Summary
מודלים של גרורות בעצמות אינם מפתחים גרורות באופן אחיד או בשכיחות של 100%. הזרקה ישירה של תאי גידול תוך אוסאוסיים עלולה לגרום לתסחיף של הריאה. אנו מציגים את הטכניקה שלנו מידול גידולי עצם ראשוניים וגרורות עצם באמצעות השתלת גידול מוצק לתוך העצם, המוביל לקליטה וצמיחה הניתנים לשחזור.
Abstract
גידולי עצם ראשוניים או גרורות עצם מגידולים מוצקים גורמים לנגעים אוסטאוליטיים, אוסטאובלסטיים או מעורבים אוסטאוליטיים/אוסטאובלסטיים כואבים. נגעים אלה פוגעים במבנה העצם, מגבירים את הסיכון לשבר פתולוגי ומשאירים את המטופלים עם אפשרויות טיפול מוגבלות. גידולי עצם ראשוניים שולחים גרורות לאיברים מרוחקים, כאשר סוגים מסוימים מסוגלים להתפשט לאתרי שלד אחרים. עם זאת, ראיות עדכניות מצביעות על כך שבגידולים מוצקים רבים, תאים סרטניים שהתפשטו לעצם עשויים להיות המקור העיקרי לתאים שבסופו של דבר שולחים גרורות למערכות איברים אחרות. רוב המודלים הסינגניים או הקסנוגרפטים של גידולי עצם ראשוניים כוללים הזרקה תוך-אוסית (אורתוטופית) של תרחיפים של תאי גידול. חלק מהמודלים של בעלי חיים של גרורות שלד מגידולים מוצקים תלויים גם בהזרקת עצם ישירה, בעוד שאחרים מנסים לשחזר שלבים נוספים של מפל גרורות העצם על ידי הזרקת תאים תוך כלי דם או לתוך האיבר של הגידול הראשוני. עם זאת, אף אחד מהמודלים הללו אינו מפתח גרורות בעצמות באופן אמין או עם שכיחות של 100%. בנוסף, הזרקה תוך-אוסית ישירה של תאי הגידול הוכחה כקשורה לאמבוליזציה פוטנציאלית של הריאה. תאי גידול תסחיף אלה מושתלים אך אינם משחזרים את המפל הגרורתי. דיווחנו על מודל עכברי של אוסטאוסרקומה שבו קטעי גידול טריים או קריוגניים (המורכבים מתאי גידול בתוספת סטרומה) מושתלים ישירות לתוך השוקה הפרוקסימלית באמצעות טכניקה כירורגית זעיר פולשנית. בעלי חיים אלה פיתחו קליטה ניתנת לשחזור, גדילה, ועם הזמן, אוסטאוליזה וגרורות ריאה. טכניקה זו יש את הרבגוניות לשמש כדי מודל גרורות עצם הגידול מוצק יכול בקלות להשתמש שתלים המורכבים סוג תא אחד או יותר, תאים מהונדסים גנטית, xenografts נגזר המטופל, ו / או תאים מסומנים שניתן לעקוב אחריהם על ידי הדמיה אופטית או מתקדמת. כאן, אנו מדגימים טכניקה זו, מידול גידולי עצם ראשוניים וגרורות עצם באמצעות השתלת גידול מוצק השתלת עצם.
Introduction
מודלים עכבריים של מחלות בני אדם ובעלי חיים הופכים פופולריים יותר ויותר במחקר ביו-רפואי. התועלת בשימוש בעכברים בהקשר זה היא שהאנטומיה והפיזיולוגיה שלהם דומות מאוד לבני אדם. יש להם תקופת הריון קצרה יחסית וזמן בחיים שלאחר הלידה כדי להשיג בגרות, והם קשורים במידה רבה עם עלות נמוכה יחסית וקלות דיור, אם כי עלויות גדלות של פיתוח או רכישה קשורות עם דרגות גבוהות יותר של שינוי גנטי, כשל חיסוני, ו / או הומניזציה1. שימוש בזנים גזעיים מביא לאוכלוסיית בעלי חיים אחידה במידה רבה לפני הכללת המחקר. ידע מלא של הגנום שלהם מצביע על רמה גבוהה של דמיון לבני אדם. מטרות מולקולריות אורתולוגיות לתהליכי מחלה רבים זוהו בגנום העכבר וכיום יש ספרייה נרחבת של ריאגנטים ספציפיים לעכבר שניתן להשיג בקלות. לכן, הם מספקים הזדמנות לניתוח תפוקה גבוהה יחסית באופן מהיר יותר וזול יותר בהשוואה למודלים גדולים יותר של בעלי חיים1. בנוסף, עם כניסתן של אסטרטגיות עריכה גנטית המאפשרות ביטוי יתר או מחיקה של גנים מסוימים באופן גלובלי או ספציפי לסוג התא ו / או באופן מכונן או אינדוקטיבי, הם מייצגים מערכת מודל שימושית מאוד מבחינה ביולוגית לחקר מחלות בני אדם ובעלי חיים2.
סרטן הוא תחום אחד שבו מודלים עכבר יש תועלת רבה. מודלים גנטיים של סרטן בעכברים מסתמכים על אפנון הביטוי של אונקוגנים או גנים מדכאי גידולים, לבד או בשילוב, כדי שתאים יעברו טרנספורמציה אונקוגנית. הזרקת קווי תאי גידול ראשוניים או מבוססים לעכברים מבוצעת גם. הכנסת קווי תאים או רקמות מבני אדם או ממיני בעלי חיים אחרים, כולל עכברים, נותרה המודל הנפוץ ביותר של סרטן in vivo. השימוש בתאים ורקמות ממינים שונים (xenografts) בעכברים מדוכאי חיסון מבוצע לרוב2. עם זאת, השימוש בתאי גידול אלוגרפט או רקמות שבהן גם המארח וגם המקבל הם מאותו מין מאפשר אינטראקציה עם מערכת חיסון שלמה בשילוב עם אותו זן עכבר מארח במערכות סינגניות3.
גידולי עצם ראשוניים או גרורות עצם מגידולים מוצקים גורמים לנגעים אוסטאוליטיים, אוסטאובלסטיים או מעורבים אוסטאוליטיים/אוסטאובלסטיים 3,4. גידולים אלה פוגעים במבנה העצם, מגבירים את הסיכון לשבר פתולוגי ומשאירים את החולים עם אפשרויות טיפול מוגבלות. גידולי עצם ראשוניים שולחים גרורות לאיברים מרוחקים, כאשר סוגים מסוימים מסוגלים להתפשט לאתרי שלד אחרים. בחולות סרטן השד, העצם היא האתר השכיח ביותר של גרורות ראשונות והאתר הראשון השכיח ביותר של הצגת מחלה גרורתית 5,6. בנוסף, תאי גידול מפוזרים (DTC) נמצאים במח העצם לפני האבחנה של, ומנבאים את התפתחותן, של גרורות באיברים אחרים7. לכן, הוא האמין כי תאים סרטניים נוכח עצם הם המקור של תאים כי בסופו של דבר גרורות למערכות איברים אחרים. קיימים מודלים עכבריים רבים של גרורות גידוליות מוצקות המפתחות גרורות בעיקר בריאה ובבלוטות הלימפה, ובהתאם לסוג הגידול וטכניקת ההזרקה, אולי מערכות איברים אחרות3. עם זאת, חסרים מודלים עכבריים של גרורות עצם שמייצרים באופן מהימן גרורות שלד ספציפיות לאתר ומפתחות גרורות עצם לפני שהעכברים מגיעים לקריטריונים להסרה מוקדמת מנטל הגידול הראשוני או גרורות לאיברים אחרים. דיווחנו על מודל של אוסטאוסרקומה של גידול העצם הראשוני המסתמך על השתלה כירורגית של אלוגרפט גידול מוצק לתוך השוקה הפרוקסימלית של עכברים8. גידולי עצם נוצרו ב-100% מהעכברים וב-88% פיתחו גרורות ריאתיות. שכיחות זו של גרורות עולה על מה שמדווח קלינית בדרך כלל אצל אנשים (~ 20-50%), אך היא מעניינת מאוד מכיוון שהריאה היא האתר השכיח ביותר של גרורות לאוסטאוסרקומה 9,10,11. בעוד מודל זה הוא יתרון במידול גידולי עצם ראשוניים, יש לו גם תועלת רבה במידול גרורות עצם מגידולים מוצקים אוסטאוטרופיים אחרים כגון שד, ריאות, ערמונית, בלוטת התריס, כבד, כליות וגידולים במערכת העיכול.
הרציונל לפיתוח מודל זה היה לפתח חלופה להזרקה התוך-אוסית המסורתית בדרך כלל לתוך השוקה הפרוקסימלית או עצם הירך הדיסטלית כדי למדל גידולי עצם ראשוניים או גרורות עצם12. המטרה העיקרית שלנו הייתה להקל על מגבלה ידועה של טכניקה זו, כלומר אמבוליזציה של הגידול של הריאה. התוצאה היא קליטה של תאי גידול תסחיפים אלה ו"גרורות מלאכותיות" שאינן משחזרות את המפל הגרורתי המלא מגידול עצם ראשוני מבוסס ששולח גרורות לריאות 8,13. זה יהיה גם המצב כאשר גרורות עצם מבוססות מתפשטות לאתר מרוחק. בנוסף, טכניקה זו פותחה גם כדי לייצר מודל של גרורות עצם שיבטיח שכיחות גבוהה יותר של השתלה וצמיחה של גידולים בעצם ובאתר אחיד בהשוואה לטכניקות הזרקה אורתוטופיות או תוך וסקולריות. למודל זה יתרונות מובהקים על פני טכניקות מתוארות אלה. מודל זה כולל העברה מבוקרת ועקבית של תאי הגידול לתוך העצם. כמו כן, הוא מונע גרורות ריאה מלאכותיות לאחר אמבוליזציה ריאתית ומבסס אוכלוסיית מחקר אחידה בסיסית. יש יתרון של גידולים ספציפיים לאתר עם מודל זה ללא הסיכון של קריטריונים להסרה מוקדמת כתוצאה מגידולים ראשוניים או גרורות לאיברים אחרים. לבסוף, מודל זה יש תועלת רבה לשינוי, כולל השימוש xenografts נגזר המטופל.
למודל המוצג יש קווי דמיון להזרקת תרחיף תאים ישיר לעצם בעקבות גישה כירורגית ואחריה הזרקה דרך קליפת המוח או העברה לחלל המח לאחר ביצוע פגם קטן בקליפת המוח (עם או בלי כריתה של החלל המדולרי)8,14,15,16,17. עם זאת, ההשתלה של אלוגרפט גידולי הופכת טכניקה זו לשונה במובהק. לכן, מטרת דו"ח זה הייתה להדגים מודל זה של גידולי עצם ראשוניים וגרורות עצם מגידולים מוצקים, המתגבר על מגבלות רבות של מודלים שתוארו קודם לכן. קבוצות מחקר בעלות ניסיון בתרביות תאים, מודלים של עכברים, הרדמה וניתוחים של עכברים ואנטומיה של עכברים מצוידות היטב כדי לשחזר את הטכניקה שלנו למדל גידולי עצם ראשוניים או גרורות עצם בעכברים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים המתוארים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת קיימברידג', קיימברידג', בריטניה.
1. הכנת קווי תאים
- לגדל קווי תאים בהתאם לפרוטוקולי תרביות התאים הסטנדרטיים של המעבדה לתרבית תאים מסורתית או הזרקה לעכברים. פרוטוקולים סטנדרטיים המשמשים כאן הם גידול בתווך הנשר המעובד של דולבקו המכיל 10% נסיוב בקר עוברי (FBS), L-גלוטמין ופניצילין/סטרפטומיצין (להלן מדיום גדילה מלא).
הערה: בניסוי זה, תאי Abrams osteosarcoma משמשים בעכברי Balb/c Foxn1 nu/nu . במחקרי סרטן השד נעשה שימוש בתאי 4T1 בעכברי Balb/c ובתאי EO771 בעכברי C57BL/6. - לגדל תאים בצלוחיות תרבית רקמה מאווררות או בצלחות תרבית רקמה 6 בארות ב 37 ° C ב 5% CO2.
- עוברים את קו העניין של התא ומכינים את התאים להזרקה כאשר התאים מגיעים למפגש נפוץ עם הזרקה של תאים אלה לעכברים.
2. בעלי חיים
- השתמש Balb/c Foxn1 nu/nu עכברים לפחות 6-8 שבועות של גיל עבור יצירת גידול תת עורי כדי להבטיח כי בעלי החיים הם מעבר לשלב הצמיחה המהירה והגיעו בגרות ובגרות השלד.
- השתמש בעכברים זכרים או נקבות. יש להחריג את בחירת שורות התאים המגיבות להורמונים (למשל, תאי סרטן השד בעכברים נקבות ותאי סרטן הערמונית בעכברים זכרים).
- לניסויי xenograft, השתמשו בעכברים עירומים אתימיים מדוכאי חיסון המבוססים על כך שקו התאים אינו תואם למערכת החיסון של עכבר שלם בתנאים רגילים.
- עבור ניסויים allograft באמצעות שורות תאים murine, זה מומלץ גם מבוסס על רקע גנטי וחיסוני שונה של עכבר. עם זאת, עבור ניסויים סינגניים, להשתמש בבעלי חיים מאותו זן כמו קו התא של עניין.
- חיות בית בצפיפות סטנדרטית בהתאם למדיניות הגידול של המוסד.
3. גידולים תת עוריים
- קצור קווי תאים מתרבית על ידי טריפסיניזציה והשהיה מחדש במי מלח סטריליים חוצצי פוספט (PBS).
- הערך את כדאיות התא וקבע את צפיפות התא באמצעות שיטת ההרחקה הכחולה של טריפאן. השתמש בהמוציטומטר או מונה תאים אוטומטי כדי לספור את התאים. כדאיות תא מינימלית של 90% תשמש להזרקה לעכברים ליצירת גידולים תת עוריים.
- התאם את צפיפות התא כדי להזריק 1-2 x 105 תאים בנפח סופי של 0.1 עד 0.15 מ"ל (100 עד 150 מיקרוליטר) של PBS סטרילי. שמור את התאים על קרח עד ההזרקה.
- לחלופין, תאי גלולה על ידי צנטריפוגה ב 800 x גרם במשך 5 דקות. השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את התאים הכדוריים בתווך מטריצת קרום מרתף סטרילי לא מדולל לקבלת 1-2 x 105 תאים בנפח סופי של 0.1 עד 0.15 מ"ל (100 עד 150 מיקרוליטר). שמור את התאים על קרח עד לשימוש נוסף.
- מרדימים עכברים שישמשו לצמיחת גידול תת עורי עם איזופלורן בהרדמת חמצן. יש להשתמש במינון אינדוקציה של 5% איזופלורן בחמצן של 2 ליטר/דקה ובמינון תחזוקה של 2-3% איזופלורן בחמצן של 2 ליטר/דקה. בדוק את חוסר הרפלקסים של המצמוץ או הדוושה לפני שתמשיך הלאה.
הערה: איזופלורן הוא חומר הרדמה בשאיפה. השתמש isoflurane באזור מאוורר היטב עם נבלות מתאימות ומערכות איסוף גז חופשי. יש להתייעץ עם הצוות הווטרינרי המוסדי כדי לגבש תוכנית להשראת הרדמה, תחזוקה וניטור, ולוודא שלצוות המעבדה יש הכשרה מתאימה בניטור הרדמה ובטיפול בחומרי הרדמה נדיפים. - הסר שיער מהאזור הגבי של בית החזה או הבטן של עכברים מורדמים עם תמיסת depilating או עם קוצץ חשמלי. פתרון Depilating עדיף כדי למזער טראומה פוטנציאלית לעור. דלג על שלב זה אם אתה משתמש בעכברים עירומים אתימיים.
- נקו את האזור המוכן עם מקלון אתנול 70% לפני הזרקת תרחיף התא.
- השתמש מזרק שחפת 1 מ"ל עם מחט 27 G כדי להזריק תאים תת עורית על האזור הגבי של בית החזה או הבטן, לא להיות מושפע על ידי תנועה של השכמות. לחלופין, הזריקו את התאים באופן תת-עורי כתרחיף במטריצה חוץ-תאית זמינה מסחרית.
הערה: הזרקה במטריצה חוץ-תאית זמינה מסחרית תגביל את נדידת תרחיף התא בחלל התת-עורי מכיוון שמטריצות אלה מתמצקות בטמפרטורת החדר. - החזירו את העכברים על כרית חימום בכלובים נפרדים עד לאמבולטורי. לאחר מכן ניתן להכניס עכברים לכלובים הרגילים שלהם עם מצעים נקיים ויבשים.
- יש לעקוב אחר גודל הגידול התת עורי מעל בית החזה הגבי או הבטן עם קליפר ולמדוד את משקל הגוף מדי שבוע כדי לוודא שהגידולים התת עוריים אינם כיבים או שהעכברים עומדים בקריטריונים להסרה מוקדמת כפי שנקבעו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המוסדות. גודל גידול מקסימלי של 15 מ"מ בכל ממד מומלץ כדי להפחית את הסיכון לכיב בעור או לנמק של הגידול המרכזי.
הערה: עיין בהנחיות המקומיות כדי לקבוע גודל/נפח הגידול המרבי המותר. - המתת חסד של עכברים הנושאים גידולים תת עוריים לאחר שלושה עד ארבעה שבועות על ידי שאיפתCO2 ואחריה פריקת צוואר הרחם. פעל בהתאם למדיניות המקובלת של המוסד בנוגע להמתת חסד של עכברים.
- קציר גידולים תת עוריים בטכניקה כירורגית אספטית. לעקר את העור מעל הגידול כמו קודם עם 70% אתנול לאחר הסרת השיער (אם רלוונטי). חתך דרך העור מעל הגידול עם להב אזמל #15 (עם או בלי ידית להב אזמל). נתחו בחדות את הגידול מהרקמות הרכות המחוברות שמסביב בעזרת זוג מספריים כירורגיים סטריליים.
- מקם את הגידול בלוחות תרבית רקמה 6 בארות המכילות מדיום צמיחה שלם וטחון למספר שברים קטנים בגודל שנקבע מראש (~ 0.6 מ"מ x 0.6 מ"מ x 0.6 מ"מ – 0.25 מ"מ 3 עד 1 מ"מ x 1 מ"מ x 1 מ"מ –1 מ" מ3) עם להב אזמל #15 (עם או בלי ידית להב אזמל).
- יש לשמור על שברי הגידול במצע צמיחה סטרילי שלם בטמפרטורת החדר עד למועד ההשתלה התוך-טיביאלית. עבור קווי תאים הנושאים גנים של לוציפראז או כתב פלואורסצנטי, השתמש בהדמיה ביולומינסנטית או פלואורסצנטית ex-vivo כדי לאשר את כדאיות הגידול לפני השתלה תוך טיביאלית בעכברים.
- לשימור בהקפאה, הניחו מקטעים מרובים באותו קריוביאל במדיום גידול מלא בתוספת 20% FBS ו-10% דימתיל סולפוקסיד (DMSO). יש להקפיא בהדרגה באמצעות מערכת הקפאה מסחרית בטמפרטורה של -80°C ולאחסן לטווח ארוך בחנקן נוזלי. שמור על שברי הגידול לניתוח לאחר מכן, אך לא להשתלה עתידית, על ידי הקפאת בזק באמצעות טבילת חנקן נוזלי. אחסנו את שברי הגידול הקפואים הללו לטווח ארוך בטמפרטורה של -80°C.
הערה: בעבר דווח כי גידולים קפואים בזק לא ישתרשו ויגדלו in vivo8.
4. השתלה כירורגית של שברי גידול תת עורי
- יש להביא שברים טריים או שמורים בהקפאה של גידול תת עורי לטמפרטורת החדר במצע צמיחה מלא לפני ההשתלה הכירורגית.
- מרדימים עכברים מהזן המעניין באמצעות איזופלורן בהרדמת חמצן כמתואר בסעיף 3. בדוק את היעדר רפלקסי הדוושה לפני שתמשיך. לנהל buprenorphine תת עורית במינון של 0.02-0.05 מ"ג / ק"ג כדי לספק שיכוך כאבים peri-operation. ניתן לחזור על כך כל 6-8 שעות בתקופה שלאחר הניתוח, במידת הצורך.
- הסר שיער על מפרק הברך הימני ואת השוקה הפרוקסימלית של הגפה האחורית עם פתרון depilating כדי למזער את הטראומה הפוטנציאלית לעור.
- לשפשף את האזור מוכן עם חיטוי כירורגי. יש לשפשף תחילה עם מקלון אתנול 70% ולאחר מכן לשפשף עם כלורהקסידין וקרצוף מלוחים לסירוגין.
- דמיינו את השוקה הפרוקסימלית כאזור פשוט דיסטלי למפרק הברך תוך כדי כיפוף והארכת המפרק.
- צור חתך 3-4 מ"מ ברמת השוקה הפרוקסימלית באספקט המדיאלי של הגפה עם להב אזמל #15 (עם או בלי ידית להב אזמל). חותכים דרך העור והרקמה התת עורית כדי לחשוף את קליפת המוח המדיאלית של השוקה הפרוקסימלית.
- הפעילו לחץ עדין עם קצה של מחט 25 גרם, תוך כדי סיבוב הקצה, כדי ליצור חור קטן בקליפת המוח המדיאלית של השוקה הפרוקסימלית. הפוך את החור הזה לדיסטלי בערך 2 מ"מ למפרק הברך בנקודה שווה בין קליפת המוח הטיביאלית הגולגולתית והקאודלית. בחר את גודל המחט בהתאם לגודל של שברי הגידול.
- השתמש במלקחיים סטריליים כדי להרים ולהחדיר את שברי הגידול לתוך החלל המדולרי של השוקה הפרוקסימלית. השתמש במחט של 27 עד 30 גרם כדי לתפעל את קטע הגידול לתוך התעלה המדולרית. בהתאם לגודל שברי הגידול, יש להשתיל לפחות 0.5 מ"מ3 נפח גידול כולל בכל שוקה. זה עשוי לדרוש השתלה של 1 או יותר שברי הגידול בהתאם לגודל של קטעי הגידול שנוצרו.
הערה: שינויים כדי למנוע או להגביל את התזוזה של השתל מחוץ לעצם יהיו מיקום של שעוות עצם או מלט עצם בפגם העצם או קצף ג'ל או שתל שומן תת עורי מעל החור בעצם. - יש להדביק את קצוות העור בעזרת דבק רקמה נוזלי סטרילי או תפר עור יחיד. אין להשתמש בקליפסים לפצעים באתר זה. היזהר אם אתה משתמש בהדמיה פלואורסצנטית בתקופה שלאחר הניתוח, שכן הן דבקי רקמות והן תפר יש פוטנציאל פלואורסצנטי.
- החזירו את העכברים על כרית חימום בכלובים נפרדים עד לאמבולטורי.
5. הערכה טורית ונקודת קצה
- מרדימים עכברים באמצעות איזופלורן בהרדמת חמצן כפי שתואר קודם לכן.
- להעריך את צמיחת הגידול הטיביאלי באופן לא פולשני על ידי רדיוגרפיה דיגיטלית שבועית, ביולומינסנציה או הדמיה פלואורסצנטית (אם משתמשים בתאים המבטאים לוציפראז או בגן כתב פלואורסצנטי). מדידות קליפר של האיבר באתר ההשתלה יכולות להתבצע גם בעכברים ערים.
- בנוסף לניטור המסורתי של עכברים נושאי גידול (משקל גוף, רמת פעילות, קצב נשימה, טיפוח, יציבה, מנטציה והתנהגות) יש לעקוב אחר עכברים מדי שבוע לאיתור סימנים של צליעה בגפיים האחוריות, נפיחות וזיהום באתר הניתוח.
- יש לעקוב אחר הפצע הניתוחי בעור במשך 10-14 הימים הראשונים לאיתור אדמומיות יתר, נפיחות, ניקוז והידרדרות הפצע עד לריפוי פצע העור. לאחר 4-5 שבועות, יש להעריך עכברים בהתאם להערכת תוצאות המחקר בחיים או לאחר המתת חסד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תוצאה חיובית תהיה קשורה לקליטת הגידול ולצמיחת הגידול המתקדמת לאורך זמן. בהתאם לסוג הגידול, גידול תוך אוסוסי עשוי להיות קשור לצליעה מתקדמת בגפיים האחוריות, אך גידולים רבים אינם גורמים לצליעה למרות סימנים של מחלת עצם נלווית. השתלה מוצלחת תועדה באמצעות הדמיה מתקדמת, לפיה יהיו שינויים רדיוגרפיים, μCT או μMRI מתקדמים בשוקה הפרוקסימלית הקשורה לפנוטיפ העצם של קו העניין של התא (גרורות אוסטאוליטיות, אוסטאובלסטיות, או מעורבות אוסטאוליטיות/אוסטאובלסטיות) (איור 1)8. בדו"ח הקודם שלנו, הפגם בקליפת המוח שנוצר כתוצאה מהשתלת שתל הגידול נראה בשוקה הפרוקסימלית שבוע לאחר ההשתלה (איור 1A). בשבוע 2 כבר הייתה אוסטאוליזה נראית לעין ועיצוב מחדש של העצם בסמוך לפגם בקליפת המוח. בין שבועות 2-5 התרחש הרס עצם מתקדם והיווצרות עצם חדשה הקשורה לקליטת הגידול ולצמיחתו (איור 1B-E). עבור שורות תאים עם גנים מדווחים, שינויים בעצמות ילוו בעלייה בתפוקות הדמיה פלואורסצנטיות או ביולומינסנציה לאורך זמן. צליעה חריפה עשויה להיות אינדיקטור לשבר עצם ממשמש ובא או ממשי, המחייבת הערכה רדיוגרפית מיידית וזהירה של העכבר, ואולי הסרה מוקדמת מהמחקר. בהתאם לקו תאי הגידול הנחקר, הרס העצם עלול להתרחש במהירות, הרבה לפני גרורות. יש לכך חשיבות ספציפית במחקרים הכוללים גידולי עצם ראשוניים, שכן ייתכן שיהיה צורך להסיר עכברים מהמחקר לפני התפתחות גרורות רלוונטיות קלינית, כלומר לריאה. במקרים אלה, מומלץ לקטוע כירורגית את האיבר הנושא את הגידול כדי לאפשר מחקר של מחלה שיורית מינימלית וגרורות עוקבות בעת שימוש בגידולי עצם ראשוניים, כפי שדיווחנו בעבר 4,8. בעוד קטיעת גפיים אחוריות מלאה אצל אנשים אינה מבוצעת בדרך כלל, זהו טיפול סטנדרטי ברפואה וטרינרית, אשר הדמיון במאפיינים הקליניים והמולקולריים של אוסטאוסרקומה אנושית וכלבית מתועד היטב. קטיעת גפיים אחוריות בעכברים רלוונטית, אם כן, לשורות תאים רבות של בעלי חיים. בנוסף, קטיעה היא שיטת טיפול בת קיימא בעכברים מכיוון שהליכים חוסכי גפיים המשמשים אנשים אינם ניתנים להשגה במכרסמים קטנים כגון עכברים. בעכברים הנושאים גידולי עצם ראשוניים, חוסר יכולת, ירידה הדרגתית במשקל, מצב גוף כללי ירוד וקשיי נשימה (קצב מוגבר או מאמץ) עשויים לאותת על התפתחות גרורות סרטניות לריאה ולאיברים אחרים. אישור על ידי הדמיה ביולומינסנטית, μCT, או הדמיית μMRI מומלץ לאשר גרורות, ויש להרדים בעלי חיים מושפעים.
יש לחשוד בתוצאה שלילית, הנובעת ככל הנראה מחוסר קליטת גידול, אם אין עדות לשינויים מתקדמים (נגעים אוסטאוליטיים, אוסטאובלסטיים או מעורבים אוסטאוליטיים/אוסטאובלסטיים, בהתאם לקו התא הנחקר) בבדיקת רדיוגרפיה או μCT של עצם השוקה המושתלת. עבור קווי תאים הנושאים גנים מדווחים, היעדר עלייה באיתות פלואורסצנטי או ביולומינסנציה לאורך זמן על ידי הדמיה אופטית יתמוך גם הוא במסקנה שהגידול נכשל בחדירה. חוסר או קליטה לקויה יכול להיות קשור לזיהום באתר הניתוח. עם זאת, זה יציג סימנים קליניים ספציפיים כגון אדמומיות, נפיחות או הפרשות בדרך כלל בתקופה המוקדמת שלאחר הניתוח (הראשון 1-2 שבועות לאחר הניתוח). בעלי חיים עלולים גם להיות חום ולהפגין חוסר פעילות או יציבה כפופה בתקופה המוקדמת שלאחר הניתוח עקב זיהום באתר הניתוח. קצירת ושמירה על האלושתלים בתנאים סטריליים במהלך ההכנה והכנה סטרילית נכונה של הגפה, טכניקה תוך ניתוחית סטרילית וסגירת פצע מלאה ימזערו את הסבירות לסיבוך פצע כירורגי לאחר הניתוח וכתוצאה מכך זיהום וכישלון של השתלת הגידול.
בדו"ח הקודםשלנו 8, כאשר כלל הן את הפיילוט המדווח והן את המחקרים הסופיים, 16 מתוך 16 עכברים (100%) שהושתלו בהם שברי אוסטאוסרקומה התקדמו לנגעים אוסטאוליטיים בעצמות ו-14 מתוך 16 עכברים אלה (88%) פיתחו גרורות. כל הגרורות נצפו בריאה ואובחנו על ידי היסטולוגיה כבר 3 שבועות לאחר ההשתלה8. בעלי חיים נוספים שנקרופסי ב-1 (n=2) ו-2 (n=2) שבועות לאחר ההשתלה לא גילו כל עדות לגרורות ריאה.
איור 1: רדיוגרפיה טורית. רדיוגרפיה טורית (לפי הסדר) מבוצעת מדי שבוע ב-(A) 1, (B) 2, (C) 3, (D) 4 ו-(E) 5 שבועות לאחר השתלה תוך tibial של אלוגרפט גידול תת-עורי באמצעות קו תאי גידול עצם ראשוני (אוסטאוסרקומה). עם הזמן, היה הרס עצם פרוגרסיבי והיווצרות של עצם חדשה הקשורה לקליטת הגידול וצמיחתו. נתון זה שונה באישור ref8. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
דו"ח זה מתעד את המודל שלנו ליצירת גידולי עצם ראשוניים או גרורות עצם לאחר השתלה תוך טיביאלית של אלוגרפט גידולי. אנו מאמינים כי ישנם מספר שלבים קריטיים בתהליך זה. יש לקבוע מישור הרדמה בטוח הן להזרקה תת עורית של תרחיף תאי הגידול והן למיקום תוך טיביאלי של שברי הגידול המתקבלים. צריכה להיות הכנה סטרילית של האתר הכירורגי הן להסרת allograft תת עורית ומיקום intratibial של allograft. יש ליצור שברי אלוגרפט גידול באופן אחיד להשתלה תוך טיביאלית לאחר מכן. יש ליצור פגם בגודל מתאים בשוקה הפרוקסימלית להשתלת שברי גידול. פצע העור הכירורגי צריך להיות סגור לחלוטין כדי להפחית את הסיכון לסיבוכים פצע לאחר הניתוח. השלב הקריטי האחרון הוא שאם משתמשים במטריצה חוץ-תאית כחלק מתרחיף תאי הגידול להזרקה תת עורית, יש להשתמש בהוראות הטיפול המומלצות על ידי היצרן כדי למנוע התמצקות של המתלה לפני ההזרקה. הכנה סטרילית נכונה של הגפה, טכניקה תוך ניתוחית סטרילית וסגירת פצע מלאה ימזערו את הסבירות לסיבוך פצע כירורגי לאחר הניתוח.
תכונות הגידול המושתל והטכניקה הכירורגית הן קריטיות לתוצאות מוצלחות וניתנות לשחזור לשילוב באוכלוסיית המחקר שלך. בתחילה, יש לוודא כי הגידול xenograft/allograft מושתל ישירות לתוך החלל medullary של השוקה, לוודא כי רקמת הגידול הוא מלא בתוך העצם. שינויים כדי למנוע או להגביל את התזוזה של השתל מחוץ לעצם יהיה בתחילה מיקום של שעווה עצם או מלט עצם בפגם העצם או קצף ג'ל או שתל שומן תת עורי מעל החור בעצם. חלופה תהיה החדרת אלוגרפט הגידול דרך חור באספקט הלטרלי של השוקה הפרוקסימלית, שנוצר מתחת לשריר הטיביאלי הגולגולתי. נוכחותו של שריר הטיביאל הגולגולתי תשמש אז ככיסוי ביולוגי על פגם העצם, ותגביל תזוזה פוטנציאלית של אלוגרפט הגידול. עם זאת, זוהי גישה כירורגית אגרסיבית יותר עם פוטנציאל לטראומה נוירומוסקולרית באספקט הצידי של השוקה הפרוקסימלית. יש להקפיד לוודא כי allografts הגידול נוצרים להיות בגודל אחיד לפני ההשתלה. עם זאת, אלושתלים סרטניים לא יעלו על 1 מ"מ בכל ממד, מכיוון שגדלים גדולים יותר של גידול בכל מערכת ביולוגית נוטים פחות להשתיל מאשר שתלים קטנים יותר כאשר אין אספקת כלי דם ישירה ומיידית לשתל בזמן ההשתלה. דיווחנו על תוצאות מוצלחות עם נפח גידול מושתל סופי של 0.5 מ"מ 3 אך אנו צופים כי נפחי מקטעי גידול משולבים עד 1 מ"מ3 ישיגו תוצאות מוצלחות. עם זאת, נפח מקטע הגידול המרבי המושתל לא נקבע. בהשוואה לרקמות שמורה בהקפאה, גידולים טריים xenografts ו allografts נוטים יותר לשרוד, אם כי לא ראינו בעיה עם הנוהג של שימוש בזהירות cryopreserved גידול allografts. אין להשתיל אלושתלים קפואים בהצמדה. בנוסף, דיסקציה של הקפסולה והחלק החיצוני של הגידול התת עורי תמנע כל תרומה משכבה זו של הגידול, שהיא סיבית ווסקולרית ברובה עם חדירה חיסונית משמעותית ולא מורכבת בעיקר מתאי הגידול עצמם. שיטה חלופית ליצירת אלושתלים סרטניים ממסת הגידול הגדולה ישירות עם להב אזמל היא באמצעות מחט ביופסיה קטנה היוצרת "ליבה" גלילית של הגידול שניתן לחתוך לאורך מוגדר מראש לפני ההשתלה. שימוש במחט ביופסיה או ניקוב ביופסיית ליבה עשוי להועיל ביצירת מקטעי גידול אחידים להשתלה, שכן לאחר שנוצרו שני ממדים אחידים (רוחב ועומק) בתהליך הביופסיה, ניתן לחתוך אותם לאורך המתאים לפני ההשתלה. אם גנים מדווחים כגון לוציפראז או חלבונים פלואורסצנטיים נמצאים בשימוש בתאי הגידול המושתלים, הערכה של מקטעי הגידול בזמן ההשתלה או שבוע לאחר ההשתלה תצביע על תרומה יחסית של תאי הגידול בשברי הגידול המושתלים, כמו גם כדאיות.
כמו בכל הליך, ישנן מגבלות בנוסף ליתרונות המדווחים שלנו של טכניקה זו. גרורות הן תהליך רב-שלבי הדורש תא ממיקומו הראשוני לבצע בהצלחה פלישה ונדידה דרך המטריצה החוץ תאית, תוך כדי אספקת הדם של הגידול, לשרוד במחזור הדם עד שהוא מגיע ליעדו הגרורתי הסופי, לחדור לאיבר תקין ואז להישאר במצב רדום או להתרבות כדי ליצור נגע גרורתי, ושינוי ארכיטקטורת הרקמה הרגילה כך שתהפוך לגרורות הניתנות לזיהוי קליני18. מודלים עכבריים המשמשים כיום של גרורות בעצמות מסתמכים בעיקר על הזרקה אורתוטופית ישירה של תאי הגידול לאתר הרגיל של הגידול הראשוני, הזרקה תוך וסקולרית לחדר השמאלי של הלב או היקפית לתוך ורידי הזנב (ורידים קאודליים לטרליים או גביים), או הזרקה תוך אוסית ישירה של תרחיף תאי הגידול3. עם זאת, דיווחים אחרונים המנסים לשפר מודלים של גרורות בעצמות תמכו בהזרקה לעורקים האילאקים, הקאודליים או הירכיים 19,20,21. כל השיטות הללו משלבות שלב אחד או יותר בתוך מפל גרורות העצם, למעט הזרקה תוך-אוסית ישירה או במקרה שלנו השתלת אלוגרפט גידולי, אשר רק מודל לשינוי רקמות קצה. לכן, זוהי מגבלה מובנית אחת של הטכניקה שלנו. מגבלה נוספת היא שכפי שמתואר כיום, היא דורשת ריבוי של האלושתלים בפונדקאי עכבר ביניים, מה שדורש שימוש בעכברים נוספים ומביא להשתלת גידול שאינו 100% תאי גידול טהורים. לאלוגרפט תהיה תרומה סטרומלית מסוימת המסופקת על ידי גידולים הגדלים במיקום תת עורי. חלופה אפשרית למזעור תרומת סטרומה תת-עורית זו תהיה הזרקת תאים תת-עוריים במצע ביולוגי כגון מטריצה חוץ-תאית או פיגום. לחילופין, ניתן לבצע הזרקה אורתוטופית לאתר הראשוני של הגידול, ולאחר מכן הסרת הגידול והכנת השתל.
לשיטה המתוארת בדו"ח זה יתרונות מרכזיים בהשוואה לשיטות הקיימות למידול גידולי עצם ראשוניים או גרורות עצם לאחר הזרקה תוך-אוסית ישירה של תאי גידול. כפי שנדון, אנו ואחרים ראינו אמבוליזציה ישירה של הריאות ומוות מיידי מדי פעם לאחר הזרקה intratibial של תרחיף התא 8,13. הדבר נובע מהזרקה בלחץ של תאי הגידול לחלל המח, שלאחריה נכנסים תאי הגידול לאספקת הדם ההיקפית דרך סינוסיואידים וסקולריים של מח העצם ונישאים לריאה על ידי החזרה ורידית. אירועים אלה דומים מבחינה מכניסטית לזו שנצפתה עם טרומבואמבוליזם ריאתי או ורידי הקשור למיקום בלחץ של שתלים בחלל המח הקשורים לארתרופלסטיקה כוללת של המפרקים באנשים ובבעלי חיים. אנו ואחרים משערים כי תופעה זו של תסחיף לריאות עשויה להיות ספציפית לקו התא (תצפיות שלא פורסמו). עם זאת, דווח על צעדים מפורטים מאוד המגבילים את היווצרותן של גרורות מלאכותיות תסחיף אלה12. בתחילה, צריך להיות טריפסיניזציה נאותה ויצירת תרחיף תא בודד אחיד להזרקה, אשר צריך להיות מאוחסן על קרח כדי למנוע גושי תאים. המחט צריכה להיות ממוקמת כראוי דרך צלחת הצמיחה הטיביאלית הפרוקסימלית, ולאחר מכן יש לבצע נפחי הזרקה קטנים (~ 10 μL) וזריקות ללא התנגדות לחלל המח. למרות זאת, ניתן לצפות בקלות בהעברת תאי גידול לריאות, וגם לאיברים אחרים, על ידי הדמיה ביולומינסצנטית בעקבות טכניקות הזרקה תוך אוסאוסיות ותוך-וסקולריות, דבר המצביע על כך שייתכן שתאים המייצרים אות ביולומינסנטי זה בריאות ובאיברים אחרים יכולים לגרום לגרורות מרוחקות (תצפיות שלא פורסמו)3. מצאנו כי יתרון נוסף של טכניקה זו הוא שגידול בודד גדל באתר עצם אחיד באוכלוסיית המחקר, מה שמפחית את השונות בין בעלי חיים לבעלי חיים. הדבר מאפשר יצירת אוכלוסיית מחקר אחידה והשוואה מוכנה בין קבוצות הטיפול. זאת בניגוד לגרורות בעצמות המתפתחות לאחר הזרקה אורתוטופית או תוך וסקולרית, שם תאים יכולים לשלוח גרורות לאתרי שלד שונים ולגדול עם קינטיקה שונה, מה שהופך את ההשוואה בין קבוצות המחקר למאתגרת. צמיחת הגידול באתר אנטומי אחד לאחר השתלת אלושתלי הגידול שלנו מונעת גם את האפשרות של הסרת עכברים עקב גרורות למערכות איברים אחרות או עומס גידול ראשוני, כפי שניתן לראות בטכניקות הזרקה תוך וסקולריות ואורתוטופיות. בנוסף, נצפתה השתלה של 100% לאחר השתלת אלוגרפט גידולי, התומכת באוכלוסיית מחקר אחידה ומונעת שימוש מיותר בעכברים נוספים להשגת מספרי גודל מדגם מתאימים. זה גם מתגבר על המגבלה של הזרקה חלקית ולא מדויקת בעקבות הזרקה מלעורית של תרחיפים של תאי גידול לתוך העצם.
טכניקה זו יש מידה רבה של צדדיות אשר הביא שינויים המשמשים כיום במחקר שלנו ויש לו פוטנציאל תועלת רבה עבור יישומים עתידיים. בתחילה, בעוד אנו משתמשים בטיביה הפרוקסימלית כאתר ההשתלה התוך-אוסוסי שלנו, ניתן להשתמש בקלות באתרים נפוצים אחרים של גידולי עצם ראשוניים או גרורות בעצמות, כולל, אך לא רק, עצם הירך הדיסטלית וההומרוס הפרוקסימלי. עם זאת, הגישה הניתוחית לאתרים אלה, כמו גם לאזורים כגון האגן ועמוד השדרה, דורשת גישה כירורגית נרחבת יותר בהדרגה בהשוואה לטיביה הפרוקסימלית. בנוסף, אתרים כגון האגן, עמוד השדרה, הגולגולת, הרדיוס והאולנה אינם נהנים ממלאי עצם מספיק להשתלת גידול. עבור ממאירויות פולשניות עצם כגון עם גידולים אוראליים, מיקום של allografts הגידול בסמוך לעצם או בתוך oropharynx עשוי גם לשחזר את ההתקדמות של גידולים פולשניים 3,22. ניסויים במבחנה ו-in vivo משתמשים לעתים קרובות בתרבית משותפת או בטכניקות הזרקה משותפת כדי לקבוע את ההשפעות של סוגי תאים שונים על סוג התא המעניין. לכן, קיים פוטנציאל להזרקה של שני סוגי תאים או יותר בו זמנית ליצירת גידולים תת עוריים, אשר לאחר מכן ניתן להשתיל לתוך העצם באמצעות טכניקה זו. תאים מהונדסים גנטית יכולים לשמש לבד או בשילוב עם תאים נורמליים אחרים או מהונדסים גנטית כדי ליצור את allografts הגידול. עם העניין הגובר ברפואה מדויקת ויצירת מודלים in vitro ו- in vivo של סרטן אנושי, השתלת xenograft שמקורו בחולים בעכברים צוברת פופולריות. לאחרונה תואר מודל של גרורות עצם בסרטן השד שבו קסנוגרפטים שמקורם במטופלות הושתלו גרורות אורתוטופיות לדיסקים של עצמות אנושיות שהושתלו תת עורית בעכברים עירומים23. מכאן, ניתן להשתיל קסנוגרפטים שמקורם במטופל ישירות לעצם באמצעות המודל שלנו, ללא צורך במארח ביניים להתרבות תת עורית. זה יאפשר הערכה מהירה של קינטיקה של הגידול ויכולת להעריך שילובי טיפול מרובים פוטנציאלית מביופסיה אחת בלבד של מטופל, ללא צורך במסת גידול גדולה להכנת allograft. השימוש הגובר באורגנואידים בחקר הסרטן יכול לשמש גם במודל24 שלנו. זה ידרוש הזרקת מחט או פיפטה של צברי תאים אלה דרך החור בקליפת המוח הטיביאלית. לכן, אנו ממליצים לאטום את הפגם בקליפת המוח (כפי שנדון לעיל) כדי להגביל את האפשרות של נדידת אורגנואידים מחוץ לחלל העצם ומח המוח. כפי שביצענו, ניתן לתייג תאים ולעקוב אחריהם באמצעות הדמיה אופטית (ביולומינסנציה או פלואורסצנציה) או מתקדמת (רדיוגרפיה דיגיטלית, μCT או μMRI) המאפשרת להעריך את צמיחת הגידול לאורך זמן. יש לזה גם את היתרון של מזעור מספר בעלי החיים מכיוון שאותם בעלי חיים מצולמים לאורך זמן.
לסיכום, דו"ח זה מדגים את הטכניקה שלנו מידול גידולי עצם ראשוניים וגרורות עצם באמצעות השתלת גידול מוצק לתוך העצם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ד"ר הילדרת' מומן על ידי ה-NIH תחת מספר פרס K01OD026527. התוכן הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של ה-NIH.
Acknowledgments
המחברים מכירים בתרומתה הקריטית של ד"ר בת' צ'אפי, DVM, PhD, DACVP לפיתוח טכניקה זו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #15 scalpel blade | Henry Schein Ltd. | 75614 | None |
| 6-well tissue culture plates | Thermo Fisher Scientific | 10578911 | Used for mincing tumor pieces. Can also be used for cell culture |
| Abrams osteosarcoma cell line | Not applicable | Not applicable | None |
| Anesthesia machine with isoflurane vaporiser and oxygen tank(s) | VetEquip | 901805 | None |
| Animal weighing scale | Kent Scientific | SCL- 1015 | None |
| BALB/c nude mouse (nu/nu) | Charles River Ltd. | NA | 6-8 weeks of age. Male or female mice |
| Bone cement | Depuy Synthes | 160504 | Optional use instead of bone wax |
| Bone wax | Ethicon | W31G | Optional |
| Buprenorphine | Animalcare Ltd. | N/A | Buprecare 0.3 mg/ml Solution for Injection for Dogs and Cats |
| Carbon dioxide euthanasia station | N/A | N/A | Should be provided within animal facility |
| Cell culture incubator set at 37 °C and 5% carbon dioxide | Heraeus | Various | None |
| Chlorhexidine surgical scrub | Vetoquinol | 411412 | None |
| Cryovials (2 ml) | Thermo Scientific Nalgene | 5000-0020 | Optional if cryopreserving tumor fragments |
| D-luciferin (Firefly), potassium salt | Perkin Elmer | 122799 | Optional if cell line of interest has a bioluminescent reporter gene |
| Digital caliper | Mitutoyo | 500-181-30 | Can be manual |
| Digital microradiography cabinet | Faxitron Bioptics, LLC | MX-20 | Optional to evaluate bone response to tumor growth |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | 1371171000 | Optional if cryopreserving tumor fragments |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | None |
| Ethanol (70%) | Sigma Aldrich | 2483 | None |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | None |
| Forceps, Dumont | Fine Science Tools, Inc. | 11200-33 | None |
| Freezer (– 80 °C) | Sanyo | MDF-794C | Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments |
| Hemocytometer | Thermo Fisher Scientific | 11704939 | Can also use automated cell counter, if available |
| Hypodermic needles (27 gauge) | Henry Schein Ltd. | DIS55510 | May also use 25G (DIS55509) and 30G (Catalog DIS599) needles |
| Ice | N/A | N/A | Ideally small pieces in a container for syringe and cell suspension storage |
| Iris scissors | Fine Science Tools, Inc. | 14084-08 | None |
| Isoflurane | Henry Schein Ltd. | 1182098 | None |
| IVIS Lumina III bioluminescence/fluorescence imaging system | Perkin Elmer | CLS136334 | Optional if cell line of interest has bioluminescent or fluorescent reporter genes |
| L-glutamine | Thermofisher scientifc | 25030081 | None |
| Liquid nitrogen | British Oxygen Corporation | NA | Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments |
| Liquid nitrogen dewar, 5 litres | Thermo Fisher Scientific | TY509X1 | Optional if cryopreserving tumor fragments |
| Matrigel® Matrix GFR, LDEV-Free, 5 ml | Corning Life Sciences | 356230 | Optional. Also available in 10 ml size (354230) |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002549 | Pellet cells at 1200 rpm for 5-6 minutes |
| Mr. Frosty freezing containiner | Fisher Scientific | 10110051 | Optional if cryopreserving tumor fragments |
| NAIR Hair remover lotion/oil | Thermo Fisher Scientific | NC0132811 | Can alternatively use an electric clipper with fine blade |
| Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | None |
| Scalpel handle, #7 Short | Fine Science Tools, Inc. | 10007-12 | User preference as long as it accepts #15 scalpel blade |
| Small animal heated pad | VetTech | HE006 | None |
| Stereomicroscope | GT Vision Ltd. | H600BV1 | None |
| Sterile phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Use for injections and also as part of the surgical scrub, alternating with chlorhexidine |
| Tissue adhesive (sterile) | 3M Corporation | 84-1469SB | Can alternatively use non-absorbable skin suture (6-0 size) |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | 5250061 | None |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | Use 0.05%-0.25% |
| Tuberculin syringe (1 ml with 0.1 ml gradations) | Becton Dickinson | 309659 | Slip tip preferred over Luer |
| Vented tissue culture flasks, T-75 | Corning Life Sciences | CLS3290 | Can also use smaller or larger flasks, as needed |
References
- Bryda, E. C. The Mighty Mouse: the impact of rodents on advances in biomedical research. Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).
- Vandamme, T. F. Use of rodents as models of human diseases. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 6 (1), 2-9 (2014).
- Simmons, J. K., et al.
- Wolfe, T. D., et al. Effect of zoledronic acid and amputation on bone invasion and lung metastasis of canine osteosarcoma in nude mice. Clinical and Experimental Metastasis. 28 (4), 377-389 (2011).
- Wang, R., et al. The Clinicopathological features and survival outcomes of patients with different metastatic sites in stage IV breast cancer. BMC Cancer. 19 (1), 1091 (2019).
- James, J. J., et al. metastases from breast carcinoma: histopathological - radiological correlations and prognostic features. British Journal of Cancer. 89 (4), 660-665 (2003).
- Pantel, K., Brakenhoff, R. H.
- Chaffee, B. K., Allen, M. J. A clinically relevant mouse model of canine osteosarcoma with spontaneous metastasis. In Vivo. 27 (5), 599-603 (2013).
- Munajat, I., Zulmi, W., Norazman, M. Z., Wan Faisham, W. I. Tumour volume and lung metastasis in patients with osteosarcoma. Journal of Orthopaedic Surgery (Hong Kong). 16 (2), 182-185 (2008).
- Huang, X., et al. Risk and clinicopathological features of osteosarcoma metastasis to the lung: A population-based study. Journal of Bone Oncology. 16, 100230 (2019).
- Li, W., Zhang, S. Survival of patients with primary osteosarcoma and lung metastases. Journal of BUON. 23 (5), 1500-1504 (2018).
- Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A.
- Maloney, C., et al. Intratibial Injection Causes Direct Pulmonary Seeding of Osteosarcoma Cells and Is Not a Spontaneous Model of Metastasis: A Mouse Osteosarcoma Model. Clinical Orthopedics and Related Research. 476 (7), 1514-1522 (2018).
- Dai, J., Hensel, J., Wang, N., Kruithof-de Julio, M., Shiozawa, Y. Mouse models for studying prostate cancer bone metastasis. BoneKey Reports. 5, 777 (2016).
- Marques da Costa, M. E., et al. Establishment and characterization of in vivo orthotopic bioluminescent xenograft models from human osteosarcoma cell lines in Swiss nude and NSG mice. Cancer Medicine. 7 (3), 665-676 (2018).
- Raheem, O., et al. A novel patient-derived intra-femoral xenograft model of bone metastatic prostate cancer that recapitulates mixed osteolytic and osteoblastic lesions. Journal of Translational Medicine. 9, 185 (2011).
- Sasaki, H., Iyer, S. V., Sasaki, K., Tawfik, O. W., Iwakuma, T. An improved intrafemoral injection with minimized leakage as an orthotopic mouse model of osteosarcoma. Analytical Biochemistry. 486, 70-74 (2015).
- Valastyan, S., Weinberg, R. A. Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms. Cell. 147 (2), 275-292 (2011).
- Yu, C., et al. Intra-iliac Artery Injection for Efficient and Selective Modeling of Microscopic Bone Metastasis. Journal of Visualized Experiments. (115), e53982 (2016).
- Kuchimaru, T., et al. A reliable murine model of bone metastasis by injecting cancer cells through caudal arteries. Nature Communications. 9 (1), 2981 (2018).
- Haley, H. R., et al. Enhanced Bone Metastases in Skeletally Immature Mice. Tomography. 4 (2), 84-93 (2018).
- Lei, Z. G., Ren, X. H., Wang, S. S., Liang, X. H., Tang, Y. L. Immunocompromised and immunocompetent mouse models for head and neck squamous cell carcinoma. Onco Targets and Therapy. 9, 545-555 (2016).
- Lefley, D., et al. Development of clinically relevant in vivo metastasis models using human bone discs and breast cancer patient-derived xenografts. Breast Cancer Research. 21 (1), 130 (2019).
- Tuveson, D., Clevers, H. Cancer modeling meets human organoid technology. Science. 364 (6444), 952-955 (2019).
