さな移植片よりも生着する可能性が低いため、腫瘍同種移植片はどの寸法でも1mmを超えてはなりません。最終移植腫瘍体積0.5 mm 3で成功した結果を報告しましたが、最大1 mm3の腫瘍断片体積の合計が成功すると予想しています。しかしながら、最大移植可能な腫瘍断片量は決定されていない。凍結保存された組織と比較して、新鮮な腫瘍異種移植片および同種移植片は生存する可能性が高いが、慎重に凍結保存された腫瘍同種移植片を使用する慣行に問題は観察されていない。急速凍結同種移植片は移植すべきではありません。さらに、皮下腫瘍のカプセルおよび外側部分の解剖は、主に適切な腫瘍細胞からなるのではなく、有意な免疫浸潤を伴う大部分が線維性および血管性である腫瘍のこの層からの寄与を妨げるであろう。メスの刃で直接大きな腫瘍塊から腫瘍同種移植片を作成する別の方法は、小さな生検針を使用して円筒形の腫瘍「コア」を作成し、移植前に事前に定義された長さに切断することです。生検針またはコア生検パンチの使用は、生検プロセスによって2つの均一な寸法(幅と深さ)が作成された後、移植前に適切な長さに切断できるため、移植用の均一な腫瘍断片を作成するのに有益である可能性があります。ルシフェラーゼや蛍光タンパク質などのレポーター遺伝子が移植された腫瘍細胞で使用されている場合、移植時または移植後1週間の腫瘍断片の評価は、移植された腫瘍断片における腫瘍細胞からの相対的な寄与、および生存率を示します。
他の手順と同様に、この手法の報告された利点に加えて制限があります。転移は、細胞外マトリックスへの浸潤と移動を正常に実行し、腫瘍の血液供給を血管内投与し、最終的な転移先に到達するまで循環して生存し、適切な臓器に血管外漏出し、休眠状態にとどまるか増殖して転移性病変を作成する、その主要な場所からの細胞を必要とする多段階プロセスです。 臨床的に検出可能な転移となるように正常組織構造を改変する18。現在使用されている骨転移のマウスモデルは、原発腫瘍の正常部位への腫瘍細胞の直接同所性注射、心臓の左心室または末梢への尾静脈(外側または背側尾静脈)への血管内注射、または腫瘍細胞懸濁液の直接骨内注射のいずれかに大きく依存しています3。しかし、骨転移モデルを改善しようとする最近の報告では、腸骨動脈、尾動脈、または大腿動脈への注射が提唱されています19,20,21。これらの方法はすべて、骨転移カスケード内に1つ以上のステップを組み込んでいますが、直接骨内注射、または私たちの場合は腫瘍同種移植片の移植を除いて、終末組織修飾のみをモデル化します。したがって、これは私たちのテクニックの1つの固有の制限です。さらなる制限は、現在記載されているように、中間マウス宿主において同種移植片を増殖させる必要があり、これは追加のマウスの使用を必要とし、100%純粋な腫瘍細胞ではない腫瘍の移植をもたらすことである。同種移植片は、皮下の場所で成長する腫瘍によって提供される間質的な寄与を有するであろう。この皮下間質の寄与を最小限に抑えるための潜在的な代替手段は、細胞外マトリックスまたは足場などの生物学的基質に細胞を皮下注射することであろう。あるいは、腫瘍の原発部位への同所性注射、続いて腫瘍除去および移植片調製を行ってもよい。
このレポートで概説されている方法は、腫瘍細胞の直接骨内注射後の原発性骨腫瘍または骨転移をモデル化する既存の方法と比較して、重要な利点があります。議論したように、私たちと他の人は、細胞懸濁液の脛骨内注射後の肺の直接塞栓術と時折の即時死を観察しました8,13。これは、腫瘍細胞を骨髄腔に加圧注入した結果であり、その後、腫瘍細胞は骨髄血管類洞を介して末梢血供給に入り、静脈還流によって肺に運ばれます。これらの事象は、人および動物の関節全置換術に関連する骨髄腔へのインプラントの加圧配置に関連する肺または静脈血栓塞栓症で観察される事象と機械的に匹敵する。私たちと他の人は、肺へのこの塞栓現象が細胞株特異的である可能性があると仮定しています(未発表の観察)。しかしながら、これらの塞栓性人工性転移の発生を制限するために非常に詳細なステップが報告されている12。最初に、適切なトリプシン処理および注射用の均一な単一細胞懸濁液の作成が必要であり、細胞凝集を防ぐために氷上に保存する必要があります。針を近位脛骨成長板に適切に配置した後、少量の注入量(~10 μL)と骨髄腔への抵抗のない注射を行う必要があります。それにもかかわらず、肺や他の臓器への腫瘍細胞送達は、骨内および血管内注射技術に続く生物発光イメージングによって容易に観察することができ、肺および他の臓器でこの生物発光シグナルを生成する細胞が遠隔転移を引き起こす可能性があることを示唆しています(未発表の観察)3.この技術の別の利点は、単一の腫瘍が研究集団内の均一な骨部位で増殖し、動物間の変動性を減らすことであることがわかりました。これにより、均一な研究集団を確立し、治療群間ですぐに比較することができます。これは、同所性または血管内注射後に発症する骨転移とは対照的であり、細胞が異なる骨格部位に転移し、異なる動態で増殖する可能性があるため、研究グループ間の比較が困難になります。腫瘍同種移植片の移植後の1つの解剖学的部位での腫瘍増殖は、血管内および同所性注射技術で見られるように、他の臓器系への転移または原発腫瘍量のためにマウスが除去される可能性も回避します。さらに、腫瘍同種移植後の100%生着が観察され、均一な研究集団をサポートし、適切なサンプルサイズ数を達成するために追加のマウスを不必要に使用することを回避します。これはまた、骨への腫瘍細胞懸濁液の経皮的注射後の不完全で不正確な注射の制限を克服します。
この技術は汎用性が高く、現在私たちの研究で使用されている変更をもたらし、将来のアプリケーションに大きな有用性をもたらす可能性があります。当初、骨内移植部位として近位脛骨を採用していますが、遠位大腿骨や近位上腕骨を含むがこれらに限定されない、原発性骨腫瘍または骨転移の他の一般的な部位を容易に使用できます。ただし、これらの部位および骨盤や脊椎などの領域への外科的アプローチでは、近位脛骨と比較して徐々に広範な外科的アプローチが必要です。さらに、骨盤、脊椎、頭蓋骨、橈骨、尺骨などの部位は、腫瘍移植のための適切な骨ストックの恩恵を受けていません。口腔腫瘍などの骨浸潤性悪性腫瘍の場合、骨に隣接または中咽頭内に腫瘍同種移植片を配置することも、浸潤性腫瘍の進行を再現する可能性があります3,22。インビトロおよびインビボ実験では、多くの場合、共培養または共注入技術を使用して、目的の細胞タイプに対するさまざまな細胞タイプの影響を決定します。したがって、2つ以上の細胞型を同時に注射して皮下腫瘍を作成し、この技術を使用して骨に移植できる可能性があります。遺伝子組み換え細胞は、単独で、または他の正常または遺伝子組み換え細胞と組み合わせて使用して、腫瘍同種移植片を作製することができる。精密医療への関心が高まり、ヒトがんのin vitroおよびin vivoモデルの作成に伴い、マウスへの患者由来の異種移植片移植が人気を集めています。最近、乳癌骨転移のモデルが記載されており、そこでは、ヌードマウスの皮下に移植されたヒト骨椎間板に同所転移した患者由来の異種移植片が記載されている23。このことから、患者由来の異種移植片は、皮下伝播のための中間宿主を必要とせずに、私たちのモデルを使用して骨に直接移植することができました。これにより、腫瘍動態の迅速な評価と、同種移植片の調製に大きな腫瘍塊を必要とせずに、単一の患者生検から複数の治療の組み合わせを評価する能力が可能になります。がん研究におけるオルガノイドの使用の増加は、モデル24でも採用できます。これには、脛骨皮質の穴を通してこれらの細胞凝集体を針またはピペットで注入する必要があります。したがって、骨および骨髄腔外へのオルガノイドの移動の可能性を制限するために、皮質欠損の封鎖(上記で説明したように)をお勧めします。これまで行ってきたように、光学(生物発光または蛍光)または高度な画像(デジタルX線撮影、μCT、またはμMRI)によって細胞を標識および追跡できるため、経時的な腫瘍の成長を評価できます。これには、同じ動物が時間の経過とともに画像化されるため、動物の数を最小限に抑えるという利点もあります。
要約すると、このレポートは、骨への固形腫瘍移植を使用して原発性骨腫瘍と骨転移をモデル化する技術を示しています。
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Disclosures
ヒルドレス博士は、NIHから賞番号K01OD026527で資金提供を受けました。 コンテンツは著者の責任であり、必ずしもNIHの公式見解を表すものではありません。
Acknowledgments
著者らは、この技術の開発に対するベス・チャフィー博士、DVM、PhD、DACVPの重要な貢献を認めています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #15 scalpel blade | Henry Schein Ltd. | 75614 | None |
| 6-well tissue culture plates | Thermo Fisher Scientific | 10578911 | Used for mincing tumor pieces. Can also be used for cell culture |
| Abrams osteosarcoma cell line | Not applicable | Not applicable | None |
| Anesthesia machine with isoflurane vaporiser and oxygen tank(s) | VetEquip | 901805 | None |
| Animal weighing scale | Kent Scientific | SCL- 1015 | None |
| BALB/c nude mouse (nu/nu) | Charles River Ltd. | NA | 6-8 weeks of age. Male or female mice |
| Bone cement | Depuy Synthes | 160504 | Optional use instead of bone wax |
| Bone wax | Ethicon | W31G | Optional |
| Buprenorphine | Animalcare Ltd. | N/A | Buprecare 0.3 mg/ml Solution for Injection for Dogs and Cats |
| Carbon dioxide euthanasia station | N/A | N/A | Should be provided within animal facility |
| Cell culture incubator set at 37 °C and 5% carbon dioxide | Heraeus | Various | None |
| Chlorhexidine surgical scrub | Vetoquinol | 411412 | None |
| Cryovials (2 ml) | Thermo Scientific Nalgene | 5000-0020 | Optional if cryopreserving tumor fragments |
| D-luciferin (Firefly), potassium salt | Perkin Elmer | 122799 | Optional if cell line of interest has a bioluminescent reporter gene |
| Digital caliper | Mitutoyo | 500-181-30 | Can be manual |
| Digital microradiography cabinet | Faxitron Bioptics, LLC | MX-20 | Optional to evaluate bone response to tumor growth |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | 1371171000 | Optional if cryopreserving tumor fragments |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | None |
| Ethanol (70%) | Sigma Aldrich | 2483 | None |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | None |
| Forceps, Dumont | Fine Science Tools, Inc. | 11200-33 | None |
| Freezer (– 80 °C) | Sanyo | MDF-794C | Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments |
| Hemocytometer | Thermo Fisher Scientific | 11704939 | Can also use automated cell counter, if available |
| Hypodermic needles (27 gauge) | Henry Schein Ltd. | DIS55510 | May also use 25G (DIS55509) and 30G (Catalog DIS599) needles |
| Ice | N/A | N/A | Ideally small pieces in a container for syringe and cell suspension storage |
| Iris scissors | Fine Science Tools, Inc. | 14084-08 | None |
| Isoflurane | Henry Schein Ltd. | 1182098 | None |
| IVIS Lumina III bioluminescence/fluorescence imaging system | Perkin Elmer | CLS136334 | Optional if cell line of interest has bioluminescent or fluorescent reporter genes |
| L-glutamine | Thermofisher scientifc | 25030081 | None |
| Liquid nitrogen | British Oxygen Corporation | NA | Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments |
| Liquid nitrogen dewar, 5 litres | Thermo Fisher Scientific | TY509X1 | Optional if cryopreserving tumor fragments |
| Matrigel® Matrix GFR, LDEV-Free, 5 ml | Corning Life Sciences | 356230 | Optional. Also available in 10 ml size (354230) |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002549 | Pellet cells at 1200 rpm for 5-6 minutes |
| Mr. Frosty freezing containiner | Fisher Scientific | 10110051 | Optional if cryopreserving tumor fragments |
| NAIR Hair remover lotion/oil | Thermo Fisher Scientific | NC0132811 | Can alternatively use an electric clipper with fine blade |
| Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | None |
| Scalpel handle, #7 Short | Fine Science Tools, Inc. | 10007-12 | User preference as long as it accepts #15 scalpel blade |
| Small animal heated pad | VetTech | HE006 | None |
| Stereomicroscope | GT Vision Ltd. | H600BV1 | None |
| Sterile phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Use for injections and also as part of the surgical scrub, alternating with chlorhexidine |
| Tissue adhesive (sterile) | 3M Corporation | 84-1469SB | Can alternatively use non-absorbable skin suture (6-0 size) |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | 5250061 | None |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | Use 0.05%-0.25% |
| Tuberculin syringe (1 ml with 0.1 ml gradations) | Becton Dickinson | 309659 | Slip tip preferred over Luer |
| Vented tissue culture flasks, T-75 | Corning Life Sciences | CLS3290 | Can also use smaller or larger flasks, as needed |
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