Summary
Os modelos de metástases ósseas não desenvolvem metástases uniformemente ou com 100% de incidência. A injeção direta intraóssea de células tumorais pode resultar em embolização do pulmão. Apresentamos nossa técnica de modelagem de tumores ósseos primários e metástases ósseas usando o implante de enxerto de tumor sólido no osso, levando a enxertia e crescimento reprodutíveis.
Abstract
Tumores ósseos primários ou metástases ósseas de tumores sólidos resultam em lesões osteolíticas, osteoblásticas ou mistas osteolíticas/osteoblásticas dolorosas. Essas lesões comprometem a estrutura óssea, aumentam o risco de fratura patológica e deixam os pacientes com opções limitadas de tratamento. Os tumores ósseos primários metastatizam para órgãos distantes, com alguns tipos capazes de se espalhar para outros sítios esqueléticos. No entanto, evidências recentes sugerem que, com muitos tumores sólidos, as células cancerosas que se espalharam para o osso podem ser a fonte primária de células que, em última análise, metastatizam para outros sistemas orgânicos. A maioria dos modelos singênicos ou xenoenxertos de tumores ósseos primários em camundongos envolve injeção intraóssea (ortotópica) de suspensões de células tumorais. Alguns modelos animais de metástase esquelética de tumores sólidos também dependem de injeção óssea direta, enquanto outros tentam recapitular etapas adicionais da cascata metastática óssea injetando células intravascularmente ou no órgão do tumor primário. No entanto, nenhum desses modelos desenvolve metástases ósseas de forma confiável ou com incidência de 100%. Além disso, a injeção intraóssea direta de células tumorais tem se mostrado associada a potencial embolização tumoral do pulmão. Essas células tumorais embólicas enxertam mas não recapitulam a cascata metastática. Relatamos um modelo de osteossarcoma em camundongo no qual fragmentos tumorais frescos ou criopreservados (consistindo de células tumorais mais estroma) são implantados diretamente na tíbia proximal usando uma técnica cirúrgica minimamente invasiva. Esses animais desenvolveram enxerto, crescimento e, ao longo do tempo, osteólise e metástase pulmonar. Esta técnica tem a versatilidade de ser usada para modelar metástases ósseas tumorais sólidas e pode prontamente empregar enxertos consistindo de um ou vários tipos celulares, células geneticamente modificadas, xenoenxertos derivados do paciente e/ou células marcadas que podem ser rastreadas por imagens ópticas ou avançadas. Demonstramos esta técnica, modelando tumores ósseos primários e metástases ósseas utilizando o implante de enxerto de tumor sólido no osso.
Introduction
Modelos de camundongos de doenças humanas e animais estão se tornando cada vez mais populares na pesquisa biomédica. A utilidade do uso de camundongos nesse contexto é que sua anatomia e fisiologia são muito semelhantes às dos seres humanos. Apresentam um período de gestação relativamente curto e um tempo na vida pós-natal para atingir a maturidade, e estão em grande parte associados a um custo relativamente baixo e à facilidade de moradia, embora os custos crescentes de desenvolvimento ou compra estejam associados a maiores graus de modificação genética, imunodeficiência e/ou humanização1. O uso de linhagens endogâmicas resulta em uma população animal amplamente uniforme antes da inclusão no estudo. Um conhecimento completo de seu genoma sugere um alto grau de semelhança com os seres humanos. Alvos moleculares ortólogos para muitos processos de doenças foram identificados no genoma de camundongos e agora há uma extensa biblioteca de reagentes específicos de camundongos que são facilmente obtidos. Portanto, eles fornecem a oportunidade de análises de rendimento relativamente alto de maneira mais rápida e menos dispendiosa quando comparados a modelos animais maiores1. Além disso, com o advento de estratégias de edição genética que permitem a superexpressão ou deleção de certos genes, seja globalmente ou de maneira específica do tipo celular e/ou constitutivamente ou de forma induzível, elas representam um sistema modelo biologicamente muito útil para a investigação de doenças humanas eanimais2.
O câncer é um campo em que os modelos de camundongos têm grande utilidade. Modelos genéticos de câncer em camundongos dependem da modulação da expressão de oncogenes ou genes supressores de tumor, isoladamente ou em combinação, para que as células sofram transformação oncogênica. A injeção de linhagens de células tumorais primárias ou estabelecidas em camundongos também é realizada. A introdução de linhagens celulares ou tecidos de humanos ou outras espécies animais, incluindo camundongos, continua sendo o modelo mais amplamente utilizado de câncer in vivo. O uso de células e tecidos de espécies diferentes (xenoenxertos) em camundongos imunocomprometidos é mais comumente realizado2. No entanto, o uso de células ou tecidos tumorais aloenxertos onde tanto o hospedeiro quanto o receptor são da mesma espécie permite a interação com um sistema imune intacto quando combinado com a mesma linhagem hospedeira em sistemas singênicos3.
Tumores ósseos primários ou metástases ósseas de tumores sólidos resultam em lesões osteolíticas, osteoblásticas ou mistas osteolíticas/osteoblásticasdolorosas3,4. Esses tumores comprometem a estrutura óssea, aumentando o risco de fratura patológica, e deixam os pacientes com opções limitadas de tratamento. Os tumores ósseos primários metastatizam para órgãos distantes, com alguns tipos capazes de se espalhar para outros sítios esqueléticos. Em pacientes com câncer de mama, o osso é o sítio mais comum da primeira metástase e o primeiro local mais frequente de apresentação da doençametastática5,6. Além disso, células tumorais disseminadas (CDTs) estão presentes na medula óssea antes do diagnóstico e predizem o desenvolvimento de metástases em outrosórgãos7. Portanto, acredita-se que as células cancerosas presentes no osso são a fonte de células que, em última análise, metastatizam para outros sistemas orgânicos. Existem muitos modelos murinos de metástases tumorais sólidas que desenvolvem metástases predominantemente pulmonares e linfonodais e, dependendo do tipo de tumor e da técnica de injeção, potencialmente de outros sistemasorgânicos3. No entanto, faltam modelos de metástase óssea em camundongos que produzam metástases esqueléticas sítio-específicas de forma confiável e reprodutível e desenvolvam metástases ósseas antes que os camundongos atinjam critérios de remoção precoce da carga tumoral primária ou metástase para outros órgãos. Relatamos um modelo de osteossarcoma de tumor ósseo primário que se baseia no implante cirúrgico de um aloenxerto de tumor sólido na tíbia proximal decamundongos8. Tumores ósseos se formaram em 100% dos camundongos e 88% desenvolveram metástase pulmonar. Essa incidência de metástase excede o que é comumente relatado clinicamente em pessoas (~20-50%), mas é de grande interesse, uma vez que o pulmão é o sítio mais comum de metástase para osteossarcoma9,10,11. Embora esse modelo seja vantajoso na modelagem de tumores ósseos primários, ele também tem grande utilidade na modelagem de metástases ósseas de outros tumores sólidos osteotrópicos, como mama, pulmão, próstata, tireoide, hepatic, renal e gastrointestinal.
A justificativa para o desenvolvimento desse modelo foi desenvolver uma alternativa à tradicional injeção intraóssea tipicamente na tíbia proximal ou fêmur distal para modelar tumores ósseos primários ou metástasesósseas12. Nosso objetivo primário foi aliviar uma conhecida limitação dessa técnica, a embolização tumoral do pulmão. Isso resulta no enxerto dessas células tumorais embólicas e "metástases artefatuais" que não recapitulam a cascata metastática completa de um tumor ósseo primário estabelecido que metastatiza para os pulmões 8,13. Esta também seria a situação em que uma metástase óssea estabelecida se espalha para um local distante. Além disso, essa técnica também foi desenvolvida para produzir um modelo de metástase óssea que garantisse maior incidência de enxertia e crescimento de tumores no osso e em local uniforme quando comparada com técnicas de injeção ortotópica ou intravascular. Este modelo apresenta vantagens distintas sobre essas técnicas descritas. Este modelo envolve a entrega controlada e consistente de células tumorais no osso. Também evita metástases pulmonares artefatuais após embolização pulmonar e estabelece uma população basal uniforme do estudo. Há o benefício de tumores sítio-específicos com esse modelo, sem o risco de critérios de remoção precoce resultantes de tumores primários ou metástases para outros órgãos. Por fim, esse modelo tem grande utilidade para modificação, incluindo o uso de xenoenxertos derivados do paciente.
O modelo apresentado tem semelhanças com a injeção direta da suspensão celular no osso após uma abordagem cirúrgica seguida de injeção através do córtex ou entrega na cavidade medular após a confecção de um pequeno defeito no córtex (com ou sem fresagem da cavidade medular)8,14,15,16,17 . No entanto, o implante de um aloenxerto tumoral torna esta técnica distinta. Portanto, o objetivo deste relato foi demonstrar este modelo de tumores ósseos primários e metástases ósseas de tumores sólidos, o que supera muitas limitações dos modelos descritos anteriormente. Grupos de pesquisa com experiência em cultura de células, modelos de camundongos, anestesia e cirurgia em camundongos e anatomia de camundongos estão bem equipados para reproduzir nossa técnica para modelar tumores ósseos primários ou metástases ósseas em camundongos.
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Protocol
Todos os experimentos com animais descritos foram aprovados pelo comitê institucional de cuidados e uso de animais da Universidade de Cambridge, Cambridge, Reino Unido.
1. Preparação das linhagens celulares
- Cultivar linhagens celulares de acordo com os protocolos padrão de cultura de células do laboratório para cultura de células tradicionais ou injeção em camundongos. Os protocolos padrão utilizados aqui são o crescimento em meio de Eagle modificado por Dulbecco contendo 10% de soro fetal bovino (SFB), L-glutamina e penicilina/estreptomicina (doravante conhecido como meio de crescimento completo).
NOTA: Neste experimento, as células de osteossarcoma de Abrams são usadas em camundongos Balb/c Foxn1 nu/nu . Para estudos de câncer de mama, são usadas células 4T1 em camundongos Balb/c e células EO771 em camundongos C57BL/6. - Cultivar células em frascos ventilados para cultura de tecidos ou placas de cultura de tecidos de 6 poços a 37 °C em 5% de CO2.
- Passe pela linhagem celular de interesse e prepare as células para injeção quando as células atingirem uma confluência comumente usada com a injeção dessas células em camundongos.
2. Animais
- Use camundongos Balb/c Foxn1 nu/nu com pelo menos 6-8 semanas de idade para geração de tumor subcutâneo para garantir que os animais estejam além da fase de crescimento rápido e tenham atingido a idade adulta e a maturidade esquelética.
- Use camundongos machos ou fêmeas. Faça exceções ao selecionar linhagens celulares responsivas a hormônios (por exemplo, células de câncer de mama em camundongos fêmeas e células de câncer de próstata em camundongos machos).
- Para experimentos de xenoenxerto, use camundongos imunodeficientes atímicos nus com base no fato de a linhagem celular ser incompatível com um sistema imunológico de camundongo intacto em condições normais.
- Para experimentos de aloenxerto usando linhagens celulares murinas, isso também é recomendado com base em origens genéticas e imunológicas de camundongos diferentes. No entanto, para experimentos singênicos, utilizar animais da mesma linhagem celular de interesse.
- Animais domésticos em densidades padrão, dependendo das políticas de criação da instituição.
3. Tumores subcutâneos
- Colher linhagens celulares de cultura por tripsinização e ressuspender em solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS).
- Avaliar a viabilidade celular e determinar a densidade celular pelo método de exclusão do azul de tripano. Use um hemocitômetro ou um contador de células automatizado para contar as células. Uma viabilidade celular mínima de 90% deve ser usada para injeção em camundongos para criar tumores subcutâneos.
- Ajustar a densidade celular para injetar 1-2 x 105 células em um volume final de 0,1 a 0,15 mL (100 a 150 μL) de PBS estéril. Mantenha as células no gelo até a injeção.
- Alternativamente, células de pellet por centrifugação a 800 x g por 5 min. Eliminar o sobrenadante e ressuspender as células peletizadas em meio matricial de membrana basal estéril não diluído para obter 1-2 x 105 células em um volume final de 0,1 a 0,15 mL (100 a 150 μL). Mantenha as células no gelo até o uso posterior.
- Anestesiar camundongos para crescimento tumoral subcutâneo com isoflurano em oxianestesia. Utilizar uma dose de indução de isoflurano a 5% em 2 L/min de oxigênio e uma dose de manutenção de 2-3% de isoflurano em 2 L/min de oxigênio. Verifique a falta de reflexos de piscar ou pedal antes de prosseguir.
NOTA: O isoflurano é um anestésico inalatório. Utilizar isoflurano em área bem ventilada com sistemas apropriados de sequestro e coleta livre de gases. Consulte a equipe veterinária institucional para desenvolver um plano de indução, manutenção e monitoramento da anestesia e garantir que a equipe do laboratório tenha treinamento adequado em monitoramento anestésico e manuseio de agentes anestésicos inalatórios. - Remova os pelos da região dorsal do tórax ou abdome de camundongos anestesiados com solução depilante ou com um cortador elétrico. A solução depilatória é preferida para minimizar possíveis traumas na pele. Pule esta etapa se estiver usando mouses athymic nude.
- Limpar a área preparada com um cotonete de etanol a 70% antes da injeção da suspensão celular.
- Use uma seringa de 1 mL de tuberculina com uma agulha 27 G para injetar células por via subcutânea sobre a região dorsal do tórax ou abdômen, para não ser impactado pelo movimento das omoplatas. Alternativamente, injetar as células por via subcutânea como suspensão em matriz extracelular comercialmente disponível.
NOTA: A injeção em matriz extracelular comercialmente disponível limitará a migração da suspensão celular no espaço subcutâneo, pois essas matrizes se solidificam à temperatura ambiente. - Recupere os ratos em uma almofada de aquecimento em gaiolas individuais até o deambulatório. Os ratos podem então ser colocados em suas gaiolas normais com roupas de cama limpas e secas.
- Monitorar o tamanho do tumor subcutâneo que recobre o tórax dorsal ou abdome com um paquímetro e medir o peso corporal semanalmente para garantir que os tumores subcutâneos não ulcerem ou que os camundongos atendam aos critérios de remoção precoce, conforme estabelecido pelo comitê de cuidados e uso de animais da instituição. Um tamanho máximo do tumor de 15 mm em qualquer dimensão é recomendado para reduzir o risco de ulceração da pele ou necrose tumoral central.
NOTA: Consulte as diretrizes locais para determinar o tamanho/volume máximo permitido do tumor. - Eutanasiar camundongos portadores de tumores subcutâneos após três a quatro semanas por inalação de CO2 seguida de luxação cervical. Siga as políticas aceitáveis da instituição para a eutanásia de ratos.
- Colher tumores subcutâneos utilizando técnica cirúrgica asséptica. Esterilizar a pele que recobre o tumor como antes com etanol 70% após a remoção dos pelos (se aplicável). Incise através da pele que recobre o tumor com uma lâmina de bisturi #15 (com ou sem cabo de lâmina de bisturi). Dissecar nitidamente o tumor dos tecidos moles adjacentes circundantes com uma tesoura cirúrgica estéril.
- Coloque o tumor em placas de cultura de tecidos de 6 poços contendo meio de crescimento completo e pice em vários pequenos fragmentos de tamanho pré-determinado (~ 0,6 mm x 0,6 mm x 0,6 mm – 0,25 mm3 até 1 mm x 1 mm x 1 mm – 1 mm3) com uma lâmina de bisturi #15 (com ou sem cabo de lâmina de bisturi).
- Manter os fragmentos tumorais em meio de crescimento estéril completo à temperatura ambiente até o momento do implante intratibial. Para linhagens celulares que carregam luciferase ou genes fluorescentes repórteres, use imagens bioluminescentes ou fluorescentes ex-vivo para confirmar a viabilidade tumoral antes da implantação intratibial em camundongos.
- Para criopreservação, colocar vários fragmentos no mesmo criovial em meio de cultura completo suplementado com 20% de SFB e 10% de dimetilsulfóxido (DMSO). Congelar gradualmente usando um sistema de criopreservação comercial a –80 °C e armazenar a longo prazo em nitrogênio líquido. Preservar fragmentos tumorais para análise posterior, mas não para implantação futura, por congelamento instantâneo usando imersão em nitrogênio líquido. Armazenar esses fragmentos de tumor congelados por longo prazo a –80 °C.
NOTA: Foi relatado anteriormente que os tumores congelados não enxertam e crescem in vivo8.
4. Implante cirúrgico de fragmentos tumorais subcutâneos
- Levar fragmentos frescos ou criopreservados de tumor subcutâneo à temperatura ambiente em meio de crescimento completo antes do implante cirúrgico.
- Anestesiar camundongos da cepa de interesse usando isoflurano em anestesia com oxigênio, conforme descrito na Seção 3. Verifique a falta de reflexos do pedal antes de prosseguir. Administrar buprenorfina subcutânea na dose de 0,02-0,05 mg/kg para proporcionar analgesia perioperatória. Isso pode ser repetido a cada 6-8 h no período pós-operatório, se necessário.
- Remover os pelos da articulação do joelho direito e da tíbia proximal do membro posterior com solução depilante para minimizar o potencial trauma na pele.
- Esfregue a área preparada com antisséptico cirúrgico. Esfregue primeiro com um cotonete de etanol a 70% e, em seguida, esfregue com clorexidina alternada e esfoliação salina.
- Visualize a tíbia proximal como a região distal à articulação do joelho enquanto flexiona e estende a articulação.
- Criar uma incisão de 3-4 mm ao nível da tíbia proximal na face medial do membro com uma lâmina de bisturi #15 (com ou sem cabo de lâmina de bisturi). Incisar através da pele e tecido subcutâneo para expor o córtex medial da tíbia proximal.
- Aplique uma pressão suave com a ponta de uma agulha de 25 G, enquanto também gira a ponta, para criar um pequeno orifício no córtex medial da tíbia proximal. Faça esse orifício aproximadamente 2 mm distal à articulação do joelho em um ponto equidistante entre os córtex tibial cranial e caudal. Selecione o tamanho da agulha dependendo do tamanho dos fragmentos tumorais.
- Use pinça estéril para captar e inserir os fragmentos tumorais na cavidade medular da tíbia proximal. Utilizar agulha de 27 a 30 G para manipular o fragmento tumoral para o canal medular. Dependendo do tamanho dos fragmentos tumorais, implantar um mínimo de 0,5 mm3 de volume total do tumor em cada tíbia. Isso pode exigir a implantação de 1 ou mais fragmentos tumorais, dependendo do tamanho dos fragmentos tumorais criados.
NOTA: Modificações para evitar ou limitar o deslocamento do enxerto para fora do osso seriam a colocação de cera ou cimento ósseo no defeito ósseo ou espuma de gel ou um enxerto de gordura subcutâneo sobre o orifício no osso. - Aplicar as bordas da pele com adesivo de tecido líquido estéril ou sutura de pele única. Não use clipes de feridas neste site. Tome cuidado ao usar imagens de fluorescência no período pós-operatório, uma vez que tanto os adesivos teciduais quanto a sutura têm o potencial de fluorescer.
- Recupere os ratos em uma almofada de aquecimento em gaiolas individuais até o deambulatório.
5. Avaliação seriada e de ponto final
- Anestesiar camundongos usando isoflurano em oxigenoanestesia conforme descrito anteriormente.
- Avaliar o crescimento do tumor tibial de forma não invasiva por radiografia digital semanal, bioluminescência ou imagem de fluorescência (se usar células expressando luciferase ou um gene repórter fluorescente). Medidas de paquímetro do membro no local de implantação também podem ser realizadas em camundongos acordados.
- Além do monitoramento tradicional de camundongos portadores de tumor (peso corporal, nível de atividade, frequência respiratória, tosa, postura, mentação e comportamento), monitore os camundongos semanalmente em busca de sinais de claudicação dos membros posteriores, inchaço e infecção do sítio cirúrgico.
- Monitore a ferida cirúrgica da pele nos primeiros 10-14 dias quanto a vermelhidão excessiva, inchaço, drenagem e deiscência da ferida até que a ferida cutânea esteja cicatrizada. Após 4-5 semanas, avaliar camundongos de acordo com a avaliação do resultado do estudo vivos ou após eutanásia.
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Representative Results
Um resultado positivo estaria associado à enxertia tumoral e ao crescimento progressivo do tumor ao longo do tempo. Dependendo do tipo de tumor, o crescimento intraósseo do tumor pode estar associado à claudicação progressiva dos membros posteriores, mas muitos tumores não causam claudicação, apesar dos sinais de doença óssea associada. O sucesso do enxerto foi documentado com exames de imagem avançados, nos quais haveria alterações radiográficas progressivas, na μTC ou na μRM da tíbia proximal associadas ao fenótipo ósseo da linhagem celular de interesse (metástase osteolítica, osteoblástica ou mista osteolítica/osteoblástica) (Figura 1)8. Em nosso relato anterior, o defeito cortical criado para o implante do enxerto tumoral era visível na tíbia proximal 1 semana após o implante (Figura 1A). Na semana 2, havia osteólise visível e remodelação óssea adjacente ao defeito cortical. Entre as semanas 2 e 5, houve destruição óssea progressiva e formação de novo osso associado à enxertia tumoral e crescimento (Figura 1B-E). Para linhagens celulares com genes repórteres, as alterações ósseas seriam acompanhadas por aumentos nas saídas de imagem de fluorescência ou bioluminescência ao longo do tempo. A claudicação aguda pode ser um indicador de fratura óssea patológica iminente ou real, necessitando de avaliação radiográfica imediata e cuidadosa do camundongo e, possivelmente, remoção precoce do estudo. Dependendo da linhagem celular tumoral em estudo, a destruição óssea pode ocorrer rapidamente, bem antes da metástase. Isto é de importância específica em estudos envolvendo tumores ósseos primários, uma vez que os ratinhos podem ter de ser retirados do estudo antes do desenvolvimento de metástases clinicamente relevantes, nomeadamente para o pulmão. Nesses casos, recomenda-se a amputação cirúrgica do membro portador do tumor para permitir o estudo de doença residual mínima e subsequente metástase quando do uso de tumores ósseos primários, como relatamosanteriormente4,8. Embora a amputação completa de membros posteriores em pessoas não seja tipicamente realizada, este é o padrão de cuidado na medicina veterinária, cujas semelhanças nas características clínicas e moleculares do osteossarcoma humano e canino estão bem documentadas. A amputação de membros posteriores em camundongos é, portanto, relevante para muitas linhagens de células animais. Além disso, a amputação é um método de tratamento viável em camundongos, uma vez que os procedimentos poupadores de membros usados em pessoas não são alcançáveis em pequenos roedores, como camundongos. Em camundongos portadores de tumores ósseos primários, inapetência, perda de peso progressiva, má condição geral do corpo e dificuldade para respirar (aumento da taxa ou esforço) podem sinalizar o desenvolvimento de metástase tumoral para o pulmão e outros órgãos. A confirmação por imagem bioluminescente, μCT ou μRM é recomendada para confirmar a metástase, e os animais afetados devem ser eutanasiados.
Um resultado negativo, provavelmente resultante da falta de enxerto tumoral, deve ser suspeitado se não houver evidência de alterações progressivas (lesões osteolíticas, osteoblásticas ou mistas osteolíticas/osteoblásticas, dependendo da linhagem celular em estudo) na radiografia ou no exame de μCT da tíbia implantada. Para linhagens celulares portadoras de genes repórteres, a falta de um aumento na fluorescência ou sinalização de bioluminescência ao longo do tempo por imagem óptica também apoiaria uma conclusão de que o tumor falhou em enxertar. A falta ou a má aplicação do enxerto podem estar associadas à infecção do sítio cirúrgico. No entanto, isso exibiria sinais clínicos específicos, como vermelhidão, inchaço ou corrimento mais comumente no período pós-operatório precoce (primeiras 1-2 semanas após a cirurgia). Os animais também poderiam estar febris e apresentar falta de atividade ou postura curvada no pós-operatório precoce devido à infecção do sítio cirúrgico. A retirada e manutenção dos aloenxertos em condições estéreis durante o preparo e o preparo estéril adequado do membro, a técnica intraoperatória estéril e o fechamento completo da ferida minimizarão a probabilidade de uma complicação da ferida cirúrgica pós-operatória resultando em infecção e falha do enxerto tumoral.
Em nosso relato anterior8, ao incluir os estudos piloto e definitivo relatados, 16 dos 16 camundongos (100%) implantados com fragmentos de osteossarcoma evoluíram para lesões ósseas osteolíticas e 14 desses 16 camundongos (88%) desenvolveram metástase. Todas as metástases foram observadas para o pulmão e diagnosticadas pela histologia já 3 semanas após o implante8. Animais adicionais necropsiados em 1 (n=2) e 2 (n=2) semanas após o implante não revelaram qualquer evidência de metástase pulmonar.
Figura 1: Radiografia seriada. Radiografias seriadas (em ordem) realizadas semanalmente em (A) 1, (B) 2, (C) 3, (D) 4 e (E) 5 semanas após o implante intratibial de um aloenxerto tumoral subcutâneo usando uma linhagem celular de tumor ósseo primário (osteossarcoma). Com o passar do tempo, houve destruição óssea progressiva e formação de novo osso associado à enxertia e crescimento tumoral. Esta figura foi modificada com permissão da ref8. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este relato documenta nosso modelo para criar tumores ósseos primários ou metástases ósseas após o implante intratibial de um aloenxerto tumoral. Acreditamos que existem várias etapas críticas nesse processo. Um plano anestésico seguro deve ser estabelecido tanto para a injeção subcutânea da suspensão de células tumorais quanto para a colocação intratibial dos fragmentos tumorais resultantes. Deve haver preparo estéril do sítio cirúrgico tanto para a retirada do aloenxerto subcutâneo quanto para a colocação intratibial do aloenxerto. Fragmentos de aloenxertos tumorais devem ser confeccionados uniformemente para posterior implante intratibial. Um defeito de tamanho adequado na tíbia proximal deve ser criado para implantação de fragmentos tumorais. A ferida cutânea cirúrgica deve ser completamente fechada para reduzir o risco de complicações pós-operatórias da ferida operatória. O último passo crítico é que, se a matriz extracelular for usada como parte da suspensão de células tumorais para injeção subcutânea, o uso das instruções de manuseio recomendadas pelo fabricante deve ser feito para evitar a solidificação da suspensão antes da injeção. O preparo estéril adequado do membro, a técnica intraoperatória estéril e o fechamento completo da ferida minimizarão a probabilidade de uma complicação da ferida cirúrgica pós-operatória.
As características do tumor implantado e da técnica cirúrgica são fundamentais para o sucesso e resultados reprodutíveis para incorporação em sua população de estudo. Inicialmente, deve-se verificar se o xenoenxerto/aloenxerto tumoral é implantado diretamente na cavidade medular da tíbia, certificando-se de que o tecido tumoral esteja totalmente dentro do osso. Modificações para evitar ou limitar o deslocamento do enxerto para fora do osso seriam inicialmente a colocação de cera ou cimento ósseo no defeito ósseo ou espuma de gel ou um enxerto de gordura subcutâneo sobre o orifício no osso. Uma alternativa seria inserir o aloenxerto tumoral através de um orifício na face lateral da tíbia proximal, criado sob o músculo tibial cranial. A presença do músculo tibial cranial serviria, então, como cobertura biológica sobre o defeito ósseo, limitando o potencial deslocamento do aloenxerto tumoral. Entretanto, trata-se de uma abordagem cirúrgica mais agressiva e com potencial de trauma neuromuscular na face lateral da tíbia proximal. Deve-se tomar cuidado para garantir que os aloenxertos tumorais sejam criados para serem de tamanho uniforme antes do implante. Dito isso, os aloenxertos tumorais não devem exceder 1 mm em qualquer dimensão, uma vez que tumores maiores em qualquer sistema biológico têm menor probabilidade de enxertos do que enxertos menores quando não há um suprimento vascular direto e imediato fornecido ao enxerto no momento do implante. Relatamos resultados bem-sucedidos com um volume tumoral final implantado de 0,5 mm 3, mas prevemos que volumes combinados de fragmentos tumorais de até 1 mm3 alcançarão resultados bem-sucedidos. Entretanto, o volume máximo do fragmento tumoral implantável ainda não foi determinado. Em comparação com o tecido criopreservado, xenoenxertos tumorais frescos e aloenxertos têm maior probabilidade de sobreviver, embora não tenhamos observado um problema com a prática de usar cuidadosamente aloenxertos tumorais criopreservados cuidadosamente. Aloenxertos congelados por encaixe não devem ser implantados. Além disso, a dissecção da cápsula e da porção externa do tumor subcutâneo impedirá qualquer contribuição dessa camada do tumor, que é em grande parte fibrosa e vascular, com um infiltrado imunológico significativo, em vez de consistir em grande parte de células tumorais propriamente ditas. Um método alternativo para criar aloenxertos tumorais a partir da maior massa tumoral diretamente com uma lâmina de bisturi é usando uma pequena agulha de biópsia que cria um "núcleo" tumoral cilíndrico que pode então ser cortado em um comprimento predefinido antes do implante. O uso de uma agulha de biópsia ou punção de core biopsy pode ser benéfico na criação de fragmentos tumorais uniformes para implantação, pois após duas dimensões uniformes (largura e profundidade) terem sido criadas pelo processo de biópsia, eles podem então ser cortados em um comprimento apropriado antes do implante. Se genes repórteres como luciferase ou proteínas fluorescentes estiverem sendo usados nas células tumorais implantadas, a avaliação dos fragmentos tumorais no momento da implantação ou 1 semana após a implantação indicará a contribuição relativa das células tumorais nos fragmentos tumorais implantados, bem como a viabilidade.
Como em qualquer procedimento, existem limitações, além dos benefícios relatados dessa técnica. A metástase é um processo de várias etapas que requer que uma célula de seu local primário execute com sucesso a invasão e a migração através da matriz extracelular, intravase o suprimento sanguíneo do tumor, sobreviva na circulação até chegar ao seu destino metastático final, extravase para o órgão próprio e, em seguida, permaneça em estado dormente ou prolifere para criar uma lesão metastática, e modificação da arquitetura tecidual normal para se tornar metástase clinicamentedetectável18. Os modelos de metástases ósseas atualmente utilizados em camundongos dependem em grande parte da injeção ortotópica direta de células tumorais no local normal do tumor primário, injeção intravascular no ventrículo esquerdo do coração ou perifericamente nas veias caudais (veias laterais ou dorsais caudais) ou injeção intraóssea direta da suspensão de célulastumorais3. Entretanto, relatos recentes tentando melhorar modelos de metástases ósseas têm defendido a injeção nas artérias ilíacas, caudais ou femorais 19,20,21. Todos esses métodos incorporam uma ou mais etapas dentro da cascata metastática óssea, exceto a injeção direta intraóssea ou, em nosso caso, o implante de um aloenxerto tumoral, que apenas modela a modificação tecidual final. Portanto, essa é uma limitação inerente à nossa técnica. Uma limitação adicional é que, como descrito atualmente, requer a propagação dos aloenxertos em um hospedeiro intermediário de camundongos, o que requer o uso de camundongos adicionais e resulta na implantação de um tumor que não é 100% puro de células tumorais. O aloenxerto possuirá alguma contribuição estromal proporcionada pelos tumores que crescem em localização subcutânea. Uma alternativa potencial para minimizar essa contribuição do estroma subcutâneo seria a injeção de células por via subcutânea em um substrato biológico como uma matriz ou arcabouço extracelular. Alternativamente, a injeção ortotópica no sítio primário do tumor, seguida de remoção do tumor e preparação do enxerto, poderia ser realizada.
O método descrito neste relato apresenta vantagens fundamentais quando comparado aos métodos existentes de modelagem de tumores ósseos primários ou metástases ósseas após injeção direta intraóssea de células tumorais. Como discutido, nós e outros observamos embolização direta dos pulmões e eventual morte imediata após injeção intratibial de uma suspensão celular 8,13. Isso resulta de uma injeção pressurizada de células tumorais na cavidade medular, após a qual as células tumorais entram no suprimento sanguíneo periférico através de sinusóides vasculares da medula óssea e são levadas para o pulmão por retorno venoso. Esses eventos são comparáveis mecanisticamente ao observado com tromboembolismo pulmonar ou venoso associado à colocação pressurizada de implantes na cavidade medular associada à artroplastia total articular em pessoas e animais. Nós e outros levantamos a hipótese de que esse fenômeno embólico para os pulmões pode ser específico da linhagem celular (observações não publicadas). No entanto, medidas muito detalhadas têm sido relatadas para limitar a criação dessas metástases embólicas artefatuais12. Inicialmente, deve haver tripsinização adequada e criação de uma suspensão uniforme de célula única para injeção, que deve ser armazenada em gelo para evitar aglomeração celular. A agulha deve ser adequadamente colocada através da placa de crescimento tibial proximal, após o que pequenos volumes de injeção (~10 μL) e injeções sem resistência na cavidade medular devem ser realizados. Apesar disso, a entrega de células tumorais aos pulmões, e também a outros órgãos, pode ser prontamente observada por imagens de bioluminescência após técnicas de injeção intraóssea e intravascular, sugerindo que é possível que células geradoras desse sinal bioluminescente nos pulmões e em outros órgãos possam dar origem a metástases à distância (observações não publicadas)3. Descobrimos que outro benefício desta técnica é que um único tumor cresce em um local ósseo uniforme dentro da população de estudo, reduzindo a variabilidade animal-animal. Isso permite o estabelecimento de uma população de estudo uniforme e pronta comparação entre os grupos de tratamento. Isso contrasta com as metástases ósseas que se desenvolvem após injeção ortotópica ou intravascular, onde é possível que as células metastatizem para diferentes sítios esqueléticos e cresçam com diferentes cinéticas, tornando as comparações entre os grupos de estudo desafiadoras. O crescimento tumoral em um sítio anatômico após o implante de nossos aloenxertos tumorais também evita a possibilidade de camundongos serem removidos devido a metástases para outros sistemas orgânicos ou carga tumoral primária, como pode ser visto com técnicas de injeção intravascular e ortotópica. Além disso, observamos um enxerto de 100% após o implante do aloenxerto tumoral, o que suporta uma população de estudo uniforme e evita o uso desnecessário de camundongos adicionais para atingir um número adequado de amostras. Isso também supera a limitação da injeção incompleta e imprecisa após a injeção percutânea de suspensões de células tumorais no osso.
Esta técnica possui um grande grau de versatilidade que tem resultado em modificações que estão sendo utilizadas atualmente em nossas pesquisas e tem potencial de grande utilidade para futuras aplicações. Inicialmente, enquanto empregamos a tíbia proximal como nosso local de implante intraósseo, outros sítios comuns de tumores ósseos primários ou metástases ósseas podem ser prontamente usados, incluindo, mas não se limitando ao fêmur distal e úmero proximal. Entretanto, a abordagem cirúrgica desses locais, bem como de áreas como pelve e coluna, requer uma abordagem cirúrgica gradualmente mais extensa quando comparada à tíbia proximal. Além disso, locais como pelve, coluna, crânio, rádio e ulna não são beneficiados pelo estoque ósseo adequado para implantação tumoral. Para neoplasias malignas invasivas ósseas, como nos tumores orais, a colocação dos aloenxertos tumorais adjacentes ao osso ou dentro da orofaringe também pode recapitular a progressão dos tumores invasivos3,22. Experimentos in vitro e in vivo frequentemente empregam técnicas de co-cultura ou co-injeção para determinar os efeitos de diferentes tipos celulares sobre um tipo celular de interesse. Portanto, existe o potencial de injeção de dois ou mais tipos celulares simultaneamente para criar os tumores subcutâneos, que podem então ser implantados no osso usando esta técnica. Células geneticamente modificadas podem ser usadas sozinhas ou em combinação com outras células normais ou geneticamente modificadas para criar os aloenxertos tumorais. Com o crescente interesse na medicina de precisão e na criação de modelos in vitro e in vivo de câncer humano, o transplante de xenoenxerto derivado de pacientes em camundongos está ganhando popularidade. Recentemente, um modelo de metástase óssea para câncer de mama foi descrito em que xenoenxertos derivados de pacientes implantados ortotopicamente metastatizaram discos ósseos humanos implantados por via subcutânea em camundongosnus23. A partir disso, xenoenxertos derivados do paciente poderiam ser implantados diretamente no osso usando nosso modelo, sem a necessidade de um hospedeiro intermediário para propagação subcutânea. Isso permitiria a rápida avaliação da cinética tumoral e a capacidade de avaliar múltiplas combinações de tratamentos potencialmente a partir de apenas uma biópsia de paciente, não necessitando de uma grande massa tumoral para o preparo do aloenxerto. O uso crescente de organoides na pesquisa do câncer também poderia ser empregado em nosso modelo24. Isso exigiria a injeção por agulha ou pipeta desses agregados celulares através do orifício no córtex tibial. Recomendaríamos, portanto, o selamento do defeito cortical (como discutido acima) para limitar a possibilidade de migração organoide para fora da cavidade óssea e medular. Como temos realizado, as células podem ser marcadas e rastreadas por imagens ópticas (bioluminescência ou fluorescência) ou avançadas (radiografia digital, μCT ou μMRI), permitindo a avaliação do crescimento tumoral ao longo do tempo. Isso também tem o benefício de minimizar o número de animais, uma vez que os mesmos animais são fotografados ao longo do tempo.
Em resumo, este relato demonstra nossa técnica de modelagem de tumores ósseos primários e metástases ósseas utilizando implante de enxerto tumoral sólido no osso.
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Disclosures
Dr. Hildreth foi financiado pelo NIH sob o número de prêmio K01OD026527. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos NIH.
Acknowledgments
Os autores agradecem a contribuição crítica da Dra. Beth Chaffee, DVM, PhD, DACVP para o desenvolvimento desta técnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #15 scalpel blade | Henry Schein Ltd. | 75614 | None |
| 6-well tissue culture plates | Thermo Fisher Scientific | 10578911 | Used for mincing tumor pieces. Can also be used for cell culture |
| Abrams osteosarcoma cell line | Not applicable | Not applicable | None |
| Anesthesia machine with isoflurane vaporiser and oxygen tank(s) | VetEquip | 901805 | None |
| Animal weighing scale | Kent Scientific | SCL- 1015 | None |
| BALB/c nude mouse (nu/nu) | Charles River Ltd. | NA | 6-8 weeks of age. Male or female mice |
| Bone cement | Depuy Synthes | 160504 | Optional use instead of bone wax |
| Bone wax | Ethicon | W31G | Optional |
| Buprenorphine | Animalcare Ltd. | N/A | Buprecare 0.3 mg/ml Solution for Injection for Dogs and Cats |
| Carbon dioxide euthanasia station | N/A | N/A | Should be provided within animal facility |
| Cell culture incubator set at 37 °C and 5% carbon dioxide | Heraeus | Various | None |
| Chlorhexidine surgical scrub | Vetoquinol | 411412 | None |
| Cryovials (2 ml) | Thermo Scientific Nalgene | 5000-0020 | Optional if cryopreserving tumor fragments |
| D-luciferin (Firefly), potassium salt | Perkin Elmer | 122799 | Optional if cell line of interest has a bioluminescent reporter gene |
| Digital caliper | Mitutoyo | 500-181-30 | Can be manual |
| Digital microradiography cabinet | Faxitron Bioptics, LLC | MX-20 | Optional to evaluate bone response to tumor growth |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | 1371171000 | Optional if cryopreserving tumor fragments |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | None |
| Ethanol (70%) | Sigma Aldrich | 2483 | None |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | None |
| Forceps, Dumont | Fine Science Tools, Inc. | 11200-33 | None |
| Freezer (– 80 °C) | Sanyo | MDF-794C | Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments |
| Hemocytometer | Thermo Fisher Scientific | 11704939 | Can also use automated cell counter, if available |
| Hypodermic needles (27 gauge) | Henry Schein Ltd. | DIS55510 | May also use 25G (DIS55509) and 30G (Catalog DIS599) needles |
| Ice | N/A | N/A | Ideally small pieces in a container for syringe and cell suspension storage |
| Iris scissors | Fine Science Tools, Inc. | 14084-08 | None |
| Isoflurane | Henry Schein Ltd. | 1182098 | None |
| IVIS Lumina III bioluminescence/fluorescence imaging system | Perkin Elmer | CLS136334 | Optional if cell line of interest has bioluminescent or fluorescent reporter genes |
| L-glutamine | Thermofisher scientifc | 25030081 | None |
| Liquid nitrogen | British Oxygen Corporation | NA | Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments |
| Liquid nitrogen dewar, 5 litres | Thermo Fisher Scientific | TY509X1 | Optional if cryopreserving tumor fragments |
| Matrigel® Matrix GFR, LDEV-Free, 5 ml | Corning Life Sciences | 356230 | Optional. Also available in 10 ml size (354230) |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002549 | Pellet cells at 1200 rpm for 5-6 minutes |
| Mr. Frosty freezing containiner | Fisher Scientific | 10110051 | Optional if cryopreserving tumor fragments |
| NAIR Hair remover lotion/oil | Thermo Fisher Scientific | NC0132811 | Can alternatively use an electric clipper with fine blade |
| Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | None |
| Scalpel handle, #7 Short | Fine Science Tools, Inc. | 10007-12 | User preference as long as it accepts #15 scalpel blade |
| Small animal heated pad | VetTech | HE006 | None |
| Stereomicroscope | GT Vision Ltd. | H600BV1 | None |
| Sterile phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Use for injections and also as part of the surgical scrub, alternating with chlorhexidine |
| Tissue adhesive (sterile) | 3M Corporation | 84-1469SB | Can alternatively use non-absorbable skin suture (6-0 size) |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | 5250061 | None |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | Use 0.05%-0.25% |
| Tuberculin syringe (1 ml with 0.1 ml gradations) | Becton Dickinson | 309659 | Slip tip preferred over Luer |
| Vented tissue culture flasks, T-75 | Corning Life Sciences | CLS3290 | Can also use smaller or larger flasks, as needed |
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