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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Digestion des yeux de souris entières pour l’analyse cytométrique de flux multi-paramètres des phagocytes mononucléaires

Published: June 17, 2020 doi: 10.3791/61348
Automatic Translation
1, *2, *1
1Department of Ophthalmology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2Department of Medicine, Division of Rheumatology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University
* These authors contributed equally

Summary

Ce protocole fournit une méthode pour digérer des yeux entiers dans une suspension cellulaire simple aux fins de l’analyse cytométrique de flux multi-paramètres afin d’identifier des populations phagocytiques mononucléaires oculaires spécifiques, y compris les monocytes, les microglies, les macrophages et les cellules dendritiques.

Abstract

Le système immunitaire inné joue un rôle important dans la pathophysiologie oculaire, y compris l’uvéite, la rétinopathie diabétique et la dégénérescence maculaire liée à l’âge. Les cellules immunitaires innées, en particulier les phagocytes mononucléaires, expriment des marqueurs de surface cellulaire qui se chevauchent, ce qui fait de l’identification de ces populations un défi. La cytométrie d’écoulement multi-paramètres permet l’analyse simultanée et quantitative de plusieurs marqueurs de surface cellulaire afin de différencier les monocytes, les macrophages, les microglies et les cellules dendritiques dans les yeux de souris. Ce protocole décrit l’enucleation des yeux entiers de souris, la dissection oculaire, la digestion dans une suspension de cellule simple, et la coloration de la suspension de cellule simple pour des marqueurs myéloïdes de cellules. En outre, nous expliquons les méthodes appropriées pour déterminer les tensions à l’aide de contrôles de couleur unique et pour délimité les portes positives en utilisant la fluorescence moins un contrôle. La principale limitation de la cytométrie du flux multi-paramètres est l’absence d’architecture tissulaire. Cette limitation peut être surmontée par la cytométrie d’écoulement multi-paramètres des compartiments oculaires individuels ou la coloration complémentaire d’immunofluorescence. Cependant, l’immunofluorescence est limitée par son manque d’analyse quantitative et la réduction du nombre de fluorophores sur la plupart des microscopes. Nous décrivons l’utilisation de la cytométrie multi-paramétrique de flux pour fournir l’analyse fortement quantitative des phagocytes mononucléaires dans la néovascularisation choroïdienne laser-induite. En outre, la cytométrie de flux multi-paramètres peut être utilisée pour l’identification des sous-ensembles de macrophages, la cartographie du destin et le tri cellulaire pour les études transcriptomiques ou protéomiques.

Introduction

Le système immunitaire inné comprend plusieurs types de cellules qui stimulent l’activation complète et l’inflammation. Les cellules immunitaires innées comprennent les cellules tueuses naturelles (NK), les mastocytes, les basophiles, les éosinophiles, les neutrophiles et les phagocytes mononucléaires. Les phagocytes mononucléaires, qui sont composés des monocytes, des macrophages, et des cellules dendritiques, ont été impliqués dans la pathophysiologie des conditions ophtalmiques multiples comprenant l’uvéite, la rétinopathie diabétique, et la dégénérescence maculaire relative à l’âge (AMD)1. Dans ce protocole, nous nous concentrerons sur l’identification des phagocytes mononucléaires utilisant l’analyse cytométrique de flux multi-paramètres dans un modèle de souris de AMD néovasculaire2. Ce protocole est adaptable pour les modèles murins de rétinopathie diabétique et/ou d’uvéite, mais une dissection oculaire plus étendue est recommandée en raison de la nature systémique de ces maladies.

Les phagocytes mononucléaires expriment des marqueurs de surface cellulaire qui se chevauchent. Les macrophages et les microglies résidents de tissu de longue durée proviennent de l’ancêtre érythromyéloïde dérivé du sacjaune 3,tandis que le recyclage des macrophages et des cellules dendritiques se différencient de l’ancêtre de cellules dendritiques macrophages dérivé de lamoelle osseuse 4. Les marqueurs de surface de cellules de souris communs aux monocytes, aux macrophages, et aux cellules dendritiques incluent CD45, CD11b5,F4/806,Cx3cr17,et le marqueur intracellulaire Iba18. Afin de surmonter ce défi, l’analyse transcriptomique des macrophages, des monocytes et des cellules dendritiques de tissus multiples définit CD64 comme un marqueur de surface cellulaire spécifique au macrophage6. Des macrophages ont été décrits dans l’iris, le choroïde, le corps ciliaire, et le nerf optique dans les yeux sains3. Alternativement, l’identification des cellules dendritiques est plus difficile; la méthode la plus spécifique d’identification des cellules dendritiques nécessite une cartographie du destin à l’aide de la souris reporter Zbtb46-GFP9. Indépendamment de cette ligne de reporter, l’expression de CD11c et MHCII en conjonction avec l’absence de CD64 peut identifier les cellules dendritiquespotentielles 6,10. Des cellules dendritiques ont été identifiées dans la cornée, la conjonctive, l’iris, et le choroïde dans les yeuxnormaux 11. Les microglies sont des macrophages spécialisés situés dans la rétine, protégés par la barrière céphalo-rétinienne, et dérivés des cellules progénitrices de sacjaune 12. En conséquence, les microglies rétiniennes peuvent être différenciées des macrophages monocyte-dérivés par leurs niveaux faibles de l’expression de CD4513 et des niveaux élevés de Tmem119, qui est disponible comme anticorps de cytométrie de flux14. Lors de l’activation des microglies, cependant, CD45 peut être jusqu’à réglementé15 et Tmem119 peut êtresous-réglementé 3, démontrant la complexité de la biologie des microglies et cela est probablement pertinent à la fois dans AMD et son modèle de souris. Enfin, les monocytes peuvent être divisés en au moins deux sous-types, y compris classique et non classique. Les monocytes classiques affichent CCR2+Ly6ChauteCX3CR1faible expression, et les monocytes non classiques démontrent CCR2-Ly6Cbasmarqueurs élevés CX3CR1 5.

En raison de la nécessité de l’analyse quantitative de l’expression des marqueurs, c’est-à-dire des niveaux élevés par rapport aux niveaux faibles/faibles, la cytométrie du flux multi-paramètres est la méthode idéale pour la discrimination entre les monocytes, les macrophages, les microglies et les cellules dendritiques dans l’œil et d’autres tissus. D’autres avantages incluent l’identification des sous-populations, la capacité d’utiliser le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour trier les populations cellulaires pour l’analyse transcriptomique ou protéomique, et la cartographie du sort. L’inconvénient majeur de la cytométrie du flux multi-paramètres est le manque d’architecture tissulaire. Ceci peut être surmonté par la dissection ophtalmique dans les divers sous-commandements oculaires : cornée, conjonctive, iris, lentille, rétine, et complexe choroïde-sclera. En outre, l’imagerie confirmatoire d’immunofluorescence peut être exécutée, mais est limitée par le nombre de marqueurs et le manque de quantitation robuste.

Les études d’association à l’échelle du génome ont établi un lien entre plusieurs gènes complémentaires et laD AMD 16. L’activation de complément mène à la production d’anaphylatoxine, au recrutement de leucocyte, et à l’inflammation qui en résulte. En complément des souris déficientes en récepteurs, les lésions au laser réduisent le recrutement de phagocytes mononucléaires et la néovascularisation choroïdienne induite par laser (CNV)zone 17. De même, le récepteur de chimiokine de motif de C-C 2 (CCR2) souris de KO, qui est déficient dans le recrutement de monocyte au tissu, démontre à la fois le recrutement mononucléaire diminué de phagocyte et la zone induite par laser de CNV18. Ces données relient le complément et les phagocytes mononucléaires avec le CNV expérimental et peut-être l’AMD néovasculaire. À l’appui de cette association, les récepteurs de complément sont dysregulated sur des monocytes périphériques de sang dans les patients présentant l’AMDnéovasculaire 19,20. Ces données démontrent une forte association entre amd et phagocytes mononucléaires.

Dans ce manuscrit, nous utiliserons le modèle expérimental de CNV induit par laser pour caractériser les populations mononucléaires de phagocyte dans l’oeil de souris utilisant la cytométrie de flux multi-paramètres. Le CNV induit au laser est le modèle standard de souris de la DMO néovasculaire, qui a démontré l’efficacité de la thérapie néovasculaire actuelle de la DMO de premièreligne 21. Ce protocole décrit l’enucleation des yeux de souris, la dissection oculaire, la digestion en une seule suspension cellulaire, la coloration des anticorps, la détermination des tensions laser à l’aide de commandes de couleur unique, et la stratégie de gating utilisant la fluorescence moins un (FMO) contrôles. Pour une description détaillée du modèle CNV induit au laser, veuillez consulter une publication précédente22. En utilisant ce protocole, nous définirons les microglies, les monocytes, les cellules dendritiques et les populations de macrophages. De plus, nous utiliserons le MHCII et le CD11c pour définir davantage les sous-ensembles de macrophages dans le modèle CNV induit par laser.

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Protocol

Toutes les procédures ont été approuvées par le Northwestern University Institutional Animal Care and Use Committee. Les souris C57BL/6 ont été logées dans un centre de barrière du Center for Comparative Medicine de l’Université Northwestern (Chicago, IL). Tous les animaux ont été logés dans 12/12 h cycle lumière/obscurité avec un accès gratuit à la nourriture et à l’eau.

1. Collection de tissus oculaires

  1. Sacrifiez des souris C57BL/6J âgées de 10 à 12 semaines de l’un ou l’autre sexe en utilisant une administration réglementée de dioxyde de carbone jusqu’à ce que la souris ne réponde plus et n’inspire plus. Effectuer une dislocation cervicale ou une autre méthode secondaire approuvée pour assurer l’euthanasie.
    REMARQUE : La perfusion transcardique peut être exécutée pour enlever les leucocytes circulants qui ne sont pas dans les tissus oculaires. Dans cette expérience, la perfusion systémique ne réduit pas le nombre de microglies, de monocytes, de macrophages ou de cellules dendritiques détectées dans des yeux entiers non traités ou traités au laser. Par conséquent, la majorité de ces types de cellules sont situés dans les tissus ophtalmiques et cette étape est facultative.
  2. Pour enucleate yeux, poussez vers le bas près de la prise d’oeil tout en plaçant une paire de forceps incurvés doucement sous l’oeil pendant qu’il se tient hors de la prise. Pincer les pincements fermés sous l’œil sans presser l’œil réel. Déloger l’œil de la conjonctive environnante (veuillez consulter la publication antérieure)23.
  3. Tirez l’œil latéralement jusqu’à ce que le nerf optique soit la seule connexion restante pour détacher l’œil. Le nerf optique se coupe souvent avec tension, mais un petit ciseaux est parfois nécessaire pour couper le nerf optique. Placez l’œil dans la solution saline tamponnée (HBSS) froide de Hank avec du calcium et du magnésium dans un tube de microcentrifugeuse de 1,7 mL.

2. Digestion des tissus oculaires

  1. Préparez le tampon de digestion contenant 0,1 mg/mL d’enzyme de digestion et 0,2 mg/mL de DNase dans le HBSS froid. Reconstituer 5 mg d’enzyme de digestion dans 2 mL d’eau stérile au départ. Préparer une dilution initiale de 10 mg/mL de DNase dans HBSS. Pour chaque 10 mL du tampon de digestion (suffisant pour 3 animaux) mélanger 9,4 mL de HBSS froid avec 0,4 mL d’enzyme de digestion reconstituée et 0,2 mL de DNase I dilué.
    REMARQUE : Ces concentrations ont été empiriquement déterminées au cours de multiples expériences afin de fournir des niveaux optimaux de coloration des anticorps des cellules individuelles, tout en réduisant la mort cellulaire. Collagène D a été essayé comme une alternative à l’enzyme de digestion avec une viabilité cellulaire réduite et diminué CD45+ cellules. S’il vous plaît voir discussion pour plus de détails concernant le processus itératif pour optimiser la digestion.
  2. Sous un microscope disséquant au grossissement total de 10x, enlevez la conjonctive restante et le nerf optique utilisant les forceps fins et les ciseaux de ressort dans le HBSS froid.
  3. Déplacez les yeux propres vers un plat sec disséquant ou un petit bateau de pesage. Injecter 0,15-0,20 mL/œil de tampon de digestion via une seringue munie d’une aiguille de 30 G dans la cavité vitreuse après que deux plaies perforantes ont été faites dans l’œil par l’axe visuel et à 90° de cette première blessure pour l’évacuation tampon de digestion.
  4. Hacher les yeux entiers à l’aide de ciseaux à ressort et de forceps fins avec tous les morceaux de moins de 0,5 mm x 0,5 mm. Dissocier le tissu de lentille avec la perturbation mécanique émoussée par des forceps pour empêcher des bouts obstruants de pipette dans les étapes suivantes. Pour chaque échantillon, rincer les forceps et les ciseaux chacun avec 0,75 mL de tampon de digestion dans un petit plat. Utilisez un nouveau plat pour chaque échantillon.
  5. Transférer le contenu du plat dans un tube de dissociation sur la glace à l’aide de la pipette P1000 en prenant soin de ne pas perdre de matière dans le transfert de pipette. Rincer le plat avec 1,5 mL supplémentaire de tampon de digestion, ce qui porte le volume total dans le tube de dissociation à 3,25-3,50 mL.
  6. Placez le tube de dissociation inversé sur le dissociateur électronique et exécutez le cycle « m_brain_03_01 », composé d’une rotation unidirectionnelle de 1 min à 200 rpm à température ambiante, qui est un programme préchargé. Assurez-vous que tous les tissus sont au fond du tube de dissociation en contact avec le tampon de digestion et le rotor pour cela et toutes les étapes restantes.
  7. Placer le tube de dissociation dans l’incubateur de secousses pendant 30 min à 200 rpm à 37 °C.
  8. Répétez les étapes 2.6 et 2.7 une fois de plus. Après la deuxième incubation de 30 min effectuer une digestion mécanique finale en utilisant dissociateur électronique comme dans l’étape 2.6.
  9. Arrêtez la réaction en ajoutant 10 mL de tampon d’écoulement froid et placez les tubes sur la glace.

3. Préparation de la suspension cellulaire

  1. Pour créer une suspension à cellules simples, versez la réaction de digestion oculaire interrompue à travers un filtre de 40 μm placé sur le dessus d’un tube de centrifugeuse conique de 50 mL. À l’aide du piston d’une seringue de 2,5 mL, poussez les morceaux restants de tissu oculaire non digéré à travers le filtre.
  2. Lavez le tube de dissociation avec 10 mL de tampon flow et rincez le filtre avant d’utiliser le même piston pour passer à nouveau des morceaux de tissu oculaire non digérés à travers le filtre.
  3. Répétez l’étape 3.2 à l’aide de 5 mL de tampon flow.
  4. Laver le tube de dissociation et filtrer avec un dernier tampon de 10 mL de flow.
    REMARQUE : Le volume total de tampon de digestion et de débit est d’environ 38-40 mL pour chaque échantillon.
  5. Centrifugeuse du tube conique à 400 x g pendant 10 min à 4 °C. Décanter le surnatant sans déranger la pastille cellulaire.
  6. Préparez une solution de lysage 1x en ajoutant une solution de lysage 10x à l’eau stérile. Casser la pastille en faisant glisser le tube contre un autre tube. Pour lyse globules rouges, ajouter 1 mL de solution de lysage 1x pour 30 s avec tourbillonnant à température ambiante (RT).
  7. Arrêtez la réaction avec 20 mL de tampon flow.
  8. Centrifugeuse du tube conique à 400 x g pendant 10 min à 4 °C. Décanter le surnatant sans déranger la pastille cellulaire.
  9. Dissocier la pastille en faisant glisser le tube contre un autre tube. Ajouter 5 mL de 1x HBSS froid par tube.
  10. Tubes de centrifugeuse à 400 x g pendant 10 min à 4 °C. Aspirer supernatant.

4. Coloration de la suspension cellulaire pour les phagocytes mononucléaires

  1. Préparez 0,5 mL de tache vivante/morte par échantillon en diluant le colorant vivant/mort 1:5 000 dans le HBSS froid.
  2. Ajouter la tache Live/Dead à chaque échantillon à l’aide d’une pipette P1000 en vous assurant de dissocier complètement la pastille. Transférer les échantillons dans des tubes de micro-litre de 1,2 mL.
  3. Prenez un petit aliquot (10 μL) pour compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur de cellules automatiques (voir 4.4). Incuber des échantillons avec des taches vivantes/mortes pendant 15 min à température ambiante dans l’obscurité.
  4. Comptez les cellules à l’aide du bleu Trypan pour déterminer le nombre de cellules vivantes par échantillon.
    REMARQUE : En règle générale, 2 yeux d’une souris C57BL/6J de 10 à 12 semaines contiennent moins de 2 x 106 cellules vivantes.
  5. Lavez les échantillons en ajoutant 400 μL de tampon flow froid. Tubes de centrifugeuse dans une grille de tube de micro-litre à 400 x g pendant 10 min à 4 °C. Aspirer le surnatant sans déranger la pastille cellulaire.
  6. Resuspendez complètement les cellules dans 500 μL de tampon flow froid. Tubes de centrifugeuse dans une grille de tube de micro-litre à 400 x g pendant 10 min à 4 °C. Aspirer le surnatant sans déranger la pastille cellulaire.
  7. Bloquer jusqu’à 5 x 106 cellules vivantes dans 50 μL de bloc Fc (1:50 dilution dans le tampon flow froid de rat purifié anti-souris CD16/CD32). Si plus de 5 x 106 cellules vivantes, augmenter les volumes de manière appropriée.
  8. Ajouter le blocF c à la pastille en s’assurant de dissocier complètement l’échantillon. Incuber pendant 20 min à 4 °C.
  9. Ajouter 50 μL de solution de coloration des anticorps (voir le tableau 1 pour le choix et la quantité de chaque anticorps inclus dans la solution) par 5 x 106 cellules vivantes directement aux cellules du bloc Fc et mélanger complètement. Incuber pendant 30 min à 4 °C.
    REMARQUE : Les quantités d’anticorps dépendent de la configuration du cytomètre d’écoulement et doivent être titrées indépendamment pour chaque laboratoire et instrument. Voir tableau 2 pour la configuration des instruments des filtres et des miroirs. Pour titrer les anticorps, commencez par la recommandation du fabricant et calculez l’indice de coloration. Effectuez un essai de différentes concentrations d’anticorps (au-dessus et en dessous de la recommandation du fabricant) et choisissez la plus faible concentration d’anticorps où l’indice de coloration est maintenu. En outre, assurez-vous que la coloration positive qui est moins lumineux que le contrôle d’une seule couleur. Utilisez des cellules non tachées pour vous assurer que les cellules tachées négativement sont à l’échelle et ont un pic à ou moins de 1 x 102. Utilisez une fluorescence moins un contrôle pour définir les cellules tachées positivement.
  10. Lavez les échantillons en ajoutant 700 μL de tampon d’écoulement froid. Tubes de centrifugeuse dans une grille de tube de micro-litre à 400 x g pendant 10 min à 4 °C. Aspirer le surnatant sans déranger la pastille cellulaire.
  11. En option, après coloration d’anticorps, les échantillons peuvent être fixés avec 500 μL de 2% de paraformaldéhyde dans le tampon flow. Fixer les échantillons pendant 15 min à température ambiante. Ensuite, effectuez un lavage tel que décrit dans 4.10. Conserver les échantillons fixes à 4 °C. Les perles de compt compte doivent être ajoutées le jour de la collecte des données de cytométrie du débit. Les échantillons fixes doivent être exécutés sur le cytomètre d’écoulement en 1-2 jours.
    MISE EN GARDE : Le paraformaldéhyde est corrosif et dangereux pour la santé.
  12. Lavez à nouveau les échantillons à l’aide de 500 μL de tampon flow froid. Tubes de centrifugeuse dans une grille de tube de micro-litre à 400 x g pendant 10 min à 4 °C. Aspirer la moitié du supernatant sans déranger la pastille cellulaire.
  13. Resuspendez les granulés et transférez-les dans une plaque d’analyse à fond U de 96 puits. Plaque de centrifugeuse à 400 x g pendant 5 min à 4 °C. Pour décanter le surnatant, retournez la plaque et, en une seule secousse forte, déloger le liquide dans un bassin d’évier, sans déranger les granulés.
  14. Dans un nouveau tube de micro-litre de 1,2 mL, placer 50 μL de perles de comptage bien vortexées.
  15. Resuspendez les granulés dans 96 plaques de puits dans 200 μL de tampon flow froid. Ajouter le mélange cellulaire sur le dessus des perles de l’étape précédente. Exécutez sur le cytomètre d’écoulement dans le volume total de 250 μL / tube de micro-litre.

5. Collecte de données de cytométrie de flux

  1. Allumez et préparez le cytomètre d’écoulement. Instructions énumérées ici sont pour un cytomètre laser modifié quatre (Tableau 2).
  2. Exécutez un échantillon d’essai, qui comprend un petit aliquot de chaque échantillon, pour vous assurer que toutes les cellules sont à l’échelle pour chaque détecteur. Ajustez les tensions de sorte que toutes les cellules soient à l’échelle.
  3. Exécutez des commandes de couleur unique (CSC) pour chaque fluorophore utilisé dans le cocktail de coloration (Tableau 3). Placez le tube de micro-titer dans un plus grand tube de polystyrène de 5 mL pour le placer sur le stade de cytomètre d’écoulement.
    REMARQUE : Les fluorophores racines comme BV421 (Pacific Blue), FITC, PE, Alexa647 (APC) et Alexa700 ne nécessitent pas le même anticorps que le cocktail (c.-à-d. CD19 PE pour CD64 PE). Cependant, les fluorophores tandem comme PE-CF594, PE-Cy7, ou APC-Cy7 nécessitent le même anticorps pour le CSC que le cocktail en raison de la dissociation potentielle des fluorophores conjugués.
    1. Créez le CSC pour BV421 en ajoutant 2 gouttes de perles de compensation à un tube de 1,2 litre de litre ainsi que 1 μL de hamster anti-souris CD11c BV421. Les perles de compensation sont utilisées parce que le CD11c BV421 est un sous-type IgG lambda plutôt que kappa tel que décrit dans 5.3.3. Incuber pendant 15 minutes à 4 °C. Ajouter 0,2 mL de tampon d’écoulement.
    2. Créez le CSC pour le colorant vivant/mort en ajoutant une goutte de perles de coloration positives (capuchon vert) à partir des perles réactives d’amine, suivies de 1 μL de colorant vivant/mort. Incuber pendant 15 min à température ambiante dans l’obscurité. Ajouter une goutte des perles négatives (capuchon blanc) des perles réactives à l’amine. Ajouter 0,2 mL de tampon d’écoulement.
    3. Créez les CSC restants en ajoutant une goutte de perles de coloration positives (capuchon vert) de l’ensemble de perles anti-rat et anti-hamster Ig kappa, suivie de la quantité d’anticorps répertoriée (tableau 3) dans un tube de 1,2 mL de litre. Incuber pendant 15 min à 4 °C. Ajouter une goutte des perles négatives (bonnet blanc) de l’ensemble de perles anti-rat et anti-hamster Ig kappa. Ajouter 0,2 mL de tampon d’écoulement.
    4. Vortex tous les mélanges de perles complètement. Conserver les CSC à 4 °C jusqu’à 3 jours.
      REMARQUE : Le CSC pour les souris fluorescentes de reporter est cellules non souillées.
    5. Lors de l’exécution des CSC, réglez des tensions de telle sorte que l’échantillon de CSC ait un pic supérieur à toute fluorescence pour un échantillon de cellules dans le même canal de détecteur. De plus, les tensions doivent être réglées de façon à ce que tout CSC ait au moins une différence de 0,5 log entre le pic d’histogramme dans le canal d’intérêt et tout autre canal (figure 1).
  4. Exécutez des échantillons sur les événements de maintien « faible » /seconde en dessous de 4 000. Si le débit ne peut pas être abaissé de façon appropriée, diluer les échantillons avec un tampon de débit froid supplémentaire. Enregistrez le volume ajouté car cela sera nécessaire pour le calcul du décompte (voir résultats représentatifs).
  5. Recueillir au moins 3 x 106 événements par échantillon. Ceci peut être plus élevé que le nombre de cellules en raison des granules pigmentaires et des débris comptant comme événements sur votre cytomètre.
  6. Enregistrez une fluorescence moins un (FMO) pour chaque fluorophore autre que Live/Dead pour une stratégie de gation appropriée à la section 6.4. Un FMO est un échantillon qui a été taché avec tous les fluorophores sauf un.
  7. Nettoyez et éte coupez le cytomètre d’écoulement selon les instructions du fabricant ou de l’installation.

6. Annotation des données de cytométrie de flux

  1. Ouvrez une nouvelle feuille de travail à l’aide d’un logiciel d’analyse. Importez les fichiers FCS à partir du cytomètre pour tous les échantillons et les contrôles monocolores.
  2. Utilisez les CSC pour créer une matrice de rémunération.
  3. Appliquez la matrice de compensation à vos échantillons tachés et fmos.
  4. Utilisez les OFO pour déterminer les taches positives pour dessiner des barrières.

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Representative Results

La figure 1 a montré des histogrammes de fréquence non compensés pour les CSC et les cellules pour le laser rouge : Alexa647, Alexa700, et APC-Cy7. Dans la figure 1A, la ligne magenta représentait le sommet de la CSC pour Alexa647, tandis que la ligne cyan montrait la différence prévue de 0,5 log. Notez que le pic d’Alexa700 et d’APC-Cy7 était à gauche (moins lumineux) de la ligne cyan. Notez également que les cellules étaient toutes à gauche de la ligne magenta. Toutes les cellules à droite du pic du CSC n’ont pas été compensées. On savait que des canaux spécifiques se déversaient dans d’autres en raison de la chimie des colorants fluorochromes (c.-à-d. Violet Laser: BV421 -> V500, Yellow-Green Laser: PE -> PE-CF594, Red Laser: Alexa647 -> Alexa700, Alexa700 -> APC-Cy7, Cross Laser: PE-Cy7 -> APC-Cy7). Si l’une ou l’autre des conditions ci-dessus n’était pas remplie, la tension d’un canal pourrait être ajustée vers le haut tandis que tous les canaux de déversement pourraient être déplacés vers le bas. Voir la figure 1B et la figure 1C pour d’autres exemples du laser rouge. Une fois les tensions déterminées puis enregistrées, tous les échantillons doivent être exécutés avec les paramètres de tension. Une compensation mise en place assistant existe et peut être utile.

L’identification de perle de compte est nécessaire pour la quantification des comptes de cellules. La figure 2A a montré les propriétés FSC-A vs SSC-A pour tous les événements analysés à partir de deux yeux d’une seule souris. Il est important d’ajuster la tension SSC pour s’assurer que vos perles de compt compte sont visibles comme une collection très serrée de SSC-Ahaute et FSC-Aévénements faibles. Les dénombrements de perles ont été nettoyés et confirmés en traçant PE vs APC-Cy7 (fig. 2B). Perles propres étaient un groupe serré de PE+ et APC-Cy7- événements.

Des singlets et des cellules vivantes ont ensuite été identifiés de tous les événements. Les singlets ont été déterminés en traçant FSC-H vs FSC-A. Les singlets ont été positivement corrélés dans ces deux propriétés tandis que les cellules de doublet et de triplet ont eu plus grand FSC-A que FSC-H (figure 2C). Les cellules vivantes ont été délimitées en traçant Live / Dead vs FSC-A. Les cellules mortes étaient vivantes /mortes positives, et les cellules démontrent plus de FSC-A que de débris (fig. 2D). Notez que les perles de compt compte étaient vivants / morts+ et ont été enlevés à cette étape.

La figure 3 montre la stratégie initiale de gation pour la délimitation des phagocytes mononucléaires à partir de cellules singlet vivantes. Les singlets en direct ont été visualisés à l’aide d’une intrigue CD45 versus CD11b(figure 3, à gauche). Notez que CD45+CD11b- (principalement des lymphocytes B et des lymphocytes T), CD45dimCD11b+ (microglies putatives), et CD45+CD11b+ cellules (infiltrant les cellules immunitaires, augmenté avec laser [Fig 3B, gauche]) ont été sélectionnés. L’absence de CD45+ cellules dans le CD45 FMO a confirmé la sélection de la porte(figure 3C, à gauche). Ensuite, les neutrophiles, Les éosinophiles, les cellules B, les cellules NK et les lymphocytes T ont été exclus en traçant des cd45+ singlets vivants à l’aide de lineage gate (Lin: Ly6G [neutrophiles], SiglecF [éosinophiles], B220 [cellules B], NK1.1 [cellules NK], CD4 [lymphocytes T], et CD8 [lymphocytes T]) vs CD11b. L’augmentation des groupes CD11b+Lin- cellules sans laser(figure 3A,milieu) et laser(figure 3B,milieu) a été facilement observée. Notez l’absence de CD11b+Lin- cellules dans le CD11b FMO (Figure 3C, milieu) et le manque de Lin+ cellules dans le Lin FMO (Figure 3C, à droite). Les microglies peuvent être séparées des phagocytes mononucléaires infiltrants par la quantité d’expression CD4513,24. CD11b+Lin- les cellules ont été visualisées à l’aide d’une intrigue CD11b vs CD45 pour identifier les microglies putatives dim CD45 et les phagocytes mononucléaires à forte infiltration CD45. L’augmentation relative des phagocytes mononucléaires élevés cd45 était claire chez la souris traitée au laser(figure 3A,B,droite).

La figure 4 a identifié des microglies, trois sous-ensembles de macrophages, des monocytes et des cellules dendritiques. Les microglies ont été déterminées en traçant des cellules faibles CD45 sur une parcelle CD64 vs MHCII (figure 4, panneau gauche). Microglia ont été montrés pour être CD64+MHCIIfaible précédemment13. Les microglies étaient relativement inchangées avec le laser et absentes dans le CD64 FMO(figure 4A,C à gauche). Les cellules hautescd45 ont ensuite été tracées sur le même graphique CD64 vs MHCII. CD64+MHCII- macrophages (MHCII- Macs), CD64-MHCII- monocytes et MHCII +cellules ont été identifiés(figure 4A,B,milieu gauche). Notez l’absence de MHCII+ cellules dans le MHCII FMO (Figure 4C, milieu gauche). MHCII+ cellules ont été encore discriminées à l’aide de CD64 et CD11c. CD64+CD11c- macrophages (CD11c- Macs), CD64+CD11c+ macrophages (CD11c+ Macs), et CD64-CD11c+ cellules dendritiques (CD) ont été définis(figure 4A, B, milieu à droite). Notez l’absence de CD11c+ cellules dans le CD11c FMO (Figure 4C, milieu à droite). Les monocytes ont été sous-typés comme ly6Cclassique + ou ly6C non classique- monocytes (figure 4, à droite). Notez l’absence de Ly6C+ monocytes dans le FMO Ly6C (Figure 4C, à droite).

Le nombre de cellules par souris (ou par 2 yeux) a été calculé avec l’équation suivante :

Equation 1

En utilisant les volumes de cette méthode, l’équation est la suivante :

Equation 2

Le nombre de cellules et le nombre de perles seront spécifiques à chaque échantillon. La concentration de perles est spécifique à chaque lot de perles de compter et fournie par le fabricant sur chaque flacon.

Macrophages infiltrer le choroïde après une blessure au laser25, et l’épuisement des macrophages réduit la zone CNV18. Ces études plus anciennes reposent sur l’imagerie immunofluorescence, qui ne peut pas différencier de manière fiable les phagocytes mononucléaires, ou moins de marqueurs cytométriques de flux pour l’identification des macrophages. L’hétérogénéité des macrophages est un concept émergent en immunologie innée, où les macrophages sont capables d’effectuer de multiples fonctions en fonction de leur origine et de leur microenvironnementtissulaire 12,26. Nous avons exécuté la cytométrie de flux multi-paramètres sur les yeux non traités et traités au laser de souris le jour 3 après blessure de laser pour identifier des phagocytes mononucléaires et l’hétérogénéité de macrophage. Le traitement au laser a augmenté MHCII-, CD11c-, et CD11c+ macrophages de 7,0-25,6, 2,8-7,2, et 3,9-8,2 fois respectivement (Figure 5A,C). Les comptes de cellules dendritiques ont également été jusqu’à régulés 4,5-4,7 fois par laser (Figure 5F). Les comptes de microglies et de monocytes n’ont pas été affectés par le traitement au laser( figure 5D,E). Aucune différence significative n’a été détectée avec ou sans perfusion systémique avant l’enucleation. Ces résultats démontrent des populations accrues de macrophages et de cellules dendritiques après des dommages de laser sans changement aux microglies ou aux monocytes. En outre, ces données mettent en évidence la façon dont la cytométrie du flux multi-paramètres peut détecter l’hétérogénéité des macrophages.

Anticorps ou tampon Fluorophore Clone Quantité par échantillon (ng)
rat anti-souris Ly6C Fitc AL-21 (al-21) 15
souris anti-souris CD64 Pe X54-5/7,1 40
rat anti-souris Tim4 AlexaFluor 647 RMT4-54 300
hamster anti-souris CD11c BV 421 (en) HL3 (HL3) 300
rat anti-souris Ly6G PE-CF594 1A8 (1A8) 10
souris anti-souris NK1.1 PE-CF594 PK136 PK136 10
rat anti-souris Siglec F PE-CF594 E50-2440 20
rat anti-souris B220 PE-CF594 RA3-6B2 20
rat anti-souris CD8 PE-CF594 53-6.7 40
rat anti-souris CD4 PE-CF594 RM4-5 20
rat anti-souris MHC II AlexaFluor 700 M5/114.15.2 2.5
rat anti-souris CD11b APC-Cy7 (en) M1/70 2
rat anti-souris CD45 PE-Cy7 30-F11 6
Tampon MACS

Tableau 1 : Fluorophore d’anticorps et clones (voir l’étape 4.9). En général, un échantillon est soit un ou deux yeux digérés. Ajoutez le tampon d’écoulement à un tube d’abord puis à chaque anticorps. Des dilutions peuvent être effectuées pour éviter que le tuyautage ne soit trop faible, tout en modifiant le volume total du tampon de débit de façon appropriée. Voir tableau des matériaux pour le numéro de produit et l’entreprise.

Laser Fente PMT Filtre Miroir Couleurs
Violet (405nm) Un 525/50 505LP (505LP) V500 ou AmCyan
B 450/50 Pacific Blue, eFluor 450, V450 ou BV421
Bleu (488nm/FSC) Un 710/50 685LP (685LP) PerCP-Cy5.5, PerCP, PI ou 7AAD
B 525/50 505LP (505LP) FITC, CFSE, GFP ou AlexaFluor 488
C 488/10 Ssc
Jaune-Vert (561nm) Un 780/60 735LP (735LP) PE-Cy7
B 610/20 600LP (600LP) PE-CF594, mCherry ou DsRed2
C 582/15 Pe
Rouge (640nm) Un 780/60 735LP (735LP) APC-Cy7, APC-H7 ou APC-eFluor 780
B 730/45 690LP (690LP) AlexaFluor 700
C 670/30 APC ou AlexaFluor 647

Tableau 2 : Configuration du cytomètre d’écoulement. Configuration du filtre et du miroir pour un cytomètre à quatre lasers et les fluorophores disponibles qui peuvent être détectés dans chaque canal. PMT = tube photomultiplier, FSC = scatter avant, SSC = éparpille latérale.

Anticorps Fluorophore Clone Montant par CSC (ng)
rat anti-souris CD45 Fitc 30-F11 500
rat anti-souris CD19 Pe 1D3 (1D3) 40
rat anti-souris Tim4 AlexaFluor 647 RMT4-54 100
hamster anti-souris CD11c BV421 (BV421) HL3 (HL3) 200
rat anti-souris Siglec F PE-CF594 E50-2440 40
rat anti-souris CD19 AlexaFluor 700 1D3 (1D3) 200
rat anti-souris CD11b APC-Cy7 (en) M1/70 200
rat anti-souris CD45 PE-Cy7 30-F11 200
Live / Dead Dye eFluor 506 N/A 1 μl

Tableau 3 : Fluorophore d’anticorps et clones pour les commandes de couleurs simples. Chaque anticorps doit être ajouté à la perle de compensation appropriée décrite dans les étapes 5.3.1 - 5.3.3.

Figure 1
Figure 1 : Tension représentative mise en place pour le laser rouge. (A) Commandes de couleur unique (CSC) pour Alexa647. Sur la gauche, le CSC pour Alexa647 est montré. Le milieu gauche affiche le déversement de la CSC Alexa647 dans le canal Alexa700. Le sommet de l’Alexa647 SCC est montré en magenta et le différentiel de but de 0,5 log est affiché en cyan. Notez que le pic est à gauche (moins lumineux) que la ligne cyan. La droite moyenne démontre le déversement de la CSC Alexa647 dans le canal APC-Cy7. Droite illustre les cellules dans le canal Alexa647. Notez que toutes les cellules sont moins brillantes que la CSC (ligne magenta). (B) CSC pour Alexa700. La gauche moyenne montre le CSC pour Alexa700. Gauche affiche le déversement de la CSC Alexa700 dans le canal Alexa647. La droite moyenne démontre le déversement de la CSC Alexa700 dans le canal APC-Cy7. Le pic de l’Alexa700 SCC est montré en magenta et le différentiel de but de 0,5 log est affiché en cyan. Notez que le pic est à gauche (moins lumineux) que la ligne cyan. Droite illustre les cellules dans le canal Alexa700. Notez que toutes les cellules sont moins brillantes que la CSC (ligne magenta). (C) CSC pour APC-Cy7. La gauche et le centre gauche montrent le déversement de la CSC APC-Cy7 dans Alexa647 et Alexa700, respectivement. Notez que les deux pics sont à gauche de la ligne cyan. La droite moyenne démontre la CSC ACP-Cy7. Droit illustre les cellules dans le canal APC-Cy7. Notez que toutes les cellules sont moins brillantes que la CSC (ligne magenta). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Identification représentative des perles de compter, des singlets et des cellules vivantes. (A) Zone latérale de dispersion (SSC-A) vs zone de dispersion avant (FSC-A) pour toutes les cellules sur une parcelle de contour. Les perles de comptage sont identifiées par le SSC-A élevé, le FSC-A bas, et le regroupement très serré des perles uniformes. (B) PE vs APC-Cy7 parcelle pour la porte de perles propres. La flèche entre A et B indique le tracé des événements positifs de perle de compte seulement. Les perles de dénombrement propre sont délimitées par une forte teneur en PE et une faible fluorescence APC-Cy7. (C) FSC-Height (FSC-H) vs FSC-Area (FSC-A) parcelle de toutes les cellules démontre des cellules singlet dans une ligne large positivement corrélée. Les doublets et autres multiplets présentent une plus grande zone FSC que la hauteur FSC. (D) Live / Dead vs FSC-A pour les cellules singlet. Les cellules vivantes sont définies comme vivant / mort faible et FSC-A positif. Les pourcentages indiquent le pourcentage de parents. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Identification représentative des phagocytes mononucléaires. À gauche : CD45 vs CD11b pseudocolor parcelle de cellules vivantes de nonlasered (A), lasered (B), et la fluorescence moins un (FMO) contrôle (C). Gauche: CD45+ cellules sont définies en A-B et absentes dans le FMO. Notez l’augmentation de CD45+CD11b+ cellules dans le groupe lasered (B). Milieu: Pseudocolor parcelle de lignée (Lin) marqueur vs CD11b pour CD45+ cellules. CD11b+Lin- les cellules sont délimitées en A-B et sont absentes de l’OMM pour le CD11b (en bas). À droite: CD11b vs CD45 parcelle de CD11b+Lin- cellules. Cd45dim et CD45cellules hautes sont identifiés. Notez l’augmentation des celluleshautes CD45 dans le groupe lasered (B). Les pourcentages indiquent le pourcentage de parents. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Identification représentative des microglies, des cellules dendritiques, des monocytes et des sous-ensembles de macrophages. À gauche : CD64 vs MHCII pseudocolor parcelle de cellules faibles CD45 définit les microglies comme CD64+MHCIIfaible. Notez la quantité similaire de microglies dans les groupes nonlasered (A) et lasered (B), et l’absence de microglies dans le contrôle FMO (C). Milieu à gauche: CD64 vs MHCII pseudocolor parcelle de cellules hautes CD45 définit MHCII- macrophages comme CD64+MHCII-, monocytes comme CD64-MHCII-, et MHCII+ cellules. Notez l’augmentation des macrophages MHCII- dans le groupe lasered (B), l’absence de cellules MHCII+ dans les cellules FMO (C, milieu), et le CD64 FMO (C, gauche) a aidé à déterminer la coupure pour CD64+ et CD64- cellules. Centre droit: CD64 vs CD11c pseudocolor parcelle de MHCII+ cellules. CD11c- les macrophages ont été définis comme CD64+CD11c-, CD11c+ macrophages ont été identifiés comme CD64+CD11c+, et les cellules dendritiques (CD) ont été délimitées comme CD64-CD11c+. Les sous-ensembles de macrophages et les cellules dendritiques ont été augmentés avec le laser (B). Notez l’absence de CD11c+ cellules dans le FMO (C). Droite: Ly6C vs Tim4 pseudocolor parcelle de monocytes. Ly6C classique+ et non classique Ly6C- monocytes ont été identifiés. Notez que ly6Cclassique + monocytes étaient absents dans le FMO Ly6C (C). Les pourcentages indiquent le pourcentage de parents. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Données représentatives pour les phagocytes mononucléaires entre souris nonlasered et lasered avec et sans perfusion systémique. MHCII- ( A), CD11c- ( B), et CD11c+ (C) comptes de macrophages ont tous été augmentés avec le laser. Aucun changement n’a été détecté entre les microglies nonlasées et laserées (D) ou les monocytes (E). Les cellules dendritiques (DC) ont également été augmentées avec le laser (F). Brown Forsythe et Welch ANOVA avec le test de comparaison multiple T3 de Dunnett ont été utilisés pour définir les différences statistiques dues à des écarts inégaux entre les groupes. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

La cytométrie de flux multi-paramètres permet l’analyse quantitative de plusieurs types de cellules dans un tissu complexe. Dans ce rapport, nous décrivons la détection cytométrique de flux des populations mononucléaires de phagocyte, y compris des monocytes, des cellules dendritiques, et des sous-ensembles de macrophage, après blessure de laser dans l’oeil de souris. Liyanage et autres ont récemment rapporté une stratégie semblable de gating pour détecter des neutrophiles, des éosinophiles, des lymphocytes, des DCs, des macrophages, des macrophages infiltrants, et des monocytes27. Notre stratégie de gating diffère principalement par l’ajout de CD64. Liyanage et coll. identifient DC comme CD4-CD8-B220-CD11b+CD11c+ cellules, et macrophages comme CD4-CD8-B220-CD11b+CD11c-NK1.1-Ly6G- cellules. Nous identifions DC comme CD4-CD8-B220-Ly6G-SiglecF-NK1.1-CD11b+CD11c+CD64- cellules et macrophages comme CD4-CD8-B220-Ly6G-SiglecF-NK1.1-CD11b+CD64+ cellules. L’utilisation du CD64 pour discriminer DC des macrophages estbien établie 6, et cette stratégie nous permet d’identifier l’hétérogénéité des macrophages, y compris les macrophages CD11c+. La principale limitation de cette méthode est qu’elle ne fournit pas de données sur l’architecture tissulaire ou l’emplacement de cellules spécifiques dans l’œil. Afin de déterminer si ces cellules sont dans la rétine, choroïde, iris, ou une autre structure oculaire, notre protocole peut être combiné avec des méthodes histologiques ou modifié pour inclure une dissection ophtalmique plus étendue pour exécuter individuellement cytométrie de flux multi-paramètres sur chaque sous-commandement oculaire.

Nous avons optimisé le protocole pour la digestion des yeux entiers de souris pour empêcher toute variance créée par la dissection. Par exemple, la dissection des tasses postérieures d’oeil avec l’enlèvement de la cornée, de l’iris, et de la lentille pourrait créer la variabilité de l’iris retenu ou du matériel cornéen (sous-dissection) ou des dommages accrus de laser à la zone postérieure normale de tasse d’oeil (sur-dissection). Notre comparaison entre les yeux nonlasered et lasered de contrôle détecte l’infiltration des phagocytes mononucléaires en raison des dommages rétinochoridal. Pour l’analyse des effets des maladies systémiques sur l’œil, c’est-à-dire l’uvéite et le diabète, l’analyse individuelle du sous-commandement oculaire est essentielle. La méthode de digestion, à la section 2 du protocole, est la plus critique, tandis que d’autres étapes des sections 3 à 5 ont été utilisées avec succès sur plusieurs types de tissus24. Nous sommes arrivés à nos conditions de digestion par une méthode itérative qui impliquait: (1) l’essai de la méthode de digestion chimique (Collagène D vs enzyme de digestion), (2) la détermination de la longueur de la digestion chimique (30, 60, et 90 minutes), et (3) l’ajout de digestion mécanique (aucune, une fois, deux fois, trois fois). À chaque étape, nous avons jugé le succès des conditions de digestion par la viabilité cellulaire et le nombre de CD45HiCD64+ (infiltrant macrophages) cellules. Nous avons constaté que l’enzyme de digestion (voir tableau supplémentaire des matériaux) a récupéré plus de cellules vivantes que la collagène D et que la tentative de la moitié de la concentration en enzymes de digestion a entraîné moins de macrophages infiltrants. Ensuite, 60 minutes de digestion chimique avec digestion mécanique ont presque doublé les populations de macrophages infiltrants. Trois digestions mécaniques étaient optimales avec 25-30% cellules vivantes des singlets et les populations macrophages les plus infiltrantes. Enfin, des conditions de digestion mécanique plus rapides ont causé une perte grave des cellules vivantes et des macrophages.

À l’avenir, nous proposons d’étendre la méthode en enlevant la cornée, l’iris et la lentille, suivie d’une digestion séparée de la rétine et de la coupe postérieure de l’œil (scléroïde, choroïde et épithélium pigmenté rétinien). Avec cette modification, nous nous attendons à réduire les conditions de digestion en raison des caractéristiques protéiques et denses de la lentille et de la cornée respectivement. Ces réductions pourraient inclure la concentration réduite d’enzymes de digestion, le passage à la collagène, une diminution du temps de digestion ou une diminution de la quantité de digestion mécanique. Nous nous attendons à des conditions de digestion globalement réduites pour la tasse postérieure d’oeil, et à d’autres conditions diminuées de digestion pour la rétine seule.

D’autres directions futures incluent l’expansion de notre panneau conventionnel de cytométrie de flux multi-paramètres à un instrument laser conventionnel de 6 ou cytométrie spectrale de flux. La cytométrie du débit spectral permet la détection du fluorophore sur l’ensemble du spectre, plutôt que déterminée par les filtres disponibles. La cytométrie du débit spectral entraîne une détection de couleur plus spécifique. Toutefois, la cytométrie du débit spectral nécessite un ensemble entièrement nouveau de considérations à suivre et dépasse le cadre de ce manuscrit. Pour plus de détails, veuillez consulter cet article récent de JoVE28. Les 6 instruments laser comprennent un laser ultraviolet, qui ajoute 6-9 détecteurs. Lors de l’ajout de marqueurs à un panneau de cytométrie du flux oculaire de la souris, nous recommandons la détection de types de cellules plus oculaires. Par exemple, la porte de lignée pourrait être séparée pour détecter les neutrophiles, les éosinophiles, les mastocytes, les cellules NK et les lymphocytes indépendamment. Il n’est pas recommandé d’augmenter la détection sous-ensemble des phagocytes mononucléaires en raison du petit nombre de macrophages à l’état stable. Lors de l’ajout de nouveaux anticorps, nous suggérons une titration minutieuse des anticorps.

En résumé, nous avons présenté une méthode adaptable et robuste pour la détection des populations mononucléaires de phagocyte dans l’oeil de souris. En raison des marqueurs de surface cellulaire très qui se chevauchent des monocytes, des cellules dendritiques, des macrophages et des microglies, la cytométrie du flux multi-paramètres est la meilleure méthode pour détecter ces populations cellulaires. La cytométrie de flux peut être utilisée pour l’analyse des types de cellules, la cartographie du destin et/ou le tri cellulaire pour l’évaluation transcriptomique ou protéomique. Sa limitation majeure est le manque d’architecture tissulaire, et les résultats clés peuvent être confirmés en utilisant l’histologie traditionnelle.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

JAL a reçu le soutien de la subvention des NIH K08EY030923; Le CMC a reçu une subvention K01 (5K01AR060169) du NIH National Institute of Arthritis and Musculoskeletal Diseases et une nouvelle subvention de recherche (637405) de la Lupus Research Alliance.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.6 ml microcentrifuge tubes Fisher Scientific 05-408-120
1.7 ml microcentrifuge tubes Costar 3620
10 ml pipettes Fisher Scientific 431031
15 ml conicals ThermoFisher 339650
1x HBSS, 500 ml Gibco 14025-092
2.5 ml syringe Henke Sass Wolf 7886-1
20% paraformaldehyde solution Electron Microscopy Sciences 15713-S
25 ml pipettes Fisher Scientific 431032
30 G needle Exel 26437
3ml luer lock syringe Fisher Scientific 14955457
41 x 41 x 8 mm polystyrene weigh dish Fisher Scientific 08-732-112
50 ml conicals Falcon 352070
96-well, U-bottom assay plate without lid Falcon 353910
Amine reactive beads ThermoFisher A10628
Analysis software FlowJo v 10
Anti-rat and anti-hamster Ig kappa bead set BD Biosciences 552845
C57BL/6J mice Jackson Laboratory 664
Cell counter Invitrogen AMQAX1000
Cell counter slides Invitrogen C10283
Compensation beads ThermoFisher 01-1111-42
Count beads ThermoFisher 01-1234-42
Curved forceps Fisher Scientific 16-100-123
Digestion enzyme Sigma Aldrich 5401020001
Dissecting microscope National Optical and Scientific Instruments, Inc. DC3-420T
Dissociation tubes Miltenyi Biotec 130-096-334
DNase Roche 10104159001
Electronic dissociator Miltenyi Biotec 130-095-937
FACS Diva software BD Biosciences
Fc block, rat anti-mouse CD16/CD32 BD Biosciences 553142
Fine forceps Integra Miltex 17035X
Flow buffer Miltenyi Biotec 130-091-221
Flow cytometer BD Biosciences
Flow tubes Falcon 352008
Hamster anti-mouse CD11c BV421 BD Biosciences 562782
Ice bucket Fisher Scientific 07-210-123
Live/Dead dye ThermoFisher 65-0866-14
Lysing solution, 10x solution BD Biosciences 555899
Micro titer tube and rack Fisher Scientific 02-681-380
Mouse anti-mouse CD64 PE BioLegend 139304
Mouse anti-mouse NK1.1 PECF594 BD Biosciences 562864
P1000 pipet tips Denville Scientific P2404
P1000 pipettor Gilson FA10006M
P2 pipet tips eppendorf 22491806
P2 pipettor Gilson FA10001M
P20 pipettor Gilson FA10003M
P200 pipet tips Denville Scientific P2401
P200 pipettor Gilson FA10005M
Pipet man Fisher Scientific FB14955202
Rat anti-mouse B220 PECF594 BD Biosciences 562313
Rat anti-mouse CD11b APC-Cy7 BD Biosciences 557657
Rat anti-mouse CD19 AlexaFluor 700 BD Biosciences 557958
Rat anti-mouse CD19 PE BD Biosciences 553786
Rat anti-mouse CD4 PECF594 BD Biosciences 562314
Rat anti-mouse CD45 FITC ThermoFisher 11-0451-82
Rat anti-mouse CD45 PE-Cy7 BD Biosciences 552848
Rat anti-mouse CD8 PECF594 BD Biosciences 562315
Rat anti-mouse Ly6C BD Biosciences 561085
Rat anti-mouse Ly6G PECF594 BD Biosciences 562700
Rat anti-mouse MHC II AlexaFluor 700 BioLegend 107622
Rat anti-mouse Siglec F PECF594 BD Biosciences 562757
Rat anti-mouse Tim4 AlexaFluor647 BD Biosciences 564178
Shaking incubator Labnet 311DS
Spring scissors Fine Science Tools 15024-10
Sterile cell strainer, 40 mm nylon mesh Fisher Scientific 22363547
Sterile water, 500 ml Gibco A12873-01
Swinging bucket centrifuge eppendorf 5910 R
Trypan blue, 0.4% solution Gibco 15250061

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References

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Immunologie et infection Numéro 160 oeil cytométrie d’écoulement macrophage microglies monocyte myéloïde
Digestion des yeux de souris entières pour l’analyse cytométrique de flux multi-paramètres des phagocytes mononucléaires
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Droho, S., Cuda, C. M., Lavine, J. A. Digestion of Whole Mouse Eyes for Multi-Parameter Flow Cytometric Analysis of Mononuclear Phagocytes. J. Vis. Exp. (160), e61348, doi:10.3791/61348 (2020).

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