Summary
Срезы мозга ex vivo могут быть использованы для изучения влияния летучих анестетиков на вызванные реакции на афферентные входы. Оптогенетика используется для независимой активации таламокортикальных и кортикокортикальных афферентов к непервичной неокортексе, а синаптические и сетевые реакции модулируются изофлураном.
Abstract
Анестетики влияют на сознание частично через свои действия на таламокортикальные цепи. Однако степень, в которой летучие анестетики влияют на различные клеточные и сетевые компоненты этих цепей, остается неясной. Срезы мозга ex vivo обеспечивают средство, с помощью которого исследователи могут исследовать дискретные компоненты сложных сетей и распутывать потенциальные механизмы, лежащие в основе воздействия летучих анестетиков на вызванные реакции. Чтобы изолировать потенциальные эффекты лекарств, специфичных для типа клеток и путей, в срезах мозга исследователи должны быть в состоянии независимо активировать пути афферентных волокон, идентифицировать неперекрывающиеся популяции клеток и применять летучие анестетики к ткани в водном растворе. В этом протоколе описаны методы измерения оптогенетически вызванных реакций на два независимых афферентных пути к неокортексу в срезах мозга ex vivo. Внеклеточные реакции регистрируются для анализа сетевой активности, а целевые записи зажимов цельноклеточного пластыря проводятся в соматостатин- и парвальбумин-положительных интернейронах. Описана доставка физиологически значимых концентраций изофлурана через искусственную спинномозговую жидкость для модуляции клеточных и сетевых реакций.
Introduction
Летучие анестетики повсеместно используются в различных клинических и академических условиях уже более века. Различные классы анестетиков имеют уникальные, часто не перекрывающиеся молекулярные мишени 1,2,3, но почти все они вызывают бессознательное состояние. Хотя их поведенческие эффекты вполне предсказуемы, механизмы, с помощью которых анестетики вызывают потерю сознания, в значительной степени неизвестны. Анестетики могут в конечном итоге влиять как на уровень, так и на содержание сознания посредством действий на кортикоталамические цепи, нарушая интеграцию информации по всей корковой иерархии 4,5,6,7,8,9. В более широком смысле, модуляция кортикоталамических цепей может играть роль в экспериментально10 или фармакологически11 измененных состояниях сознания, а также может быть вовлечена в сон12 и в патофизиологические расстройства сознания13,14.
Неуловимость механизмов, лежащих в основе потери и возвращения сознания во время анестезии, может быть частично объяснена нелинейными, синергетическими действиями анестетиков на клеточном, сетевом и системном уровнях15. Изофлуран, например, подавляет активность в выбранных областях мозга 16,17,18, ухудшает связь между удаленными областями мозга 19,20,21,22,23 и уменьшает синаптические реакции специфическим для пути способом 24,25 . Какие эффекты анестетиков, от молекулярного до системного уровня, необходимы или достаточны для потери сознания, остается неясным. В дополнение к существенным клиническим исследованиям сознания с использованием неинвазивных методов 19,20,26, важно, чтобы экспериментаторы стремились распутать различные клеточные и сетевые взаимодействия, которые обслуживают сознательный опыт.
Упрощая сложные взаимодействия, обнаруженные в неповрежденном мозге, срезы мозга ex vivo позволяют изучать изолированные компоненты динамических систем мозга9. Препарат с уменьшенным срезом сочетает в себе преимущества относительно неповрежденных анатомических структур локальных нейронных цепей с универсальностью манипуляций in vitro. Однако до недавнего времени методологические ограничения препятствовали изучению синаптических и цепных свойств дальнобойных входов в срезах мозга 27,28; извилистый путь кортикоталамических волоконных трактов сделал активацию независимых афферентных путей практически невозможной с помощью электрической стимуляции.
Изучение влияния анестетиков на препараты среза мозга создает дополнительные проблемы. При отсутствии интактной дыхательной и кровеносной системы обезболивающие средства должны применяться в ванне, а концентрации тщательно сопоставляться с расчетными концентрациями в месте воздействия. Для многих внутривенных анестетиков медленная скорость уравновешивания в тканях делает традиционные фармакологические исследования трудоемкими29,30. Исследование влияния летучих газовых анестетиков в препаратах ex vivo является более сговорчивым, но также представляет собой проблемы. К ним относятся преобразование ингаляционных доз парциального давления в водные концентрации и необходимость модифицированной системы доставки лекарственного средства в ткани через искусственную спинномозговую жидкость31.
Здесь описаны методы, с помощью которых исследователи могут извлечь выгоду из хорошо документированных физико-химических свойств летучего анестетика изофлурана для доставки лекарств в срезы мозга ex vivo, активировать специфические для пути и слоя входы в область коры, представляющую интерес, с высоким пространственно-временным разрешением и проводить одновременные ламинарные записи и целевые записи зажимов пластырей из отдельных популяций нейронов. В совокупности эти процедуры позволяют исследователям измерять летучие анестетик-индуцированные изменения в нескольких наблюдаемых электрофизиологических свойствах ответа, от синаптического до локального сетевого уровня.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры с участием животных, описанные в этом протоколе, были одобрены Медицинской школой Университета Висконсина-Мэдисона и Комитетом по уходу за животными и их использованию.
1. Разведение мышей для экспрессии флуоресцентного репортерного белка в субпопуляциях интернейронов
- Пара гомозиогичных, cre-зависимых tdTomato самцов мыши с гомозиготной самкой SOM-Cre или гомозиготной pv-Cre самкой мыши.
ПРИМЕЧАНИЕ: Другие специфические нейронные популяции могут быть нацелены с использованием соответствующих линий Cre. - Позвольте гетерозиготному потомству созреть, по крайней мере, до 3-недельного возраста, прежде чем продолжить. Для экспериментов, описанных здесь, генотипирование не является необходимым, так как гомозиготные родители производят потомство, которое является гетерозиготным как для клеточного типа-специфического Cre-рекомбиназы, так и для Cre-зависимых репортерных аллелей.
2. Выполнение односторонней стереотаксической инъекции вирусной конструкции
- Отрегулируйте параметры съемника микропипетки для инъекционных пипеток, как указано в руководстве по эксплуатации прибора (рекомендуемые настройки см. в таблице 1 ). Потяните стеклянную микропипетку.
- Разбейте кончик острого конца пипетки так, чтобы диаметр наконечника составлял примерно 30 мкм с минимальным сужением на несколько миллиметров.
- Используя ранее задокументированные процедуры, определитесь с соответствующим титром и объемом вируса, который будет введен. В экспериментах, описанных здесь, инъекции 1,0 мкл (титр: 3,1-5,7 TU/мл) в одностороннем порядке давали хорошие результаты.
- Наполните весь объем пипетки минеральным маслом. Загрузите пипетку на микрошприц и пропустите небольшое количество минерального масла через наконечник, чтобы наконечник не засорился.
- Передняя засыпка не менее 1,0 мкл вирусной конструкции. Рекомбинантным аденоассоциированным вирусным вектором, используемым в этих экспериментах, был AAV2-hSyn-hChR2(H134R)-EYFP.
- Устройте стерильную драпировку в хирургической зоне. Стерилизуйте инструменты для стереотаксической процедуры и поместите их на драпировку.
- Обезболивают SOM-tdTomato или PV-tdTomato гетерозиготным животным с использованием изофлурана (3% для индукции, 1,5-2% для поддержания) и кислородной смеси. Периодически подтверждают хирургический уровень анестезии с защемлением пальцев ног на протяжении всей операции. Убедитесь, что животное не выходит за рамки хирургического плана анестезии, контролируя дыхание каждые 10-15 минут.
- Побрить верхнюю часть головы животного. Нанесите 70% изопропиловый спирт и раствор на основе йода обильно на хирургическую область и офтальмологическую мазь на глазницы для предотвращения высыхания мембраны. Вводят бупивакаин/лидокаин (соотношение 1:1, 1,0 мг/кг) подкожно в хирургический участок для местного анестетика.
- Поместите животное в стереотаксическую рамку.
- Используйте скальпель, чтобы сделать разрез вдоль сагиттальной оси кожи, покрывающей дорсальную поверхность черепа. Втягивайте кожу с помощью щипцов. Увлажняйте череп 0,9% физиологическим раствором по мере необходимости.
- На поверхности черепа слегка отметьте пересечение передней и боковой координат крестом карандашом. Просверлите отверстие по соответствующим координатам в поперечной плоскости (в мм относительно Брегмы, для инъекции поясной коры (Cg): передней 0,2, боковой 0,3; для задней таламусной (Po) инъекции: задняя 2,25, боковая 3,4).
ПРИМЕЧАНИЕ: Маркировка должна выходить за пределы отверстия заусенца, чтобы обеспечить руководство для точного размещения пипетки. - Включите и уравновесьтесь воздушным столом.
- Перепозиционирование электродного манипулятора стереотаксической рамки под 0° для инъекций в Cg или 45° в корональной плоскости для инъекций в Po.
- Прикрепите шприцевой насос к электродному манипулятору. Прикрепите контроллер микрошприцевого насоса к шприцевому насосу.
- Перемещайтесь кончиком пипетки вблизи (но не касаясь) поверхности мозга, на пересечении отметин, созданных в Шаге 2.11. Выдвигайте пипетку со скоростью примерно 1 мм/с вдоль ее продольной оси в мозг либо на 0,9 мм (инъекция в Cg), либо на 3,1 мм (инъекция в Po). Подождите 10 минут, прежде чем продолжить.
- Вводят 1,0 мкл вирусной конструкции в течение 10 мин (100 нл/мин). Если наблюдается попадание вируса из места введения пипетки, замедляют скорость инъекции до 50 нл/мин.
- После инъекции подождите 10 мин, прежде чем медленно втягивать инъекционную пипетку.
- Шов для закрытия разреза кожи головы и введения 2-5 мг/кг мелоксикама подкожно.
- Прекратить прием изофлурана и контролировать животных во время выхода из наркоза. Позволяют восстанавливаться в соответствии с процедурами, описанными Комитетом по уходу за животными и их использованию, включая дальнейшее введение анальгетиков.
3. Подготовка острых срезов мозга
- Подождите не менее 3 недель для экспрессии вирусной конструкции перед сбором ткани.
- Подготовьте 1 л искусственной спинномозговой жидкости для процедуры нарезки (нарезка искусственной спинномозговой жидкости, sACSF). Ингредиенты см. в таблице 2 .
- На протяжении всей процедуры нарезки поставлять sACSF растворенной смесью 95% O2/5% CO2 , доставляемой через газовую дисперсионную трубку.
- Подготовьте ледяную ванну для вибрационного микротома лезвия. Установите ледяную стадию образца на микротом и закрепите сапфировое лезвие на месте для сечения тканей.
- Обезболивают мышь 3% изофлураном и кислородом до потери корректирующего рефлекса.
- Обезглавить мышь с помощью гильотины и немедленно погрузить голову в sACSF при температуре 4°C. Чтобы сохранить здоровье тканей, выполните следующие шаги как можно быстрее.
- Откройте полость черепа, сделав небольшой разрез у основания черепа и аккуратно удалив каждую пластину черепа. Аккуратно удалите подстилающую твердую мозговую оболочку.
- Пока мозг все еще находится в полости черепа, используйте лезвие бритвы, чтобы удалить мозжечок. Сделайте второй вертикальный разрез вдоль сагиттальной плоскости в левом полушарии, только сбоку от средней линии.
- Подготовьте тканевый блок к сечению.
- Осторожно поднимите мозг из полости черепа. Поместите мозг на фильтровальную бумагу плоской сагиттальной плоскостью вниз. Наведите фильтровальную бумагу на блокирующий шаблон и выровняйте мозг по контуру базового шаблона (дополнительный рисунок 1).
- Сделайте два параллельных разреза в корональной плоскости, как указано линиями на шаблоне. Добавьте небольшую каплю sACSF, чтобы фильтровальная бумага оставалась влажной, если это необходимо.
- Поместите тканевый блок в 4°C sACSF ненадолго, пока проводится этап 3.8.4.
- Нанесите небольшое количество суперклея на стадию ледяного образца.
- Поднимите тканевый блок от холодного sACSF. Используйте угол абсорбирующего полотенца, чтобы удалить избыток sACSF. Приклейте заднюю корональную плоскость тканевого блока к стадии образца, при этом дорсальная поверхность мозга обращена к сапфировому лезвию.
- Соберите корональные срезы мозга толщиной 500 мкм. Поместите интересующие ломтики на нейлоновую сетку (дополнительный рисунок 2) при 34 °C sACSF и дайте контейнеру достичь комнатной температуры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для экспериментов, описанных здесь, электрофизиологические записи были собраны из коронального сечения, центрированного примерно на 2,25 мм позади брегмы, для изучения непервичной сенсорной области, медиальной вторичной зрительной коры (V2MM).
4. Приготовление экспериментальных пакетов с искусственной спинномозговой жидкостью (eACSF), содержащих растворенный летучий анестетик изофлуран
- Готовят 300 мл запасной смеси 3,0% изофлурана.
- В герметичный газовый мешок политетрафторэтилена добавляют ~100 мл 95% O2/5% газовой смесиCO2 в 20-30 мл жидкого изофлурана и небольшое количество 0,9% физиологического раствора. Подождите не менее 30 минут, чтобы обеспечить равновесие изофлурана между жидкой и газовой фазами.
- Определите количество насыщенного газообразного изофлурана, Vsat, чтобы добавить в запасной мешок, используя следующее уравнение:
где P% stock - целевой состав запасного газа (3% в данном случае), Vstock - конечный объем запасного газового мешка, Pизофлуран - парциальное давление изофлунана при комнатной температуре (~240 мм рт.ст.), а Ptotal - атмосферное давление (~760 мм рт.ст.). - Добавьте расчетное количество насыщенного газа в пустой газовый мешок и заполните мешок объемом 95% O2/5% газовой смеси CO2 , чтобы довести общий объем запасного мешка до 300 мл.
- Подготовьте 2 л искусственной спинномозговой жидкости для перфузии среза во время эксперимента (экспериментальный ACSF, eACSF). Ингредиенты см. в таблице 2 . Растворить 95% O2/5% CO2 газовой смеси в растворе.
- Приготовьте два отдельных пакета растворов Control и Isoflurane.
- В пустой газовый мешок политетрафторэтилена добавить 600 мл eACSF и 600 мл газовой смеси 95% O2/5% CO2 . Пометьте этот пакет как Контрольный.
- В другой пустой газовый мешок политетрафторэтилена добавьте 300 мл eACSF. Пометьте этот пакет как Изофлуран.
- Выберите физиологически значимую уравновешенную концентрацию изофлурана в газовой фазе. Эксперименты проводились с использованием концентраций газа, эквивалентных 1,3% изофлурана. Мыши теряют корректирующий рефлекс и, предположительно, сознание при 0,9% вдыхания изофлурана.
- Используйте следующее уравнение для расчета эквивалентной концентрации газовой фазы при комнатной температуре, P%(Tкомната)31:
где P%(тело T) - физиологически значимая концентрация газовой фазы, выбранная на этапе 4.3.3,T-комната составляет 25 °C, аT-тело - 37 °C. - Используйте следующее уравнение для определения объема газа из запасного газового мешка, Vзапаса, для добавления в раствор Изофлурана.
гдеV-раствор - объем eACSF в изофлурановом мешке (300 мл), P%(Tкомната) вводится из уравнения (2), λ - коэффициент разделения Оствальда на солевой раствор изофлурана (λ = 1,232), а P% - концентрация газовой фазы запасного газового мешка (P%stock = 3,0%). - В мешок для раствора изофлурана добавьте объем газа из запасного газового мешка, Vзапаса, рассчитанный на этапе 4.3.5.
- В мешок для раствора изофлурана добавьте объем газовой смеси 95% O2/5% CO2 , чтобы довести общий объем газа в мешке для раствора изофлурана до 300 мл.
- Встряхните пакеты Control и Isoflurane на шейкере в течение не менее 1 ч, чтобы обеспечить равновесие фазы изофлурана.
- После того, как все данные были собраны, правильная концентрация может быть проверена с помощью монитора анестезирующего газа для измерения эквивалентной концентрации газа изофлурана над оставшимся раствором в пакете.
- Сообщайте об экспериментальных концентрациях летучих газов в водных единицах, поскольку миллимолярные концентрации более устойчивы к изменениям температуры. Используйте следующее уравнение для преобразования концентрации газовой фазы при комнатнойтемпературе, P%(T комнатная), в эквивалентную воднуюконцентрацию (C в водном растворе, в мМ)31:
где α - коэффициент разделения соляной соль/газ Бунзена для изофлурана при 25°C32.
5. Подготовка аппаратного и программного обеспечения для многоканальной записи
- Настройте 16-канальную систему сбора данных в соответствии с инструкциями производителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для сбора многоканальных записей может использоваться несколько коммерчески доступных усилителей и систем сбора данных. В экспериментах, описанных здесь, аналоговые сигналы доставляются через панель сравнения электродов на два усилителя, где они усиливаются (2000x) и фильтруются (0,1-10 кГц). Аналоговые входы в систему сбора данных оцифровываются на частоте 40 кГц. - Прикрепите соответствующий 16-канальный адаптер головной ступени к микроманипулятору микроскопа. Ориентируйте адаптер так, чтобы порты разъема были направлены вниз.
- Отрегулируйте угол работы этого микроманипулятора таким образом, чтобы он был ориентирован вниз к записывающей камере, под углом примерно 70° относительно горизонтали.
- Подключите вход головной ступени к зонду 16 x 1 для электрофизиологии in vitro через адаптер головной ступени, закрепленный на микроманипуляторе.
- Подключите выходной разъем головного каскада к системе сбора данных.
- Установите соответствующее программное обеспечение для сбора данных. Сконфигурируйте 15 входных каналов в соответствии с входными сигналами от первых 15 многоканальных контактов зонда. Сконфигурируйте оставшийся канал для приема входных данных от внутриклеточного электрода.
ПРИМЕЧАНИЕ: При сборе и анализе данных необходимо учитывать карты электродов и адаптеров, чтобы убедиться, что соответствующий сигнал соответствует контакту электрода, с которого он был собран.
6. Настройка протоколов световой стимуляции
- Настройте систему доставки света и установите сопутствующее программное обеспечение.
- Откройте программное обеспечение. Выберите конфигурацию аппаратной проводки, в которой источник триггера (цифровой / TTL-выход) подает сигнал Trigger In в систему доставки света, а система доставки света обеспечивает сигнал Trigger Out на светодиод 470 нм.
- Установите мощный объектив. Используя цифровую камеру, откалибруйте мощный объектив для использования с системой подачи света.
- Создайте новую последовательность профилей световой стимуляции.
- Создайте шаблон выбора. В экспериментах, описанных здесь, круг диаметром 150 мкм используется для обеспечения послойной активации клемм аксона.
- Чтобы создать последовательность профилей, скопируйте и вставьте этот профиль для каждого из любого количества испытаний.
- Создайте список осциллограмм, содержащий формы сигналов любой интенсивности света, длительности импульса или номера импульса.
- Случайным образом назначайте формы сигналов каждому профилю. Каждый профиль с присвоенной ему формой сигнала соответствует одному триггерному импульсу от входа Digital TTL или одному испытанию.
- Сохраните последовательность профилей.
- В программном обеспечении для сбора данных создайте новый протокол.
- Задайте для числа пробных версий равное количеству профилей в только что созданной последовательности профилей.
- Выберите сигнальные входы, соответствующие тем, которые настроены на шаге 5.6. Настройте протокол, который обеспечивает один цифровой выход TTL, записывая с этих 16 входных каналов в течение соответствующего периода времени до и после цифрового триггера.
7. Размещение многоканального зонда в срезе мозговой ткани ex vivo
- Перфьюз пузырьков eACSF (не в герметичных пакетах) при 3-6 мл/мин.
- Перенесите срез мозга, содержащий интересующую область, на сетку сетки в перфузионной камере микроскопа. Якорь с платиновой арфой (см. Дополнительный рисунок 3).
- Поверните сетку сетки таким образом, чтобы линия контактов электрода на дистальном конце многоканального зонда была примерно перпендикулярна поверхности пиала.
- При широкоугольном освещении и под тонким контролем микроманипулятора опустите многоканальный зонд к поверхности среза.
- Поверните башню куба фильтра, чтобы задействовать соответствующий куб фильтра для визуализации флуоресцентного репортерного белка, экспрессируемого в аксонных терминалах корковых афферентов. При необходимости поверните срез, чтобы более точно выровнять зонд с поверхностью пиала.
- Расположите зонд чуть выше плоскости среза, ~200 мкм ниже конечного целевого положения вдоль оси X, оставив по меньшей мере один канал за пределами границы регистрируемой области ткани.
- Медленно вставьте зонд в срез, переместив манипулятор вдоль его продольной оси. Чтобы свести к минимуму повреждение ткани, только продвигайте зонд до такой степени, что острые кончики видны только под поверхностью ткани. Это сведет к минимуму повреждение ткани, в то же время гарантируя, что контакты электродов находятся в контакте с тканью.
8. Зажим пластыря целевых нейронов и получение конфигурации всей клетки
- Переключите источник eACSF на пакетное решение Control.
- Определите флуоресцентно меченую ячейку для записи целевого зажима пластыря.
- Ограничьте диафрагму диафрагмы до наименьшего диаметра. Задействуйте объектив с низким энергопотреблением и сфокусируйте ткань.
- Центрируйте свет над областью ткани, прилегающей к многоканальному зонду (но не перекрывающей его).
- Включите мощный (40x или 60x) объектив погружения в воду, соблюдая осторожность, чтобы избежать контакта между многоканальным зондом и объективом.
- Поверните башню куба фильтра, чтобы задействовать соответствующий набор фильтров, чтобы обеспечить визуализацию клеток, экспрессирующих cre-зависимый флуоресцентный маркер.
- Определите флуоресцентно меченую ячейку в качестве мишени для записи зажимов. Поднимите объектив, чтобы создать достаточно места для опускания патч-пипетки.
- Загрузите патч-пипетку (см. таблицу 1) внутренним раствором (таблица 2) и установите пипетку в держатель электрода. Используя шприц 1 мл, примените положительное давление, соответствующее ~ 0,1 мл воздуха.
- Опустите пипетку в раствор. Поместите наконечник пипетки в фокус под визуальным руководством.
- Получите запись всей клетки из целевой ячейки, используя шаги, ранее продемонстрированные33.
- Если планируется оценить изменения внутренних свойств ячейки (например, входное сопротивление, скорость срабатывания потенциала действия в ответ на текущие шаги), проведите эти записи. В противном случае перейдите к протоколу стимуляции аксонов ниже.
9. Послойно-специфическая оптогенетическая активация аксонных терминалей
- Манипулируйте полем зрения в плоскости x-y, чтобы выровнять профиль световой стимуляции с требуемым местоположением на срезе.
- Загрузите протокол светового стимула и подготовьте систему доставки света к получению цифрового импульса TTL.
- Оптогенетически активируют аксонные терминали, одновременно регистрируя потенциалы внеклеточного поля и флуктуации внутриклеточной мембраны.
- Переключите источник eACSF на раствор Изофлурана и промойте препарат в течение 15 мин. При необходимости соберите спонтанные записи во время стирки.
- Повторите шаги 9.2-9.3.
- Переключите источник eACSF на Контрольный раствор и смойте препарат в течение 20 мин. При необходимости соберите спонтанные записи во время промывки.
- Повторите шаги 9.2-9.3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Временная шкала шагов, описанных в протоколе, показана на рисунке 1. Корковые входы, поступающие из корковых областей более высокого порядка или из непервичных таламических ядер, имеют частично перекрывающиеся терминальные поля в слое 1 непервичной зрительной коры24. Чтобы выделить независимые таламокортикальные или кортикокортикальные афферентные пути, вводили вирусный вектор, содержащий ChR2 и флуоресцентный репортер eYFP, в Po или Cg. Клетки в радиусе инъекции поглощают вирусный вектор и через 2-4 недели экспрессируют неспецифический катионный канал ChR2 и репортер как в соме, так и в проекционных аксонах (рисунок 2A). Корональные срезы были собраны. При включенном соответствующем кубе фильтра были изображены аксоны, экспрессирующие вирусную конструкцию (рисунок 2B). Использование ChR2 для активации аксонных терминалов позволяет активировать афференты без предварительного условия для прикрепленной сомы.
Животные, используемые в экспериментах, описанных здесь, были гибридными животными SOM-tdTomato или PV-tdTomato, которые экспрессируют флуоресцентный репортерный белок tdTomato в соматостатин-(SOM+) или парвальбумин-положительных (PV+) интернейронах соответственно. Интернейроны SOM+ или PV+ в слое 2/3 были нацелены на зажим патча под визуальным руководством с соответствующим кубом фильтра (слой 1C). Эти интернейроны имеют дендриты в слое 1 и являются мишенями кортикокортикальных входов (рисунок 3А).
Добавление 125 мл 3,0% изофлуранового газа и 175 мл 95% O2/5% CO2 в герметичный мешок приводило к предравновешенной концентрации газа 1,3%. Газ растворяется в eACSF в соответствии с его коэффициентом разделения; прогнозируемая равновесная концентрация изофлунана в газовой фазе при комнатной температуре составила 0,6% (рисунок 2D). Это было подтверждено с помощью газового монитора.
Срез ткани переносили в записывающую камеру, а многоканальный регистрирующий зонд 16x1 помещали ортогонально к корковым пластинам (рисунок 2E). 150-мкм окружность света 470 нм, центрированная над корковым слоем 1, была доставлена по объективному световому пути, в то время как потенциалы внеклеточного поля были собраны с использованием многоканального зонда 16 x 1, а целевые записи зажимов цельноклеточного пластыря были проведены в интернейронах. Схема настройки записи показана на рисунке 2F.
Постсинаптические потенциалы (PSP) наблюдались в интернейронах в ответ на поезд из четырех импульсов света по 2 мс (10 Гц; Рисунок 3А). Были также зарегистрированы локальные полевые потенциалы (рисунок 3B). Плотность источника тока (CSD; Рисунок 3C) и деятельность с участием нескольких подразделений (MUA; Рисунок 3D) были извлечены из местных полевых потенциалов. Десять испытаний при нескольких различных интенсивностях света были использованы для проведения пост-специальных анализов. Амплитуда токовых поглотителей, извлеченных из CSD, увеличивалась в зависимости от интенсивности света (рисунок 4A). Трехпараметрическое нелинейное логистическое уравнение соответствовало данным для сравнения по путям. Амплитуда PSP также увеличивалась с амплитудой тока (рисунок 4B).
Синаптические реакции на таламокортикальные и кортикокортикальные входы измеряли во время контроля, изофлурана (0,28 мМ) и условий восстановления. Постсинаптические реакции соматостатина( рисунок 5А) на кортикокортикальные раздражители подавлялись во время изофлурана, как и вызванные токовые поглотители (рисунок 5В).
Рисунок 1: Схема, описывающая временную шкалу важных шагов в протоколе.
Вверх: Описаны сроки этапов, необходимых для разведения трансгенных животных и экспрессии вирусного вектора. Дно: Показаны этапы и сроки подготовки материалов и проведения эксперимента в день приготовления среза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Инъекция вирусного вектора и препарат ex vivo корональных срезов мозга.
(A) Схематическое изображение инъекции вирусного вектора гибридным мышам SOM-tdTomato или PV-tdTomato. (B) Корональные срезы медиальной теменной ассоциативной области (mPtA) были собраны, а таламокортикальные (сверху) или кортикокортикальные (снизу) афферентные волокна были идентифицированы их репортером eYFP в слое 1. Эта цифра изменена с разрешенияот 24. (C) Наложение эмблемированных eYFP терминалей аксонов в слой 1 (зеленый) и интернейронов SOM+ с маркировкой tdTomato (красный) в поверхностный слой 2/3. (D) Запечатанные пакеты готовили из смеси раствор-газ 50:50. (E) Помещение зонда 16 x 1 в mPtA (черный контур). (F) Схема записи, установленной в кортикальном срезе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Одновременные внутриклеточные и многоканальные внеклеточные записи в корковом срезе.
(A) Запись пластыря зажимом цельноячечного тока из сомы слоя 2/3 PV+ интернейрона. Четыре импульса (по 2 мс каждый, синие стрелки) синего света (2,2 мВт) при 10 Гц были доставлены на кортикокортикальные аксонные клеммы в L1. Показано среднее (красный след) десяти испытаний (серые следы). (B) Необработанные данные из 16 каналов внеклеточного зонда 16 x 1. Каналы, помещенные в кортикальную ткань, показаны черным цветом, а те, которые лежат за пределами коры, серым. (C) Диаграмма плотности источника тока, извлеченная из сигнала локального потенциала поля, показывает поглотители синаптического тока (синий) в слое 1. (D) Многоблочная активность, генерируемая путем применения фильтра высоких частот к локальному полевому потенциальному сигналу, изолирует пиковую активность, вызванную в нижних слоях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Сравнение ответов из записей в двух разных срезах.
Множественные интенсивности света использовались для вызова синаптических реакций в корковом слое 1. Для каждого испытания пиковую амплитуду вызванного ответа извлекали из внеклеточного токового приемника слоя 1 и EPSP в интернейронах слоя 2/3 PV+. (A) Внеклеточные профили ответа таламокортикальных и кортикокортикальных афферентов сравниваются в зависимости от интенсивности света. (B) Зависимость между амплитудой тока и амплитудой EPSP зависит от пути. В рамках каждого пути стимулирования данные из (A) и (B) собирались одновременно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Применение в ванне изофлурана, растворенного в eACSF во время одновременных записей.
(A) Внутриклеточный внутриклеточный зажим тока из слоя 2/3 SOM+ интернейрона при активации кортикокортикальных афферентов во время контроля, изофлурана и условий промывки. Вертикальные синие линии указывают на световые раздражители (2 мс; 1,65 мВт). (B) След плотности источника тока, извлеченный из электрода в слое 1. Данные собирались одновременно с данными, собранными в пункте (А). Восстановление реакций при стирке демонстрирует угнетение синаптических реакций изофлураном. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Микропипетка для инъекций вируса | ||||
| Стекло | Id: 0.05 мм, OD: 0.11 мм | |||
| Петли | 1 | |||
| Жара | Тянуть | Вел | Время | Давление |
| Пандус + 10 | 20 | 40 | 200 | 300 |
| Микропипетка для записи зажимов с цельноклеточными патчами | ||||
| Стекло | ID: 1.1 мм, OD: 1.7 мм | |||
| Петли | 4 | |||
| Жара | Тянуть | Вел | Время | Давление |
| Рампа | 0 | 25 | 250 | 500 |
Таблица 1: Рекомендуемое стекло и параметры для вытягивания микропипет для вирусных инъекций и записей цельноклеточных зажимов. Описано стекло, используемое для вирусных инъекций и записей цельноклеточных зажимов, а также параметры для вытягивания микропипеток с помощью съемника микропипетки. Обратитесь к руководству по эксплуатации съемника микропипетки для дальнейших рекомендаций или тонкой настройки настроек.
| Нарезка ACSF, sACSF (в мММ) | Эксперимент ACSF, eACSF (в мМ) | |
| НаКл | 111 | 111 |
| НаХКО3 | 35 | 35 |
| ХЕПЕС | 20 | 20 |
| ККл | 1.8 | 1.8 |
| КаКл2 | 1.05 | 2.1 |
| МгСО4 | 2.8 | 1.4 |
| KH2PO4 | 1.2 | 1.2 |
| глюкоза | 10 | 10 |
| Внутреннее решение | ||
| К-глюконат | 140 | |
| НаКл | 10 | |
| ХЕПЕС | 10 | |
| ЭГТА | 0.1 | |
| МгАТП | 4 | |
| НаГТП | 0.3 | |
| pH = 7,2 |
Таблица 2: Состав искусственной спинномозговой жидкости и внутриклеточного раствора. Перечислены реагенты и концентрации для sACSF, eACSF и внутриклеточного пипеточного раствора для записи зажимов.
Дополнительный рисунок 1: Шаблон для подготовки блока ткани для сбора срезов мозга. Шаблон настраивается на соответствующий размер, печатается и приклеивается к слайду микроскопа. На шаблон наклеивается крышка для продления срока его использования. Тканевый блок укладывают на лист фильтровальной бумаги с сагиттальной плоскостью вниз, выравнивают по розовому фону, а в корональной плоскости вдоль черной линии делается вертикальный разрез. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот рисунок.
Дополнительный рисунок 2: Инкубационная камера для собранных срезов мозга. Камера заполняется sACSF и пузырится с газовой смесью 95% O2/5% CO2 через изогнутую иглу, прикрепленную к трубке. Инкубационная платформа изготовлена из нейлона, натянутого поверх пластикового круглого фитинга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот рисунок.
Дополнительный рисунок 3: Платиновые структуры для среза в записывающей камере. Мозговой срез переносится в камеру записи через пипетку и помещается поверх нейлоновой сетки, которая натягивается на подковообразный кусок сплющенной платиновой проволоки и супер приклеивается на место. Платиновая арфа помещается над срезом мозга, чтобы закрепить ее на месте во время записи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот рисунок.
Дополнительная таблица 1: Коэффициенты Оствальда (λ) и Бунзена (α) для других летучих анестетиков. Адаптировать этот протокол для изучения других летучих газовых анестетиков, таких как галотан, севофлуран или десфлуран. Замените уравнения, описанные в протоколе, соответствующими коэффициентами, перечисленными в этой таблице. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой рукописи описан протокол оценки внутри- и внеклеточных реакций на избирательно активированные афферентные пути в срезах мозга ex vivo.
Использование оптогенетических инструментов и параллельных схем записи позволяет исследователям исследовать реакцию местного населения на афферентные входы из отдаленных областей мозга, одновременно регистрируя из целевых популяций интернейронов. Использование оптогенетической технологии позволяет сохранять и активировать аксонные терминалы афферентных проекций, даже если их клеточные тела больше не прикреплены. Это снимает геометрические ограничения, ранее наложенные на срезы ex vivo , поскольку сохранение дальнобойных электрических соединений больше не имеет первостепенного значения. Тем не менее, следует позаботиться о том, чтобы подготовить срезы в геометрической плоскости, которая сохраняет любые оставшиеся связи, представляющие интерес. Например, пирамидальные клетки ориентированы вертикально вдоль кортикального столба, а вызванная сетевая активность, измеренная многоканальными зондами в этих экспериментах, требует максимального сохранения таких локальных связей. Таким образом, корональные срезы были подготовлены для сохранения локальной связности.
При выборе оптогенетических конструкций и соответствующих флуоресцентных репортерных белков необходимо учитывать свойства их спектров возбуждения/излучения и микроскопической оптики. Стойкая световая стимуляция может привести к частичной инактивации многих вариантов34 канального родопсина, чего можно избежать, выбрав репортерные белки, спектры возбуждения которых не перекрываются с спектрами опсина. Альтернативные варианты с различной кинетикой или светочувствительностью также могут быть выбраны в зависимости от экспериментальной парадигмы35, включая манипуляции с использованием альтернативных возбуждающих или ингибирующих опсинов. Кубы фильтров также должны быть соответствующим образом выровнены с выбранными флуоресцентными репортерами, так что афферентные аксонные клеммы или интернейроны могут быть изображены независимо и без активации выраженных опсинов. Чтобы объяснить изменчивость экспрессии вируса, исследователям также может быть уместно нормализовать любую оптогенетически индуцированную активность до уровня экспрессии вирусной конструкции, измеряемого флуоресцентным выходом репортерного белка.
Доставка заранее рассчитанных концентраций летучих анестетиков в срез ткани также возможна с использованием методов, описанных здесь. При выборе соответствующих физиологически значимых процентов газового равновесия исследователи должны учитывать потерю 10-15% растворенного газообразного изофлурана между линией перфузии и тканью36. Были представлены способы, применимые к изофлурану, но другие препараты, такие как галотан, севофлуран или десфлуран, могут обрабатываться аналогичным образом с использованием соответствующих коэффициентов Оствальда и Бунзена (Дополнительная таблица 1). Расщепляющие свойства летучих анестетиков гарантируют, что они предсказуемо растворятся в ACSF. Однако, поскольку парциальные давления более чувствительны к изменениям температуры, чем водные концентрации EC50 37, объемные проценты содержания летучих анестетиков в газовом равновесии должны быть преобразованы в прогнозируемые миллимолярные концентрации при комнатной температуре для сравнения наблюдаемых эффектов с физиологически значимыми дозами in vivo. Если вы решите изучить внутривенные анестетики, такие как этомидат или пропофол в срезах мозга, исследователи должны учитывать диффузионные профили исследуемых препаратов, поскольку время уравновешивания и физиологически значимые концентрации могут сильно варьироватьсяна 30.
В этой рукописи описан протокол проверки влияния летучих анестетиков на отдельные компоненты таламокортикальных цепей в срезах мозга ex vivo. Многие переменные и параметры в описанных методах могут быть использованы для дальнейших исследований. Например, различные области мозга, афферентные пути, клеточные мишени или летучие анестетики могут быть изучены путем адаптации изложенных методов для ответа на новые вопросы. В сочетании с другими теоретическими и экспериментальными методами изучение уникальных клеточных и сетевых компонентов с использованием срезов мозга ex vivo будет способствовать нашему пониманию динамического мозга и изменений, которые он претерпевает во время фармакологических и патофизиологических изменений в сознании.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы благодарят Брайана Краузе за техническую поддержку и руководство по этому проекту.
Эта работа была поддержана Международным обществом исследований анестезии (IMRA to AR), Национальными институтами здравоохранения (R01 GM109086 to MIB) и Кафедрой анестезиологии, Школой медицины и общественного здравоохранения, Университет Висконсина, Мэдисон, Штат Висконсин, США.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.5x broadfield objective lens | Olympus | MPLFLN2.5X | |
| 40x water immersion objective lens | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| 95% O2/5% CO2 mixture | Airgas | Z02OX95R2003045 | |
| A16 probe | NeuroNexus | A16x1-2mm-100-177-A16 | 16-channel probe |
| AAV2-hSyn-hChR2(H134R)-EYFP | Karl Deisseroth Lab, UNC Vector Core | ||
| Anesthetic gas monitor (POET II) | Criticare | 602-3A | |
| ATP, Magnesium Salt | Sigma Aldrich | A9187 | intracellular solution |
| B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J | The Jackson Laboratory | 007914 | Cre-dependent tdTomato mouse |
| B6;129P2-Pvalbtm1(cre)Arbr/J | The Jackson Laboratory | 008069 | PV-Cre mouse |
| Belly Dancer Shaker | Thomas Scientific | 1210H86-TS | for equilibration of sealed gas bags |
| Betadine solution | Generic brand | ||
| Bleach | Generic brand | for silver chloriding patch clamp electrode | |
| Bupivicaine | |||
| Calcium Chloride (CaCl2) | Dot Scientific | DSC20010 | ACSF |
| Capillary glass (patch clamp recordings) | King Precision Glass, Inc. | KG-33 | Borosilicate, ID: 1.1mm, OD: 1.7mm, Length: 90.0mm |
| Capillary glass (viral injections) | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | 3.5" |
| Control of junior micromanipulator | Luigs and Neumann | SM8 | for control of junior micromanipulator |
| Control of manipulators and shifting table | Luigs and Neumann | SM7 | for control of multichannel electrode and shifting table |
| Digidata 1440A + Clampex 10 | Molecular Devices | 1440A | Digitizer and software |
| E-3603 tubing | Fisher Scientific | 14171208 | for delivery of 95% O2/5% CO2 gas mixture to incubation chamber + application of pressure during patch clamping |
| EGTA | Dot Scientific | DSE57060 | intracellular solution |
| ERP-27 EEG Reference/Patch Panel | Neuralynx | Retired | |
| Filling needle | World Precision Instruments | 50821912 | for filling patch clamp pipettes |
| Filter cube for imaging EYFP | Olympus | U-MRFPHQ | |
| Filter paper | Fisher Scientific | 09801E | lay over slice template during preparation of tissue block |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | 2.5x2.5 Box filament |
| Gas dispersion tube | Sigma Aldrich | CLS3953312C | |
| Glass syringe (100 mL) | Sigma Aldrich | Z314390 | for filling gas-sealed bags |
| Gluconic Acid, Potassium Salt (K-gluconate) | Dot Scientific | DSG37020 | intracellular solution |
| Glucose | Dot Scientific | DSG32040 | ACSF |
| GTP, Sodium Salt | Sigma Aldrich | G8877 | intracellular solution |
| Headstage-probe adaptor | NeuroNexus | A16-OM16 | adaptor to connect 16-channel probe to headstage input |
| Hemostatic Forceps | VWR International | 76192-096 | |
| HEPES | Dot Scientific | DSH75030 | ACSF,intracellular solution |
| HS-16 Headstage | Neuralynx | Retired | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Isopropyl alcohol (70%) | VWR International | 101223-746 | |
| Junior micromanipulator | Luigs and Neumann | 210-100 000 0090-R | for manipulation of patch clamp electrode |
| LED Light Source Control Module | Mightex | BLS-PL02_US | optogenetic light source control |
| Lidocaine | |||
| Lynx-8 Amplifier | Neuralynx | Retired | |
| Lynx-8 Power Supply | Neuralynx | Retired | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | Dot Scientific | DSM24300 | ACSF |
| mCherry, Texas Red filter cube | Chroma | 49008 | for imaging tdTomato fluorescent reporter |
| Meloxicam | |||
| Micropipette holder | Fisher Scientific | NC9044962 | |
| Microsyringe pump | World Precision Instruments | UMP3-4 | |
| Mineral oil | Generic brand | ||
| MultiClamp 700A | Molecular Devices/Axon Instruments | 700A | Amplifier |
| Nitrogen (for air table) | Airgas | NI200 | |
| Nylon mesh | Fisher Scientific | 501460083 | stretched over horseshoe of flattened platinum wire, slice rest on top of this during recordings |
| Nylon, cut from pantyhose | Generic brand | small piece to create slice platform in incubation chamber, single fibers to create platinum harp | |
| Ophthalmic ointment | Fisher Scientific | NC1697520 | |
| Pipette | Dot Scientific | 307 | For transferring tissue to rig |
| Platinum wire | VWR International | BT124000 | 2 cm, flattened, to make platinum harp |
| Polygon400 | Mightex | DSI-E-0470-0617-000 | optogenetic light delivery system, comes with PolyScan2 software |
| Potassium Chloride (KCl) | Dot Scientific | DSP41000 | ACSF |
| Potassium Phosphate (KH2PO4) | Dot Scientific | DSP41200 | ACSF |
| Razor blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Sapphire blade (for vibratome) | VWR International | 100492-502 | |
| Scalpel blade | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-361445 | |
| Sealed gas bag | Fisher Scientific | 109236 | |
| Shifting table for microscope | Luigs and Neumann | 380FMU | |
| Sodium Bicarbonate (HCO3-) | Dot Scientific | DSS22060 | ACSF |
| Sodium Chloride (NaCl) | Dot Scientific | DSS23020 | ACSF, intracellular solution |
| Ssttm2.1(cre)Zjh/J (SOM-IRES-Cre) | The Jackson Laboratory | 013044 | SOM-Cre mouse |
| Stereotaxic instrument | Kopf | Model 902 | Dual Small Animal |
| Super glue | Staples | 886833 | to fix tissue block to specimen stage during slice preparation |
| Surgical drill | RAM Products Inc. | DIGITALMICROTORQUE | Microtorque II |
| Syringe (1 mL) with LuerLock tip | Fisher Scientific | 309628 | for application of pressure during patch clamping |
| Syringe (1 mL) with slip tip | WW Grainger, Inc. | 19G384 | for filling patch clamp pipettes |
| Syringe Filters | VWR International | 66064-414 | |
| Upright microscope | Olympus | BX51 | |
| Vibrating microtome | Leica Biosystems | VT1000S | |
| Wypall towels | Fisher Scientific | 19-042-427 |
References
- Baumgart, J. P., et al. Isoflurane inhibits synaptic vesicle exocytosis through reduced Ca2+ influx, not Ca2+-exocytosis coupling. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 112 (38), 11959-11964 (2015).
- Herring, B. E., Xie, Z., Marks, J., Fox, A. P. Isoflurane inhibits the neurotransmitter release machinery. Journal of Neurophysiology. 102 (2), 1265-1273 (2009).
- Xie, Z., et al. Interaction of anesthetics with neurotransmitter release machinery proteins. Journal of Neurophysiology. 109 (3), 758-767 (2013).
- Crick, F., Koch, C.
- Koch, C., Massimini, M., Boly, M., Tononi, G. Neural correlates of consciousness: progress and problems. Nature Reviews Neurosciences. 17 (5), 307-321 (2016).
- Dehaene, S., Changeux, J. P. Experimental and theoretical approaches to conscious processing. Neuron. 70 (2), 200-227 (2011).
- Friston, K.
- Mashour, G. A., Hudetz, A. G. Bottom-Up and Top-Down Mechanisms of General Anesthetics Modulate Different Dimensions of Consciousness. Frontiers in Neural Circuits. 11, 44 (2017).
- Voss, L. J., Garcia, P. S., Hentschke, H., Banks, M. I. Understanding the Effects of General Anesthetics on Cortical Network Activity Using Ex Vivo Preparations. Anesthesiology. 130 (6), 1049-1063 (2019).
- Redinbaugh, M. J., et al. Thalamus Modulates Consciousness Via Layer-Specific Control of Cortex. Neuron. 105 (4), 0896 (2020).
- Carhart-Harris, R. L., Friston, K. J. REBUS and the Anarchic Brain: Toward a Unified Model of the Brain Action of Psychedelics. Pharmacological Reviews. 71 (3), 316-344 (2019).
- Mak-McCully, R. A., et al. Coordination of cortical and thalamic activity during non-REM sleep in humans. Nature communications. 8 (1), 15499 (2017).
- Alkire, M. T., Hudetz, A. G., Tononi, G.
- Sanders, R. D., Maze, M. Noradrenergic trespass in anesthetic and sedative states. Anesthesiology. 117 (5), 945-947 (2012).
- Hemmings, H. C., et al. Towards a Comprehensive Understanding of Anesthetic Mechanisms of Action: A Decade of Discovery. Trends in Pharmacological Sciences. 40 (7), 464-481 (2019).
- Nourski, K. V., et al. Auditory Predictive Coding across Awareness States under Anesthesia: An Intracranial Electrophysiology Study. Journal of Neurosciences. 38 (39), 8441-8452 (2018).
- Liu, X., et al. Propofol disrupts functional interactions between sensory and high-order processing of auditory verbal memory. Human Brain Mapping. 33 (10), 2487-2498 (2012).
- Hentschke, H., Raz, A., Krause, B. M., Murphy, C. A., Banks, M. I. Disruption of cortical network activity by the general anesthetic isoflurane. British Journal of Anaesthesiology. 119 (4), 685-696 (2017).
- Lee, U., et al. Disruption of frontal-parietal communication by ketamine, propofol, and sevoflurane. Anesthesiology. 118 (6), 1264-1275 (2013).
- Ferrarelli, F., et al. Breakdown in cortical effective connectivity during midazolam-induced loss of consciousness. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 107 (6), 2681-2686 (2010).
- Ku, S. W., Lee, U., Noh, G. J., Jun, I. G., Mashour, G. A. Preferential inhibition of frontal-to-parietal feedback connectivity is a neurophysiologic correlate of general anesthesia in surgical patients. PLoS.One. 6 (10), 25155 (2011).
- Lee, M., et al. Network Properties in Transitions of Consciousness during Propofol-induced Sedation. Scientific Reports. 7 (1), 16791 (2017).
- Murphy, M., et al. Propofol anesthesia and sleep: a high-density EEG study. Sleep. 34 (3), 283-291 (2011).
- Murphy, C., Krause, B., Banks, M. Selective effects of isoflurane on cortico-cortical feedback afferent responses in murine non-primary neocortex. British Journal of Anaesthesiology. 123 (4), 488-496 (2019).
- Raz, A., et al. Preferential effect of isoflurane on top-down versus bottom-up pathways in sensory cortex. Frontiers in System Neurosciences. 8, 191 (2014).
- Schrouff, J., et al. Brain functional integration decreases during propofol-induced loss of consciousness. Neuroimage. 57 (1), 198-205 (2011).
- Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).
- Cruikshank, S. J., Urabe, H., Nurmikko, A. V., Connors, B. W. Pathway-Specific Feedforward Circuits between Thalamus and Neocortex Revealed by Selective Optical Stimulation of Axons. Neuron. 65 (2), 230-245 (2010).
- Gredell, J. A., Turnquist, P. A., MacIver, M. B., Pearce, R. A. Determination of diffusion and partition coefficients of propofol in rat brain tissue: implications for studies of drug action in vitro. BJA: British Journal of Anaesthesia. 93 (6), 810-817 (2004).
- Benkwitz, C., et al. Determination of the EC50 amnesic concentration of etomidate and its diffusion profile in brain tissue: implications for in vitro studies. Anesthesiology. 106 (1), 114-123 (2007).
- Franks, N. P., Lieb, W. R. Selective actions of volatile general anaesthetics at molecular and cellular levels. British Journal of Anaesthesia. 71 (1), 65-76 (1993).
- Honemann, C. W., Washington, J., Honemann, M. C., Nietgen, G. W., Durieux, M. E. Partition coefficients of volatile anesthetics in aqueous electrolyte solutions at various temperatures. Anesthesiology. 89 (4), 1032-1035 (1998).
- Au - Segev, A., Au - Garcia-Oscos, F., Au - Kourrich, S.
- Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophysical Journal. 96 (5), 1803-1814 (2009).
- Lin, J. Y. A user's guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments. Experimental Physiology. 96 (1), 19-25 (2011).
- Banks, M. I., Pearce, R. A. Dual actions of volatile anesthetics on GABAA IPSCs: dissociation of blocking and prolonging effects. Anesthesiology. 90 (1), 120-134 (1999).
- Hagan, C. E., Pearce, R. A., Trudell, J. R., MacIver, M. B. Concentration measures of volatile anesthetics in the aqueous phase using calcium sensitive electrodes. Journal of Neuroscience Methods. 81, 177-184 (1998).
