Summary
Knoglemetastasemodeller udvikler ikke metastase ensartet eller med en 100% forekomst. Direkte intra-osseøs tumorcelleinjektion kan resultere i embolisering af lungen. Vi præsenterer vores teknikmodellering af primære knogletumorer og knoglemetastaser ved hjælp af solid tumortransplantatimplantation i knoglen, hvilket fører til reproducerbar engraftment og vækst.
Abstract
Primære knogletumorer eller knoglemetastaser fra solide tumorer resulterer i smertefulde osteolytiske, osteoblastiske eller blandede osteolytiske / osteoblastiske læsioner. Disse læsioner kompromitterer knoglestrukturen, øger risikoen for patologiske brud og efterlader patienter med begrænsede behandlingsmuligheder. Primære knogletumorer metastaserer til fjerne organer, hvor nogle typer er i stand til at sprede sig til andre skeletsteder. Nylige beviser tyder imidlertid på, at kræftceller, der har spredt sig til knogle, med mange solide tumorer kan være den primære kilde til celler, der i sidste ende metastaserer til andre organsystemer. De fleste syngeneiske eller xenograft musemodeller af primære knogletumorer involverer intra-osseøs (ortotopisk) injektion af tumorcellesuspensioner. Nogle dyremodeller af skeletmetastase fra faste tumorer afhænger også af direkte knogleinjektion, mens andre forsøger at rekapitulere yderligere trin i knoglemetastatisk kaskade ved at injicere celler intravaskulært eller ind i organet af den primære tumor. Imidlertid udvikler ingen af disse modeller knoglemetastaser pålideligt eller med en forekomst på 100%. Derudover har direkte intraosseøs injektion af tumorceller vist sig at være forbundet med potentiel tumorembolisering af lungen. Disse emboliske tumorceller indpoder, men rekapitulerer ikke den metastatiske kaskade. Vi rapporterede en musemodel af osteosarkom, hvor friske eller kryopræserverede tumorfragmenter (bestående af tumorceller plus stroma) implanteres direkte i den proksimale skinneben ved hjælp af en minimalt invasiv kirurgisk teknik. Disse dyr udviklede reproducerbar engraftment, vækst og over tid osteolyse og lungemetastase. Denne teknik har den alsidighed, der skal bruges til at modellere solid tumorknoglemetastase og kan let anvende transplantater bestående af en eller flere celletyper, genetisk modificerede celler, patientafledte xenotransplantater og / eller mærkede celler, der kan spores ved optisk eller avanceret billeddannelse. Her demonstrerer vi denne teknik, modellering af primære knogletumorer og knoglemetastase ved hjælp af solid tumortransplantatimplantation i knogle.
Introduction
Musemodeller af sygdomme hos mennesker og dyr bliver stadig mere populære inden for biomedicinsk forskning. Nytten af at bruge mus i denne sammenhæng er, at deres anatomi og fysiologi ligner mennesker meget. De har en relativt kort drægtighedsperiode og tid i postnatal liv for at opnå modenhed og er stort set forbundet med relativt lave omkostninger og lette boliger, omend stigende omkostninger til udvikling eller køb er forbundet med større grader af genetisk modifikation, immundefekt og / eller humanisering1. Anvendelse af indavlede stammer resulterer i en stort set ensartet dyrepopulation før inklusion i undersøgelsen. Et fuldstændigt kendskab til deres genom tyder på en høj grad af lighed med mennesker. Ortologe molekylære mål for mange sygdomsprocesser er blevet identificeret i musegenomet, og der er nu et omfattende bibliotek af musespecifikke reagenser, der er let tilgængelige. Derfor giver de mulighed for analyse med relativt høj kapacitet på en hurtigere og billigere måde sammenlignet med større dyremodeller1. Med fremkomsten af genetiske redigeringsstrategier, der giver mulighed for overekspression eller deletion af visse gener enten globalt eller på en celletypespecifik måde og/eller konstitutivt eller på en inducerbar måde, repræsenterer de desuden et meget biologisk nyttigt modelsystem til undersøgelse af sygdomme hos mennesker og dyr2.
Kræft er et felt, hvor musemodeller har stor nytteværdi. Genetiske musemodeller af kræft er afhængige af modulering af ekspressionen af enten onkogener eller tumorsuppressorgener, alene eller i kombination, for celler at gennemgå onkogen transformation. Injektionen af primære eller etablerede tumorcellelinjer i mus udføres også. Indførelsen af enten cellelinjer eller væv fra mennesker eller andre dyrearter, herunder mus, er fortsat den mest udbredte kræftmodel in vivo. Anvendelse af celler og væv fra forskellige arter (xenotransplantater) i immunkompromitterede mus udføres oftest2. Imidlertid muliggør brugen af allograft tumorceller eller væv, hvor både vært og recipient er af samme art, interaktion med et intakt immunsystem, når det kombineres med den samme værtsmusestamme i syngeneiske systemer3.
Primære knogletumorer eller knoglemetastaser fra solide tumorer resulterer i smertefulde osteolytiske, osteoblastiske eller blandede osteolytiske/osteoblastiske læsioner 3,4. Disse tumorer kompromitterer knoglestrukturen, øger risikoen for patologisk brud og efterlader patienter med begrænsede behandlingsmuligheder. Primære knogletumorer metastaserer til fjerne organer, hvor nogle typer er i stand til at sprede sig til andre skeletsteder. Hos brystkræftpatienter er knogle det mest almindelige sted for første metastase og det hyppigste første sted for præsentation af metastatisk sygdom 5,6. Derudover er disseminerede tumorceller (DTC'er) til stede i knoglemarven forud for diagnosen af og forudsiger udviklingen af metastaser i andre organer7. Derfor menes det, at kræftceller, der er til stede i knogler, er kilden til celler, der i sidste ende metastaserer til andre organsystemer. Der findes mange musemodeller af solid tumormetastase, der overvejende udvikler metastaser i lunger og lymfeknuder, og afhængigt af tumortype og injektionsteknik, potentielt andre organsystemer3. Imidlertid mangler musemodeller af knoglemetastase, der pålideligt producerer stedspecifik skeletmetastase og udvikler knoglemetastase, før mus når tidlige fjernelseskriterier fra primær tumorbyrde eller metastase til andre organer. Vi har rapporteret en model af den primære knogletumor osteosarkom, der er afhængig af kirurgisk implantation af en solid tumorallograft i den proksimale skinneben hos mus8. Knogletumorer dannet hos 100% af mus og 88% udviklede lungemetastase. Denne forekomst af metastase overstiger det, der almindeligvis rapporteres klinisk hos mennesker (~ 20-50%), men er af stor interesse, da lungen er det mest almindelige sted for metastase for osteosarkom 9,10,11. Mens denne model er fordelagtig i modellering primære knogletumorer, har den også stor nytte i modellering af knoglemetastaser fra andre osteotrope faste tumorer såsom bryst, lunge, prostata, skjoldbruskkirtel, lever, nyre og gastrointestinale tumorer.
Begrundelsen for udviklingen af denne model var at udvikle et alternativ til den traditionelle intraosseøse injektion, typisk i den proksimale skinneben eller distale lårben, til at modellere primære knogletumorer eller knoglemetastaser12. Vores primære mål var at afhjælpe en kendt begrænsning af denne teknik, dvs. tumorembolisering af lungen. Dette resulterer i indkapsling af disse emboliske tumorceller og "kunstig metastase", der ikke rekapitulerer den komplette metastatiske kaskade fra en etableret primær knogletumor, der metastaserer til lungerne 8,13. Dette ville også være situationen, når en etableret knoglemetastase spredes til et fjernt sted. Derudover blev denne teknik også udviklet til at producere en model af knoglemetastase, der ville sikre en større forekomst af engraftment og vækst af tumorer i knogler og på et ensartet sted sammenlignet med ortopiske eller intravaskulære injektionsteknikker. Denne model har forskellige fordele i forhold til disse beskrevne teknikker. Denne model indebærer kontrolleret, konsekvent levering af tumorceller ind i knoglen. Det undgår også kunstig lungemetastase efter lungeembolisering og etablerer en baseline ensartet undersøgelsespopulation. Der er fordelen ved stedspecifikke tumorer med denne model uden risiko for tidlige fjernelseskriterier som følge af primære tumorer eller metastaser til andre organer. Endelig har denne model stor anvendelighed til modifikation, herunder brugen af patientafledte xenotransplantater.
Den præsenterede model har ligheder med direkte cellesuspensionsinjektion i knoglen efter en kirurgisk tilgang efterfulgt af enten injektion gennem cortex eller levering i marvhulen efter at have lavet en lille defekt i cortex (med eller uden at udrulle medullært hulrum)8,14,15,16,17. Imidlertid gør implantationen af en tumorallograft denne teknik tydeligt anderledes. Derfor var formålet med denne rapport at demonstrere denne model af primære knogletumorer og knoglemetastaser fra solide tumorer, som overvinder mange begrænsninger af tidligere beskrevne modeller. Forskningsgrupper med erfaring inden for cellekultur, musemodeller, musebedøvelse og kirurgi samt museanatomi er godt rustet til at reproducere vores teknik til at modellere primære knogletumorer eller knoglemetastaser hos mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle beskrevne dyreforsøg blev godkendt af den institutionelle dyrepleje- og brugskomité ved University of Cambridge, Cambridge, Storbritannien.
1. Forberedelse af cellelinjer
- Dyrk cellelinjer i overensstemmelse med laboratoriets standardcellekulturprotokoller for traditionel cellekultur eller injektion i mus. Standardprotokoller, der anvendes her, er vækst i Dulbeccos modificerede Eagle's medium indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS), L-glutamin og penicillin / streptomycin (i det følgende kendt som komplet vækstmedium).
BEMÆRK: I dette eksperiment anvendes Abrams osteosarkomceller i Balb / c Foxn1 nu / nu-mus . Til brystkræftundersøgelser anvendes 4T1-celler i Balb/c-mus og EO771-celler i C57BL/6-mus. - Der dyrkes celler i enten ventilerede vævskulturkolber eller 6-brønds vævskulturplader ved 37 °C i 5 % CO2.
- Gennemgå cellelinjen af interesse og forbered cellerne til injektion, når cellerne når en sammenløb, der almindeligvis anvendes med injektion af disse celler i mus.
2. Dyr
- Brug Balb/c Foxn1 nu/nu-mus , der er mindst 6-8 uger gamle, til subkutan tumordannelse for at sikre, at dyrene er ude over den hurtige vækstfase og har opnået voksenalder og skeletmodenhed.
- Brug enten han- eller hunmus. Gør undtagelser, når du vælger hormonresponsive cellelinjer (f.eks. brystkræftceller hos hunmus og prostatacancerceller hos hanmus).
- Til xenograft-eksperimenter skal du bruge immunodeficiente athymiske nøgne mus baseret på, at cellelinjen er uforenelig med et intakt museimmunsystem under normale forhold.
- Til allograftforsøg med murine cellelinjer anbefales dette også baseret på forskellige musegenetiske og immune baggrunde. Til syngeneiske forsøg skal du dog bruge dyr af samme stamme som cellelinjen af interesse.
- Husdyr ved standardtætheder afhængigt af institutionens opdrætspolitik.
3. Subkutane tumorer
- Høst cellelinjer fra kultur ved trypsinisering og resuspender i sterilt fosfatbufret saltvand (PBS).
- Vurder cellelevedygtighed og bestem celletætheden ved hjælp af trypanblå udelukkelsesmetode. Brug et hæmocytometer eller en automatiseret celletæller til at tælle cellerne. En minimum celle levedygtighed på 90% skal anvendes til injektion i mus for at skabe subkutane tumorer.
- Celletætheden justeres for at injicere 1-2 x 105 celler i et slutvolumen på 0,1 til 0,15 ml (100 til 150 μL) steril PBS. Hold cellerne på is indtil injektion.
- Alternativt pelletceller ved centrifugering ved 800 x g i 5 min. Supernatanten kasseres, og de pelleterede celler opslæmmes igen i ufortyndet sterilt kældermembranmatrixmedium for at opnå 1-2 x 105 celler i et slutvolumen på 0,1 til 0,15 ml (100 til 150 μl). Hold cellerne på is indtil videre brug.
- Bedøv mus, der skal bruges til subkutan tumorvækst med isofluran i iltbedøvelse. Brug en induktionsdosis på 5 % isofluran i 2 l/min oxygen og en vedligeholdelsesdosis på 2-3 % isofluran i 2 l/min oxygen. Kontroller for manglen på blink- eller pedalreflekser, før du fortsætter videre.
BEMÆRK: Isofluran er et inhalationsbedøvelsesmiddel. Brug isofluran i et godt ventileret område med passende skyllesystemer og frie gasopsamlingssystemer. Rådfør dig med det institutionelle veterinærpersonale for at udvikle en plan for anæstesiinduktion, vedligeholdelse og overvågning og sikre, at laboratoriepersonalet har passende uddannelse i anæstesiovervågning og håndtering af inhalationsanæstetiske midler. - Fjern hår fra dorsalområdet i thoraxen eller maven hos bedøvede mus med depileringsopløsning eller med en elektrisk klipper. Depilating opløsning foretrækkes for at minimere potentielle traumer på huden. Spring dette trin over, hvis du bruger athymiske nøgne mus.
- Rengør det forberedte område med en 70% ethanolserviet inden injektion af cellesuspensionen.
- Brug en 1 ml tuberkulinsprøjte med en 27 G kanyle til at injicere celler subkutant over brystkassens eller mavens dorsale område, så de ikke påvirkes af skulderbladenes bevægelse. Alternativt injiceres cellerne subkutant som en suspension i kommercielt tilgængelig ekstracellulær matrix.
BEMÆRK: Injektion i kommercielt tilgængelig ekstracellulær matrix vil begrænse migrationen af cellesuspensionen i det subkutane rum, fordi disse matricer størkner ved stuetemperatur. - Gendan musene på en varmepude i individuelle bur, indtil ambulant. Mus kan derefter placeres i deres normale bure med rent, tørt strøelse.
- Overvåg størrelsen af den subkutane tumor, der ligger over den dorsale thorax eller abdomen med en tykkelse, og mål kropsvægt ugentligt for at sikre, at de subkutane tumorer ikke sårdanner, eller mus opfylder kriterierne for tidlig fjernelse som fastlagt af institutionernes udvalg for dyrepleje og brug. En maksimal tumorstørrelse på 15 mm i enhver dimension anbefales for at reducere risikoen for hudsår eller central tumornekrose.
BEMÆRK: Se lokale retningslinjer for at bestemme maksimalt tilladt tumorstørrelse / volumen. - Aflive mus, der bærer subkutane tumorer efter tre til fire uger ved CO2 -indånding efterfulgt af cervikal dislokation. Følg institutionens acceptable politikker for musedødshjælp.
- Høst subkutane tumorer ved hjælp af aseptisk kirurgisk teknik. Steriliser huden, der ligger over tumoren som før, med 70% ethanol efter fjernelse af håret (hvis relevant). Skær gennem huden overliggende tumoren med et # 15 skalpelblad (med eller uden skalpelbladhåndtag). Dissekere tumoren skarpt fra det omgivende vedhæftede bløde væv med et par sterile kirurgiske saks.
- Placer tumoren i 6-brønds vævskulturplader, der indeholder komplet vækstmedium og hakket i flere små fragmenter af forudbestemt størrelse (~ 0.6 mm x 0.6 mm x 0.6 mm - 0.25 mm3 op til 1 mm x 1 mm x 1 mm - 1 mm3) med et # 15 skalpelblad (med eller uden skalpelbladhåndtag).
- Oprethold tumorfragmenter i sterilt komplet vækstmedium ved stuetemperatur indtil tidspunktet for intratibiel implantation. For cellelinjer, der bærer luciferase eller fluorescerende reportergener, skal du bruge ex-vivo bioluminescerende eller fluorescerende billeddannelse for at bekræfte tumorlevedygtighed forud for intratibiel implantation i mus.
- Til kryopræservering anbringes flere fragmenter i samme cryovial i komplet vækstmedium suppleret med 20 % FBS og 10 % dimethylsulfoxid (DMSO). Fryses gradvist ved hjælp af et kommercielt kryopræserveringssystem ved –80 °C og opbevares på lang sigt i flydende nitrogen. Bevar tumorfragmenter til efterfølgende analyse, men ikke til fremtidig implantation, ved snapfrysning ved hjælp af flydende nitrogennedsænkning. Opbevar disse frosne tumorfragmenter på lang sigt ved –80 °C.
BEMÆRK: Det er tidligere blevet rapporteret, at snapfrosne tumorer ikke vil indpode og vokse in vivo8.
4. Kirurgisk implantation af subkutane tumorfragmenter
- Bring friske eller kryopræserverede fragmenter af subkutan tumor til stuetemperatur i komplet vækstmedium før kirurgisk implantation.
- Bedøv mus af den pågældende stamme ved hjælp af isofluran i iltbedøvelse som beskrevet i afsnit 3. Kontroller for manglen på pedalreflekser, før du fortsætter. Subkutan buprenorphin administreres i en dosis på 0,02-0,05 mg/kg for at tilvejebringe perioperativ analgesi. Dette kan gentages hver 6-8 timer i den postoperative periode, hvis det er nødvendigt.
- Fjern hår på højre knæled og proksimal skinneben i bagbenet med depileringsopløsning for at minimere det potentielle traume på huden.
- Skrub det forberedte område med kirurgisk antiseptisk middel. Skrub først med en 70% ethanolpind og skrub derefter med skiftevis chlorhexidin og saltvandskrubbe.
- Visualiser den proksimale skinneben som regionen, der bare er distal til knæleddet, mens du bøjer og strækker leddet.
- Opret et 3-4 mm snit på niveauet af den proksimale skinneben på det mediale aspekt af lemmen med et # 15 skalpelblad (med eller uden skalpelbladhåndtag). Skær gennem huden og subkutant væv for at udsætte den mediale cortex i den proksimale skinneben.
- Tryk let med spidsen af en 25 G nål, mens du også roterer spidsen for at skabe et lille hul i den mediale cortex i den proksimale skinneben. Gør dette hul ca. 2 mm distalt til knæleddet på et punkt lige langt mellem kraniale og kaudale tibiale cortexer. Vælg nålestørrelsen afhængigt af tumorfragmenternes størrelse.
- Brug sterile tang til at afhente og indsætte tumorfragmenterne i medullært hulrum i den proksimale tibia. Brug en 27 til 30 G nål til at manipulere tumorfragmentet ind i medullær kanal. Afhængigt af størrelsen af tumorfragmenterne implanteres mindst 0,5 mm3 total tumorvolumen i hver skinneben. Dette kan kræve implantation af 1 eller flere tumorfragmenter afhængigt af størrelsen af tumorfragmenter oprettet.
BEMÆRK: Ændringer for at forhindre eller begrænse forskydning af transplantatet uden for knoglen ville være placering af knoglevoks eller knoglecement i knogledefekten eller enten gelskum eller et subkutant fedttransplantat over hullet i knoglen. - Påfør hudkanterne med sterilt flydende vævslim eller en enkelt hudsutur. Brug ikke sårklemmer på dette websted. Vær forsigtig, hvis du bruger fluorescensbilleddannelse i den postoperative periode, da både vævslim og sutur har potentialet til at fluorescere.
- Gendan musene på en varmepude i individuelle bur, indtil ambulant.
5. Seriel vurdering og vurdering af slutpunkt
- Bedøv mus ved hjælp af isofluran i iltbedøvelse som beskrevet tidligere.
- Evaluer tibial tumorvækst ikke-invasivt ved enten ugentlig digital radiografi, bioluminescens eller fluorescensbilleddannelse (hvis du bruger celler, der udtrykker luciferase eller et fluorescerende reportergen). Caliper målinger af lemmen på implantationsstedet kan også udføres hos vågne mus.
- Ud over den traditionelle overvågning af tumorbærende mus (kropsvægt, aktivitetsniveau, respirationsfrekvens, pleje, kropsholdning, mentation og adfærd) overvåger mus ugentligt for tegn på halthed i bagbenene, hævelse og infektion på operationsstedet.
- Overvåg hudens kirurgiske sår i de første 10-14 dage for overdreven rødme, hævelse, dræning og sårdehiscens, indtil hudsåret er helet. Efter 4-5 uger evalueres mus i overensstemmelse med evalueringen af undersøgelsesresultatet enten i live eller efter eutanasi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et positivt resultat ville være forbundet med tumor engraftment og progressiv tumorvækst over tid. Afhængigt af tumortypen kan intraosseøs tumorvækst være forbundet med progressiv halthed i bagbenene, men mange tumorer forårsager ikke halthed på trods af tegn på ledsagende knoglesygdom. Vellykket engraftment blev dokumenteret med avanceret billeddannelse, hvorved der ville være progressive radiografiske, μCT- eller μMRI-ændringer i det proksimale skinneben forbundet med knoglefænotypen af cellelinjen af interesse (osteolytisk, osteoblastisk eller blandet osteolytisk / osteoblastisk metastase) (figur 1)8. I vores tidligere rapport var den kortikale defekt, der blev skabt til tumortransplantatimplantation, synlig i den proksimale skinneben 1 uge efter implantation (figur 1A). I uge 2 var der synlig osteolyse og knoglemodellering ved siden af den kortikale defekt. Fra uge 2-5 var der progressiv knogledestruktion og dannelse af ny knogle forbundet med tumorindgravering og vækst (figur 1B-E). For cellelinjer med reportergener vil knogleændringer ledsages af stigninger i fluorescens eller bioluminescensbilleddannelsesoutput over tid. Akut halthed kan være en indikator for forestående eller faktisk patologisk knoglebrud, hvilket kræver øjeblikkelig og omhyggelig radiografisk evaluering af musen og muligvis tidlig fjernelse fra undersøgelsen. Afhængigt af tumorcellelinjen, der undersøges, kan knogleødelæggelse forekomme hurtigt, langt foran metastase. Dette er af særlig betydning i undersøgelser, der involverer primære knogletumorer, da mus muligvis skal fjernes fra undersøgelsen forud for udvikling af klinisk relevant metastase, nemlig til lungen. I disse tilfælde anbefales kirurgisk amputation af det tumorbærende lem for at muliggøre undersøgelse af minimal resterende sygdom og efterfølgende metastase ved anvendelse af primære knogletumorer, som vi tidligere har rapporteret 4,8. Mens fuldstændig amputation af bagben hos mennesker ikke typisk udføres, er dette standard for pleje inden for veterinærmedicin, hvoraf lighederne i de kliniske og molekylære egenskaber ved osteosarkom hos mennesker og hunde er veldokumenterede. Amputation af bagben hos mus er derfor relevant for mange dyrecellelinjer. Derudover er amputation en levedygtig behandlingsmetode hos mus, da lembesparende procedurer, der anvendes til mennesker, ikke kan opnås hos små gnavere som mus. Hos mus, der bærer primære knogletumorer, kan appetitløshed, progressivt vægttab, generel dårlig kropstilstand og åndedrætsbesvær (øget hastighed eller indsats) signalere udviklingen af tumormetastaser til lungen og andre organer. Bekræftelse ved bioluminescerende billeddannelse, μCT eller μMRI-billeddannelse anbefales for at bekræfte metastase, og berørte dyr bør aflives.
Et negativt resultat, sandsynligvis som følge af manglende tumorindkapsling, bør mistænkes, hvis der ikke er tegn på progressive ændringer (osteolytiske, osteoblastiske eller blandede osteolytiske/osteoblastiske læsioner, afhængigt af cellelinjen, der undersøges) på radiografi eller μCT-undersøgelse af det implanterede skinneben. For cellelinjer, der bærer reportergener, vil manglen på en stigning i fluorescens eller bioluminescenssignalering over tid ved optisk billeddannelse også understøtte en konklusion om, at tumoren ikke har indpodet. Manglende eller dårlig engraftment kan være forbundet med infektion på operationsstedet. Dette vil dog udvise specifikke kliniske tegn såsom rødme, hævelse eller udflåd oftest i den tidlige postoperative periode (første 1-2 uger efter operationen). Dyr kan potentielt også være febril og udvise manglende aktivitet eller krumbøjet kropsholdning i den tidlige postoperative periode på grund af infektion på operationsstedet. Høst og vedligeholdelse af allotransplantaterne under sterile forhold under forberedelse og korrekt steril forberedelse af lemmerne, steril intraoperativ teknik og fuldstændig sårlukning minimerer sandsynligheden for en postoperativ kirurgisk sårkomplikation, der resulterer i infektion og svigt i tumorindkapsling.
I vores tidligere rapport8, når vi inkluderede både de rapporterede pilot- og endelige undersøgelser, udviklede 16 ud af 16 mus (100%) implanteret med osteosarkomfragmenter sig til osteolytiske knoglelæsioner, og 14 ud af disse 16 mus (88%) udviklede metastaser. Alle metastaser blev observeret til lungen og diagnosticeret ved histologi så tidligt som 3 uger efter implantation8. Yderligere dyr obduceret ved 1 (n = 2) og 2 (n = 2) uger efter implantation afslørede ingen tegn på lungemetastaser.
Figur 1: Seriel radiografi. Seriel radiografi (i rækkefølge) udført ugentligt ved (A) 1, (B) 2, (C) 3, (D) 4 og (E) 5 uger efter intratibiel implantation af en subkutan tumorallograft ved anvendelse af en primær knogletumorcellelinje (osteosarkom). Over tid var der progressiv knogleødelæggelse og dannelsen af ny knogle forbundet med tumorindgravering og vækst. Dette tal er ændret med tilladelse fra ref8. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne rapport dokumenterer vores model til at skabe primære knogletumorer eller knoglemetastaser efter intratibiel implantation af en tumorallograft. Vi mener, at der er flere kritiske skridt i denne proces. Der bør etableres et sikkert bedøvelsesplan for både subkutan injektion af tumorcellesuspensionen og intratibiel placering af de resulterende tumorfragmenter. Der bør være steril forberedelse af det kirurgiske sted til både fjernelse af det subkutane allotransplantat og intratibiel placering af allotransplantatet. Tumorallograftfragmenter bør skabes ensartet til efterfølgende intratibiel implantation. En passende størrelse defekt i den proksimale tibia bør oprettes til implantation af tumorfragmenter. Det kirurgiske hudsår skal lukkes fuldstændigt for at reducere risikoen for postoperative sårkomplikationer. Det sidste kritiske trin er, at hvis ekstracellulær matrix anvendes som en del af tumorcellesuspensionen til subkutan injektion, skal producentens anbefalede håndteringsinstruktioner anvendes for at undgå størkning af suspensionen før injektion. Korrekt steril forberedelse af lemmen, steril intraoperativ teknik og fuldstændig sårlukning minimerer sandsynligheden for en postoperativ kirurgisk sårkomplikation.
Funktioner af den implanterede tumor og den kirurgiske teknik er afgørende for vellykkede og reproducerbare resultater til inkorporering i din undersøgelsespopulation. Indledningsvis skal det verificeres, at tumorxenograft / allograft implanteres direkte i skinnebenets medullære hulrum, og sørg for, at tumorvævet er helt inde i knoglen. Ændringer for at forhindre eller begrænse forskydning af transplantatet uden for knoglen ville oprindeligt være placering af knoglevoks eller knoglecement i knogledefekten eller enten gelskum eller et subkutant fedttransplantat over hullet i knoglen. Et alternativ ville være at indsætte tumorallograften gennem et hul på det laterale aspekt af den proksimale tibia, skabt under kranial tibial muskel. Tilstedeværelsen af kranial tibial muskel ville derefter tjene som et biologisk dække over knogledefekten, hvilket begrænser potentiel forskydning af tumorallograften. Dette er imidlertid en mere aggressiv kirurgisk tilgang med potentiale for neuromuskulært traume på det laterale aspekt af det proksimale skinneben. Der skal udvises forsigtighed for at sikre, at tumorallotransplantaterne er skabt til at være af ensartet størrelse før implantation. Når det er sagt, bør tumorallotransplantater ikke overstige 1 mm i nogen dimension, da større tumorstørrelser i ethvert biologisk system er mindre tilbøjelige til at engraft end mindre transplantater, når der ikke er en direkte, øjeblikkelig vaskulær forsyning til transplantatet på implantationstidspunktet. Vi har rapporteret vellykkede resultater med et endeligt implanteret tumorvolumen på 0,5 mm 3, men forventer, at kombinerede tumorfragmentvolumener op til 1 mm3 vil opnå vellykkede resultater. Imidlertid er det maksimale implanterbare tumorfragmentvolumen ikke blevet bestemt. Sammenlignet med kryopræserveret væv er friske tumorxenotransplantater og allotransplantater mere tilbøjelige til at overleve, selvom vi ikke har observeret et problem med praksis med at bruge omhyggeligt kryopræserverede tumorallotransplantater. Snapfrosne allotransplantater bør ikke implanteres. Derudover vil dissektion af kapslen og den ydre del af den subkutane tumor forhindre ethvert bidrag fra dette lag af tumoren, som stort set er fibrøst og vaskulært med et signifikant immuninfiltrat snarere end stort set består af tumorceller korrekt. En alternativ metode til at skabe tumorallotransplantater fra den større tumormasse direkte med et skalpelblad er ved hjælp af en lille biopsinål, der skaber en cylindrisk tumor "kerne", der derefter kan skæres til en foruddefineret længde før implantation. Brug af en biopsinål eller kernebiopsistans kan være gavnlig for at skabe ensartede tumorfragmenter til implantation, for efter at to ensartede dimensioner (bredde og dybde) er blevet skabt ved biopsiprocessen, kan de derefter skæres til en passende længde før implantation. Hvis reportergener såsom luciferase eller fluorescerende proteiner anvendes i de implanterede tumorceller, vil evaluering af tumorfragmenter på implantationstidspunktet eller 1 uge efter implantation indikere relativt bidrag fra tumorceller i de implanterede tumorfragmenter samt levedygtighed.
Som med enhver procedure er der begrænsninger ud over vores rapporterede fordele ved denne teknik. Metastase er en flertrinsproces, der kræver, at en celle fra sin primære placering med succes udfører invasion i og migration gennem den ekstracellulære matrix, intravaserer tumorens blodforsyning, overlever i omløb, indtil den ankommer til sin endelige metastatiske destination, ekstravaserer ind i selve organet og derefter enten forbliver i sovende tilstand eller spredes for at skabe en metastatisk læsion, og ændring af den normale vævsarkitektur til at blive en klinisk påviselig metastase18. I øjeblikket anvendte musemodeller af knoglemetastase er i vid udstrækning afhængige af enten direkte ortopisk injektion af tumorceller i det normale sted for den primære tumor, intravaskulær injektion i hjertets venstre ventrikel eller perifert ind i halevenerne (laterale eller dorsale kaudale vener) eller direkte intraosseøs injektion af tumorcellesuspensionen3. Imidlertid har nylige rapporter, der forsøger at forbedre knoglemetastasemodeller, anbefalet injektion i illiac, kaudale eller lårbensarterier 19,20,21. Alle disse metoder inkorporerer et eller flere trin inden for knoglemetastatisk kaskade, undtagen direkte intraosseøs injektion eller i vores tilfælde implantation af en tumorallograft, som kun modellerer endevævsmodifikation. Derfor er dette en iboende begrænsning af vores teknik. En yderligere begrænsning er, at som det i øjeblikket er beskrevet, kræver det formering af allotransplantaterne i en mellemliggende musevært, hvilket kræver brug af yderligere mus og resulterer i implantation af en tumor, der ikke er 100% rene tumorceller. Allograften vil have noget stromalt bidrag fra tumorer, der vokser på et subkutant sted. Et potentielt alternativ til at minimere dette subkutane stromale bidrag ville være injektion af celler subkutant i et biologisk substrat, såsom en ekstracellulær matrix eller stillads. Alternativt kan ortopisk injektion i tumorens primære sted efterfulgt af tumorfjernelse og transplantatpræparation udføres.
Metoden skitseret i denne rapport har vigtige fordele sammenlignet med eksisterende metoder til modellering af primære knogletumorer eller knoglemetastaser efter direkte intraosseøs injektion af tumorceller. Som diskuteret har vi og andre observeret direkte embolisering af lungerne og lejlighedsvis øjeblikkelig død efter intratibiel injektion af en cellesuspension 8,13. Dette skyldes en trykinjektion af tumorceller i marvhulen, hvorefter tumorceller kommer ind i den perifere blodforsyning gennem knoglemarvsvaskulære sinusoider og transporteres til lungen ved venøs tilbagevenden. Disse hændelser er mekanisk sammenlignelige med dem, der observeres med lunge- eller venøs tromboemboli forbundet med trykplacering af implantater i marvhulen forbundet med total ledartroplastik hos mennesker og dyr. Vi og andre antager, at dette emboliske fænomen i lungerne kan være cellelinjespecifikt (upublicerede observationer). Imidlertid er der rapporteret meget detaljerede skridt til at begrænse dannelsen af disse emboliske kunstige metastaser12. Indledningsvis bør der være tilstrækkelig trypsinisering og oprettelse af en ensartet enkeltcellesuspension til injektion, som skal opbevares på is for at forhindre celleklumpning. Nålen skal placeres korrekt gennem den proksimale tibiale vækstplade, hvorefter små injektionsvolumener (~ 10 μL) og modstandsfrie injektioner i marvhulen skal udføres. På trods af dette kan tumorcelleafgivelse til lungerne og også til andre organer let observeres ved bioluminescensbilleddannelse efter intraosseøse og intravaskulære injektionsteknikker, hvilket tyder på, at det er muligt, at celler, der genererer dette bioluminescerende signal i lungerne og andre organer, kan give anledning til fjern metastase (upublicerede observationer)3. Vi har fundet ud af, at en anden fordel ved denne teknik er, at en enkelt tumor vokser på et ensartet knoglested inden for undersøgelsespopulationen, hvilket reducerer variationen fra dyr til dyr. Dette muliggør etablering af en ensartet undersøgelsespopulation og let sammenligning mellem behandlingsgrupper. Dette er i modsætning til knoglemetastaser, der udvikler sig efter ortopisk eller intravaskulær injektion, hvor det er muligt for celler at metastasere til forskellige skeletsteder og vokse med forskellig kinetik, hvilket gør sammenligninger mellem studiegrupper udfordrende. Tumorvækst på et anatomisk sted efter implantation af vores tumorallotransplantater undgår også muligheden for, at mus fjernes på grund af metastase til andre organsystemer eller primær tumorbyrde, som det kan ses med intravaskulære og ortopiske injektionsteknikker. Derudover har vi observeret en 100% engraftment efter tumorallograftimplantation, hvilket understøtter en ensartet undersøgelsespopulation og undgår unødvendig brug af yderligere mus for at opnå passende prøvestørrelsestal. Dette overvinder også begrænsningen af ufuldstændig og unøjagtig injektion efter perkutan injektion af tumorcellesuspensioner i knogler.
Denne teknik har en stor grad af alsidighed, hvilket har resulteret i ændringer, der i øjeblikket bruges i vores forskning og har potentiale til stor nytte for fremtidige applikationer. I første omgang, mens vi anvender den proksimale skinneben som vores intra-osseøse implantationssted, kan andre almindelige steder med primære knogletumorer eller knoglemetastaser let anvendes, herunder men ikke begrænset til den distale lårben og proksimale humerus. Den kirurgiske tilgang til disse steder såvel som til områder som bækken og rygsøjle kræver imidlertid en gradvist mere omfattende kirurgisk tilgang sammenlignet med den proksimale skinneben. Derudover er steder som bækken, rygsøjle, kranium, radius og ulna ikke nydt godt af tilstrækkelig knoglebestand til tumorimplantation. For knogleinvasive maligniteter, såsom med orale tumorer, kan placering af tumorallotransplantaterne ved siden af knoglen eller i oropharynx også rekapitulere progressionen af invasive tumorer 3,22. In vitro og in vivo eksperimenter anvender ofte co-kultur eller co-injektion teknikker til at bestemme virkningerne af forskellige celletyper på en celletype af interesse. Derfor eksisterer potentialet for injektion af to eller flere celletyper samtidigt for at skabe de subkutane tumorer, som derefter kan implanteres i knoglen ved hjælp af denne teknik. Genetisk modificerede celler kan bruges alene eller i kombination med andre normale eller genetisk modificerede celler til at skabe tumorallotransplantaterne. Med den stigende interesse for præcisionsmedicin og oprettelse af in vitro- og in vivo-modeller af kræft hos mennesker vinder patientafledt xenografttransplantation i mus popularitet. For nylig er en model af brystkræftknoglemetastase blevet beskrevet, hvor patientafledte xenotransplantater implanteret ortopisk metastaseret til humane knogleskiver implanteret subkutant i nøgne mus23. Ud fra dette kunne patientafledte xenotransplantater implanteres direkte i knoglen ved hjælp af vores model uden behov for en mellemliggende vært til subkutan formering. Dette ville muliggøre hurtig evaluering af tumorkinetik og evne til at evaluere flere behandlingskombinationer potentielt fra kun en enkelt patientbiopsi, hvilket ikke kræver en stor tumormasse til allograftpræparation. Den stigende brug af organoider i kræftforskning kunne også anvendes i vores model24. Dette ville kræve injektion af nål eller pipette af disse celleaggregater gennem hullet i tibial cortex. Vi vil derfor anbefale forsegling af den kortikale defekt (som diskuteret ovenfor) for at begrænse muligheden for organoid migration uden for knogle- og marvhulen. Som vi har udført, kan celler mærkes og spores ved optisk (bioluminescens eller fluorescens) eller avanceret (digital radiografi, μCT eller μMRI) billeddannelse, der muliggør vurdering af tumorvækst over tid. Dette har også fordelen ved at minimere antallet af dyr, da de samme dyr afbildes over tid.
Sammenfattende demonstrerer denne rapport vores teknik modellering af primære knogletumorer og knoglemetastaser ved hjælp af solid tumortransplantatimplantation i knogle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr. Hildreth blev finansieret af NIH under tildelingsnummer K01OD026527. Indhold er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis NIH's officielle synspunkter.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender det kritiske bidrag fra Dr. Beth Chaffee, DVM, PhD, DACVP til udviklingen af denne teknik.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #15 scalpel blade | Henry Schein Ltd. | 75614 | None |
| 6-well tissue culture plates | Thermo Fisher Scientific | 10578911 | Used for mincing tumor pieces. Can also be used for cell culture |
| Abrams osteosarcoma cell line | Not applicable | Not applicable | None |
| Anesthesia machine with isoflurane vaporiser and oxygen tank(s) | VetEquip | 901805 | None |
| Animal weighing scale | Kent Scientific | SCL- 1015 | None |
| BALB/c nude mouse (nu/nu) | Charles River Ltd. | NA | 6-8 weeks of age. Male or female mice |
| Bone cement | Depuy Synthes | 160504 | Optional use instead of bone wax |
| Bone wax | Ethicon | W31G | Optional |
| Buprenorphine | Animalcare Ltd. | N/A | Buprecare 0.3 mg/ml Solution for Injection for Dogs and Cats |
| Carbon dioxide euthanasia station | N/A | N/A | Should be provided within animal facility |
| Cell culture incubator set at 37 °C and 5% carbon dioxide | Heraeus | Various | None |
| Chlorhexidine surgical scrub | Vetoquinol | 411412 | None |
| Cryovials (2 ml) | Thermo Scientific Nalgene | 5000-0020 | Optional if cryopreserving tumor fragments |
| D-luciferin (Firefly), potassium salt | Perkin Elmer | 122799 | Optional if cell line of interest has a bioluminescent reporter gene |
| Digital caliper | Mitutoyo | 500-181-30 | Can be manual |
| Digital microradiography cabinet | Faxitron Bioptics, LLC | MX-20 | Optional to evaluate bone response to tumor growth |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | 1371171000 | Optional if cryopreserving tumor fragments |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | None |
| Ethanol (70%) | Sigma Aldrich | 2483 | None |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | None |
| Forceps, Dumont | Fine Science Tools, Inc. | 11200-33 | None |
| Freezer (– 80 °C) | Sanyo | MDF-794C | Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments |
| Hemocytometer | Thermo Fisher Scientific | 11704939 | Can also use automated cell counter, if available |
| Hypodermic needles (27 gauge) | Henry Schein Ltd. | DIS55510 | May also use 25G (DIS55509) and 30G (Catalog DIS599) needles |
| Ice | N/A | N/A | Ideally small pieces in a container for syringe and cell suspension storage |
| Iris scissors | Fine Science Tools, Inc. | 14084-08 | None |
| Isoflurane | Henry Schein Ltd. | 1182098 | None |
| IVIS Lumina III bioluminescence/fluorescence imaging system | Perkin Elmer | CLS136334 | Optional if cell line of interest has bioluminescent or fluorescent reporter genes |
| L-glutamine | Thermofisher scientifc | 25030081 | None |
| Liquid nitrogen | British Oxygen Corporation | NA | Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments |
| Liquid nitrogen dewar, 5 litres | Thermo Fisher Scientific | TY509X1 | Optional if cryopreserving tumor fragments |
| Matrigel® Matrix GFR, LDEV-Free, 5 ml | Corning Life Sciences | 356230 | Optional. Also available in 10 ml size (354230) |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002549 | Pellet cells at 1200 rpm for 5-6 minutes |
| Mr. Frosty freezing containiner | Fisher Scientific | 10110051 | Optional if cryopreserving tumor fragments |
| NAIR Hair remover lotion/oil | Thermo Fisher Scientific | NC0132811 | Can alternatively use an electric clipper with fine blade |
| Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | None |
| Scalpel handle, #7 Short | Fine Science Tools, Inc. | 10007-12 | User preference as long as it accepts #15 scalpel blade |
| Small animal heated pad | VetTech | HE006 | None |
| Stereomicroscope | GT Vision Ltd. | H600BV1 | None |
| Sterile phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Use for injections and also as part of the surgical scrub, alternating with chlorhexidine |
| Tissue adhesive (sterile) | 3M Corporation | 84-1469SB | Can alternatively use non-absorbable skin suture (6-0 size) |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | 5250061 | None |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | Use 0.05%-0.25% |
| Tuberculin syringe (1 ml with 0.1 ml gradations) | Becton Dickinson | 309659 | Slip tip preferred over Luer |
| Vented tissue culture flasks, T-75 | Corning Life Sciences | CLS3290 | Can also use smaller or larger flasks, as needed |
References
- Bryda, E. C. The Mighty Mouse: the impact of rodents on advances in biomedical research. Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).
- Vandamme, T. F. Use of rodents as models of human diseases. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 6 (1), 2-9 (2014).
- Simmons, J. K., et al.
- Wolfe, T. D., et al. Effect of zoledronic acid and amputation on bone invasion and lung metastasis of canine osteosarcoma in nude mice. Clinical and Experimental Metastasis. 28 (4), 377-389 (2011).
- Wang, R., et al. The Clinicopathological features and survival outcomes of patients with different metastatic sites in stage IV breast cancer. BMC Cancer. 19 (1), 1091 (2019).
- James, J. J., et al. metastases from breast carcinoma: histopathological - radiological correlations and prognostic features. British Journal of Cancer. 89 (4), 660-665 (2003).
- Pantel, K., Brakenhoff, R. H.
- Chaffee, B. K., Allen, M. J. A clinically relevant mouse model of canine osteosarcoma with spontaneous metastasis. In Vivo. 27 (5), 599-603 (2013).
- Munajat, I., Zulmi, W., Norazman, M. Z., Wan Faisham, W. I. Tumour volume and lung metastasis in patients with osteosarcoma. Journal of Orthopaedic Surgery (Hong Kong). 16 (2), 182-185 (2008).
- Huang, X., et al. Risk and clinicopathological features of osteosarcoma metastasis to the lung: A population-based study. Journal of Bone Oncology. 16, 100230 (2019).
- Li, W., Zhang, S. Survival of patients with primary osteosarcoma and lung metastases. Journal of BUON. 23 (5), 1500-1504 (2018).
- Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A.
- Maloney, C., et al. Intratibial Injection Causes Direct Pulmonary Seeding of Osteosarcoma Cells and Is Not a Spontaneous Model of Metastasis: A Mouse Osteosarcoma Model. Clinical Orthopedics and Related Research. 476 (7), 1514-1522 (2018).
- Dai, J., Hensel, J., Wang, N., Kruithof-de Julio, M., Shiozawa, Y. Mouse models for studying prostate cancer bone metastasis. BoneKey Reports. 5, 777 (2016).
- Marques da Costa, M. E., et al. Establishment and characterization of in vivo orthotopic bioluminescent xenograft models from human osteosarcoma cell lines in Swiss nude and NSG mice. Cancer Medicine. 7 (3), 665-676 (2018).
- Raheem, O., et al. A novel patient-derived intra-femoral xenograft model of bone metastatic prostate cancer that recapitulates mixed osteolytic and osteoblastic lesions. Journal of Translational Medicine. 9, 185 (2011).
- Sasaki, H., Iyer, S. V., Sasaki, K., Tawfik, O. W., Iwakuma, T. An improved intrafemoral injection with minimized leakage as an orthotopic mouse model of osteosarcoma. Analytical Biochemistry. 486, 70-74 (2015).
- Valastyan, S., Weinberg, R. A. Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms. Cell. 147 (2), 275-292 (2011).
- Yu, C., et al. Intra-iliac Artery Injection for Efficient and Selective Modeling of Microscopic Bone Metastasis. Journal of Visualized Experiments. (115), e53982 (2016).
- Kuchimaru, T., et al. A reliable murine model of bone metastasis by injecting cancer cells through caudal arteries. Nature Communications. 9 (1), 2981 (2018).
- Haley, H. R., et al. Enhanced Bone Metastases in Skeletally Immature Mice. Tomography. 4 (2), 84-93 (2018).
- Lei, Z. G., Ren, X. H., Wang, S. S., Liang, X. H., Tang, Y. L. Immunocompromised and immunocompetent mouse models for head and neck squamous cell carcinoma. Onco Targets and Therapy. 9, 545-555 (2016).
- Lefley, D., et al. Development of clinically relevant in vivo metastasis models using human bone discs and breast cancer patient-derived xenografts. Breast Cancer Research. 21 (1), 130 (2019).
- Tuveson, D., Clevers, H. Cancer modeling meets human organoid technology. Science. 364 (6444), 952-955 (2019).
