Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

التنشيط البصري الوراثي للمسارات الوراثية في شرائح الدماغ وتعديل الاستجابات بواسطة التخدير المتطاير

Published: July 23, 2020 doi: 10.3791/61333
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1
1Department of Anesthesiology, University of Wisconsin, 2Department of Anesthesiology, Rambam Health Care Campus, the Ruth and Bruce Rappaport Faculty of Medicine, Technion - Israel Institute of Technology

Summary

يمكن استخدام شرائح الدماغ خارج الجسم الحي لدراسة آثار التخدير المتطاير على الاستجابات المستحثة للمدخلات القريبة. يتم استخدام علم البصريات الوراثي لتنشيط القشرة المهادية والقشرية بشكل مستقل إلى القشرة المخية الجديدة غير الأولية ، ويتم تعديل الاستجابات المشبكية والشبكة باستخدام الأيزوفلوران.

Abstract

يؤثر التخدير على الوعي جزئيا من خلال أفعالهم على الدوائر القشرية المهادية. ومع ذلك ، فإن مدى تأثير التخدير المتطاير على المكونات الخلوية والشبكية المتميزة لهذه الدوائر لا يزال غير واضح. توفر شرائح الدماغ خارج الجسم الحي وسيلة يمكن للمحققين من خلالها التحقيق في المكونات المنفصلة للشبكات المعقدة وفك تشابك الآليات المحتملة الكامنة وراء آثار التخدير المتطاير على الاستجابات المستحثة. لعزل التأثيرات الدوائية المحتملة الخاصة بنوع الخلية ومسارها في شرائح الدماغ ، يجب أن يكون الباحثون قادرين على تنشيط مسارات الألياف القريبة بشكل مستقل ، وتحديد المجموعات غير المتداخلة من الخلايا ، وتطبيق التخدير المتطاير على الأنسجة في محلول مائي. في هذا البروتوكول ، يتم وصف طرق لقياس الاستجابات المستحثة بصريا لمسارين مستقلين مرتبطين بالقشرة المخية الجديدة في شرائح الدماغ خارج الجسم الحي. يتم تسجيل الاستجابات خارج الخلية لفحص نشاط الشبكة ويتم إجراء تسجيلات مشبك رقعة الخلية الكاملة المستهدفة في الخلايا العصبية الداخلية الإيجابية للسوماتوستاتين والبارفالبومين. يتم وصف توصيل تركيزات الأيزوفلوران ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية عبر السائل الشوكي الدماغي الاصطناعي لتعديل الاستجابات الخلوية والشبكية.

Introduction

تم استخدام التخدير المتطاير في كل مكان في مجموعة متنوعة من الإعدادات السريرية والأكاديمية لأكثر من قرن. فئات متميزة من التخدير لها أهداف جزيئية فريدة من نوعها ، وغالبا ما تكون غير متداخلة1،2،3 ، ولكن جميعها تقريبا تنتج فقدان الوعي. في حين أن آثارها السلوكية يمكن التنبؤ بها تماما ، فإن الآليات التي يحفز بها التخدير فقدان الوعي غير معروفة إلى حد كبير. قد يؤثر التخدير في نهاية المطاف على كل من مستوى الوعي ومحتوياته من خلال الإجراءات على الدوائر القشرية ، مما يعطل تكامل المعلومات في جميع أنحاء التسلسل الهرمي القشري4،5،6،7،8،9. على نطاق أوسع ، قد يلعب تعديل الدوائر القشرية دورا في10 أو دوائيا 11 حالة وعي متغيرة تجريبيا ، وقد يكون متورطا أيضا في النوم 12 وفي الاضطرابات الفسيولوجية المرضية للوعي 13,14.

يمكن أن يعزى مراوغة الآليات الكامنة وراء فقدان الوعي وعودته أثناء التخدير جزئيا إلى الإجراءات غير الخطية والتآزرية للتخدير على المستويات الخلوية والشبكة والأنظمة15. على سبيل المثال ، يثبط الأيزوفلوران النشاط داخل مناطق الدماغ المختارة 16،17،18 ، ويضعف الاتصال بين مناطق الدماغ البعيدة 19،20،21،22،23 ، ويقلل من الاستجابات المشبكية بطريقة خاصة بالمسار24،25 . ما هي آثار التخدير ، من الجزيئي إلى مستوى الأنظمة ، ضرورية أو كافية لإحداث فقدان الوعي لا تزال غير واضحة. بالإضافة إلى التحقيقات السريرية الموضوعية للوعي باستخدام التقنيات غير الغازية19،20،26 ، من المهم أن يسعى التجريبيون إلى فك تشابك التفاعلات الخلوية والشبكة المتميزة التي تخدم التجربة الواعية.

من خلال تبسيط التفاعلات المعقدة الموجودة في الدماغ السليم ، تسمح شرائح الدماغ خارج الجسم الحي بدراسة المكونات المعزولة للأنظمة الديناميكية للدماغ9. يجمع إعداد الشريحة المخفضة بين فوائد الهياكل التشريحية السليمة نسبيا للدوائر العصبية المحلية مع تنوع التلاعب في المختبر. ومع ذلك ، حتى وقت قريب ، حالت القيود المنهجية دون دراسة الخصائص المتشابكة والدائرة للمدخلات طويلة المدى في شرائح الدماغ27,28 ؛ جعل المسار المتعرج لمسالك الألياف القشرية تنشيط المسارات المستقلة القريبة مستحيلا عن طريق التحفيز الكهربائي.

يمثل التحقيق في آثار عوامل التخدير على مستحضرات شريحة الدماغ تحديات إضافية. في غياب الجهاز التنفسي والدورة الدموية السليم ، يجب تطبيق عوامل التخدير على الحمام ، ومطابقة التركيزات بعناية مع تركيزات موقع التأثير المقدرة. بالنسبة للعديد من عوامل التخدير الوريدي ، فإن المعدل البطيء للتوازن في الأنسجة يجعل التحقيقات الدوائية التقليدية شاقة29,30. يعد التحقيق في تأثيرات تخدير الغاز المتطاير في الاستعدادات خارج الجسم الحي أكثر قابلية للسحب ، ولكنه يمثل أيضا تحديات. وتشمل هذه تحويل جرعات الضغط الجزئي المستنشقة إلى تركيزات مائية ، والحاجة إلى نظام توصيل معدل للدواء إلى الأنسجة عبر السائل الشوكي الدماغي الاصطناعي31.

هنا ، يتم وصف الطرق التي يمكن للمحققين من خلالها الاستفادة من الخصائص الفيزيائية والكيميائية الموثقة جيدا للإيزوفلوران المخدر المتطاير لتوصيل الدواء إلى شرائح الدماغ خارج الجسم الحي ، وتنشيط المدخلات الخاصة بالمسار والطبقة إلى منطقة قشرية ذات أهمية ذات دقة مكانية زمانية عالية ، وإجراء تسجيلات صفائحية متزامنة وتسجيلات مشبك التصحيح المستهدفة من مجموعات مختارة من الخلايا العصبية. تسمح هذه الإجراءات مجتمعة للباحثين بقياس التغيرات المتطايرة الناجمة عن التخدير في العديد من خصائص الاستجابة الكهروفسيولوجية التي يمكن ملاحظتها ، من المشبكي إلى مستوى الشبكة المحلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات الموصوفة في هذا البروتوكول من قبل كلية الطب بجامعة ويسكونسن ماديسون ولجنة رعاية واستخدام الحيوانات والصحة العامة.

1. تربية الفئران للتعبير عن بروتين مراسل الفلورسنت في المجموعات الفرعية interneuron

  1. قم بإقران الفأر الذكري المتجانس ، المعتمد على Cre ، مع أنثى SOM-Cre متماثلة الزيجوت أو أنثى PV-Cre متماثلة الزيجوت.
    ملاحظة: يمكن استهداف مجموعات عصبية محددة أخرى باستخدام خطوط Cre المناسبة.
  2. اسمح للنسل غير المتجانس بالنضج إلى عمر 3 أسابيع على الأقل قبل المتابعة. بالنسبة للتجارب الموصوفة هنا ، فإن التنميط الجيني ليس ضروريا ، حيث ينتج الآباء المتجانسون ذرية كلها متغايرة الزيجوت لكل من كري ريكومبيناز الخاصة بنوع الخلية وأليلات المراسل المعتمدة على كري.

2. إجراء الحقن المجسمة من جانب واحد من بناء الفيروسية

  1. اضبط إعدادات مجتذب الماصة الدقيقة لماصات الحقن كما هو موضح في دليل مستخدم الأداة (انظر الجدول 1 للاطلاع على الإعدادات الموصى بها). اسحب الماصة الزجاجية الدقيقة.
  2. كسر طرف الطرف الحاد من ماصة بحيث يكون قطر الطرف حوالي 30 ميكرومتر مع الحد الأدنى من تفتق أكثر من عدة ملليمترات.
  3. باستخدام إجراءات موثقة سابقا ، حدد العيار المناسب وحجم الفيروس المراد حقنه. في التجارب الموصوفة هنا ، حقن 1.0 ميكرولتر (العيار: 3.1-5.7 وحدة حرارية بريطانية / مل) حقن من جانب واحد نتائج جيدة.
  4. ردم الحجم الكامل للماصة بالزيوت المعدنية. قم بتحميل الماصة على المحقنة الدقيقة وتدفق كمية صغيرة من الزيت المعدني عبر الطرف لضمان عدم انسداد الطرف.
  5. Frontfill ما لا يقل عن 1.0 ميكرولتر من البناء الفيروسي. كان الناقل الفيروسي المرتبط بالغدي المؤتلف المستخدم في هذه التجارب هو AAV2-hSyn-hChR2 (H134R)-EYFP.
  6. رتب ستارة معقمة في منطقة جراحية. تعقيم أدوات الإجراء التجسيمي ووضعها على الستائر.
  7. تخدير SOM-tdTomato أو PV-tdTomato غير متجانس الزيجوت باستخدام الأيزوفلوران (3٪ للحث ، 1.5-2٪ للصيانة) وخليط الأكسجين. تأكد بشكل دوري من المستوى الجراحي للتخدير مع قرصة إصبع القدم طوال الجراحة. تأكد من أن الحيوان لا يتجاوز الخطة الجراحية للتخدير من خلال مراقبة التنفس كل 10-15 دقيقة.
  8. حلق الجزء العلوي من رأس الحيوان. ضع 70٪ من كحول الأيزوبروبيل والمحلول القائم على اليود بحرية على المنطقة الجراحية ومرهم العيون على مآخذ العين لمنع تجفيف الغشاء. إدارة بوبيفاكايين / يدوكائين (نسبة 1: 1 ، 1.0 ملغ / كغ) تحت الجلد إلى الموقع الجراحي للتخدير الموضعي.
  9. تناسب الحيوان في إطار مجسم.
  10. استخدم المشرط لعمل شق على طول المحور السهمي للجلد الذي يغطي السطح الظهري للجمجمة. اسحب الجلد باستخدام الملقط. ترطيب الجمجمة بنسبة 0.9٪ محلول ملحي حسب الضرورة.
  11. على سطح الجمجمة ، ضع علامة خفيفة على تقاطع الإحداثيات الأمامية والجانبية بصليب في قلم رصاص. حفر ثقب في الإحداثيات المناسبة في المستوى العرضي (بالملم بالنسبة إلى Bregma ، لحقن القشرة الحزامية (Cg): الأمامي 0.2 ، الجانبي 0.3 ؛ لحقن المهاد الخلفي (Po): الخلفي 2.25 ، الجانبي 3.4).
    ملاحظة: يجب أن تمتد العلامات إلى ما وراء حدود ثقب اللدغ لتوفير إرشادات لوضع الماصة بدقة.
  12. قم بتشغيل طاولة الهواء وموازنتها.
  13. تغيير موضع القطب الكهربائي المتلاعب بالإطار المجسمة عند 0 درجة للحقن في Cg ، أو 45 درجة في المستوى الإكليلي للحقن في Po.
  14. قم بتوصيل مضخة المحقنة بجهاز مناور القطب الكهربائي. قم بتوصيل وحدة التحكم في مضخة المحقنة الدقيقة بمضخة المحقنة.
  15. تنقل طرف الماصة بالقرب من (ولكن لا تلمس) سطح الدماغ، عند تقاطع العلامات التي تم إنشاؤها في الخطوة 2.11. تقدم الماصة بسرعة 1 مم / ثانية تقريبا على طول محورها الطولي في الدماغ إما 0.9 مم (الحقن في Cg) أو 3.1 مم (الحقن في Po). انتظر لمدة 10 دقائق قبل المتابعة.
  16. حقن 1.0 ميكرولتر من البناء الفيروسي على مدى 10 دقائق (100 نانولتر / دقيقة). إذا لوحظ تسرب الفيروس من موقع إدخال الماصة ، فقم بإبطاء معدل الحقن إلى 50 nL / min.
  17. بعد الحقن ، انتظر لمدة 10 دقائق قبل سحب ماصة الحقن ببطء.
  18. خياطة لإغلاق شق فروة الرأس وإدارة 2-5 ملغ / كغ ميلوكسيكام تحت الجلد.
  19. التوقف عن الايزوفلوران ومراقبة الحيوان أثناء الخروج من التخدير. السماح بالتعافي وفقا للإجراءات التي وصفتها لجنة رعاية واستخدام الحيوانات في المؤسسة ، بما في ذلك مزيد من إدارة المسكنات.

3. إعداد شرائح الدماغ الحادة

  1. اسمح لمدة 3 أسابيع على الأقل للتعبير عن البنية الفيروسية قبل حصاد الأنسجة.
  2. تحضير 1 لتر من السائل الشوكي الدماغي الاصطناعي لإجراء التقطيع (تقطيع السائل الشوكي الدماغي الاصطناعي ، sACSF). انظر الجدول 2 للاطلاع على المكونات.
  3. طوال عملية التقطيع ، قم بتزويد sACSF بخليط 95٪ O 2/5٪ CO2 المذاب ، الذي يتم تسليمه عبر أنبوب تشتت الغاز.
  4. تحضير حمام بارد مثلج لاهتزاز شفرة microtome. قم بتركيب مرحلة عينة الجليد البارد على microtome وقم بتثبيت شفرة الياقوت في مكانها لتقسيم الأنسجة.
  5. تخدير الفأر مع 3 ٪ من الايزوفلوران والأكسجين حتى فقدان رد الفعل الصحيح.
  6. قطع رأس الماوس باستخدام المقصلة وغمر الرأس على الفور في 4 درجات مئوية sACSF. للحفاظ على صحة الأنسجة ، أكمل الخطوات التالية في أسرع وقت ممكن.
  7. افتح تجويف الجمجمة عن طريق إجراء شق صغير في قاعدة الجمجمة وإزالة كل صفيحة جمجمة برفق. أزيلي الأم الجافية الأساسية برفق.
  8. بينما لا يزال الدماغ في تجويف الجمجمة ، استخدم شفرة الحلاقة لإزالة المخيخ. قم بعمل قطع رأسي ثان على طول المستوى السهمي في نصف الكرة الأيسر ، فقط جانبي إلى خط الوسط.
  9. تحضير كتلة الأنسجة للتقسيم.
    1. ارفع الدماغ بلطف من تجويف الجمجمة. ضع الدماغ على ورقة الترشيح مع الطائرة السهمية المسطحة لأسفل. قم بتوجيه ورقة الترشيح فوق قالب الحظر ومحاذاة الدماغ مع مخطط القالب الأساسي (الشكل التكميلي 1).
    2. قم بإجراء قطعتين متوازيتين في المستوى الإكليلي كما هو موضح في الأسطر الموجودة في القالب. أضف قطرة صغيرة من sACSF للحفاظ على ورق الترشيح رطبا ، إذا لزم الأمر.
    3. ضع كتلة الأنسجة في sACSF 4 درجات مئوية لفترة وجيزة أثناء إجراء الخطوة 3.8.4.
    4. ضع كمية صغيرة من الغراء الفائق على مرحلة العينة الباردة الثلجية.
    5. ارفع كتلة الأنسجة من sACSF الباردة. استخدم زاوية منشفة ماصة للتخلص من sACSF الزائد. قم بلصق المستوى الإكليلي الخلفي لكتلة الأنسجة إلى مرحلة العينة ، مع مواجهة السطح الظهري للدماغ لشفرة الياقوت.
  10. جمع 500 ميكرومتر شرائح الدماغ الإكليلي السميكة. ضع شرائح ذات أهمية على شبكة نايلون (الشكل التكميلي 2) في 34 درجة مئوية sACSF واسمح للحاوية بالوصول إلى درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: بالنسبة للتجارب الموصوفة هنا، تم جمع التسجيلات الكهروفسيولوجية من قسم إكليلي يتمركز حول 2.25 مم من الخلف إلى البريجما لدراسة منطقة حسية غير أولية، وهي القشرة البصرية الثانوية الإنسية (V2MM).

4. تحضير أكياس تجريبية من السائل الشوكي الدماغي الاصطناعي (eACSF) تحتوي على إيسوفلوران مخدر متطاير مذاب

  1. تحضير 300 مل من خليط المرق من 3.0 ٪ isoflurane.
    1. في كيس غاز بولي تترافلورو إيثيلين مغلق ، أضف ~ 100 مل من خليط غاز 95٪ O 2/5٪ CO2 إلى 20-30 مل من الأيزوفلوران السائل وكمية صغيرة من محلول ملحي بنسبة 0.9٪. انتظر لمدة 30 دقيقة على الأقل للسماح بتوازن الأيزوفلوران بين مرحلتي السائل والغاز.
    2. أوجد كمية غاز الأيزوفلوران المشبع، Vsat، لإضافتها إلى كيس المخزون باستخدام المعادلة التالية:
      Equation 1
      حيث P٪ stock هو التركيب المستهدف لغاز المخزون (3٪ في هذه الحالة) ،والمخزون V هو الحجم النهائي لكيس غاز المخزون ، Pisoflurane هو الضغط الجزئي للإيسوفلوران في درجة حرارة الغرفة (~ 240 مم زئبق) ، و Pالإجمالي هو الضغط الجوي (~ 760 مم زئبق).
    3. أضف الكمية المحسوبة من الغاز المشبع إلى كيس غاز فارغ واملأ الكيس بحجم 95٪ O 2/5٪ CO2 خليط الغاز ليصل الحجم الإجمالي لكيس المخزون إلى 300 مل.
  2. تحضير 2 لتر من السائل الشوكي الدماغي الاصطناعي لتروية الشريحة أثناء التجربة (ACSF التجريبي ، eACSF). انظر الجدول 2 للاطلاع على المكونات. يذوب 95٪ O 2/5٪ CO2 خليط الغاز في محلول.
  3. قم بإعداد حقيبتين منفصلتين من حلول التحكم و Isoflurane.
    1. إلى كيس غاز بولي تترافلورو إيثيلين فارغ ، أضف 600 مل eACSF و 600 مل من خليط غاز 95٪ O2/5٪ CO2 . قم بتسمية هذه الحقيبة باسم التحكم.
    2. إلى كيس غاز بولي تترافلورو إيثيلين فارغ آخر ، أضف 300 مل من eACSF. ضع علامة على هذه الحقيبة على أنها أيسوفلوران.
    3. اختر تركيز الطور الغازي المتوازن ذي الصلة من الناحية الفسيولوجية للأيزوفلوران. أجريت التجارب باستخدام تركيزات الغاز التي تعادل 1.3٪ من الأيزوفلوران. تفقد الفئران رد الفعل الصحيح ، ويفترض الوعي ، بنسبة 0.9٪ استنشقت الأيزوفلوران.
    4. استخدم المعادلة التالية لحساب تركيز الطور الغازي المكافئ في درجة حرارة الغرفة، P٪ (Troom)31:
      Equation 2
      حيث P٪ (T body) هو تركيز مرحلة الغاز ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية المختار في الخطوة 4.3.3 ،وغرفة T هي 25 درجة مئوية ،والجسم T هو 37 درجة مئوية.
    5. استخدم المعادلة التالية لتحديد حجم الغاز من كيس غاز المخزون ،مخزون V ، لإضافته إلى محلول Isoflurane.
      Equation 3
      حيثالحل V هو حجم eACSF في كيس ISOFLURANE (300 مل) ، يتم إدخال P٪ (غرفة T) من المعادلة (2) ، λ هو معامل تقسيم Ostwald الملحي / الغازي للإيسوفلوران (λ = 1.232) ، و P٪ stock هو تركيز الطور الغازي لكيس غاز المخزون (P٪ stock = 3.0٪).
    6. إلى كيس محلول Isoflurane ، أضف حجم الغاز من كيس غاز المخزون، مخزون V ، محسوبا في الخطوة 4.3.5.
    7. إلى كيس محلول Isoflurane ، أضف حجما قدره 95٪ O 2/5٪ CO2 خليط الغاز ليصل الحجم الإجمالي للغاز في كيس محلول Isoflurane إلى 300 مل.
  4. رج كل من أكياس Control و Isoflurane على الخلاط لمدة 1 ساعة على الأقل للسماح بتوازن طور الأيزوفلوران.
  5. بعد جمع جميع البيانات ، يمكن التحقق من التركيز الصحيح باستخدام جهاز مراقبة غاز مخدر لقياس تركيز الغاز المتوازن من الأيزوفلوران فوق المحلول المتبقي في الكيس.
  6. الإبلاغ عن التركيزات التجريبية للغازات المتطايرة في الوحدات المائية، حيث أن تركيزات الملليمولات أكثر قوة للتغيرات في درجة الحرارة. استخدم المعادلة التالية لتحويل تركيز الطور الغازي في درجة حرارة الغرفة، P٪ (غرفة T)، إلى تركيز مائي مكافئ (Cمائي، بالملليمتر)31:
    Equation 4
    حيث α هو معامل تقسيم بنسن المالحة / الغازية للأيسوفلوران عند 25 درجة مئوية32.

5. إعداد الأجهزة والبرامج للتسجيلات متعددة القنوات

  1. قم بإعداد نظام الحصول على البيانات المكون من 16 قناة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    ملاحظة: يمكن استخدام العديد من مكبرات الصوت المتاحة تجاريا وأنظمة الحصول على البيانات لجمع التسجيلات متعددة القنوات. في التجارب الموصوفة هنا ، يتم تسليم الإشارات التناظرية عبر لوحة مرجعية قطب كهربائي إلى اثنين من مكبرات الصوت ، حيث يتم تضخيمها (2000x) وتصفيتها (0.1-10kHz). يتم رقمنة المدخلات التناظرية لنظام الحصول على البيانات عند 40 كيلو هرتز.
  2. اربط محول المسرح الرئيسي المناسب المكون من 16 قناة بجهاز ميكرومبهور مجهري. قم بتوجيه المحول بحيث تكون منافذ الموصل الأنثوية متجهة لأسفل.
  3. اضبط زاوية تشغيل هذا المتلاعب الدقيق بحيث يتم توجيهه لأسفل نحو غرفة التسجيل ، بزاوية حوالي 70 درجة بالنسبة إلى أفقي.
  4. قم بتوصيل مدخل المنصة بمسبار 16 × 1 للفيزيولوجيا الكهربية في المختبر عبر محول المنطلخ الرئيسي المثبت على المتلاعب الدقيق.
  5. قم بتوصيل موصل إخراج المرحلة الرئيسية بنظام الحصول على البيانات.
  6. قم بتثبيت البرامج المناسبة للحصول على البيانات. قم بتكوين 15 قناة إدخال لتتوافق مع إشارات الإدخال من أول 15 جهة اتصال متعددة القنوات للمسبار. قم بتكوين القناة المتبقية لتلقي المدخلات من القطب داخل الخلايا.
    ملاحظة: احرص على النظر في خرائط القطب الكهربائي والمحول عند جمع البيانات وتحليلها ، للتأكد من أن الإشارة المناسبة تتوافق مع اتصال القطب الكهربائي الذي تم جمعها منه.

6. تكوين بروتوكولات تحفيز الضوء

  1. قم بإعداد نظام توصيل الضوء وتثبيت البرنامج المصاحب.
  2. افتح البرنامج. اختر تكوين أسلاك الأجهزة حيث يوفر مصدر الزناد (رقمي / TTL Out) إشارة Trigger In إلى نظام توصيل الضوء ، ويوفر نظام توصيل الضوء إشارة Trigger Out إلى LED 470 نانومتر.
  3. قم بتركيب عدسة موضوعية عالية الطاقة. باستخدام الكاميرا الرقمية ، قم بمعايرة الهدف عالي الطاقة للاستخدام مع نظام توصيل الضوء.
  4. إنشاء تسلسل ملف تعريف جديد لملفات تعريف تحفيز الضوء.
    1. إنشاء نمط من الاختيار. في التجارب الموصوفة هنا ، يتم استخدام دائرة قطرها 150 ميكرومتر للسماح بتنشيط طبقة محددة من محطات المحور العصبي.
    2. لإنشاء تسلسل ملف تعريف، انسخ ملف التعريف هذا والصقه لكل من أي عدد من التجارب.
    3. قم بإنشاء قائمة أشكال موجية تحتوي على أشكال موجية لأي شدة ضوء أو مدة نبض أو رقم نبض.
    4. تعيين أشكال موجية عشوائيا لكل ملف تعريف. يتوافق كل ملف تعريف بشكله الموجي المعين مع نبضة مشغل واحدة من إدخال TTL رقمي ، أو تجربة واحدة.
    5. احفظ تسلسل ملف التعريف.
  5. في برنامج الحصول على البيانات، قم بإنشاء بروتوكول جديد.
    1. قم بتعيين عدد التجارب ليساوي عدد ملفات التعريف في تسلسل ملف التعريف الذي تم إنشاؤه للتو.
    2. اختر مدخلات الإشارة لمطابقة تلك التي تم تكوينها في الخطوة 5.6. قم بتكوين بروتوكول يوفر مخرج TTL رقمي واحد ، يتم تسجيله من قنوات الإدخال ال 16 هذه لفترة زمنية مناسبة قبل وبعد المشغل الرقمي.

7. وضع مسبار متعدد القنوات في شريحة أنسجة المخ خارج الجسم الحي

  1. eACSF الفقاعي Perfuse (ليس في أكياس مغلقة) عند 3-6 مل / دقيقة.
  2. انقل شريحة الدماغ التي تحتوي على منطقة ذات أهمية إلى شبكة شبكية في غرفة تروية المجهر. مرساة مع قيثارة بلاتينية (انظر الشكل التكميلي 3).
  3. قم بتدوير الشبكة الشبكية بحيث يكون خط تلامس القطب الكهربائي على الطرف البعيد من المسبار متعدد القنوات عموديا تقريبا على سطح القضيب.
  4. تحت إضاءة المجال العريض وتحت التحكم الدقيق في المتلاعب الدقيق ، اخفض المسبار متعدد القنوات نحو سطح الشريحة.
  5. قم بتدوير برج مكعب المرشح لإشراك مكعب المرشح المناسب لتصور بروتين مراسل الفلورسنت المعبر عنه في أطراف محورية من الأفيرينات القشرية . إذا لزم الأمر ، قم بتدوير الشريحة لمحاذاة المسبار بدقة أكبر مع سطح الحفرة.
  6. ضع المسبار فوق مستوى الشريحة مباشرة، أي أقل ب 200 ميكرومتر تقريبا من الموضع النهائي المستهدف على طول المحور x، تاركا قناة واحدة على الأقل خارج حدود منطقة الأنسجة التي يتم تسجيلها.
  7. أدخل المسبار ببطء في الشريحة عن طريق تحريك المتلاعب على طول محوره الطولي. لتقليل الضرر الذي يلحق بالأنسجة ، قم فقط بتطوير المسبار إلى الحد الذي تكون فيه الأطراف الحادة مرئية فقط تحت سطح الأنسجة. سيؤدي ذلك إلى تقليل الضرر الذي يلحق بالأنسجة مع ضمان اتصال القطب الكهربائي بالأنسجة.

8. تصحيح تثبيت الخلايا العصبية المستهدفة والحصول على تكوين الخلية بأكملها

  1. قم بتبديل مصدر eACSF إلى حل التحكم المعبأ في أكياس.
  2. حدد الخلايا المصنفة بالفلورسنت لتسجيل مشبك التصحيح المستهدف.
    1. تقييد الحجاب الحاجز القزحية فتحة العدسة إلى أصغر قطر. قم بإشراك عدسة موضوعية منخفضة الطاقة وجلب الأنسجة إلى التركيز البؤري.
    2. قم بتوسيط الضوء فوق منطقة من الأنسجة المجاورة (ولكن ليس المتداخلة) مع المسبار متعدد القنوات.
    3. قم بإشراك هدف الغمر المائي عالي الطاقة (40x أو 60x) ، مع توخي الحذر لتجنب التلامس بين المسبار متعدد القنوات والعدسة الموضوعية.
    4. قم بتدوير برج مكعب المرشح لإشراك مجموعة المرشح المناسبة للسماح بتصوير الخلايا التي تعبر عن علامة الفلورسنت المعتمدة على Cre.
    5. حدد خلية مصنفة بالفلورسنت كهدف لتسجيل مشبك التصحيح. ارفع العدسة الموضوعية لتوفير مساحة واسعة لخفض ماصة التصحيح.
  3. قم بتحميل ماصة تصحيح (انظر الجدول 1) بمحلول داخلي (الجدول 2) وقم بتركيب ماصة في حامل القطب الكهربائي. باستخدام حقنة 1 مل ، ضع ضغطا إيجابيا مطابقا ل ~ 0.1 مل من الهواء.
  4. خفض ماصة التصحيح في المحلول. ضع طرف الماصة في بؤرة التركيز تحت التوجيه البصري.
  5. احصل على تسجيل خلية كاملة من الخلية المستهدفة باستخدام الخطوات الموضحة سابقا33.
  6. إذا كنت تخطط لتقييم التغييرات في الخصائص الجوهرية للخلية (على سبيل المثال ، مقاومة المدخلات ، ومعدل إطلاق النار المحتمل استجابة للخطوات الحالية) ، فقم بإجراء هذه التسجيلات. خلاف ذلك ، انتقل إلى بروتوكول تحفيز المحور العصبي أدناه.

9. التنشيط البصري الوراثي الخاص بالطبقة للمحطات الطرفية للمحور العصبي

  1. تعامل مع مجال الرؤية في المستوى x-y لمحاذاة ملف تعريف تحفيز الضوء مع الموقع المطلوب على الشريحة.
  2. قم بتحميل بروتوكول تحفيز الضوء وإعداد نظام توصيل الضوء لتلقي نبضة TTL رقمية.
  3. تنشيط أطراف المحور العصبي بصريا مع تسجيل إمكانات المجال خارج الخلية وتقلبات الغشاء داخل الخلايا في نفس الوقت.
  4. قم بتبديل مصدر eACSF إلى محلول Isoflurane واغسل الدواء لمدة 15 دقيقة. إذا لزم الأمر ، اجمع التسجيلات التلقائية أثناء الغسيل.
  5. كرر الخطوة 9.2-9.3.
  6. قم بتبديل مصدر eACSF إلى محلول التحكم واغسل الدواء لمدة 20 دقيقة. إذا لزم الأمر ، اجمع التسجيلات التلقائية أثناء الغسيل.
  7. كرر الخطوة 9.2-9.3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويرد في الشكل 1 جدول زمني للخطوات الموصوفة في البروتوكول. تحتوي المدخلات القشرية القادمة من المناطق القشرية ذات الترتيب الأعلى أو من نوى المهاد غير الأولية على حقول طرفية متداخلة جزئيا في الطبقة 1 من القشرة البصرية غير الأولية24. ولعزل المسارات المستقلة القشرية القشرية أو القشرية التابعة، تم حقن ناقل فيروسي يحتوي على ChR2 ومراسل فلورسنت eYFP إما في Po أو Cg. وتشغل الخلايا داخل دائرة نصف قطرها الحقن الناقل الفيروسي، وبعد 2-4 أسابيع، تعبر عن قناة الكاتيون غير المحددة ChR2 والمراسل في كل من محاور السوما والإسقاط (الشكل 2A). تم جمع شرائح إكليلية. مع تشغيل مكعب المرشح المناسب ، تم تصوير المحاور التي تعبر عن البنية الفيروسية (الشكل 2B). يسمح استخدام ChR2 لتنشيط محطات المحور العصبي بتنشيط الأفيرنتس دون الحاجة إلى سوما مرفقة.

كانت الحيوانات المستخدمة في التجارب الموصوفة هنا هي الحيوانات الهجينة SOM-tdTomato أو PV-tdTomato ، والتي تعبر عن بروتين المراسل الفلوري tdTomato إما في السوماتوستاتين (SOM+) أو الخلايا العصبية الداخلية الإيجابية (PV+) ، على التوالي. تم استهداف الخلايا العصبية الداخلية SOM+ أو PV+ في الطبقة 2/3 لتثبيت التصحيح تحت التوجيه البصري باستخدام مكعب المرشح المناسب (الطبقة 1C). تحتوي هذه الخلايا العصبية الداخلية على تشعبات في الطبقة 1 وهي أهداف للمدخلات القشرية القشرية (الشكل 3A).

أدت إضافة 125 مل من غاز الأيزوفلوران بنسبة 3.0٪ و 175 مل من 95٪ O2/5٪ CO2 إلى كيس مغلق إلى تركيز ما قبل التوازن للغاز بنسبة 1.3٪. الغاز المذاب في eACSF وفقا لمعامل التقسيم الخاص به ؛ كان تركيز توازن الطور الغازي المتوقع للأيسوفلوران في درجة حرارة الغرفة 0.6٪ (الشكل 2D). تم تأكيد ذلك عبر مراقبة الغاز.

تم نقل شريحة الأنسجة إلى غرفة التسجيل وتم وضع مسبار التسجيل متعدد القنوات 16x1 بشكل متعامد على الصفيحة القشرية (الشكل 2E). تم تسليم دائرة 150 ميكرومتر من ضوء 470 نانومتر متمركزة فوق الطبقة القشرية 1 عبر مسار الضوء الموضوعي ، في حين تم جمع إمكانات المجال خارج الخلية باستخدام مسبار متعدد القنوات 16 × 1 وتم إجراء تسجيلات مشبك رقعة خلية كاملة مستهدفة في الخلايا العصبية الداخلية. يظهر مخطط لإعداد التسجيل في الشكل 2F.

لوحظت إمكانات ما بعد المشبكي (PSPs) في الخلايا العصبية الداخلية استجابة لقطار من أربع نبضات من الضوء 2 مللي ثانية (10 هرتز; الشكل 3 ألف). وسجلت أيضا إمكانات ميدانية محلية (الشكل 3 باء). كثافة المصدر الحالية (CSD; الشكل 3 جيم) والنشاط المتعدد الوحدات (MUA; الشكل 3 دال) تم استخراجها من الإمكانات الميدانية المحلية. واستخدمت عشر تجارب بعدة شدة مختلفة للضوء لإجراء تحليلات لاحقة للضوء. زادت سعة المصارف الحالية المستخرجة من CSD كدالة لشدة الضوء (الشكل 4A). كانت المعادلة اللوجستية غير الخطية المكونة من ثلاث معلمات مناسبة للبيانات لإجراء مقارنات عبر المسارات. كما زادت سعة PSP مع سعة الحوض الحالية (الشكل 4B).

تم قياس الاستجابات المشبكية للمدخلات القشرية القشرية والقشرية أثناء التحكم ، و isoflurane (0.28 mM) ، وظروف الاسترداد. تم قمع الاستجابات اللاحقة للتشابك من السوماتوستاتين (الشكل 5A) للمحفزات القشرية القشرية أثناء الأيزوفلوران ، كما تم استحضار المصارف الحالية (الشكل 5B).

Figure 1
الشكل 1: مخطط يحدد الجدول الزمني للخطوات الهامة في البروتوكول.
أعلى: يصف الجدول الزمني للخطوات اللازمة لتربية الحيوانات المعدلة وراثيا والتعبير عن الناقل الفيروسي. قاع: يصور الخطوات والجدول الزمني لإعداد المواد وإجراء التجارب في يوم إعداد الشريحة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: حقن الناقل الفيروسي وإعداد شرائح الدماغ الإكليلية خارج الجسم الحي.
(أ) التمثيل التخطيطي لحقن الناقل الفيروسي في الفئران الهجينة SOM-tdTomato أو PV-tdTomato. (ب) تم حصاد شرائح إكليلية من منطقة الارتباط الجداري الإنسي (mPtA) ، وتم تحديد الألياف القشرية (أعلى) أو القشرية (أسفل) من قبل مراسل eYFP في الطبقة 1. يتم تعديل هذا الرقم بإذن من24. (ج) تراكب أطراف المحور العصبي الموسومة ب eYFP في الطبقة 1 (باللون الأخضر) والخلايا العصبية الداخلية SOM+ الموسومة بالطماطم (الحمراء) في الطبقة السطحية 2/3. (دال) أعدت أكياس مختومة بخليط من المحلول إلى الغاز بنسبة 50:50. (ه) وضع مسبار 16 × 1 في mPtA (مخطط أسود). (و) مخطط إعداد التسجيل في الشريحة القشرية . يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تسجيلات متزامنة داخل الخلايا ومتعددة القنوات خارج الخلية في شريحة قشرية
(أ) تسجيل رقعة المشبك الحالية كاملة الخلية من سوما طبقة 2/3 PV+ interneuron. تم تسليم أربع نبضات (2 مللي ثانية لكل منها ، أسهم زرقاء) من الضوء الأزرق (2.2 ميجاوات) عند 10 هرتز إلى أطراف المحور العصبي القشرية في L1. يظهر متوسط (أثر أحمر) لعشر تجارب (آثار رمادية). (ب) بيانات أولية من 16 قناة من مسبار 16 × 1 خارج الخلية. تظهر القنوات الموضوعة في الأنسجة القشرية باللون الأسود، وتلك التي تقع خارج القشرة باللون الرمادي. (ج) يوضح مخطط كثافة المصدر الحالي، المستخرج من إشارة جهد المجال المحلي، بالوعات التيار المتشابك (الأزرق) في الطبقة 1. (د) النشاط المتعدد الوحدات، الذي ينشأ عن تطبيق مرشح عالي التمرير على إشارة الجهد الميداني المحلي، يعزل النشاط المتصاعد المستثار في الطبقات السفلى. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: مقارنة الردود من التسجيلات في شريحتين مختلفتين.
تم استخدام كثافات ضوئية متعددة لإثارة استجابات متشابكة في الطبقة القشرية 1. لكل تجربة، تم استخراج سعة الذروة للاستجابة المستحثة من بالوعة التيار خارج الخلية من الطبقة 1 وEPSPs في الخلايا العصبية الداخلية للطبقة 2/3 PV+. (أ) تتم مقارنة ملامح الاستجابة خارج الخلية للقشرة المهادية والقشرية كدالة لشدة الضوء. (ب) تعتمد العلاقة بين سعة البالوعة الحالية وسعة EPSP على المسار. ضمن كل مسار تحفيزي ، تم جمع البيانات من (A) و (B) في وقت واحد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: تطبيق حمام الأيزوفلوران المذاب في eACSF أثناء التسجيلات المتزامنة.
(أ) تسجيل المشبك الحالي داخل الخلايا كاملة الخلايا من الطبقة 2/3 SOM + interneuron عند تنشيط القشرة القشرية أثناء التحكم ، الأيزوفلوران ، وظروف الغسيل. تشير الخطوط الزرقاء الرأسية إلى محفزات الضوء (2 مللي ثانية ؛ 1.65 ميجاوات). (ب) تتبع كثافة المصدر الحالي المستخرج من القطب الكهربائي في الطبقة 1. تم جمع البيانات في وقت واحد مع تلك التي تم جمعها في (أ). يظهر استرداد الاستجابات عند الغسيل اكتئاب الاستجابات المشبكية بواسطة الأيزوفلوران. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ماصة دقيقة لحقن الفيروسات
زجاج ID: 0.05 ملم, OD: 0.11 ملم
الحلقات 1
حرارة سحب الوقت ضغط
منحدر + 10 20 40 200 300
ماصة دقيقة لتسجيلات المشبك التصحيح خلية كاملة
زجاج ID: 1.1 ملم, OD: 1.7 ملم
الحلقات 4
حرارة سحب الوقت ضغط
منحدر 0 25 250 500

الجدول 1: الزجاج والمعلمات الموصى بها لسحب الماصات الدقيقة للحقن الفيروسي وتسجيلات المشبك الرقعة كاملة الخلايا. يتم وصف الزجاج المستخدم في الحقن الفيروسية وتسجيلات مشبك تصحيح الخلية الكاملة ، بالإضافة إلى معلمات سحب الماصات الدقيقة باستخدام مجتذب الماصة الدقيقة. راجع كتيبات التعليمات الخاصة بمجتذب الماصة الدقيقة للحصول على مزيد من التوصيات أو ضبط الإعدادات.

تقطيع ACSF، sACSF (بالمللي ملليمتر) تجربة ACSF ، eACSF (بالملليمتر ملي)
كلوريد الصوديوم 111 111
ناهكو3 35 35
هيبس 20 20
كيه سي ال 1.8 1.8
كاكل2 1.05 2.1
ملغسو4 2.8 1.4
KH2PO4 1.2 1.2
الجلوكوز 10 10
الحل الداخلي
ك-غلوكونات 140
كلوريد الصوديوم 10
هيبس 10
EGTA 0.1
MgATP 4
NaGTP 0.3
الرقم الهيدروجيني = 7.2

الجدول 2: تكوين السائل الشوكي الدماغي الاصطناعي والمحلول داخل الخلايا. يتم سرد الكواشف والتركيزات ل sACSF و eACSF ومحلول الماصة داخل الخلايا لتسجيلات مشبك التصحيح.

الشكل التكميلي 1: قالب لإعداد كتلة من الأنسجة لجمع شرائح الدماغ. يتم ضبط القالب على الحجم المناسب وطباعته ولصقه على شريحة مجهرية. يتم لصق قسيمة غطاء فوق القالب لإطالة استخدامه. يتم وضع كتلة الأنسجة على قطعة من ورق الترشيح مع المستوى السهمي لأسفل ، محاذاة للخلفية الوردية ، ويتم إجراء قطع عمودي في المستوى الإكليلي على طول الخط الأسود. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 2: غرفة حضانة شرائح الدماغ المحصودة. تمتلئ الغرفة ب sACSF وتفقاعات بخليط غاز 95٪ O 2/5٪ CO2 عبر إبرة منحنية متصلة بالأنابيب. منصة الحضانة مصنوعة من النايلون تمتد فوق تركيب دائري بلاستيكي. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 3: هياكل البلاتين للشريحة في غرفة التسجيل. يتم نقل شريحة الدماغ إلى غرفة التسجيل عبر ماصة وتوضع فوق شبكة النايلون ، والتي تمتد فوق قطعة على شكل حدوة حصان من سلك البلاتين المسطح ولصقها في مكانها. يتم وضع القيثارة البلاتينية فوق شريحة الدماغ لتثبيتها في مكانها أثناء التسجيل. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الرقم.

الجدول التكميلي 1: معاملات أوستوالد (λ) وبنسن (α) للتخدير المتطاير الآخر. قم بتكييف هذا البروتوكول لدراسة مخدرات الغاز المتطاير الأخرى ، مثل الهالوثان أو سيفوفلوران أو ديسفلوران. استبدل المعادلات الموضحة في البروتوكول بالمعاملات المناسبة كما هو موضح في هذا الجدول. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذه المخطوطة، يتم وصف بروتوكول لتقييم الاستجابات داخل وخارج الخلية للمسارات القريبة المنشطة بشكل انتقائي في شرائح الدماغ خارج الجسم الحي.

يسمح استخدام الأدوات البصرية الجينية ومخططات التسجيل المتوازية للمحققين بالتحقيق في استجابات السكان المحليين للمدخلات القريبة من مناطق الدماغ البعيدة ، مع التسجيل في وقت واحد من المجموعات المستهدفة من الخلايا العصبية الداخلية. يسمح استخدام التكنولوجيا البصرية الجينية بالحفاظ على أطراف المحور العصبي للإسقاطات القريبة وتنشيطها على الرغم من أن أجسامها الخلوية لم تعد متصلة. هذا يخفف من القيود الهندسية المفروضة سابقا على شرائح خارج الجسم الحي ، حيث لم يعد الحفاظ على التوصيلات الكهربائية طويلة المدى أمرا بالغ الأهمية. ومع ذلك ، يجب توخي الحذر لإعداد شرائح في مستوى هندسي يحافظ على أي اتصالات متبقية ذات أهمية. على سبيل المثال ، يتم توجيه الخلايا الهرمية عموديا على طول العمود القشري ، ويتطلب نشاط الشبكة المستحضر الذي تقاس بواسطة المجسات متعددة القنوات في هذه التجارب الحفاظ على هذه الاتصالات المحلية قدر الإمكان. وهكذا ، تم إعداد شرائح الإكليل للحفاظ على الاتصال المحلي سليما.

عند اختيار التركيبات البصرية الجينية وبروتينات مراسل الفلورسنت ذات الصلة ، يجب مراعاة خصائص أطياف الإثارة / الانبعاثات والبصريات المجهرية. قد يؤدي التحفيز الضوئي المستمر إلى تعطيل جزئي للعديد من متغيرات channelrhodopsin34 ، والتي يمكن تجنبها عن طريق اختيار البروتينات الصحفية التي لا تتداخل أطياف الإثارة مع تلك الموجودة في opsin. يمكن أيضا اختيار المتغيرات البديلة ذات الحركيات المختلفة أو حساسيات الضوء اعتمادا على النموذج التجريبي35 ، بما في ذلك التلاعب باستخدام أوبسينات بديلة مثيرة أو مثبطة. يجب أيضا محاذاة مكعبات المرشح بشكل مناسب مع مراسلي الفلورسنت المختارين ، بحيث يمكن تصوير محطات المحور العصبي أو الخلايا العصبية الداخلية بشكل مستقل ودون تنشيط opsins المعبر عنه. لحساب التباين في التعبير عن الفيروس ، قد يكون من المناسب أيضا للمحققين تطبيع أي نشاط مستحث بصريا إلى مستوى التعبير عن البنية الفيروسية ، مقاسا بإنتاج الفلورسنت من بروتين المراسل.

من الممكن أيضا توصيل تركيزات محسوبة مسبقا من التخدير المتطاير إلى شرائح الأنسجة باستخدام الطرق الموضحة هنا. عند اختيار النسب المئوية المناسبة لتوازن الغاز ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية ، يجب على الباحثين حساب فقدان 10-15٪ من غاز الأيزوفلوران المذاب بين خط التروية والأنسجة36. تم تقديم الطرق المطبقة على الأيزوفلوران ، ولكن يمكن التعامل مع أدوية أخرى مثل الهالوثان أو سيفوفلوران أو ديسفلوران بالمثل باستخدام معاملات أوستوالد وبنسن المناسبة (الجدول التكميلي 1). تضمن خصائص تقسيم التخدير المتطاير أنها ستذوب بشكل متوقع في ACSF. ومع ذلك ، نظرا لأن الضغوط الجزئية أكثر حساسية للتغيرات في درجة الحرارة من تركيزات EC50 المائية37 ، يجب تحويل النسب المئوية لحجم توازن الغاز للتخدير المتطاير إلى تركيزات ملليمولار متوقعة في درجة حرارة الغرفة لمقارنة التأثيرات المرصودة بالجرعات ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية في الجسم الحي. إذا اختار الباحثون دراسة التخدير الوريدي مثل الإيتوميدات أو البروبوفول في شرائح الدماغ ، فيجب عليهم النظر في ملامح انتشار الأدوية قيد الدراسة ، حيث قد تختلف أوقات التوازن والتركيزات ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية اختلافا كبيرا30.

في هذه المخطوطة، تم وصف بروتوكول لاختبار آثار التخدير المتطاير على المكونات المتميزة للدوائر القشرية المهادية في شرائح الدماغ خارج الجسم الحي. يمكن التلاعب بالعديد من المتغيرات والمعلمات في الأساليب الموصوفة لمزيد من التحقيقات. على سبيل المثال ، يمكن دراسة مناطق الدماغ المختلفة أو المسارات القريبة أو أهداف الخلايا أو التخدير المتطاير من خلال تكييف الطرق المحددة للإجابة على الأسئلة الجديدة. جنبا إلى جنب مع الأساليب النظرية والتجريبية الأخرى ، فإن دراسة المكونات الخلوية والشبكية الفريدة باستخدام شرائح الدماغ خارج الجسم الحي ستعزز فهمنا للدماغ الديناميكي ، والتغيرات التي يمر بها أثناء التغيرات الدوائية والفسيولوجية المرضية في الوعي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

يشكر المؤلفون برايان كراوس على الدعم الفني والتوجيه بشأن هذا المشروع.

تم دعم هذا العمل من قبل الجمعية الدولية لأبحاث التخدير (IMRA to AR) ، والمعاهد الوطنية للصحة (R01 GM109086 إلى MIB) ، وقسم التخدير ، كلية الطب والصحة العامة ، جامعة ويسكونسن ، ماديسون ، ويسكونسن ، الولايات المتحدة الأمريكية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2.5x broadfield objective lens Olympus MPLFLN2.5X
40x water immersion objective lens Olympus LUMPLFLN40XW
95% O2/5% CO2 mixture Airgas Z02OX95R2003045
A16 probe NeuroNexus A16x1-2mm-100-177-A16 16-channel probe
AAV2-hSyn-hChR2(H134R)-EYFP Karl Deisseroth Lab, UNC Vector Core
Anesthetic gas monitor (POET II) Criticare 602-3A
ATP, Magnesium Salt Sigma Aldrich A9187 intracellular solution
B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J The Jackson Laboratory 007914 Cre-dependent tdTomato mouse
B6;129P2-Pvalbtm1(cre)Arbr/J The Jackson Laboratory 008069 PV-Cre mouse
Belly Dancer Shaker Thomas Scientific 1210H86-TS for equilibration of sealed gas bags
Betadine solution Generic brand
Bleach Generic brand for silver chloriding patch clamp electrode
Bupivicaine
Calcium Chloride (CaCl2) Dot Scientific DSC20010 ACSF
Capillary glass (patch clamp recordings) King Precision Glass, Inc. KG-33 Borosilicate, ID: 1.1mm, OD: 1.7mm, Length: 90.0mm
Capillary glass (viral injections) Drummond Scientific Company 3-000-203-G/X 3.5"
Control of junior micromanipulator Luigs and Neumann SM8 for control of junior micromanipulator
Control of manipulators and shifting table Luigs and Neumann SM7 for control of multichannel electrode and shifting table
Digidata 1440A + Clampex 10 Molecular Devices 1440A Digitizer and software
E-3603 tubing Fisher Scientific 14171208 for delivery of 95% O2/5% CO2 gas mixture to incubation chamber + application of pressure during patch clamping
EGTA Dot Scientific DSE57060 intracellular solution
ERP-27 EEG Reference/Patch Panel Neuralynx Retired
Filling needle World Precision Instruments 50821912 for filling patch clamp pipettes
Filter cube for imaging EYFP Olympus U-MRFPHQ
Filter paper Fisher Scientific 09801E lay over slice template during preparation of tissue block
Flaming/Brown micropipette puller Sutter Instrument P-1000 2.5x2.5 Box filament
Gas dispersion tube Sigma Aldrich CLS3953312C
Glass syringe (100 mL) Sigma Aldrich Z314390 for filling gas-sealed bags
Gluconic Acid, Potassium Salt (K-gluconate) Dot Scientific DSG37020 intracellular solution
Glucose Dot Scientific DSG32040 ACSF
GTP, Sodium Salt Sigma Aldrich G8877 intracellular solution
Headstage-probe adaptor NeuroNexus A16-OM16 adaptor to connect 16-channel probe to headstage input
Hemostatic Forceps VWR International 76192-096
HEPES Dot Scientific DSH75030 ACSF,intracellular solution
HS-16 Headstage Neuralynx Retired
Isoflurane Patterson Veterinary 07-893-1389
Isopropyl alcohol (70%) VWR International 101223-746
Junior micromanipulator Luigs and Neumann 210-100 000 0090-R for manipulation of patch clamp electrode
LED Light Source Control Module Mightex BLS-PL02_US optogenetic light source control
Lidocaine
Lynx-8 Amplifier Neuralynx Retired
Lynx-8 Power Supply Neuralynx Retired
Magnesium Sulfate (MgSO4) Dot Scientific DSM24300 ACSF
mCherry, Texas Red filter cube Chroma 49008 for imaging tdTomato fluorescent reporter
Meloxicam
Micropipette holder Fisher Scientific NC9044962
Microsyringe pump World Precision Instruments UMP3-4
Mineral oil Generic brand
MultiClamp 700A Molecular Devices/Axon Instruments 700A Amplifier
Nitrogen (for air table) Airgas NI200
Nylon mesh Fisher Scientific 501460083 stretched over horseshoe of flattened platinum wire, slice rest on top of this during recordings
Nylon, cut from pantyhose Generic brand small piece to create slice platform in incubation chamber, single fibers to create platinum harp
Ophthalmic ointment Fisher Scientific NC1697520
Pipette Dot Scientific 307 For transferring tissue to rig
Platinum wire VWR International BT124000 2 cm, flattened, to make platinum harp
Polygon400 Mightex DSI-E-0470-0617-000 optogenetic light delivery system, comes with PolyScan2 software
Potassium Chloride (KCl) Dot Scientific DSP41000 ACSF
Potassium Phosphate (KH2PO4) Dot Scientific DSP41200 ACSF
Razor blade Fisher Scientific 12-640
Sapphire blade (for vibratome) VWR International 100492-502
Scalpel blade Santa Cruz Biotechnology, Inc. sc-361445
Sealed gas bag Fisher Scientific 109236
Shifting table for microscope Luigs and Neumann 380FMU
Sodium Bicarbonate (HCO3-) Dot Scientific DSS22060 ACSF
Sodium Chloride (NaCl) Dot Scientific DSS23020 ACSF, intracellular solution
Ssttm2.1(cre)Zjh/J (SOM-IRES-Cre) The Jackson Laboratory 013044 SOM-Cre mouse
Stereotaxic instrument Kopf Model 902 Dual Small Animal
Super glue Staples 886833 to fix tissue block to specimen stage during slice preparation
Surgical drill RAM Products Inc. DIGITALMICROTORQUE Microtorque II
Syringe (1 mL) with LuerLock tip Fisher Scientific 309628 for application of pressure during patch clamping
Syringe (1 mL) with slip tip WW Grainger, Inc. 19G384 for filling patch clamp pipettes
Syringe Filters VWR International 66064-414
Upright microscope Olympus BX51
Vibrating microtome Leica Biosystems VT1000S
Wypall towels Fisher Scientific 19-042-427

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baumgart, J. P., et al. Isoflurane inhibits synaptic vesicle exocytosis through reduced Ca2+ influx, not Ca2+-exocytosis coupling. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 112 (38), 11959-11964 (2015).
  2. Herring, B. E., Xie, Z., Marks, J., Fox, A. P. Isoflurane inhibits the neurotransmitter release machinery. Journal of Neurophysiology. 102 (2), 1265-1273 (2009).
  3. Xie, Z., et al. Interaction of anesthetics with neurotransmitter release machinery proteins. Journal of Neurophysiology. 109 (3), 758-767 (2013).
  4. Crick, F., Koch, C. A framework for consciousness. Nature Neurosciences. 6 (2), 119-126 (2003).
  5. Koch, C., Massimini, M., Boly, M., Tononi, G. Neural correlates of consciousness: progress and problems. Nature Reviews Neurosciences. 17 (5), 307-321 (2016).
  6. Dehaene, S., Changeux, J. P. Experimental and theoretical approaches to conscious processing. Neuron. 70 (2), 200-227 (2011).
  7. Friston, K. A theory of cortical responses. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B Biological Sciences. 360 (1456), 815-836 (2005).
  8. Mashour, G. A., Hudetz, A. G. Bottom-Up and Top-Down Mechanisms of General Anesthetics Modulate Different Dimensions of Consciousness. Frontiers in Neural Circuits. 11, 44 (2017).
  9. Voss, L. J., Garcia, P. S., Hentschke, H., Banks, M. I. Understanding the Effects of General Anesthetics on Cortical Network Activity Using Ex Vivo Preparations. Anesthesiology. 130 (6), 1049-1063 (2019).
  10. Redinbaugh, M. J., et al. Thalamus Modulates Consciousness Via Layer-Specific Control of Cortex. Neuron. 105 (4), 0896 (2020).
  11. Carhart-Harris, R. L., Friston, K. J. REBUS and the Anarchic Brain: Toward a Unified Model of the Brain Action of Psychedelics. Pharmacological Reviews. 71 (3), 316-344 (2019).
  12. Mak-McCully, R. A., et al. Coordination of cortical and thalamic activity during non-REM sleep in humans. Nature communications. 8 (1), 15499 (2017).
  13. Alkire, M. T., Hudetz, A. G., Tononi, G. Consciousness and anesthesia. Science. 322 (5903), 876-880 (2008).
  14. Sanders, R. D., Maze, M. Noradrenergic trespass in anesthetic and sedative states. Anesthesiology. 117 (5), 945-947 (2012).
  15. Hemmings, H. C., et al. Towards a Comprehensive Understanding of Anesthetic Mechanisms of Action: A Decade of Discovery. Trends in Pharmacological Sciences. 40 (7), 464-481 (2019).
  16. Nourski, K. V., et al. Auditory Predictive Coding across Awareness States under Anesthesia: An Intracranial Electrophysiology Study. Journal of Neurosciences. 38 (39), 8441-8452 (2018).
  17. Liu, X., et al. Propofol disrupts functional interactions between sensory and high-order processing of auditory verbal memory. Human Brain Mapping. 33 (10), 2487-2498 (2012).
  18. Hentschke, H., Raz, A., Krause, B. M., Murphy, C. A., Banks, M. I. Disruption of cortical network activity by the general anesthetic isoflurane. British Journal of Anaesthesiology. 119 (4), 685-696 (2017).
  19. Lee, U., et al. Disruption of frontal-parietal communication by ketamine, propofol, and sevoflurane. Anesthesiology. 118 (6), 1264-1275 (2013).
  20. Ferrarelli, F., et al. Breakdown in cortical effective connectivity during midazolam-induced loss of consciousness. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 107 (6), 2681-2686 (2010).
  21. Ku, S. W., Lee, U., Noh, G. J., Jun, I. G., Mashour, G. A. Preferential inhibition of frontal-to-parietal feedback connectivity is a neurophysiologic correlate of general anesthesia in surgical patients. PLoS.One. 6 (10), 25155 (2011).
  22. Lee, M., et al. Network Properties in Transitions of Consciousness during Propofol-induced Sedation. Scientific Reports. 7 (1), 16791 (2017).
  23. Murphy, M., et al. Propofol anesthesia and sleep: a high-density EEG study. Sleep. 34 (3), 283-291 (2011).
  24. Murphy, C., Krause, B., Banks, M. Selective effects of isoflurane on cortico-cortical feedback afferent responses in murine non-primary neocortex. British Journal of Anaesthesiology. 123 (4), 488-496 (2019).
  25. Raz, A., et al. Preferential effect of isoflurane on top-down versus bottom-up pathways in sensory cortex. Frontiers in System Neurosciences. 8, 191 (2014).
  26. Schrouff, J., et al. Brain functional integration decreases during propofol-induced loss of consciousness. Neuroimage. 57 (1), 198-205 (2011).
  27. Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).
  28. Cruikshank, S. J., Urabe, H., Nurmikko, A. V., Connors, B. W. Pathway-Specific Feedforward Circuits between Thalamus and Neocortex Revealed by Selective Optical Stimulation of Axons. Neuron. 65 (2), 230-245 (2010).
  29. Gredell, J. A., Turnquist, P. A., MacIver, M. B., Pearce, R. A. Determination of diffusion and partition coefficients of propofol in rat brain tissue: implications for studies of drug action in vitro. BJA: British Journal of Anaesthesia. 93 (6), 810-817 (2004).
  30. Benkwitz, C., et al. Determination of the EC50 amnesic concentration of etomidate and its diffusion profile in brain tissue: implications for in vitro studies. Anesthesiology. 106 (1), 114-123 (2007).
  31. Franks, N. P., Lieb, W. R. Selective actions of volatile general anaesthetics at molecular and cellular levels. British Journal of Anaesthesia. 71 (1), 65-76 (1993).
  32. Honemann, C. W., Washington, J., Honemann, M. C., Nietgen, G. W., Durieux, M. E. Partition coefficients of volatile anesthetics in aqueous electrolyte solutions at various temperatures. Anesthesiology. 89 (4), 1032-1035 (1998).
  33. Au - Segev, A., Au - Garcia-Oscos, F., Au - Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. Journal of Visualized Experiments. (112), e54024 (2016).
  34. Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophysical Journal. 96 (5), 1803-1814 (2009).
  35. Lin, J. Y. A user's guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments. Experimental Physiology. 96 (1), 19-25 (2011).
  36. Banks, M. I., Pearce, R. A. Dual actions of volatile anesthetics on GABAA IPSCs: dissociation of blocking and prolonging effects. Anesthesiology. 90 (1), 120-134 (1999).
  37. Hagan, C. E., Pearce, R. A., Trudell, J. R., MacIver, M. B. Concentration measures of volatile anesthetics in the aqueous phase using calcium sensitive electrodes. Journal of Neuroscience Methods. 81, 177-184 (1998).

Tags

علم الأعصاب ، العدد 161 ، channelrhodopsins ، علم البصريات ، المهاد ، القشرة المخية الحديثة ، الأيزوفلوران ، التخدير ، الاستنشاق ، الفيزيولوجيا الكهربية ، تقنيات المشبك التصحيحي ، الخلايا العصبية الداخلية
التنشيط البصري الوراثي للمسارات الوراثية في شرائح الدماغ وتعديل الاستجابات بواسطة التخدير المتطاير
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Murphy, C. A., Raz, A., Grady, S.… More

Murphy, C. A., Raz, A., Grady, S. M., Banks, M. I. Optogenetic Activation of Afferent Pathways in Brain Slices and Modulation of Responses by Volatile Anesthetics. J. Vis. Exp. (161), e61333, doi:10.3791/61333 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter