Summary
Les tranches de cerveau ex vivo peuvent être utilisées pour étudier les effets des anesthésiques volatils sur les réponses évoquées aux entrées afférentes. L’optogénétique est utilisée pour activer indépendamment les afférences thalamocorticales et corticocorticales au néocortex non primaire, et les réponses synaptiques et réseau sont modulées avec l’isoflurane.
Abstract
Les anesthésiques influencent la conscience en partie via leurs actions sur les circuits thalamocorticaux. Cependant, la mesure dans laquelle les anesthésiques volatils affectent les composants cellulaires et de réseau distincts de ces circuits reste incertaine. Les tranches de cerveau ex vivo fournissent un moyen par lequel les chercheurs peuvent sonder des composants discrets de réseaux complexes et démêler les mécanismes potentiels sous-jacents aux effets des anesthésiques volatils sur les réponses évoquées. Pour isoler les effets potentiels des médicaments spécifiques au type cellulaire et à la voie dans les tranches de cerveau, les chercheurs doivent être en mesure d’activer indépendamment les voies des fibres afférentes, d’identifier les populations de cellules qui ne se chevauchent pas et d’appliquer des anesthésiques volatils sur le tissu en solution aqueuse. Dans ce protocole, des méthodes pour mesurer les réponses évoquées optogénétiquement à deux voies afférentes indépendantes vers le néocortex dans des coupes de cerveau ex vivo sont décrites. Les réponses extracellulaires sont enregistrées à l’activité du réseau de dosage et des enregistrements ciblés de patch cellulaire entier sont effectués dans les interneurones positifs à la somatostatine et à la parvalbumine. L’administration de concentrations physiologiquement pertinentes d’isoflurane par le liquide céphalo-rachidien artificiel pour moduler les réponses cellulaires et de réseau est décrite.
Introduction
Les anesthésiques volatils sont utilisés partout dans divers milieux cliniques et universitaires depuis plus d’un siècle. Des classes distinctes d’anesthésiques ont des cibles moléculaires uniques, souvent sans chevauchement 1,2,3, mais presque toutes produisent une perte de conscience. Bien que leurs effets comportementaux soient assez prévisibles, les mécanismes par lesquels les anesthésiques induisent une perte de conscience sont largement inconnus. Les anesthésiques peuvent finalement influencer à la fois le niveau et le contenu de la conscience via des actions sur les circuits corticothalamiques, perturbant l’intégration de l’information dans toute la hiérarchie corticale 4,5,6,7,8,9. Plus largement, la modulation des circuits corticothalamiques peut jouer un rôle dans expérimentalement 10 ou pharmacologiquement 11 états altérés de conscience, et peut également être impliquée dans le sommeil12 et dans les troubles physiopathologiques de la conscience 13,14.
Le caractère insaisissable des mécanismes sous-jacents à la perte et au retour de conscience pendant l’anesthésie peut être attribué en partie aux actions synergiques non linéaires des anesthésiques aux niveaux cellulaire, du réseau et des systèmes15. L’isoflurane, par exemple, supprime l’activité dans les régions cérébrales sélectionnées 16,17,18, altère la connectivité entre les régions cérébrales distantes 19,20,21,22,23 et diminue les réponses synaptiques d’une manière spécifique à la voie 24,25 . Les effets des anesthésiques, du niveau moléculaire au niveau systémique, sont nécessaires ou suffisants pour provoquer une perte de conscience restent incertains. En plus des recherches cliniques substantielles de la conscience utilisant des techniques non invasives 19,20,26, il est important que les expérimentateurs cherchent à démêler les interactions cellulaires et de réseau distinctes qui sous-servent l’expérience consciente.
En simplifiant les interactions complexes trouvées dans le cerveau intact, les tranches de cerveau ex vivo permettent l’étude de composants isolés des systèmes dynamiques du cerveau9. Une préparation en tranches réduites combine les avantages des structures anatomiques relativement intactes des circuits neuronaux locaux avec la polyvalence des manipulations in vitro. Cependant, jusqu’à récemment, des contraintes méthodologiques ont empêché l’étude des propriétés synaptiques et des circuits des entrées à longue portée dans les tranches de cerveau27,28; Le chemin tortueux des voies fibreuses corticothalamiques rendait l’activation des voies afférentes indépendantes pratiquement impossible par stimulation électrique.
L’étude des effets des agents anesthésiques sur les préparations de tranches de cerveau présente des défis supplémentaires. En l’absence d’un système respiratoire et circulatoire intact, les agents anesthésiques doivent être appliqués au bain et les concentrations doivent être soigneusement adaptées aux concentrations estimées au site d’effet. Pour de nombreux anesthésiques intraveineux, la lenteur de l’équilibre dans le tissu rend les investigations pharmacologiques traditionnelles laborieuses29,30. L’étude des effets des anesthésiques gazeux volatils dans les préparations ex vivo est plus facile à traiter, mais présente également des défis. Il s’agit notamment de convertir les doses de pression partielle inhalées en concentrations aqueuses et de la nécessité d’un système d’administration modifié du médicament dans les tissus par le liquide céphalo-rachidien artificiel31.
Ici, des méthodes sont décrites par lesquelles les chercheurs peuvent capitaliser sur les propriétés physico-chimiques bien documentées de l’isoflurane anesthésique volatil pour l’administration de médicaments à des tranches de cerveau ex vivo, activer des entrées spécifiques à la voie et à la couche dans une zone d’intérêt corticale avec une résolution spatio-temporelle élevée, et effectuer simultanément des enregistrements laminaires et des enregistrements ciblés de pinces patch à partir de populations sélectionnées de neurones. Combinées, ces procédures permettent aux chercheurs de mesurer les changements volatils induits par l’anesthésique dans plusieurs propriétés de réponse électrophysiologique observables, du niveau synaptique au niveau du réseau local.
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Protocol
Toutes les procédures impliquant des animaux décrites dans ce protocole ont été approuvées par l’École de médecine de l’Université du Wisconsin-Madison et le Comité de soin et d’utilisation des animaux de santé publique.
1. Des souris reproductrices pour exprimer une protéine rapporteur fluorescente dans des sous-populations interneuronales
- Associez une souris mâle tdTomato homozyoge dépendante de Cre à une souris femelle SOM-Cre homozygote ou à une souris femelle PV-Cre homozygote.
REMARQUE: D’autres populations neuronales spécifiques peuvent être ciblées en utilisant les lignées Cre appropriées. - Laissez la progéniture hétérozygote mûrir jusqu’à l’âge d’au moins 3 semaines avant de procéder. Pour les expériences décrites ici, le génotypage n’est pas nécessaire, car les parents homozygotes produisent une progéniture qui est hétérozygote pour la recombinase Cre recombinase spécifique au type cellulaire et les allèles rapporteurs Cre-dépendants.
2. Effectuer une injection stéréotaxique unilatérale de construction virale
- Réglez les réglages de l’extracteur de micropipettes pour les pipettes d’injection comme indiqué dans le manuel d’utilisation de l’instrument (voir le tableau 1 pour les réglages recommandés). Tirez sur la micropipette en verre.
- Casser l’extrémité de l’extrémité tranchante de la pipette de telle sorte que le diamètre de l’embout soit d’environ 30 μm avec une conicité minimale sur plusieurs millimètres.
- À l’aide de procédures documentées précédemment, décider du titre et du volume appropriés de virus à injecter. Dans les expériences décrites ici, 1,0 μL (titre: 3,1-5,7 TU / mL) injecté unilatéralement a donné de bons résultats.
- Remplissez le volume complet de la pipette avec de l’huile minérale. Chargez la pipette sur la microseringue et faites couler une petite quantité d’huile minérale à travers l’embout pour vous assurer que l’embout n’est pas bouché.
- Remplir au début au moins 1,0 μL de construction virale. Le vecteur viral adéno-associé recombinant utilisé dans ces expériences était AAV2-hSyn-hChR2(H134R)-EYFP.
- Disposez un champ stérile dans une zone chirurgicale. Stérilisez les outils pour la procédure stéréotaxique et placez-les sur le rideau.
- Anesthésier SOM-tdTomate ou PV-tdTomate hétérozygote animal en utilisant de l’isoflurane (3% pour l’induction, 1,5-2% pour l’entretien) et un mélange d’oxygène. Confirmer périodiquement le niveau chirurgical de l’anesthésie avec pincement des orteils tout au long de la chirurgie. Assurez-vous que l’animal ne va pas au-delà du plan chirurgical de l’anesthésie en surveillant les respirations toutes les 10 à 15 minutes.
- Rasez le haut de la tête de l’animal. Appliquez généreusement de l’alcool isopropylique à 70% et une solution à base d’iode sur la zone chirurgicale et une pommade ophtalmique sur les orbites pour éviter le dessèchement de la membrane. Administrer bupivacaïne/lidocaïne (rapport 1:1, 1,0 mg/kg) par voie sous-cutanée au site chirurgical pour l’anesthésie locale.
- Placez l’animal dans un cadre stéréotaxique.
- Utilisez le scalpel pour faire une incision le long de l’axe sagittal de la peau recouvrant la surface dorsale du crâne. Rétractez la peau à l’aide d’une pince. Hydrater le crâne avec une solution saline à 0,9% si nécessaire.
- Sur la surface du crâne, marquez légèrement l’intersection des coordonnées antérieures et latérales avec une croix au crayon. Percer un trou aux coordonnées appropriées dans le plan transversal (en mm par rapport à Bregma, pour l’injection du cortex cingulaire (Cg) : antérieure 0,2, latérale 0,3 ; pour l’injection postérieure du thalamus (Po) : postérieure 2,25, latérale 3,4).
NOTA : Les marquages doivent s’étendre au-delà des limites du trou de bavure pour fournir des indications pour le placement précis de la pipette. - Allumez et équilibrez la table d’air.
- Repositionner le manipulateur d’électrode du cadre stéréotaxique à 0° pour les injections dans Cg, ou à 45° dans le plan coronal pour les injections dans Po.
- Fixez la pompe à seringue au manipulateur d’électrodes. Fixez le contrôleur de la pompe à microseringue à la pompe à seringue.
- Naviguez à l’extrémité de la pipette près (mais sans toucher) la surface du cerveau, à l’intersection des marques créées à l’étape 2.11. Faire avancer la pipette d’environ 1 mm/s le long de son axe longitudinal dans le cerveau soit 0,9 mm (injection en Cg) ou 3,1 mm (injection en Po). Attendez 10 minutes avant de continuer.
- Injecter 1,0 μL de construction virale sur une période de 10 minutes (100 nL/min). Si l’on observe un écoulement du virus à partir du site d’insertion de la pipette, ralentir le débit d’injection à 50 nL/min.
- Après l’injection, attendez 10 minutes avant de rétracter lentement la pipette d’injection.
- Suture pour fermer l’incision du cuir chevelu et administrer 2-5 mg / kg de méloxicam par voie sous-cutanée.
- Arrêter l’isoflurane et surveiller l’animal pendant l’émergence de l’anesthésie. Laisser reposer selon les procédures décrites par le Comité de soin et d’utilisation des animaux de l’établissement, y compris l’administration ultérieure d’analgésiques.
3. Préparation de tranches de cerveau aiguës
- Attendez au moins 3 semaines pour l’expression de la construction virale avant de prélever du tissu.
- Préparer 1 L de liquide céphalo-rachidien artificiel pour la procédure de tranchage (tranchage du liquide céphalo-rachidien artificiel, sACSF). Voir le tableau 2 pour les ingrédients.
- Tout au long de la procédure de tranchage, fournir au sACSF un mélange dissous à 95 % d’O, 2/5 % de CO2, livré par tube de dispersion de gaz.
- Préparez un bain glacé pour le microtome à lame vibrante. Montez le stade d’échantillon glacé sur microtome et fixez la lame de saphir en place pour la section des tissus.
- Anesthésier la souris avec 3% d’isoflurane et d’oxygène jusqu’à perte du réflexe de redressement.
- Décapitater la souris à l’aide d’une guillotine et immerger immédiatement la tête dans 4°C sACSF. Pour préserver la santé du tissu, effectuez les étapes suivantes le plus rapidement possible.
- Ouvrez la cavité du crâne en faisant une petite incision à la base du crâne et en retirant doucement chaque plaque crânienne. Retirez délicatement la dure-mère sous-jacente.
- Pendant que le cerveau est encore dans la cavité du crâne, utilisez la lame de rasoir pour enlever le cervelet. Faites une deuxième coupe verticale le long du plan sagittal dans l’hémisphère gauche, juste latéralement à la ligne médiane.
- Préparer le bloc de tissu pour la section.
- Soulevez doucement le cerveau de la cavité crânienne. Placez le cerveau sur le papier filtre avec le plan plat et sagittal vers le bas. Guidez le papier filtre sur le gabarit de blocage et alignez le cerveau sur le contour du modèle sous-jacent (Figure supplémentaire 1).
- Faites deux coupes parallèles dans le plan coronal comme indiqué par les lignes sur le gabarit. Ajouter une petite goutte de sACSF pour garder le papier filtre humide, si nécessaire.
- Placer brièvement le bloc tissulaire dans un sACSF à 4°C pendant que l’étape 3.8.4 est effectuée.
- Appliquez une petite quantité de super colle sur le stade de l’échantillon glacé.
- Soulevez le bloc tissulaire du sACSF froid. Utilisez le coin d’une serviette absorbante pour évacuer l’excès de sACSF. Collez le plan coronal postérieur du bloc tissulaire au stade de l’échantillon, avec la surface dorsale du cerveau face à la lame de saphir.
- Recueillir des tranches de cerveau coronal de 500 μm d’épaisseur. Placer les tranches d’intérêt sur un treillis de nylon (figure supplémentaire 2) à 34 °C sACSF et laisser le récipient atteindre la température ambiante.
NOTE: Pour les expériences décrites ici, des enregistrements électrophysiologiques ont été recueillis à partir d’une section coronale centrée à environ 2,25 mm en arrière du bregma pour étudier une aire sensorielle non primaire, le cortex visuel secondaire médian (V2MM).
4. Préparation de poches expérimentales de liquide céphalo-rachidien artificiel (eACSF) contenant de l’isoflurane anesthésique volatil dissous
- Préparer 300 mL d’un mélange de bouillon d’isoflurane à 3,0 %.
- Dans un sac de gaz en polytétrafluoroéthylène scellé, ajouter ~100 mL de mélange gazeux O 2/5% CO2 à 95% à 20-30 mL d’isoflurane liquide et une petite quantité de solution saline à 0,9%. Attendre au moins 30 minutes pour permettre l’équilibrage de l’isoflurane entre les phases liquide et gazeuse.
- Déterminer la quantité d’isoflurane saturé gazeux, Vsat, à ajouter au sac de stock à l’aide de l’équation suivante :
où P%stock est la composition cible du gaz stock (3% dans ce cas), Vstock est le volume final du sac de gaz stock, P isoflurane est la pression partielle del’isoflurane à température ambiante (~240 mmHg) et Ptotal est la pression atmosphérique (~760 mmHg). - Ajouter la quantité calculée de gaz saturé dans un sac de gaz vide et remplir le sac avec un volume de mélange gazeux O 2/5% CO2 à 95% pour porter le volume total du sac de stock à 300 mL.
- Préparer 2 L de liquide céphalo-rachidien artificiel pour la perfusion de la tranche pendant l’expérience (ACSF expérimental, eACSF). Voir le tableau 2 pour les ingrédients. Dissoudre le mélange gazeux à 95 %O-2/5 % de CO2 dans la solution.
- Préparer deux sacs séparés de solutions de contrôle et d’isoflurane.
- Dans un sac de gaz polytétrafluoroéthylène vide, ajouter 600 mL d’eACSF et 600 mL de mélange gazeux à 95 % O 2/5 % CO2. Étiquetez ce sac comme Contrôle.
- Dans un autre sac de gaz en polytétrafluoroéthylène vide, ajouter 300 mL d’eACSF. Étiquetez ce sac comme Isoflurane.
- Choisissez une concentration en phase gazeuse équilibrée physiologiquement pertinente de l’isoflurane. Des expériences ont été menées en utilisant des concentrations de gaz équivalant à 1,3% d’isoflurane. Les souris perdent le réflexe de redressement, et probablement la conscience, à 0,9% d’isoflurane inhalé.
- Utilisez l’équation suivante pour calculer la concentration équivalente en phase gazeuse à température ambiante, P%(Tpièce)31 :
où P%(corps T) est la concentration en phase gazeuse physiologiquement pertinente choisie à l’étape 4.3.3, lapièce T est de 25 °C et lateneur en T est de 37 °C. - Utilisez l’équation suivante pour déterminer le volume de gaz du sac de gaz stock, Vstock, à ajouter à la solution d’isoflurane.
oùsolution V est le volume d’eACSF dans le sac ISOFLURANE (300 mL), P%(salle T) est entré à partir de l’équation (2), λ est le coefficient de partage Ostwald salin/gaz de l’isoflurane (λ = 1,232), et P%stock est la concentration en phase gazeuse du sac de gaz stock (P%stock = 3,0%). - Dans le sac de solution d’isoflurane, ajouter le volume de gaz du sac de gaz stock, Vstock, calculé à l’étape 4.3.5.
- Dans le sac de solution d’isoflurane, ajouter un volume de mélange gazeux à 95 % O 2/5 % CO2 pour porter le volume total de gaz dans le sac de solution d’isoflurane à 300 mL.
- Agiter les sacs de contrôle et d’isoflurane sur l’agitateur pendant au moins 1 h pour permettre l’équilibrage de la phase isoflurane.
- Une fois que toutes les données ont été recueillies, la concentration correcte peut être vérifiée à l’aide d’un moniteur de gaz anesthésique pour mesurer la concentration équilibrée d’isoflurane dans le gaz au-dessus de la solution restante dans le sac.
- Déclarez les concentrations expérimentales de gaz volatils dans les unités aqueuses, car les concentrations millimolaires sont plus résistantes aux changements de température. Utiliser l’équation suivante pour convertir la concentration en phase gazeuse à température ambiante, P%(Tpièce), en concentration aqueuse équivalente (Caqueuse, en mM)31 :
où α est le coefficient de partage salin/gaz Bunsen pour l’isoflurane à 25 °C32.
5. Préparation du matériel et des logiciels pour les enregistrements multicanaux
- Configurez un système d’acquisition de données à 16 canaux conformément aux instructions du fabricant.
REMARQUE: Plusieurs amplificateurs et systèmes d’acquisition de données disponibles dans le commerce peuvent être utilisés pour collecter des enregistrements multicanaux. Dans les expériences décrites ici, les signaux analogiques sont délivrés via un panneau de référence d’électrodes à deux amplificateurs, où ils sont amplifiés (2000x) et filtrés (0,1-10 kHz). Les entrées analogiques du système d’acquisition de données sont numérisées à 40 kHz. - Fixez l’adaptateur de coiffe à 16 canaux approprié à un micromanipulateur de microscope. Orientez l’adaptateur de manière à ce que les ports du connecteur femelle soient orientés vers le bas.
- Réglez l’angle de fonctionnement de ce micromanipulateur de manière à ce qu’il soit orienté vers le bas vers la chambre d’enregistrement, à un angle d’environ 70° par rapport à l’horizontale.
- Connectez l’entrée de la tête à une sonde 16 x 1 pour l’électrophysiologie in vitro via l’adaptateur de la tête ancré au micromanipulateur.
- Connectez le connecteur de sortie de la scène de tête au système d’acquisition de données.
- Installez le logiciel approprié pour l’acquisition de données. Configurez 15 canaux d’entrée pour qu’ils correspondent aux signaux d’entrée des 15 premiers contacts de sonde multicanaux. Configurez le canal restant pour recevoir l’entrée de l’électrode intracellulaire.
REMARQUE: Prenez soin de tenir compte des cartes d’électrodes et d’adaptateurs lors de la collecte et de l’analyse des données, afin de vous assurer que le signal approprié correspond au contact de l’électrode à partir duquel il a été recueilli.
6. Configuration des protocoles de stimulation lumineuse
- Configurez le système de distribution de lumière et installez le logiciel qui l’accompagne.
- Ouvrez le logiciel. Choisissez une configuration de câblage matériel dans laquelle une source de déclenchement (sortie numérique/TTL) fournit un signal de déclenchement au système de distribution de lumière et le système de distribution de lumière fournit un signal de déclenchement à une LED de 470 nm.
- Montez un objectif haute puissance. À l’aide d’un appareil photo numérique, calibrez l’objectif haute puissance pour une utilisation avec le système de distribution de lumière.
- Créez une nouvelle séquence de profils de stimulation lumineuse.
- Créez un modèle de choix. Dans les expériences décrites ici, un cercle de diamètre 150 μm est utilisé pour permettre l’activation spécifique de la couche des terminaisons axonales.
- Pour construire une séquence de profils, copiez et collez ce profil pour chacun des essais.
- Créez une liste de formes d’onde contenant des formes d’onde de n’importe quelle intensité lumineuse, durée d’impulsion ou nombre d’impulsions.
- Attribuez aléatoirement des formes d’onde à chaque profil. Chaque profil avec sa forme d’onde assignée correspond à une impulsion de déclenchement d’une entrée TTL numérique, ou à un essai.
- Enregistrez la séquence de profils.
- Dans le logiciel d’acquisition de données, créez un nouveau protocole.
- Définissez le nombre d’essais pour qu’il soit égal au nombre de profils dans la séquence de profils qui vient d’être créée.
- Choisissez des entrées de signal correspondant à celles configurées à l’étape 5.6. Configurez un protocole qui fournit une seule sortie TTL numérique, enregistrant à partir de ces 16 canaux d’entrée pendant une durée appropriée avant et après le déclenchement numérique.
7. Mise en place d’une sonde multicanal dans une tranche de tissu cérébral ex vivo
- Perfuse bulle eACSF (pas dans des sacs scellés) à 3-6 mL/min.
- Transférer la tranche de cerveau contenant la zone d’intérêt sur une grille de maillage dans une chambre de perfusion au microscope. Ancre avec harpe en platine (voir la figure supplémentaire 3).
- Faire pivoter la grille de maillage de telle sorte que la ligne de contacts des électrodes à l’extrémité distale de la sonde multicanal soit approximativement perpendiculaire à la surface piale.
- Sous éclairage à grand champ et sous contrôle fin du micromanipulateur, abaissez la sonde multicanal vers la surface de la tranche.
- Faire pivoter la tourelle du cube filtrant pour engager le cube filtrant approprié pour la visualisation de la protéine rapporteur fluorescente exprimée dans les terminaisons axonales des afférences corticales. Si nécessaire, faites pivoter la tranche pour aligner plus précisément la sonde avec la surface piale.
- Positionner la sonde juste au-dessus du plan de la tranche, à ~200 μm de la position finale de la cible le long de l’axe des abscisses, laissant au moins un canal à l’extérieur de la limite de la zone de tissu enregistrée
- Insérez lentement la sonde dans la tranche en déplaçant le manipulateur le long de son axe longitudinal. Pour minimiser les dommages au tissu, n’avancez la sonde que dans la mesure où les pointes tranchantes sont juste visibles sous la surface du tissu. Cela minimisera les dommages au tissu tout en s’assurant que les contacts de l’électrode sont en contact avec le tissu.
8. Patch clampant les neurones ciblés et obtenant une configuration de cellule entière
- Basculez la source eACSF vers la solution de contrôle en sac.
- Identifiez la cellule marquée par fluorescence pour l’enregistrement ciblé de la pince patch.
- Limitez le diaphragme du diaphragme de diaphragme de l’iris d’ouverture au plus petit diamètre. Engagez une lentille d’objectif de faible puissance et mettez le tissu au point.
- Centrez la lumière sur une zone de tissu adjacente (mais ne se chevauchant pas) à la sonde multicanaux.
- Engagez l’objectif d’immersion dans l’eau haute puissance (40x ou 60x), en faisant preuve de prudence pour éviter tout contact entre la sonde multicanal et la lentille de l’objectif.
- Faites pivoter la tourelle du cube filtrant pour engager le jeu de filtres approprié afin de permettre l’imagerie des cellules exprimant le marqueur fluorescent Cre-dépendant.
- Identifiez une cellule marquée par fluorescence comme cible pour l’enregistrement de la pince patch. Soulevez la lentille de l’objectif pour créer suffisamment d’espace pour abaisser une pipette de brassage.
- Chargez une pipette brassicole (voir Tableau 1) avec une solution interne (Tableau 2) et montez la pipette dans le support d’électrode. À l’aide d’une seringue de 1 mL, appliquer une pression positive correspondant à ~0,1 mL d’air.
- Abaissez la pipette patch dans la solution. Mettez la pointe de la pipette au point sous guidage visuel.
- Obtenir l’enregistrement des cellules entières à partir de la cellule ciblée en suivant les étapes précédemment démontrées33.
- Si vous prévoyez évaluer les changements apportés aux propriétés intrinsèques de la cellule (p. ex. résistance à l’entrée, vitesse de tir du potentiel d’action en réponse aux étapes actuelles), effectuez ces enregistrements. Sinon, passez au protocole de stimulation axonale ci-dessous.
9. Activation optogénétique spécifique à la couche des terminaisons axonales
- Manipulez le champ de vision dans le plan x-y pour aligner le profil de stimulation lumineuse avec l’emplacement souhaité sur la tranche.
- Chargez le protocole de stimulus lumineux et préparez le système de distribution de lumière à recevoir une impulsion TTL numérique.
- Activer optogénétiquement les terminaisons axonales tout en enregistrant simultanément les potentiels de champ extracellulaire et les fluctuations de la membrane intracellulaire.
- Remplacer la source eACSF par une solution d’isoflurane et laver le médicament pendant 15 min. Si nécessaire, collectez les enregistrements spontanés pendant le lavage.
- Répétez les étapes 9.2-9.3.
- Basculer la source eACSF sur Solution de contrôle et laver le médicament pendant 20 min. Si nécessaire, recueillir les enregistrements spontanés pendant le lavage.
- Répétez les étapes 9.2-9.3.
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Representative Results
Une chronologie des étapes décrites dans le protocole est illustrée à la figure 1. Les entrées corticales provenant de zones corticales d’ordre supérieur ou de noyaux thalamiques non primaires ont des champs terminaux qui se chevauchent partiellement dans la couche 1 du cortex visuel non primaire24. Pour isoler les voies afférentes thalamocorticales ou corticocorticales indépendantes, un vecteur viral contenant ChR2 et un rapporteur fluorescent eYFP dans Po ou Cg a été injecté. Les cellules situées dans le rayon d’injection absorbent le vecteur viral et, après 2 à 4 semaines, expriment le canal cationique non spécifique ChR2 et le rapporteur dans le soma et les axones saillants (Figure 2A). Des tranches coronales ont été collectées. Avec le cube filtrant approprié engagé, les axones exprimant la construction virale ont été imagés (Figure 2B). L’utilisation de ChR2 pour activer les terminaisons axonales permet l’activation des afférences sans la condition préalable à un soma attaché.
Les animaux utilisés dans les expériences décrites ici étaient des animaux hybrides SOM-tdTomato ou PV-tdTomato, qui expriment la protéine rapporteur fluorescente tdTomato dans les interneurones somatostatine (SOM+) ou parvalbumine positive (PV+), respectivement. Les interneurones SOM+ ou PV+ de la couche 2/3 ont été ciblés pour le serrage de patch sous guidage visuel avec le cube filtrant approprié engagé (couche 1C). Ces interneurones ont des dendrites dans la couche 1 et sont des cibles d’apports corticocorticaux (Figure 3A).
L’ajout de 125 mL de gaz isoflurane à 3,0 % et de 175 mL d’O 2/5 % de CO2 à 95 % dans un sac scellé a donné une concentration de gaz de 1,3 % avant l’équilibre. Gaz dissous dans eACSF selon son coefficient de partage; la concentration prévue d’isoflurane en phase gazeuse à température ambiante était de 0,6 % (figure 2D). Cela a été confirmé par un moniteur de gaz.
La tranche de tissu a été transférée dans la chambre d’enregistrement et la sonde d’enregistrement multicanal 16x1 a été placée orthogonalement aux lames corticales (Figure 2E). Un cercle de 150 μm de lumière de 470 nm centré sur la couche corticale 1 a été délivré via le trajet de la lumière objective, tandis que les potentiels de champ extracellulaire ont été collectés à l’aide de la sonde multicanal 16 x 1 et des enregistrements ciblés de patch cellulaire entier ont été effectués dans les interneurones. Un schéma de la configuration d’enregistrement est présenté à la figure 2F.
Des potentiels post-synaptiques (PSP) ont été observés dans les interneurones en réponse à un train de quatre impulsions lumineuses de 2 ms (10 Hz; Figure 3A). Des potentiels de champs locaux ont également été enregistrés (figure 3B). Densité de la source de courant (SDR; Figure 3C) et l’activité multi-unités (MUA; Figure 3D) ont été extraits des potentiels locaux des champs. Dix essais à plusieurs intensités lumineuses différentes ont été utilisés pour effectuer des analyses post-hoc. L’amplitude des puits de courant extraits du CSD a augmenté en fonction de l’intensité lumineuse (figure 4A). Une équation logistique non linéaire à trois paramètres a été ajustée aux données pour les comparaisons entre les voies. L’amplitude PSP a également augmenté avec l’amplitude du puits de courant (Figure 4B).
Les réponses synaptiques aux apports thalamocorticaux et corticocorticaux ont été mesurées pendant les conditions de contrôle, d’isoflurane (0,28 mM) et de récupération. Les réponses post-synaptiques de la somatostatine- (Figure 5A) aux stimuli corticocorticaux ont été supprimées pendant l’isoflurane, de même que les puits de courant évoqués (Figure 5B).
Figure 1 : Schéma décrivant la chronologie des étapes importantes du protocole.
Retour au début: Décrit la chronologie des étapes nécessaires à la reproduction des animaux transgéniques et l’expression du vecteur viral. Fond: Décrit les étapes et le calendrier de préparation du matériel et de réalisation de l’expérience le jour de la préparation des tranches. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Injection de vecteur viral et préparation ex vivo de tranches de cerveau coronales.
(A) Représentation schématique de l’injection d’un vecteur viral chez des souris hybrides SOM-tdTomato ou PV-tdTomato. (B) Des tranches coronales de la zone d’association pariétale médiale (mPtA) ont été récoltées, et les fibres afférentes thalamocorticales (en haut) ou corticocorticales (en bas) ont été identifiées par leur rapporteur eYFP dans la couche 1. Ce chiffre est modifié avec la permission de24. (C) Superposition de bornes axonales marquées eYFP dans la couche 1 (vert) et d’interneurones SOM+ marqués par tdTomato-(rouge) dans la couche superficielle 2/3. (D) Les sacs scellés ont été préparés avec un mélange 50:50 solution-gaz. E) Mise en place d’une sonde 16 x 1 dans mPtA (contour noir). (F) Schéma de la configuration de l’enregistrement dans la tranche corticale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Enregistrements intracellulaires et extracellulaires multicanaux simultanés dans une tranche corticale.
(A) Enregistrement du patch de pince de courant à cellules entières à partir du soma d’un interneurone PV+ de couche 2/3. Quatre impulsions (2 ms chacune, flèches bleues) de lumière bleue (2,2 mW) à 10 Hz ont été délivrées aux terminaisons axonales corticocorticales en L1. La moyenne (trace rouge) de dix essais (traces grises) est indiquée. (B) Données brutes provenant de 16 canaux de sonde extracellulaire 16 x 1. Les canaux placés dans le tissu cortical sont représentés en noir et ceux situés à l’extérieur du cortex en gris. (C) Un diagramme de densité de source de courant, extrait du signal de potentiel de champ local, montre les puits de courant synaptique (bleu) dans la couche 1. (D) L’activité multi-unités, générée par l’application d’un filtre passe-haut au signal de potentiel de champ local, isole l’activité de pointe évoquée dans les couches inférieures. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Comparaison des réponses des enregistrements dans deux tranches différentes.
Plusieurs intensités lumineuses ont été utilisées pour évoquer des réponses synaptiques dans la couche corticale 1. Pour chaque essai, l’amplitude maximale de la réponse évoquée a été extraite du puits de courant extracellulaire de couche 1 et des EPSP dans les interneurones PV+ de la couche 2/3. (A) Les profils de réponse extracellulaire des afférences thalamocorticales et corticocorticales sont comparés en fonction de l’intensité lumineuse. (B) La relation entre l’amplitude du puits de courant et l’amplitude EPSP dépend de la voie. Dans chaque voie de stimulation, les données de (A) et (B) ont été recueillies simultanément. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Application en bain d’isoflurane dissous dans l’eACSF pendant les enregistrements simultanés.
(A) Enregistrement intracellulaire de la pince de courant cellulaire entière à partir de l’interneurone SOM+ de couche 2/3 lors de l’activation des afférences corticocorticales pendant les conditions de contrôle, d’isoflurane et de lavage. Les lignes bleues verticales indiquent des stimuli lumineux (2 ms; 1,65 mW). (B) Trace de densité de source de courant extraite de l’électrode dans la couche 1. Les données ont été recueillies simultanément avec celles recueillies en (A). La récupération des réponses au lavage démontre une dépression des réponses synaptiques par l’isoflurane. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Micropipette pour injection de virus | ||||
| Verre | ID: 0,05 mm, OD: 0,11 mm | |||
| Boucles | 1 | |||
| Chaleur | Tirer | Vel | Heure | Pression |
| Rampe + 10 | 20 | 40 | 200 | 300 |
| Micropipette pour enregistrements de patch clamp à cellules entières | ||||
| Verre | ID: 1,1 mm, OD: 1,7 mm | |||
| Boucles | 4 | |||
| Chaleur | Tirer | Vel | Heure | Pression |
| Rampe | 0 | 25 | 250 | 500 |
Tableau 1 : Verre recommandé et paramètres pour tirer des micropipettes pour les injections virales et les enregistrements de patch clamp à cellules entières. Le verre utilisé pour les injections virales et les enregistrements de patch à cellules entières est décrit, ainsi que les paramètres pour tirer des micropipettes à l’aide de l’extracteur de micropipettes. Consultez les manuels d’instructions pour l’extracteur de micropipettes pour obtenir d’autres recommandations ou un réglage précis des réglages.
| Tranches ACSF, sACSF (en mM) | Expérience ACSF, eACSF (en mM) | |
| NaCl | 111 | 111 |
| NaHCO3 | 35 | 35 |
| HEPES | 20 | 20 |
| Kcl | 1.8 | 1.8 |
| CaCl2 | 1.05 | 2.1 |
| MgSO4 | 2.8 | 1.4 |
| KH2PO4 | 1.2 | 1.2 |
| glucose | 10 | 10 |
| Solution interne | ||
| K-gluconate | 140 | |
| NaCl | 10 | |
| HEPES | 10 | |
| L’EGTA | 0.1 | |
| MgATP | 4 | |
| NaGTP | 0.3 | |
| pH = 7,2 |
Tableau 2: Composition du liquide céphalo-rachidien artificiel et de la solution intracellulaire. Les réactifs et les concentrations pour sACSF, eACSF et la solution de pipette intracellulaire pour les enregistrements de patch clamp sont répertoriés.
Figure supplémentaire 1 : Modèle de préparation du bloc de tissu pour recueillir les tranches de cerveau. Le gabarit est ajusté à la taille appropriée, imprimé et collé sur une lame de microscope. Un bordereau de couverture est collé sur le gabarit pour prolonger son utilisation. Le bloc de tissu est placé sur un morceau de papier filtre avec le plan sagittal vers le bas, aligné sur le fond rose, et une coupe verticale est faite dans le plan coronal le long de la ligne noire. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.
Figure supplémentaire 2 : Chambre d’incubation des tranches de cerveau récoltées. La chambre est remplie de sACSF et barbotée avec un mélange gazeux à 95% O 2/5% CO2 via une aiguille courbée fixée à un tube. La plate-forme d’incubation est faite de nylon tendu sur un raccord circulaire en plastique. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.
Figure supplémentaire 3 : Structures en platine pour tranches dans la chambre d’enregistrement. La tranche de cerveau est transférée dans la chambre d’enregistrement via une pipette et placée sur un treillis de nylon, qui est tendu sur un morceau de fil de platine aplati en forme de fer à cheval et super collé en place. Une harpe en platine est placée sur la tranche de cerveau pour l’ancrer en place pendant l’enregistrement. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.
Tableau supplémentaire 1: Coefficients d’Ostwald (λ) et de Bunsen (α) pour les autres anesthésiques volatils. Adapter ce protocole à l’étude d’autres anesthésiques gazeux volatils, tels que l’halothane, le sévoflurane ou le desflurane. Remplacez les équations décrites dans le protocole par les coefficients appropriés énumérés dans ce tableau. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
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Discussion
Dans ce manuscrit, un protocole d’évaluation des réponses intra- et extracellulaires aux voies afférentes activées sélectivement dans des tranches de cerveau ex vivo est décrit.
L’utilisation d’outils optogénétiques et de schémas d’enregistrement parallèles permet aux chercheurs de sonder les réponses des populations locales aux entrées afférentes provenant de régions cérébrales éloignées, tout en enregistrant simultanément des populations ciblées d’interneurones. L’utilisation de la technologie optogénétique permet de préserver et d’activer les terminaisons axonales des projections afférentes même si leurs corps cellulaires ne sont plus attachés. Cela allège les restrictions géométriques précédemment imposées aux tranches ex vivo , car la préservation des connexions électriques à longue portée n’est plus primordiale. Néanmoins, il faut prendre soin de préparer les tranches dans un plan géométrique qui préserve toutes les connexions d’intérêt restantes. Par exemple, les cellules pyramidales sont orientées verticalement le long de la colonne corticale, et l’activité de réseau évoquée mesurée par les sondes multicanaux dans ces expériences nécessite que ces connexions locales soient préservées autant que possible. Ainsi, des tranches coronales ont été préparées pour garder la connectivité locale intacte.
Lors du choix des constructions optogénétiques et des protéines rapporteures fluorescentes pertinentes, les propriétés de leurs spectres d’excitation/émission et de leur optique microscopique doivent être prises en compte. La stimulation lumineuse persistante peut entraîner une inactivation partielle de nombreuses variantes de channelrhodopsine34, ce qui peut être évité en choisissant des protéines rapporteures dont les spectres d’excitation ne chevauchent pas celui de l’opsine. Des variantes alternatives avec des cinétiques ou des sensibilités à la lumière différentes peuvent également être choisies en fonction du paradigme expérimental35, y compris des manipulations utilisant des opsines excitatrices ou inhibitrices alternatives. Les cubes filtrants doivent également être alignés de manière appropriée avec les rapporteurs fluorescents choisis, de sorte que les terminaisons axonales afférentes ou les interneurones puissent être imagés indépendamment et sans activer les opsines exprimées. Pour tenir compte de la variabilité de l’expression du virus, il peut également être pertinent pour les chercheurs de normaliser toute activité induite optogénétiquement au niveau d’expression de la construction virale, mesuré par la sortie fluorescente de la protéine rapporteure.
L’administration de concentrations précalculées d’anesthésiques volatils pour trancher le tissu est également possible en utilisant les méthodes décrites ici. Lorsqu’ils choisissent des pourcentages d’équilibre gazeux physiologiquement pertinents appropriés, les chercheurs doivent tenir compte de la perte de 10 à 15 % de gaz isoflurane dissous entre la ligne de perfusion et le tissu36. Les méthodes applicables à l’isoflurane ont été présentées, mais d’autres médicaments tels que l’halothane, le sévoflurane ou le desflurane peuvent être manipulés de la même manière en utilisant les coefficients d’Ostwald et de Bunsen appropriés (tableau supplémentaire 1). Les propriétés de répartition des anesthésiques volatils garantissent qu’ils se dissoudront de manière prévisible dans l’ACSF. Cependant, étant donné que les pressions partielles sont plus sensibles aux changements de température que les concentrations aqueuses EC50 37, les pourcentages de volume d’équilibre gazeux des anesthésiques volatils doivent être convertis en concentrations millimolaires prévues à température ambiante afin de comparer les effets observés aux doses physiologiquement pertinentes in vivo. S’ils choisissent d’étudier des anesthésiques intraveineux tels que l’étomidate ou le propofol dans des tranches de cerveau, les chercheurs doivent tenir compte des profils de diffusion des médicaments à l’étude, car les temps d’équilibration et les concentrations physiologiquement pertinentes peuvent varier considérablement30.
Dans ce manuscrit, un protocole est décrit pour tester les effets des anesthésiques volatils sur des composants distincts des circuits thalamocorticaux dans des tranches de cerveau ex vivo. Bon nombre des variables et des paramètres des méthodes décrites peuvent être manipulés pour des recherches plus approfondies. Par exemple, différentes zones du cerveau, voies afférentes, cibles cellulaires ou anesthésiques volatils peuvent être étudiés en adaptant les méthodes décrites pour répondre à de nouvelles questions. Combinée à d’autres méthodes théoriques et expérimentales, l’étude de composants cellulaires et de réseaux uniques à l’aide de tranches de cerveau ex vivo fera progresser notre compréhension du cerveau dynamique et des changements qu’il subit lors de changements pharmacologiques et physiopathologiques de la conscience.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs remercient Bryan Krause pour son soutien technique et ses conseils sur ce projet.
Ce travail a été soutenu par l’International Anesthesia Research Society (IMRA à AR), les National Institutes of Health (R01 GM109086 à MIB) et le Département d’anesthésiologie, École de médecine et de santé publique, Université du Wisconsin, Madison, WI, États-Unis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.5x broadfield objective lens | Olympus | MPLFLN2.5X | |
| 40x water immersion objective lens | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| 95% O2/5% CO2 mixture | Airgas | Z02OX95R2003045 | |
| A16 probe | NeuroNexus | A16x1-2mm-100-177-A16 | 16-channel probe |
| AAV2-hSyn-hChR2(H134R)-EYFP | Karl Deisseroth Lab, UNC Vector Core | ||
| Anesthetic gas monitor (POET II) | Criticare | 602-3A | |
| ATP, Magnesium Salt | Sigma Aldrich | A9187 | intracellular solution |
| B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J | The Jackson Laboratory | 007914 | Cre-dependent tdTomato mouse |
| B6;129P2-Pvalbtm1(cre)Arbr/J | The Jackson Laboratory | 008069 | PV-Cre mouse |
| Belly Dancer Shaker | Thomas Scientific | 1210H86-TS | for equilibration of sealed gas bags |
| Betadine solution | Generic brand | ||
| Bleach | Generic brand | for silver chloriding patch clamp electrode | |
| Bupivicaine | |||
| Calcium Chloride (CaCl2) | Dot Scientific | DSC20010 | ACSF |
| Capillary glass (patch clamp recordings) | King Precision Glass, Inc. | KG-33 | Borosilicate, ID: 1.1mm, OD: 1.7mm, Length: 90.0mm |
| Capillary glass (viral injections) | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | 3.5" |
| Control of junior micromanipulator | Luigs and Neumann | SM8 | for control of junior micromanipulator |
| Control of manipulators and shifting table | Luigs and Neumann | SM7 | for control of multichannel electrode and shifting table |
| Digidata 1440A + Clampex 10 | Molecular Devices | 1440A | Digitizer and software |
| E-3603 tubing | Fisher Scientific | 14171208 | for delivery of 95% O2/5% CO2 gas mixture to incubation chamber + application of pressure during patch clamping |
| EGTA | Dot Scientific | DSE57060 | intracellular solution |
| ERP-27 EEG Reference/Patch Panel | Neuralynx | Retired | |
| Filling needle | World Precision Instruments | 50821912 | for filling patch clamp pipettes |
| Filter cube for imaging EYFP | Olympus | U-MRFPHQ | |
| Filter paper | Fisher Scientific | 09801E | lay over slice template during preparation of tissue block |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | 2.5x2.5 Box filament |
| Gas dispersion tube | Sigma Aldrich | CLS3953312C | |
| Glass syringe (100 mL) | Sigma Aldrich | Z314390 | for filling gas-sealed bags |
| Gluconic Acid, Potassium Salt (K-gluconate) | Dot Scientific | DSG37020 | intracellular solution |
| Glucose | Dot Scientific | DSG32040 | ACSF |
| GTP, Sodium Salt | Sigma Aldrich | G8877 | intracellular solution |
| Headstage-probe adaptor | NeuroNexus | A16-OM16 | adaptor to connect 16-channel probe to headstage input |
| Hemostatic Forceps | VWR International | 76192-096 | |
| HEPES | Dot Scientific | DSH75030 | ACSF,intracellular solution |
| HS-16 Headstage | Neuralynx | Retired | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Isopropyl alcohol (70%) | VWR International | 101223-746 | |
| Junior micromanipulator | Luigs and Neumann | 210-100 000 0090-R | for manipulation of patch clamp electrode |
| LED Light Source Control Module | Mightex | BLS-PL02_US | optogenetic light source control |
| Lidocaine | |||
| Lynx-8 Amplifier | Neuralynx | Retired | |
| Lynx-8 Power Supply | Neuralynx | Retired | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | Dot Scientific | DSM24300 | ACSF |
| mCherry, Texas Red filter cube | Chroma | 49008 | for imaging tdTomato fluorescent reporter |
| Meloxicam | |||
| Micropipette holder | Fisher Scientific | NC9044962 | |
| Microsyringe pump | World Precision Instruments | UMP3-4 | |
| Mineral oil | Generic brand | ||
| MultiClamp 700A | Molecular Devices/Axon Instruments | 700A | Amplifier |
| Nitrogen (for air table) | Airgas | NI200 | |
| Nylon mesh | Fisher Scientific | 501460083 | stretched over horseshoe of flattened platinum wire, slice rest on top of this during recordings |
| Nylon, cut from pantyhose | Generic brand | small piece to create slice platform in incubation chamber, single fibers to create platinum harp | |
| Ophthalmic ointment | Fisher Scientific | NC1697520 | |
| Pipette | Dot Scientific | 307 | For transferring tissue to rig |
| Platinum wire | VWR International | BT124000 | 2 cm, flattened, to make platinum harp |
| Polygon400 | Mightex | DSI-E-0470-0617-000 | optogenetic light delivery system, comes with PolyScan2 software |
| Potassium Chloride (KCl) | Dot Scientific | DSP41000 | ACSF |
| Potassium Phosphate (KH2PO4) | Dot Scientific | DSP41200 | ACSF |
| Razor blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Sapphire blade (for vibratome) | VWR International | 100492-502 | |
| Scalpel blade | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-361445 | |
| Sealed gas bag | Fisher Scientific | 109236 | |
| Shifting table for microscope | Luigs and Neumann | 380FMU | |
| Sodium Bicarbonate (HCO3-) | Dot Scientific | DSS22060 | ACSF |
| Sodium Chloride (NaCl) | Dot Scientific | DSS23020 | ACSF, intracellular solution |
| Ssttm2.1(cre)Zjh/J (SOM-IRES-Cre) | The Jackson Laboratory | 013044 | SOM-Cre mouse |
| Stereotaxic instrument | Kopf | Model 902 | Dual Small Animal |
| Super glue | Staples | 886833 | to fix tissue block to specimen stage during slice preparation |
| Surgical drill | RAM Products Inc. | DIGITALMICROTORQUE | Microtorque II |
| Syringe (1 mL) with LuerLock tip | Fisher Scientific | 309628 | for application of pressure during patch clamping |
| Syringe (1 mL) with slip tip | WW Grainger, Inc. | 19G384 | for filling patch clamp pipettes |
| Syringe Filters | VWR International | 66064-414 | |
| Upright microscope | Olympus | BX51 | |
| Vibrating microtome | Leica Biosystems | VT1000S | |
| Wypall towels | Fisher Scientific | 19-042-427 |
References
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