Summary
I modelli di metastasi ossee non sviluppano metastasi in modo uniforme o con un'incidenza del 100%. L'iniezione diretta di cellule tumorali intra-ossee può provocare l'embolizzazione del polmone. Presentiamo la nostra tecnica di modellazione dei tumori ossei primari e delle metastasi ossee utilizzando l'impianto di innesto tumorale solido nell'osso, portando a attecchimento e crescita riproducibili.
Abstract
I tumori ossei primari o le metastasi ossee da tumori solidi provocano lesioni osteolitiche, osteoblastiche o osteolitiche / osteoblastiche miste. Queste lesioni compromettono la struttura ossea, aumentano il rischio di fratture patologiche e lasciano i pazienti con opzioni di trattamento limitate. I tumori ossei primari metastatizzano in organi distanti, con alcuni tipi in grado di diffondersi ad altri siti scheletrici. Tuttavia, prove recenti suggeriscono che con molti tumori solidi, le cellule tumorali che si sono diffuse alle ossa possono essere la fonte primaria di cellule che alla fine metastatizzano in altri sistemi di organi. La maggior parte dei modelli murini singeneici o xenograft di tumori ossei primari comportano l'iniezione intra-ossea (ortotopica) di sospensioni di cellule tumorali. Alcuni modelli animali di metastasi scheletriche da tumori solidi dipendono anche dall'iniezione ossea diretta, mentre altri tentano di ricapitolare ulteriori passaggi della cascata metastatica ossea iniettando cellule intravascolarmente o nell'organo del tumore primario. Tuttavia, nessuno di questi modelli sviluppa metastasi ossee in modo affidabile o con un'incidenza del 100%. Inoltre, è stato dimostrato che l'iniezione intraossea diretta di cellule tumorali è associata a una potenziale embolizzazione tumorale del polmone. Queste cellule tumorali emboliche si innestano ma non ricapitolano la cascata metastatica. Abbiamo riportato un modello murino di osteosarcoma in cui frammenti tumorali freschi o crioconservati (costituiti da cellule tumorali più stroma) vengono impiantati direttamente nella tibia prossimale utilizzando una tecnica chirurgica minimamente invasiva. Questi animali hanno sviluppato attecchimento riproducibile, crescita e, nel tempo, osteolisi e metastasi polmonari. Questa tecnica ha la versatilità per essere utilizzata per modellare metastasi ossee tumorali solide e può facilmente impiegare innesti costituiti da uno o più tipi di cellule, cellule geneticamente modificate, xenotrapianti derivati dal paziente e / o cellule marcate che possono essere monitorate mediante imaging ottico o avanzato. Qui, dimostriamo questa tecnica, modellando i tumori ossei primari e le metastasi ossee utilizzando l'impianto di innesto tumorale solido nell'osso.
Introduction
I modelli murini di malattie umane e animali stanno diventando sempre più popolari nella ricerca biomedica. L'utilità di usare i topi in questo contesto è che la loro anatomia e fisiologia sono molto simili agli esseri umani. Hanno un periodo di gestazione relativamente breve e un tempo nella vita post-natale per raggiungere la maturità e sono in gran parte associati a un costo relativamente basso e alla facilità di alloggio, sebbene l'aumento dei costi di sviluppo o acquisto sia associato a maggiori gradi di modificazione genetica, immunodeficienza e / o umanizzazione1. L'uso di ceppi inbred si traduce in una popolazione animale ampiamente uniforme prima dell'inclusione nello studio. Una conoscenza completa del loro genoma suggerisce un alto grado di somiglianza con gli esseri umani. Nel genoma del topo sono stati identificati bersagli molecolari ortologhi per molti processi patologici e ora esiste una vasta libreria di reagenti specifici per il topo che sono facilmente ottenibili. Pertanto, offrono l'opportunità di analisi a produttività relativamente elevata in modo più rapido e meno costoso rispetto ai modelli animali più grandi1. Inoltre, con l'avvento di strategie di editing genetico che consentono la sovraespressione o la delezione di determinati geni sia globalmente che in modo specifico di un tipo cellulare e/o costitutivamente o in modo inducibile, rappresentano un sistema modello biologicamente molto utile per lo studio delle malattie umane e animali2.
Il cancro è un campo in cui i modelli murini hanno una grande utilità. I modelli genetici murini di cancro si basano sulla modulazione dell'espressione di oncogeni o geni oncosoppressori, da soli o in combinazione, affinché le cellule subiscano una trasformazione oncogena. Viene eseguita anche l'iniezione di linee cellulari tumorali primarie o stabilite nei topi. L'introduzione di linee cellulari o tessuti da esseri umani o altre specie animali, compresi i topi, rimane il modello di cancro più utilizzato in vivo. L'uso di cellule e tessuti di specie dissimili (xenotrapianti) in topi immunocompromessi è più comunemente eseguito2. Tuttavia, l'uso di cellule o tessuti tumorali allogenici in cui sia l'ospite che il ricevente sono della stessa specie consente l'interazione con un sistema immunitario intatto quando combinato con lo stesso ceppo di topo ospite nei sistemi singeneici3.
I tumori ossei primari o le metastasi ossee da tumori solidi provocano lesioni osteolitiche, osteoblastiche o miste osteolitiche/osteoblastiche dolorose 3,4. Questi tumori compromettono la struttura ossea, aumentando il rischio di fratture patologiche e lasciano i pazienti con opzioni di trattamento limitate. I tumori ossei primari metastatizzano in organi distanti, con alcuni tipi in grado di diffondersi ad altri siti scheletrici. Nelle pazienti con carcinoma mammario, l'osso è il sito più comune di prima metastasi e il più frequente primo sito di presentazione della malattia metastatica 5,6. Inoltre, le cellule tumorali disseminate (DTC) sono presenti nel midollo osseo prima della diagnosi e predicono lo sviluppo di metastasi in altri organi7. Pertanto, si ritiene che le cellule tumorali presenti nelle ossa siano la fonte di cellule che alla fine metastatizzano in altri sistemi di organi. Esistono molti modelli murini di metastasi tumorali solide che sviluppano metastasi prevalentemente nei polmoni e nei linfonodi e, a seconda del tipo di tumore e della tecnica di iniezione, potenzialmente altri sistemi di organi3. Tuttavia, mancano modelli murini di metastasi ossee che producano in modo affidabile e riproducibile metastasi scheletriche specifiche del sito e sviluppino metastasi ossee prima che i topi raggiungano i criteri di rimozione precoce dal carico tumorale primario o dalle metastasi ad altri organi. Abbiamo riportato un modello di osteosarcoma tumorale osseo primario che si basa sull'impianto chirurgico di un allotrapianto tumorale solido nella tibia prossimale dei topi8. I tumori ossei si sono formati nel 100% dei topi e l'88% ha sviluppato metastasi polmonari. Questa incidenza di metastasi supera quanto comunemente riportato clinicamente nelle persone (~20-50%), ma è di grande interesse poiché il polmone è il sito più comune di metastasi per l'osteosarcoma 9,10,11. Mentre questo modello è vantaggioso nella modellazione dei tumori ossei primari, ha anche una grande utilità nella modellazione delle metastasi ossee da altri tumori solidi osteotropi come tumori al seno, polmone, prostata, tiroide, epatici, renali e gastrointestinali.
Il razionale per lo sviluppo di questo modello era quello di sviluppare un'alternativa alla tradizionale iniezione intra-ossea tipicamente nella tibia prossimale o nel femore distale per modellare tumori ossei primari o metastasi ossee12. Il nostro obiettivo primario era quello di alleviare una limitazione nota di questa tecnica, cioè l'embolizzazione tumorale del polmone. Ciò si traduce nell'attecchimento di queste cellule tumorali emboliche e "metastasi artifattuali" che non ricapitolano la cascata metastatica completa da un tumore osseo primario stabilito che metastatizza ai polmoni 8,13. Questa sarebbe anche la situazione in cui una metastasi ossea stabilita si diffonde in un sito distante. Inoltre, questa tecnica è stata sviluppata anche per produrre un modello di metastasi ossee che garantisse una maggiore incidenza di attecchimento e crescita dei tumori nell'osso e in un sito uniforme rispetto alle tecniche di iniezione ortotopica o intravascolare. Questo modello presenta vantaggi distinti rispetto a queste tecniche descritte. Questo modello comporta la consegna controllata e coerente delle cellule tumorali nell'osso. Inoltre, evita metastasi polmonari artifattuali dopo l'embolizzazione polmonare e stabilisce una popolazione di studio uniforme di base. C'è il beneficio dei tumori sito-specifici con questo modello senza il rischio di criteri di rimozione precoce derivanti da tumori primari o metastasi ad altri organi. Infine, questo modello ha una grande utilità per la modifica, compreso l'uso di xenotrapianti derivati dal paziente.
Il modello presentato ha somiglianze con l'iniezione diretta di sospensione cellulare nell'osso seguendo un approccio chirurgico seguito da iniezione attraverso la corteccia o consegna nella cavità del midollo dopo aver commesso un piccolo difetto nella corteccia (con o senza alesatura della cavità midollare)8,14,15,16,17. Tuttavia, l'impianto di un allotrapianto tumorale rende questa tecnica nettamente diversa. Pertanto, lo scopo di questo rapporto era quello di dimostrare questo modello di tumori ossei primari e metastasi ossee da tumori solidi, che supera molte limitazioni dei modelli precedentemente descritti. I gruppi di ricerca con esperienza in colture cellulari, modelli murini, anestesia e chirurgia del topo e anatomia del topo sono ben attrezzati per riprodurre la nostra tecnica per modellare tumori ossei primari o metastasi ossee nei topi.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali descritti sono stati approvati dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Cambridge, Cambridge, Regno Unito.
1. Preparazione di linee cellulari
- Coltivare linee cellulari in conformità con i protocolli di coltura cellulare standard del laboratorio per la coltura cellulare tradizionale o l'iniezione nei topi. I protocolli standard utilizzati qui sono la crescita nel terreno di coltura modificato di Eagle di Dulbecco contenente il 10% di siero bovino fetale (FBS), L-glutammina e penicillina / streptomicina (di seguito noto come mezzo di crescita completo).
NOTA: In questo esperimento, le cellule di osteosarcoma di Abrams sono utilizzate nei topi Balb / c Foxn1 nu / nu . Per gli studi sul cancro al seno, vengono utilizzate cellule 4T1 in topi Balb / c e cellule EO771 in topi C57BL / 6. - Coltivare le cellule in flaconi di coltura tissutale ventilati o piastre di coltura tissutale a 6 pozzetti a 37 °C in CO2 al 5%.
- Far passare la linea cellulare di interesse e preparare le cellule per l'iniezione quando le cellule raggiungono una confluenza comunemente usata con l'iniezione di queste cellule nei topi.
2. Animali
- Utilizzare topi Balb/c Foxn1 nu/nu di almeno 6-8 settimane di età per la generazione di tumori sottocutanei per assicurarsi che gli animali siano oltre la fase di crescita rapida e abbiano raggiunto l'età adulta e la maturità scheletrica.
- Usa topi maschi o femmine. Fare eccezioni quando si selezionano linee cellulari sensibili agli ormoni (ad esempio, cellule di cancro al seno in topi femmina e cellule tumorali della prostata nei topi maschi).
- Per gli esperimenti di xenotrapianto, utilizzare topi nudi atimici immunodeficienti in base al fatto che la linea cellulare è incompatibile con un sistema immunitario di topo intatto in condizioni normali.
- Per gli esperimenti di allotrapianto che utilizzano linee cellulari murine, questo è raccomandato anche sulla base di background genetici e immunitari di topo dissimili. Tuttavia, per esperimenti singeneici, utilizzare animali dello stesso ceppo della linea cellulare di interesse.
- Ospitare animali a densità standard a seconda delle politiche di allevamento dell'istituzione.
3. Tumori sottocutanei
- Raccogliere linee cellulari dalla coltura mediante tripsinizzazione e risospendere in soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS).
- Valutare la vitalità cellulare e determinare la densità cellulare con il metodo di esclusione del blu tripano. Utilizzare un emocitometro o un contatore automatico delle cellule per contare le cellule. Una vitalità cellulare minima del 90% deve essere utilizzata per l'iniezione nei topi per creare tumori sottocutanei.
- Regolare la densità cellulare per iniettare 1-2 x 105 cellule in un volume finale da 0,1 a 0,15 ml (da 100 a 150 μL) di PBS sterile. Tenere le cellule sul ghiaccio fino all'iniezione.
- In alternativa, celle a pellet centrifugando a 800 x g per 5 min. Scartare il surnatante e risospendere le cellule pellettate in un mezzo di matrice basale sterile non diluito per ottenere 1-2 x 105 cellule in un volume finale da 0,1 a 0,15 ml (da 100 a 150 μL). Mantenere le celle sul ghiaccio fino a nuovo utilizzo.
- Anestetizzare topi da utilizzare per la crescita tumorale sottocutanea con isoflurano in anestesia dell'ossigeno. Utilizzare una dose di induzione del 5% di isoflurano in 2 L/min di ossigeno e una dose di mantenimento del 2-3% di isoflurano in 2 L/min di ossigeno. Verificare la mancanza di riflessi di battito di ciglia o pedale prima di procedere ulteriormente.
NOTA: L'isoflurano è un anestetico inalatorio. Utilizzare l'isoflurano in un'area ben ventilata con adeguati sistemi di scavenging e raccolta del gas libero. Si prega di consultare il personale veterinario istituzionale per sviluppare un piano per l'induzione, il mantenimento e il monitoraggio dell'anestesia e assicurarsi che il personale di laboratorio abbia una formazione adeguata nel monitoraggio dell'anestesia e nella manipolazione di agenti anestetici inalanti. - Rimuovere i peli dalla regione dorsale del torace o dell'addome di topi anestetizzati con soluzione depilante o con un tagliacapelli elettrico. La soluzione depilante è preferibile per ridurre al minimo il potenziale trauma alla pelle. Salta questo passaggio se usi topi nudi athymi.
- Pulire l'area preparata con un tampone etanolo al 70% prima dell'iniezione della sospensione cellulare.
- Utilizzare una siringa da 1 mL di tubercolina con un ago da 27 G per iniettare le cellule per via sottocutanea sulla regione dorsale del torace o dell'addome, per non essere influenzato dal movimento delle scapole. In alternativa, iniettare le cellule per via sottocutanea come sospensione nella matrice extracellulare disponibile in commercio.
NOTA: L'iniezione nella matrice extracellulare disponibile in commercio limiterà la migrazione della sospensione cellulare nello spazio sottocutaneo perché queste matrici si solidificano a temperatura ambiente. - Recuperare i topi su una piastra elettrica in gabbie individuali fino a deambulazione. I topi possono quindi essere collocati nelle loro gabbie normali con lettiere pulite e asciutte.
- Monitorare le dimensioni del tumore sottocutaneo sovrastante il torace dorsale o l'addome con una pinza e misurare il peso corporeo settimanalmente per garantire che i tumori sottocutanei non ulcerino o che i topi soddisfino i criteri di rimozione precoce stabiliti dal comitato per la cura e l'uso degli animali delle istituzioni. Si raccomanda una dimensione massima del tumore di 15 mm in qualsiasi dimensione per ridurre il rischio di ulcerazione cutanea o necrosi tumorale centrale.
NOTA: Consultare le linee guida locali per determinare la dimensione / volume massimo ammissibile del tumore. - Eutanasia topi portatori di tumori sottocutanei dopo tre o quattro settimane per inalazione di CO2 seguita da lussazione cervicale. Seguire le politiche accettabili dell'istituzione per l'eutanasia dei topi.
- Raccogliere tumori sottocutanei utilizzando la tecnica chirurgica asettica. Sterilizzare la pelle sovrastante il tumore come prima con etanolo al 70% dopo la rimozione dei peli (se applicabile). Incidere attraverso la pelle sovrastante il tumore con una lama di bisturi # 15 (con o senza un manico della lama del bisturi). Sezionare bruscamente il tumore dai tessuti molli circostanti attaccati con un paio di forbici chirurgiche sterili.
- Posizionare il tumore in piastre di coltura tissutale a 6 pozzetti contenenti terreno di crescita completo e tritare in più piccoli frammenti di dimensioni predeterminate (~ 0,6 mm x 0,6 mm x 0,6 mm – 0,25 mm 3 fino a 1 mm x 1 mm x 1 mm – 1 mm3) con una lama di bisturi #15 (con o senza manico a lama di bisturi).
- Mantenere i frammenti tumorali in terreno di crescita completo sterile a temperatura ambiente fino al momento dell'impianto intratibiale. Per le linee cellulari che trasportano geni reporter luciferasi, utilizzare l'imaging bioluminescente o fluorescente ex-vivo per confermare la vitalità del tumore prima dell'impianto intratibiale nei topi.
- Per la crioconservazione, posizionare più frammenti nello stesso crioviale in mezzo di crescita completo integrato con 20% FBS e 10% dimetil solfossido (DMSO). Congelare gradualmente utilizzando un sistema di crioconservazione commerciale a -80 °C e conservare a lungo termine in azoto liquido. Conservare i frammenti tumorali per le analisi successive, ma non per l'impianto futuro, mediante congelamento a scatto mediante immersione di azoto liquido. Conservare questi frammenti tumorali congelati a lungo termine a -80 °C.
NOTA: È stato precedentemente riportato che i tumori congelati a scatto non si attecchiscono e crescono in vivo8.
4. Impianto chirurgico di frammenti tumorali sottocutanei
- Portare frammenti freschi o crioconservati di tumore sottocutaneo a temperatura ambiente in mezzo di crescita completo prima dell'impianto chirurgico.
- Anestetizzare topi del ceppo di interesse usando isoflurano in anestesia con ossigeno come descritto nel paragrafo 3. Verificare la mancanza di riflessi del pedale prima di procedere. Somministrare buprenorfina sottocutanea alla dose di 0,02-0,05 mg/kg per fornire analgesia perioperatoria. Questo può essere ripetuto ogni 6-8 ore nel periodo post-operatorio, se necessario.
- Rimuovere i peli sull'articolazione del ginocchio destro e la tibia prossimale dell'arto posteriore con soluzione depilante per ridurre al minimo il potenziale trauma alla pelle.
- Strofinare l'area preparata con antisettico chirurgico. Strofinare prima con un tampone etanolo al 70% e poi strofinare con clorexidina alternata e scrub salino.
- Visualizza la tibia prossimale come la regione appena distale all'articolazione del ginocchio mentre fletti ed estendi l'articolazione.
- Creare un'incisione di 3-4 mm a livello della tibia prossimale sull'aspetto mediale dell'arto con una lama di bisturi #15 (con o senza manico a lama di bisturi). Incidere attraverso la pelle e il tessuto sottocutaneo per esporre la corteccia mediale della tibia prossimale.
- Applicare una leggera pressione con la punta di un ago da 25 G, ruotando anche la punta, per creare un piccolo foro nella corteccia mediale della tibia prossimale. Fai questo foro distale di circa 2 mm all'articolazione del ginocchio in un punto equidistante tra la corteccia tibiale cranica e caudale. Selezionare la dimensione dell'ago in base alla dimensione dei frammenti tumorali.
- Utilizzare una pinza sterile per raccogliere e inserire i frammenti tumorali nella cavità midollare della tibia prossimale. Utilizzare un ago da 27 a 30 G per manipolare il frammento tumorale nel canale midollare. A seconda delle dimensioni dei frammenti tumorali, impiantare un volume tumorale totale di almeno 0,5 mm3 in ciascuna tibia. Ciò può richiedere l'impianto di 1 o più frammenti tumorali a seconda delle dimensioni dei frammenti tumorali creati.
NOTA: Le modifiche per prevenire o limitare lo spostamento dell'innesto al di fuori dell'osso sarebbero il posizionamento di cera ossea o cemento osseo nel difetto osseo o schiuma di gel o un innesto di grasso sottocutaneo sopra il foro nell'osso. - Applicare i bordi della pelle con adesivo sterile per tessuti liquidi o una sutura a pelle singola. Non utilizzare clip per ferite in questo sito. Prestare attenzione se si utilizza l'imaging a fluorescenza nel periodo post-operatorio, poiché sia gli adesivi tissutali che la sutura hanno il potenziale di fluorescenza.
- Recuperare i topi su una piastra elettrica in gabbie individuali fino a deambulazione.
5. Valutazione seriale ed endpoint
- Anestetizzare i topi usando l'isoflurano in anestesia con ossigeno come descritto in precedenza.
- Valutare la crescita del tumore tibiale in modo non invasivo mediante radiografia digitale settimanale, bioluminescenza o imaging a fluorescenza (se si utilizzano cellule che esprimono luciferasi o un gene reporter fluorescente). Le misurazioni del calibro dell'arto nel sito di impianto possono essere eseguite anche nei topi svegli.
- Oltre al monitoraggio tradizionale dei topi portatori di tumore (peso corporeo, livello di attività, frequenza respiratoria, toelettatura, postura, mentazione e comportamento) monitorare settimanalmente i topi per segni di zoppia degli arti posteriori, gonfiore e infezione del sito chirurgico.
- Monitorare la ferita chirurgica della pelle per i primi 10-14 giorni per arrossamento eccessivo, gonfiore, drenaggio e deiscenza della ferita fino a quando la ferita cutanea non è guarita. Dopo 4-5 settimane, valutare i topi in base alla valutazione dei risultati dello studio vivi o dopo l'eutanasia.
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Representative Results
Un risultato positivo sarebbe associato all'attecchimento del tumore e alla crescita progressiva del tumore nel tempo. A seconda del tipo di tumore, la crescita tumorale intraossea può essere associata a zoppia progressiva degli arti posteriori, ma molti tumori non causano zoppia nonostante i segni di malattia ossea associata. L'attecchimento riuscito è stato documentato con imaging avanzato, per cui ci sarebbero cambiamenti radiografici, μTC o μMRI progressivi nella tibia prossimale associata al fenotipo osseo della linea cellulare di interesse (metastasi osteolitiche, osteoblastiche o miste osteolitiche/osteoblastiche) (Figura 1)8. Nel nostro precedente rapporto, il difetto corticale creato per l'impianto dell'innesto tumorale era visibile nella tibia prossimale 1 settimana dopo l'impianto (Figura 1A). Entro la settimana 2, c'era osteolisi visibile e rimodellamento osseo adiacente al difetto corticale. Dalle settimane 2-5, c'è stata una progressiva distruzione ossea e la formazione di nuovo osso associato all'attecchimento e alla crescita del tumore (Figura 1B-E). Per le linee cellulari con geni reporter, i cambiamenti ossei sarebbero accompagnati da aumenti delle uscite di imaging a fluorescenza o bioluminescenza nel tempo. La zoppia acuta può essere un indicatore di frattura ossea patologica imminente o effettiva, che richiede una valutazione radiografica immediata e attenta del topo e possibilmente la rimozione precoce dallo studio. A seconda della linea cellulare tumorale studiata, la distruzione ossea può verificarsi rapidamente, ben prima delle metastasi. Ciò è di particolare importanza negli studi che coinvolgono tumori ossei primari, poiché i topi possono dover essere rimossi dallo studio prima dello sviluppo di metastasi clinicamente rilevanti, vale a dire al polmone. In questi casi, si raccomanda l'amputazione chirurgica dell'arto portatore del tumore per consentire lo studio della malattia residua minima e delle successive metastasi quando si utilizzano tumori ossei primari, come abbiamo riportato in precedenza 4,8. Mentre l'amputazione completa degli arti posteriori nelle persone non viene tipicamente eseguita, questo è lo standard di cura in medicina veterinaria, di cui le somiglianze nelle caratteristiche cliniche e molecolari dell'osteosarcoma umano e canino sono ben documentate. L'amputazione degli arti posteriori nei topi è, quindi, rilevante per molte linee cellulari animali. Inoltre, l'amputazione è un metodo di trattamento praticabile nei topi poiché le procedure di risparmio degli arti utilizzate nelle persone non sono realizzabili in piccoli roditori come i topi. Nei topi portatori di tumori ossei primari, inappetenza, perdita di peso progressiva, cattive condizioni corporee generali e difficoltà respiratorie (aumento della velocità o dello sforzo) possono segnalare lo sviluppo di metastasi tumorali al polmone e ad altri organi. La conferma mediante imaging bioluminescente, μCT o imaging μMRI è raccomandata per confermare le metastasi e gli animali affetti devono essere eutanasiati.
Un risultato negativo, molto probabilmente derivante dalla mancanza di attecchimento tumorale, dovrebbe essere sospettato se non vi è evidenza di cambiamenti progressivi (lesioni osteolitiche, osteoblastiche o miste osteolitiche/osteoblastiche, a seconda della linea cellulare studiata) alla radiografia o all'esame μTC della tibia impiantata. Per le linee cellulari che trasportano geni reporter, la mancanza di un aumento della fluorescenza o della segnalazione di bioluminescenza nel tempo mediante imaging ottico supporterebbe anche la conclusione che il tumore non è riuscito a trapiantarsi. La mancanza o lo scarso attecchimento potrebbe essere associato a un'infezione del sito chirurgico. Tuttavia, questo mostrerebbe segni clinici specifici come arrossamento, gonfiore o scarico più comunemente nel primo periodo post-operatorio (prime 1-2 settimane dopo l'intervento chirurgico). Gli animali potrebbero anche essere potenzialmente febbrili e mostrare una mancanza di attività o una postura curva nel primo periodo post-operatorio a causa dell'infezione del sito chirurgico. La raccolta e il mantenimento degli allotrapianti in condizioni sterili durante la preparazione e la corretta preparazione sterile dell'arto, la tecnica intraoperatoria sterile e la chiusura completa della ferita ridurranno al minimo la probabilità di una complicanza della ferita chirurgica post-operatoria con conseguente infezione e fallimento dell'attecchimento del tumore.
Nel nostro precedente rapporto8, includendo sia gli studi pilota riportati che quelli definitivi, 16 topi su 16 (100%) impiantati con frammenti di osteosarcoma sono progrediti in lesioni ossee osteolitiche e 14 di questi 16 topi (88%) hanno sviluppato metastasi. Tutte le metastasi sono state osservate al polmone e diagnosticate mediante istologia già 3 settimane dopo l'impianto8. Altri animali sottoposti a necroscopia a 1 (n=2) e 2 (n=2) settimane dopo l'impianto non hanno rivelato alcuna evidenza di metastasi polmonari.
Figura 1: Radiografia seriale. Radiografia seriale (in ordine) eseguita settimanalmente a (A) 1, (B) 2, (C) 3, (D) 4 e (E) 5 settimane dopo l'impianto intratibiale di un allotrapianto tumorale sottocutaneo utilizzando una linea cellulare tumorale ossea primaria (osteosarcoma). Nel corso del tempo, c'è stata una progressiva distruzione ossea e la formazione di nuovo osso associato all'attecchimento e alla crescita del tumore. Questa cifra è stata modificata con il permesso del ref8. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Questo rapporto documenta il nostro modello per creare tumori ossei primari o metastasi ossee dopo l'impianto intratibiale di un allotrapianto tumorale. Riteniamo che ci siano diversi passaggi critici in questo processo. Deve essere stabilito un piano anestetico sicuro sia per l'iniezione sottocutanea della sospensione delle cellule tumorali che per il posizionamento intratibiale dei frammenti tumorali risultanti. Ci dovrebbe essere una preparazione sterile del sito chirurgico sia per la rimozione dell'allotrapianto sottocutaneo che per il posizionamento intratibiale dell'allotrapianto. I frammenti di allotrapianto tumorale devono essere creati uniformemente per il successivo impianto intratibiale. Un difetto di dimensioni appropriate nella tibia prossimale dovrebbe essere creato per l'impianto di frammenti tumorali. La ferita cutanea chirurgica deve essere chiusa completamente per ridurre il rischio di complicanze post-operatorie. L'ultimo passo critico è che se la matrice extracellulare viene utilizzata come parte della sospensione di cellule tumorali per iniezione sottocutanea, deve essere fatto l'uso delle istruzioni di manipolazione raccomandate dal produttore per evitare la solidificazione della sospensione prima dell'iniezione. Una corretta preparazione sterile dell'arto, una tecnica intraoperatoria sterile e la chiusura completa della ferita ridurranno al minimo la probabilità di una complicazione della ferita chirurgica post-operatoria.
Le caratteristiche del tumore impiantato e della tecnica chirurgica sono fondamentali per risultati di successo e riproducibili per l'incorporazione nella popolazione dello studio. Inizialmente, si dovrebbe verificare che lo xenotrapianto tumorale / allotrapianto viene impiantato direttamente nella cavità midollare della tibia, assicurandosi che il tessuto tumorale sia completamente all'interno dell'osso. Le modifiche per prevenire o limitare lo spostamento dell'innesto al di fuori dell'osso sarebbero inizialmente il posizionamento di cera ossea o cemento osseo nel difetto osseo o schiuma di gel o un innesto di grasso sottocutaneo sopra il foro nell'osso. Un'alternativa sarebbe quella di inserire l'allotrapianto tumorale attraverso un foro sull'aspetto laterale della tibia prossimale, creato sotto il muscolo tibiale cranico. La presenza del muscolo tibiale cranico servirebbe quindi come copertura biologica sul difetto osseo, limitando il potenziale spostamento dell'allotrapianto tumorale. Tuttavia, questo è un approccio chirurgico più aggressivo con il potenziale di trauma neuromuscolare sull'aspetto laterale della tibia prossimale. Bisogna fare attenzione per assicurarsi che gli allotrapianti tumorali siano creati per essere di dimensioni uniformi prima dell'impianto. Detto questo, gli allotrapianti tumorali non dovrebbero superare 1 mm in nessuna dimensione, poiché le dimensioni tumorali più grandi in qualsiasi sistema biologico hanno meno probabilità di attecchire rispetto agli innesti più piccoli quando non vi è una fornitura vascolare diretta e immediata fornita all'innesto al momento dell'impianto. Abbiamo riportato risultati positivi con un volume finale del tumore impiantato di 0,5 mm 3, ma prevediamo che volumi combinati di frammenti tumorali fino a 1 mm3 otterranno risultati positivi. Tuttavia, il volume massimo del frammento tumorale impiantabile non è stato determinato. Rispetto al tessuto crioconservato, gli xenotrapianti e gli allotrapianti tumorali freschi hanno maggiori probabilità di sopravvivere, sebbene non abbiamo osservato un problema con la pratica di utilizzare allotrapianti tumorali accuratamente crioconservati. Gli allotrapianti congelati a scatto non devono essere impiantati. Inoltre, la dissezione della capsula e della porzione esterna del tumore sottocutaneo impedirà qualsiasi contributo da questo strato del tumore, che è in gran parte fibroso e vascolare con un significativo infiltrato immunitario piuttosto che costituito in gran parte da cellule tumorali vere e proprie. Un metodo alternativo alla creazione di allotrapianti tumorali dalla massa tumorale più grande direttamente con una lama di bisturi è utilizzando un piccolo ago da biopsia che crea un "nucleo" tumorale cilindrico che può quindi essere tagliato a una lunghezza predefinita prima dell'impianto. L'uso di un ago da biopsia o di un punzone per biopsia può essere utile nella creazione di frammenti tumorali uniformi per l'impianto, poiché dopo che due dimensioni uniformi (larghezza e profondità) sono state create dal processo di biopsia, possono quindi essere tagliate a una lunghezza appropriata prima dell'impianto. Se geni reporter come la luciferasi o le proteine fluorescenti vengono utilizzati nelle cellule tumorali impiantate, la valutazione dei frammenti tumorali al momento dell'impianto o 1 settimana dopo l'impianto indicherà il contributo relativo delle cellule tumorali nei frammenti tumorali impiantati, nonché la vitalità.
Come con qualsiasi procedura, ci sono limitazioni oltre ai nostri benefici riportati di questa tecnica. La metastasi è un processo a più fasi che richiede una cellula dalla sua posizione primaria per eseguire con successo l'invasione e la migrazione attraverso la matrice extracellulare, intravasare l'afflusso di sangue del tumore, sopravvivere in circolazione fino a quando non arriva alla sua destinazione metastatica finale, stravasare nell'organo vero e proprio e quindi rimanere in uno stato dormiente o proliferare per creare una lesione metastatica, e modifica della normale architettura tissutale per diventare una metastasi clinicamente rilevabile18. I modelli murini attualmente utilizzati di metastasi ossee si basano in gran parte sull'iniezione ortotopica diretta di cellule tumorali nel sito normale del tumore primario, sull'iniezione intravascolare nel ventricolo sinistro del cuore o perifericamente nelle vene caudali (vene caudali laterali o dorsali) o sull'iniezione intraossea diretta della sospensione cellulare tumorale3. Tuttavia, recenti rapporti che cercano di migliorare i modelli di metastasi ossee hanno sostenuto l'iniezione nelle arterie illiache, caudali o femorali 19,20,21. Tutti questi metodi incorporano uno o più passaggi all'interno della cascata metastatica ossea, ad eccezione dell'iniezione intraossea diretta o nel nostro caso l'impianto di un allotrapiante tumorale, che modella solo la modifica del tessuto. Pertanto, questa è una limitazione intrinseca della nostra tecnica. Un'ulteriore limitazione è che, come attualmente descritto, richiede la propagazione degli allotrapianti in un ospite di topo intermedio, che richiede l'uso di topi aggiuntivi e si traduce nell'impianto di un tumore che non è costituito da cellule tumorali pure al 100%. L'allotrapianto possederà un contributo stromale fornito dai tumori che crescono in una posizione sottocutanea. Una potenziale alternativa per ridurre al minimo questo contributo stromale sottocutaneo sarebbe l'iniezione di cellule sottocutanee in un substrato biologico come una matrice extracellulare o un'impalcatura. In alternativa, potrebbe essere eseguita l'iniezione ortotopica nel sito primario del tumore, seguita dalla rimozione del tumore e dalla preparazione dell'innesto.
Il metodo delineato in questo rapporto presenta vantaggi chiave rispetto ai metodi esistenti di modellazione dei tumori ossei primari o delle metastasi ossee dopo l'iniezione intraossea diretta di cellule tumorali. Come discusso, noi e altri abbiamo osservato embolizzazione diretta dei polmoni e morte immediata occasionale dopo iniezione intratibiale di una sospensione cellulare 8,13. Ciò deriva da un'iniezione pressurizzata di cellule tumorali nella cavità del midollo, dopo di che le cellule tumorali entrano nell'afflusso di sangue periferico attraverso le sinusoidi vascolari del midollo osseo e vengono trasportate al polmone dal ritorno venoso. Questi eventi sono paragonabili meccanicamente a quelli osservati con tromboembolia polmonare o venosa associata al posizionamento pressurizzato di impianti nella cavità midollare associata all'artroplastica articolare totale nelle persone e negli animali. Noi e altri ipotizziamo che questo fenomeno embolico ai polmoni possa essere specifico della linea cellulare (osservazioni non pubblicate). Tuttavia, sono stati riportati passi molto dettagliati per limitare la creazione di queste metastasi emboliche artefattuali12. Inizialmente, ci dovrebbe essere un'adeguata tripsinizzazione e la creazione di una sospensione monocellulare uniforme per iniezione, che deve essere conservata su ghiaccio per prevenire l'aggregazione cellulare. L'ago deve essere posizionato correttamente attraverso la piastra di crescita tibiale prossimale, dopo di che devono essere eseguiti piccoli volumi di iniezione (~ 10 μL) e iniezioni prive di resistenza nella cavità del midollo. Nonostante ciò, la somministrazione di cellule tumorali ai polmoni, e anche ad altri organi, può essere facilmente osservata mediante imaging a bioluminescenza seguendo tecniche di iniezione intra-ossea e intravascolare, suggerendo che è possibile che le cellule che generano questo segnale bioluminescente nei polmoni e in altri organi possano dare origine a metastasi a distanza (osservazioni non pubblicate)3. Abbiamo scoperto che un altro vantaggio di questa tecnica è che un singolo tumore cresce in un sito osseo uniforme all'interno della popolazione dello studio, riducendo la variabilità da animale ad animale. Ciò consente la creazione di una popolazione di studio uniforme e un rapido confronto tra i gruppi di trattamento. Ciò è in contrasto con le metastasi ossee che si sviluppano dopo l'iniezione ortotopica o intravascolare, dove è possibile per le cellule metastatizzare in diversi siti scheletrici e crescere con cinetiche diverse, rendendo difficili i confronti tra i gruppi di studio. La crescita tumorale in un sito anatomico dopo l'impianto dei nostri allotrapianti tumorali evita anche la possibilità che i topi vengano rimossi a causa di metastasi ad altri sistemi di organi o carico tumorale primario, come si può vedere con le tecniche di iniezione intravascolare e ortotopica. Inoltre, abbiamo osservato un attecchimento del 100% dopo l'impianto di allotrapianto tumorale, che supporta una popolazione di studio uniforme ed evita l'uso non necessario di topi aggiuntivi per ottenere numeri di dimensioni del campione appropriati. Ciò supera anche la limitazione dell'iniezione incompleta e imprecisa a seguito dell'iniezione percutanea di sospensioni di cellule tumorali nell'osso.
Questa tecnica ha un ampio grado di versatilità che ha portato a modifiche che sono attualmente in uso nella nostra ricerca e ha il potenziale per una grande utilità per applicazioni future. Inizialmente, mentre impieghiamo la tibia prossimale come nostro sito di impianto intra-osseo, altri siti comuni di tumori ossei primari o metastasi ossee possono essere facilmente utilizzati, incluso ma non limitato al femore distale e all'omero prossimale. Tuttavia, l'approccio chirurgico a questi siti e ad aree come il bacino e la colonna vertebrale richiede un approccio chirurgico gradualmente più esteso rispetto alla tibia prossimale. Inoltre, siti come il bacino, la colonna vertebrale, il cranio, il radio e l'ulna non sono beneficiati da un adeguato stock osseo per l'impianto del tumore. Per i tumori maligni invasivi ossei come con i tumori orali, il posizionamento degli allotrapianti tumorali adiacenti all'osso o all'interno dell'orofaringe può anche ricapitolare la progressione dei tumori invasivi 3,22. Gli esperimenti in vitro e in vivo spesso impiegano tecniche di co-coltura o co-iniezione per determinare gli effetti di diversi tipi di cellule su un tipo di cellula di interesse. Pertanto, esiste il potenziale per l'iniezione di due o più tipi di cellule contemporaneamente per creare i tumori sottocutanei, che possono quindi essere impiantati nell'osso utilizzando questa tecnica. Le cellule geneticamente modificate possono essere utilizzate da sole o in combinazione con altre cellule normali o geneticamente modificate per creare gli allotrapianti tumorali. Con il crescente interesse per la medicina di precisione e la creazione di modelli in vitro e in vivo di cancro umano, il trapianto di xenotrapianto derivato dal paziente nei topi sta guadagnando popolarità. Recentemente, è stato descritto un modello di metastasi ossee del cancro al seno in cui xenotrapianti derivati dal paziente impiantati ortotopicamente su dischi ossei umani impiantati per via sottocutanea in topi nudi23. Da questo, gli xenotrapianti derivati dal paziente potrebbero essere impiantati direttamente nell'osso utilizzando il nostro modello, senza la necessità di un ospite intermedio per la propagazione sottocutanea. Ciò consentirebbe la rapida valutazione della cinetica del tumore e la capacità di valutare più combinazioni di trattamento potenzialmente da una sola biopsia del paziente, non richiedendo una grande massa tumorale per la preparazione dell'allotrapianto. L'uso crescente di organoidi nella ricerca sul cancro potrebbe anche essere impiegato nel nostro modello24. Ciò richiederebbe l'iniezione con ago o pipetta di questi aggregati cellulari attraverso il foro nella corteccia tibiale. Pertanto, raccomandiamo di sigillare il difetto corticale (come discusso sopra) per limitare la possibilità di migrazione organoide al di fuori della cavità ossea e midollare. Come abbiamo eseguito, le cellule possono essere marcate e tracciate mediante imaging ottico (bioluminescenza o fluorescenza) o avanzato (radiografia digitale, μTC o μMRI) che consente la valutazione della crescita del tumore nel tempo. Ciò ha anche il vantaggio di ridurre al minimo il numero di animali poiché gli stessi animali vengono fotografati nel tempo.
In sintesi, questo rapporto dimostra la nostra tecnica di modellazione dei tumori ossei primari e delle metastasi ossee utilizzando l'impianto di innesto tumorale solido nell'osso.
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Disclosures
Il Dr. Hildreth è stato finanziato dal NIH con il numero di premio K01OD026527. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente il punto di vista ufficiale del NIH.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono il contributo critico della dott.ssa Beth Chaffee, DVM, PhD, DACVP allo sviluppo di questa tecnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #15 scalpel blade | Henry Schein Ltd. | 75614 | None |
| 6-well tissue culture plates | Thermo Fisher Scientific | 10578911 | Used for mincing tumor pieces. Can also be used for cell culture |
| Abrams osteosarcoma cell line | Not applicable | Not applicable | None |
| Anesthesia machine with isoflurane vaporiser and oxygen tank(s) | VetEquip | 901805 | None |
| Animal weighing scale | Kent Scientific | SCL- 1015 | None |
| BALB/c nude mouse (nu/nu) | Charles River Ltd. | NA | 6-8 weeks of age. Male or female mice |
| Bone cement | Depuy Synthes | 160504 | Optional use instead of bone wax |
| Bone wax | Ethicon | W31G | Optional |
| Buprenorphine | Animalcare Ltd. | N/A | Buprecare 0.3 mg/ml Solution for Injection for Dogs and Cats |
| Carbon dioxide euthanasia station | N/A | N/A | Should be provided within animal facility |
| Cell culture incubator set at 37 °C and 5% carbon dioxide | Heraeus | Various | None |
| Chlorhexidine surgical scrub | Vetoquinol | 411412 | None |
| Cryovials (2 ml) | Thermo Scientific Nalgene | 5000-0020 | Optional if cryopreserving tumor fragments |
| D-luciferin (Firefly), potassium salt | Perkin Elmer | 122799 | Optional if cell line of interest has a bioluminescent reporter gene |
| Digital caliper | Mitutoyo | 500-181-30 | Can be manual |
| Digital microradiography cabinet | Faxitron Bioptics, LLC | MX-20 | Optional to evaluate bone response to tumor growth |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | 1371171000 | Optional if cryopreserving tumor fragments |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | None |
| Ethanol (70%) | Sigma Aldrich | 2483 | None |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | None |
| Forceps, Dumont | Fine Science Tools, Inc. | 11200-33 | None |
| Freezer (– 80 °C) | Sanyo | MDF-794C | Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments |
| Hemocytometer | Thermo Fisher Scientific | 11704939 | Can also use automated cell counter, if available |
| Hypodermic needles (27 gauge) | Henry Schein Ltd. | DIS55510 | May also use 25G (DIS55509) and 30G (Catalog DIS599) needles |
| Ice | N/A | N/A | Ideally small pieces in a container for syringe and cell suspension storage |
| Iris scissors | Fine Science Tools, Inc. | 14084-08 | None |
| Isoflurane | Henry Schein Ltd. | 1182098 | None |
| IVIS Lumina III bioluminescence/fluorescence imaging system | Perkin Elmer | CLS136334 | Optional if cell line of interest has bioluminescent or fluorescent reporter genes |
| L-glutamine | Thermofisher scientifc | 25030081 | None |
| Liquid nitrogen | British Oxygen Corporation | NA | Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments |
| Liquid nitrogen dewar, 5 litres | Thermo Fisher Scientific | TY509X1 | Optional if cryopreserving tumor fragments |
| Matrigel® Matrix GFR, LDEV-Free, 5 ml | Corning Life Sciences | 356230 | Optional. Also available in 10 ml size (354230) |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002549 | Pellet cells at 1200 rpm for 5-6 minutes |
| Mr. Frosty freezing containiner | Fisher Scientific | 10110051 | Optional if cryopreserving tumor fragments |
| NAIR Hair remover lotion/oil | Thermo Fisher Scientific | NC0132811 | Can alternatively use an electric clipper with fine blade |
| Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | None |
| Scalpel handle, #7 Short | Fine Science Tools, Inc. | 10007-12 | User preference as long as it accepts #15 scalpel blade |
| Small animal heated pad | VetTech | HE006 | None |
| Stereomicroscope | GT Vision Ltd. | H600BV1 | None |
| Sterile phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Use for injections and also as part of the surgical scrub, alternating with chlorhexidine |
| Tissue adhesive (sterile) | 3M Corporation | 84-1469SB | Can alternatively use non-absorbable skin suture (6-0 size) |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | 5250061 | None |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | Use 0.05%-0.25% |
| Tuberculin syringe (1 ml with 0.1 ml gradations) | Becton Dickinson | 309659 | Slip tip preferred over Luer |
| Vented tissue culture flasks, T-75 | Corning Life Sciences | CLS3290 | Can also use smaller or larger flasks, as needed |
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