Summary
Denne protokol giver en metode til at fordøje hele øjne i en enkelt celle suspension med henblik på multi-parameter flow cytometrisk analyse med henblik på at identificere specifikke okulære mononukleare phagocytiske populationer, herunder monocytter, mikroglia, makrofager, og dendritiske celler.
Abstract
Det medfødte immunsystem spiller vigtige roller i okulær patofysiologi, herunder uveitis, diabetisk retinopati og aldersrelateret makuladegeneration. Medfødte immunceller, specielt mononukleare fagocytter, udtrykker overlappende celleoverflademarkører, hvilket gør det til en udfordring at identificere disse populationer. Multiparameterflowcytometry giver mulighed for samtidig, kvantitativ analyse af flere celleoverflademarkører for at differentiere monocytter, makrofager, mikroglia og dendritiske celler i museøjne. Denne protokol beskriver enucleation af hele museøjne, okulær dissektion, fordøjelse i en enkelt celle suspension, og farvning af en enkelt celle suspension for myeloid celle markører. Derudover forklarer vi de korrekte metoder til bestemmelse af spændinger ved hjælp af enkeltfarvekontroller og til afgrænselse af positive porte ved hjælp af fluorescens minus en kontrol. Den største begrænsning af multi-parameter flow cytometry er fraværet af vævsarkitektur. Denne begrænsning kan overvindes ved multi-parameter flow cytometry af individuelle okulære rum eller gratis immunofluorescens farvning. Immunfluorescens er imidlertid begrænset af manglende kvantitativ analyse og reduceret antal fluorophorer på de fleste mikroskoper. Vi beskriver brugen af multi-parametrisk flow cytometri til at give meget kvantitativ analyse af mononukleare fagocytter i laser-induceret choroidal neovascularization. Derudover kan multiparameterflowcytometry bruges til identifikation af makrofagundersæt, skæbnetilknytning og cellesortering til transskriptionomik eller proteomiske undersøgelser.
Introduction
Det medfødte immunsystem omfatter flere celletyper, der stimulerer komplementaktivering og inflammation. Medfødte immunceller omfatter naturlige dræberceller (NK), mastceller, basofiler, eosinofiler, neutrofiler og mononukleare fagocytter. Mononukleare fagocytter, som består af monocytter, makrofager og dendritiske celler, har været impliceret i patofysiologien af flere oftalmiske tilstande, herunder uveitis, diabetisk retinopati og aldersrelateret makuladegeneration (AMD)1. I denne protokol vil vi fokusere på identifikation af mononukleare fagocytter ved hjælp af multiparameterflow cytometrisk analyse i en musemodel af neovaskulær AMD2. Denne protokol kan tilpasses til musemodeller af diabetisk retinopati og / eller uveitis, men mere omfattende okulær dissektion anbefales på grund af disse sygdommes systemiske karakter.
Mononukleare fagocytter udtrykker overlappende celleoverflademarkører. Langvarige makrofager i væv og mikroglia stammer fra den erythromyeloide stamfader, der stammer fra æggeblommen3, mens genanvendelse af makrofager og dendritiske celler adskiller sig fra den knoglemarvsafledte makrofaglige cellegenitor4. Musecelleoverflademærker, der er fælles for monocytter, makrofager og dendritiske celler, omfatter CD45, CD11b5, F4/806, Cx3cr17og den intracellulære markør Iba18. For at overvinde denne udfordring definerer transskriptionsanalyse af makrofager, monocytter og dendritiske celler fra flere væv CD64 som en makrofaglig celleoverflademarkør6. Makrofager er blevet beskrevet i iris, choroid, ciliary krop, og synsnerven i sunde øjne3. Alternativt er identifikation af dendritiske celler vanskeligere. den mest specifikke metode til identifikation af dendritiske celler kræver skæbnekortlægning ved hjælp af Zbtb46-GFP-reportermusen9. Uafhængigt af denne reporterlinje kan udtryk for CD11c og MHCII i forbindelse med fraværet af CD64 identificerepotentielledendritiske celler 6,10. Dendritiske celler er blevet identificeret i hornhinden, bindehinden, iris, og choroid i normale øjne11. Microglia er specialiserede makrofager placeret i nethinden, beskyttet af blod-nethinde barrieren, og stammer fra æggeblomme sæk stamceller12. Som følge heraf kan nethindemikroglia skelnes fra monocyt-afledte makrofager ved deres dimniveauer af CD45-udtryk13 og høje niveauer af Tmem119, som fås som et flowcytometriantistof antistof14. Ved microglia aktivering, dog CD45 kan up-reguleret15 og Tmem119 kan være ned-reguleret3, der viser kompleksiteten af microglia biologi, og dette er sandsynligvis relevant i både AMD og dens musemodel. Endelig kan monocytter opdeles i mindst to undertyper, herunder klassisk og ikke-klassisk. Klassiske monocytter viser CCR2+Ly6ChøjCX3CR1lavt udtryk, og ikke-klassiske monocytter demonstrere CCR2-Ly6ClavCX3CR1høje markører5.
På grund af nødvendigheden af den kvantitative analyse af markørudtryk, dvs. Yderligere fordele omfatter identifikation af underpopulationer, evnen til at bruge fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) til at sortere cellepopulationer til transskriptionomic eller proteomic analyse og skæbnekortlægning. Den største ulempe ved multi-parameter flow cytometry er manglen på vævsarkitektur. Dette kan overvindes ved oftalmisk dissektion i de forskellige okulære subcompartments: hornhinde, bindehinde, iris, linse, nethinden, og choroid-sclera kompleks. Derudover kan bekræftende immunfluorescens imaging udføres, men er begrænset af antallet af markører og mangel på robust kvantantitation.
Genom brede forening undersøgelser har knyttet flere komplement gener med AMD16. Komplement aktivering fører til anafylakin produktion, leukocyt rekruttering, og deraf følgende inflammation. I komplementreceptor mangelfulde mus reducerer laserskade mononuklear phagocytrekruttering og laserinduceret choroidal neovascularisering (CNV) område17. Tilsvarende C-C motiv kemokin receptor 2 (CCR2) knockout mus, som er mangelfuld i monocyt rekruttering til vævet, viser både nedsat mononuklear phagocyt rekruttering og laser-induceret CNV område18. Disse data link supplement og mononukleare fagocytter med eksperimentelLE CNV og muligvis neovaskulær AMD. Til støtte for denne forening dysreguleres komplementreceptorer på perifere blodmon monocytter hos patienter med neovaskulær AMD19,20. Disse data viser en stærk sammenhæng mellem AMD og mononukleare fagocytter.
I dette manuskript vil vi bruge den eksperimentelle laserinducerede CNV-model til at karakterisere de mononukleare fagocytpopulationer i museøjet ved hjælp af multiparameterflowcytometri. Laser-induceret CNV er standardmus model af neovaskulær AMD, som viste effekten af den nuværende første linje neovaskulær AMD behandling21. Denne protokol vil beskrive enucleation af museøjne, okulær dissektion, fordøjelse i en enkelt celle suspension, antistof farvning, bestemmelse af laser spændinger ved hjælp af enkelt farve kontrol, og gating strategi ved hjælp af fluorescens minus en (FMO) kontrol. En detaljeret beskrivelse af den laserfremkaldte CNV-model findes i en tidligere publikation22. Ved hjælp af denne protokol definerer vi mikroglia, monocytter, dendritiske celler og makrofagpopulationer. Desuden vil vi bruge MHCII og CD11c til yderligere at definere makrofag delsæt inden for laser induceret CNV model.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer blev godkendt af Northwestern University Institutional Animal Care and Use Committee. C57BL/6 mus var gruppehus på en barriere facilitet på Center for Comparative Medicine på Northwestern University (Chicago, IL). Alle dyr blev opstaldet i 12/12 timers lys / mørk cyklus med fri adgang til mad og vand.
1. Indsamling af okulært væv
- Ofre 10-12 uger gamle C57BL/6J mus af begge køn ved hjælp af reguleret administration af kuldioxid, indtil musen ikke reagerer og ikke længere inhalere. Udfør cervikal dislokation eller anden godkendt sekundær metode til at sikre aktiv dødshjælp.
BEMÆRK: Transcardial perfusion kan udføres for at fjerne cirkulerende leukocytter, der ikke er i okulære væv. I dette eksperiment reducerer systemisk perfusion ikke antallet af mikroglia, monocytter, makrofager eller dendritiske celler, der påvises i ubehandlede eller laserbehandlede hele øjne. Derfor er de fleste af disse celletyper placeret i de oftalmiske væv, og dette trin er valgfrit. - For at forstørre øjnene skal du skubbe ned i nærheden af øjenhulen, mens du placerer et par buede pincet forsigtigt under øjet, da det skiller sig ud af stikkontakten. Knivspids pincet lukket under øjet uden at klemme det faktiske øje. Løsrive øjet fra det omgivende bindehinde (se tidligere offentliggørelse)23.
- Træk øjet sideværts, indtil synsnerven er den eneste tilbageværende forbindelse til at løsne øjet. Synsnerven skærer ofte med spænding, men en lille saks er undertiden nødvendig for at skære synsnerven. Øjet anbringes i kold 1x Hanks Buffered Saline Solution (HBSS) med calcium og magnesium i 1,7 ml mikrocentrifugerør.
2. Fordøjelsen af okulært væv
- Fordøjelsesbufferen, der indeholder 0,1 mg/mL fordøjelsesenzym og 0,2 mg/mL DNase, forberedes i koldt HBSS. Rekonstruer 5 mg fordøjelsesenzym i 2 mL sterilt vand i første omgang. Forbered en indledende fortynding på 10 mg/mL DNase i HBSS. For hver 10 mL af fordøjelsesbufferen (tilstrækkelig til 3 dyr) blandes 9,4 mL kold HBSS med 0,4 mL rekonstitueret fordøjelsesenzym og 0,2 mL fortyndet DNase I.
BEMÆRK: Disse koncentrationer blev empirisk bestemt over flere forsøg for at give optimale niveauer af antistof farvning af enkelte celler, samtidig med at celledøden blev reduceret. Kollagen D blev forsøgt som et alternativ til fordøjelsesenzym med nedsat celle levedygtighed og nedsat CD45+ celler. Se Diskussion for at få flere oplysninger om den iterative proces til optimering af fordøjelsen. - Under et dissekerende mikroskop ved 10x total forstørrelse fjernes den resterende bindehinde og synsnerve ved hjælp af fine pincet og fjedersaks i kold HBSS.
- Flyt rene øjne til en tør dissekeringsskål eller en lille vejebåd. Der indsprøjes 0,15-0,20 mL/øje af fordøjelsesbufferen via sprøjte udstyret med 30 G nål i glashulen, efter at der er lavet to perforeringssår i øjet gennem den visuelle akse og 90° væk fra dette første sår for fordøjelsesbufferudgang.
- Hakke hele øjne med fjedersaks og fine pince med alle stykker mindre end 0,5 mm x 0,5 mm. Dissociate linsevæv med stump mekanisk forstyrrelse via pincet for at forhindre tilstopning pipette tips i de efterfølgende trin. For hver prøve skylles pincet og saks hver med 0,75 mL fordøjelsesbuffer i lille skål. Brug en ny skål til hver prøve.
- Indholdet af skålen overføres til et dissociationsrør på isen ved hjælp af P1000-pipette, der sørger for ikke at miste noget materiale i pipetteoverførslen. Skålen skylles med yderligere 1,5 mL fordøjelsesbuffer, hvilket bringer det samlede volumen i dissociationsrøret op på 3,25-3,50 mL.
- Placer dissociationsrøret omvendt på elektronisk dissociator og kør cyklus "m_brain_03_01", der består af 1 min ensrettet rotation ved 200 omdrejninger i minuttet ved stuetemperatur, som er et forudindlæst program. Sørg for, at alt væv er i bunden af dissociationsrøret i kontakt med fordøjelsesbufferen og rotoren til dette og alle resterende trin.
- Dissociationsrøret anbringes i rysteinkubatoren i 30 minutter ved 200 omdrejninger ved 37 °C.
- Gentag trin 2.6 og 2.7 en ekstra gang. Efter anden 30 minutters inkubation udføres en endelig mekanisk fordøjelse ved hjælp af elektronisk dissociator som i trin 2.6.
- Stop reaktionen ved at tilføje 10 mL koldstrømsbuffer og læg rør på is.
3. Forberedelse af celleaffjedring
- For at skabe encellet affjedring hældes den standsede øjenfordøjeholdelsesreaktion gennem et 40 μm filter placeret på toppen af et 50 mL konisk centrifugerør. Brug stemplet fra en 2,5 mL sprøjte, skub eventuelle resterende stykker ufordøjet øjenvæv gennem filteret.
- Dissociationsrøret vaskes med 10 mL Flow buffer og skylles filter, før du bruger det samme stempel til igen at passere ufordøjede øjenvævsstykker gennem filteret.
- Gentag trin 3.2 ved hjælp af 5 mL Flow-buffer.
- Dissociationsrøret vaskes og filtreres med en sidste 10 mL Flow-buffer.
BEMÆRK: Den samlede mængde fordøjelses- og flowbuffer er ca. 38-40 mL for hver prøve. - Det koniske rør centrifuges ved 400 x g i 10 minutter ved 4 °C. Dekanter supernatanten uden at forstyrre cellepillen.
- Forbered 1x lysingopløsning ved at tilsætte 10x lysingsopløsning til sterilt vand. Bryd pellet ved at svirpe røret mod et andet rør. For at lyse røde blodlegemer tilsættes 1 ml 1x lysingsopløsning til 30 s med hvirvlende ved stuetemperatur (RT).
- Stop reaktionen med 20 mL Flow buffer.
- Det koniske rør centrifuges ved 400 x g i 10 minutter ved 4 °C. Dekanter supernatanten uden at forstyrre cellepillen.
- Dissociate pellet ved at svirpe rør mod et andet rør. Der tilsættes 5 mL kold 1x HBSS pr. rør.
- Centrifugerør ved 400 x g i 10 minutter ved 4 °C. Aspirat supernatant.
4. Farvning af cellesuspension til mononukleare fagocytter
- Forbered 0,5 mL levende/død plet pr. prøve ved fortynding af levende/dødt farvestof 1:5.000 i koldt HBSS.
- Tilføj Live / Dead plet til hver prøve ved hjælp af en P1000 pipette og sørg for at adskille pellet helt. Prøver overføres til 1,2 mL mikrotitlerør.
- Tag en lille aliquot (10 μL) for at tælle celler ved hjælp af et hæmocytometer eller automatisk celletæller (se 4.4). Inkuber prøver med levende/død plet i 15 minutter ved stuetemperatur i mørke.
- Tæl celler ved hjælp af Trypan blue for at bestemme antallet af levende celler pr. prøve.
BEMÆRK: Typisk indeholder 2 øjne fra en 10-12 uger gammel C57BL/6J-mus mindre end 2 x 106 levende celler. - Prøverne vaskes ved at tilsætte 400 μL kold flowbuffer. Centrifugerør i et mikrotitlerørholder ved 400 x g i 10 minutter ved 4 °C. Indsug supernatanten uden at forstyrre cellepillen.
- Resuspend celler helt i 500 μL kold Flow buffer. Centrifugerør i et mikrotitlerørholder ved 400 x g i 10 minutter ved 4 °C. Indsug supernatanten uden at forstyrre cellepillen.
- Bloker op til 5 x 106 levende celler i 50 μL Fc blok (1:50 fortynding i kold Flow buffer af renset rotte anti-mus CD16/CD32). Hvis mere end 5 x 106 levende celler, øge mængderne korrekt.
- Tilsæt Fc blok til pellet og sørg for helt at adskille prøven. Inkuber i 20 minutter ved 4 °C.
- Der tilsættes 50 μL antistofbejdningsopløsning (se tabel 1 for valg og mængde af hvert antistof, der indgår i opløsningen) pr. 5 x 106 levende celler direkte til celler i Fc blok og bland fuldstændigt. Inkuber i 30 minutter ved 4 °C.
BEMÆRK: Antistofmængder er afhængige af flowcytometerkonfigurationen og bør titreres uafhængigt for hvert laboratorium og instrument. Se tabel 2 for instrumentkonfiguration af filtre og spejle. For at titrere antistoffer skal du starte med producentens anbefaling og beregne farvningsindekset. Udfør en testkørsel med varierende antistofkoncentrationer (både over og under producentens anbefaling), og vælg den laveste koncentration af antistof, hvor farvningsindekset opretholdes. Sørg også for, at positiv farvning, der er mindre lys end kontrolelementet med en enkelt farve. Brug ikke-indgroede celler til at sikre, at negativt farvede celler er på skalaen og har en top på eller mindre end 1 x 102. Brug en fluorescens minus en kontrol til at definere de positivt farvede celler. - Prøverne vaskes ved at tilsætte 700 μL kold flowbuffer. Centrifugerør i et mikrotitlerørholder ved 400 x g i 10 minutter ved 4 °C. Indsug supernatanten uden at forstyrre cellepillen.
- Efter farvning af antistoffer kan prøverne eventuelt fastgøres med 500 μL 2% paraformaldehyd i flowbuffer. Fastgør prøver i 15 minutter ved stuetemperatur. Udfør derefter en vask som beskrevet i 4.10. Faste prøver opbevares ved 4 °C. Tælle perler bør tilføjes på dagen for flow cytometry dataindsamling. Faste prøver skal køres på flowcytometer om 1-2 dage.
ADVARSEL: Paraformaldehyd er en ætsende og sundhedsfare. - Prøverne vaskes igen med 500 μL kold flowbuffer. Centrifugerør i et mikrotitlerørholder ved 400 x g i 10 minutter ved 4 °C. Indsug halvdelen af supernatanten uden at forstyrre cellepillen.
- Resuspend pellets og overføre til en 96 godt, U-bund assay plade. Centrifugeplade ved 400 x g i 5 min ved 4 °C. For at dekantere supernatanten skal du vende pladen om og i en stærk ryste løsne væsken i et vaskebassin uden at forstyrre pellet.
- I et nyt mikrotitlerør på 1,2 mL placeres 50 μL velkragede perler.
- Genbrugte pellets i 96 brøndplader i 200 μL kold flowbuffer. Tilføj celleblanding på toppen af perler fra tidligere trin. Kør på flowcytometer i samlet volumen på 250 μL / mikrotitlerrør.
5. Indsamling af flowcytometridata
- Tænd og forbered flowcytometer. De her anførte instruktioner gælder for et modificeret firelasercytometer (tabel 2).
- Kør en testprøve, som indeholder en lille aliquot fra hver prøve, for at sikre, at alle celler er i skala for hver detektor. Juster spændingerne, så alle celler er på skalaen.
- Kør enkeltfarvekontroller (SCC) for hver fluorophore, der bruges i farvningscocktail(tabel 3). Placer mikrotitlerrøret i et større 5 mL polystyrenrør til placering på flowcytometerstadiet.
BEMÆRK: Rodfluorophorer som BV421 (Pacific Blue), FITC, PE, Alexa647 (APC) og Alexa700 kræver ikke det samme antistof som cocktailen (dvs. CD19 PE til CD64 PE). Tandemfluorophorer som PE-CF594, PE-Cy7 eller APC-Cy7 kræver imidlertid det samme antistof til SCC som cocktail på grund af potentiel dissociation af de konjugerede fluorophorer.- Opret SCC for BV421 ved at tilføje 2 dråber kompensation perler til en 1,2 mL titer rør sammen med 1 μL hamster anti-mus CD11c BV421. Kompensationsperler bruges, fordi CD11c BV421 er en IgG lambda-undertype i stedet for kappa som beskrevet i 5.3.3. Inkuber i 15 minutter ved 4 °C. Tilføj 0,2 mL flowbuffer.
- Opret SCC for Live / Dead farvestof ved at tilføje en dråbe positive farvning perler (grøn hætte) fra amin reaktive perler, efterfulgt af 1 μL af Live / Dead farvestof. Inkuber i 15 minutter ved stuetemperatur i mørke. Tilsæt en dråbe af de negative perler (hvid hætte) fra aminreaktive perler. Tilføj 0,2 mL flowbuffer.
- De resterende SPC'er oprettes ved at lægge en dråbe positive farvningsperler (grøn hætte) fra antirotten og anti-hamsteren Ig kappa perlesæt efterfulgt af den anførte antistofmængde (tabel 3) i et titerrør på 1,2 mL. Inkuber i 15 minutter ved 4 °C. Tilsæt en dråbe af de negative perler (hvid hætte) fra anti-rotte og anti-hamster Ig kappa perle sæt. Tilføj 0,2 mL flowbuffer.
- Vortex alle perle blandinger helt. Opbevar SPC'er ved 4 °C i op til 3 dage.
BEMÆRK: SCC for fluorescerende reportermus er ikke-indgroede celler. - Når der køres SCC'er, skal du indstille spændinger, således at SCC-prøven har en top større end nogen fluorescens for en prøve af celler i samme detektorkanal. Derudover skal der indstilles spændinger, så enhver SCC har mindst en 0,5 Logforskel mellem histogrammetop i den pågældende kanal i forhold til enhver anden kanal (Figur 1).
- Kør prøver på "Lav" holde begivenheder / sekund under 4000. Hvis strømningshastigheden ikke kan sænkes korrekt, fortyndes prøverne med yderligere koldstrømsbuffer. Registrer den diskenhed, der er tilføjet, da dette vil være nødvendigt for optællingsberegningen (se repræsentative resultater).
- Indsaml mindst 3 x 106 hændelser pr. prøve. Dette kan være højere end cellenummeret på grund af pigmentgranulat og snavs, der tæller som begivenheder på dit cytometer.
- Registrer en fluorescens minus 1 (FMO) for hver anden fluorrør end Live/Dead for korrekt gating-strategi i afsnit 6.4. En FMO er en prøve, der er blevet farvet med alle fluorophorer undtagen én.
- Rengør og luk flowcytometeret i henhold til producentens eller anlæggets anvisninger.
6. Anmærkning af flowcytometridata
- Åbn et nyt regneark ved hjælp af analysesoftware. Importer FCS-filer fra cytometeret for alle prøver og kontrolelementer med én farve.
- Brug SCC'er til at oprette en kompensationsmatrix.
- Påfør kompensationsmatrixen på dine farvede prøver og FMOs.
- Brug FMOs til at bestemme positiv farvning til at tegne porte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viste ukompenserede frekvens histogrammer for SCC'er og celler til den røde laser: Alexa647, Alexa700 og APC-Cy7. I figur 1A, den magenta linje afbildet toppen af SCC for Alexa647, mens cyan linje viste den påtænkte 0,5 Log forskel. Bemærk, at toppen i Alexa700 og APC-Cy7 var til venstre (mindre lyse) af cyan linje. Bemærk også, at cellerne alle var til venstre for magentalinjen. Alle celler til højre for SCC-toppen blev ikke kompenseret. Specifikke kanaler var kendt for at spilde ind i andre baseret på kemien i fluorochrom farvestoffer (dvs. Violet Laser: BV421 -V500, Gul-Grøn Laser: PE -PE-CF594, Red Laser: Alexa647 -,> Alexa700, Alexa700 -,APC-Cy7, Cross Laser: PE-Cy7 -,APC-Cy7). Hvis en af ovenstående betingelser ikke var opfyldt, kunne spændingen på en kanal justeres opad, mens eventuelle spildkanaler kunne flyttes ned. Se figur 1B og figur 1C for yderligere eksempler på den røde laser. Når spændingerne er fastlagt og derefter registreret, skal alle prøver køres med spændingsparametrene. Der findes en guide til opsætning af kompensation, som kan være nyttig.
Tæl perle identifikation er nødvendig for kvantificering af celletal. Figur 2A viste FSC-A vs SSC-A egenskaber for alle analyserede hændelser fra to øjne af en enkelt mus. Det er vigtigt at justere SSC spændingen for at sikre, at dine tælle perler er synlige som en meget stram samling af SSC-Ahøj og FSC-Alave begivenheder. Antallet af perler blev renset og bekræftet ved at plotte PE vs APC-Cy7 (fig. 2B). Rene perler var en stram klynge af PE+ og APC-Cy7- begivenheder.
Singlets og levende celler blev næste identificeret fra alle begivenheder. Singlets blev bestemt ved at plotte FSC-H vs FSC-A. Singlets var positivt korreleret i disse to egenskaber, mens doublet og triplet celler havde større FSC-A end FSC-H (Figur 2C). Levende celler blev afgrænset ved at plotte Live / Dead vs FSC-A. Døde celler var levende / døde positive, og celler viser større FSC-A end snavs (Fig 2D). Bemærk, at tælle perler var Live / Dead+ og blev fjernet på dette trin.
Figur 3 viser den oprindelige gatingstrategi for afgrænsning af mononukleare fagocytter fra levende singletceller. Live singler blev visualiseret ved hjælp af en CD45 versus CD11b plot (Figur 3, venstre). Bemærk, at CD45+CD11b- (for det meste B-celler og T-celler), CD45dimCD11b+ (putative microglia) og CD45+CD11b+ celler (infiltrere immunceller, øget med laser [Fig. 3B, venstre]) blev valgt. Fraværet af CD45+ celler i CD45 FMO bekræftede portvalget (Figur 3C, venstre). Næste, neutrofiler, eosinofiler, B-celler, NK-celler og T-celler blev ekskluderet ved at plotte CD45+ live singler ved hjælp af Lineage gate (Lin: Ly6G [neutrofiler], SiglecF [eosinophils], B220 [B-celler], NK1.1 [NK celler], CD4 [T-celler], og CD8 [T-celler]) vs CD11b. Stigningen i cd11b+lin- celler mellem ingen laser(figur 3A, midten) og lasergrupper(figur 3B, mellem) blev let observeret. Bemærk manglen på CD11b+Lin-celler i CD11b FMO(Figur 3C, midten) og manglen på Lin+ celler i Lin FMO(Figur 3C, højre). Microglia kan adskilles fra infiltrere mononukleare fagocytter med mængden af CD45-udtryk13,24. CD11b+Lin- celler blev visualiseret ved hjælp af en CD11b vs CD45 plot til at identificere CD45dim putative microglia og CD45høj infiltrere mononukleare fagocytter. Den relative stigning i CD45høje mononukleare fagocytter var tydelig i den laserbehandlede mus (figur 3A,B, højre).
Figur 4 identificerede mikroglia, tre makrofagsundersæt, monocytter og dendritiske celler. Microglia blev bestemt ved at plotte CD45dim celler på en CD64 vs MHCII plot (Figur 4, venstre panel). Microglia har vist sig at være CD64+MHCIIlav tidligere13. Microglia var relativt uændret med laser og fraværende i CD64 FMO(Figur 4A, C venstre). CD45høje celler blev næste plottet på samme CD64 vs MHCII graf. CD64+MHCII- makrofager (MHCII- Mac-macs), CD64-MHCII- monocytter og MHCII+ celler blev identificeret (Figur 4A, B, midterste venstre). Bemærk fraværet af MHCII+ celler i MHCII FMO(Figur 4C, midterste venstre). MHCII+ celler blev yderligere diskrimineret ved hjælp af CD64 og CD11c. CD64+CD11c- makrofager (CD11c- Macs), CD64+CD11c+ macrophages (CD11c+ Macs) og CD64-CD11c+ dendritiske celler (DCs) blev defineret(Figur 4A, B, midterste højre). Bemærk fraværet af CD11c+ celler i CD11c FMO (Figur 4C, midterste højre). Monocytter blev underskrevet som klassisk Ly6C+ eller ikke-klassisk Ly6C- monocytter(Figur 4, højre). Bemærk fraværet af Ly6C+ monocytter i Ly6C FMO(Figur 4C, højre).
Antallet af celler pr. mus (eller pr. 2 øjne) blev beregnet med følgende ligning:
Ved hjælp af diskenhederne i denne metode er ligningen:
Celleantal og perleantal vil være specifikke for hver prøve. Koncentrationen af perler er specifik for hvert parti tælle perler og leveres af fabrikanten på hvert hætteglas.
Makrofager infiltrere choroid efter laser skade25, og makrofag udtømning reducerer CNV område18. Disse ældre undersøgelser er afhængige af immunfluorescensbilleddannelse, som ikke pålideligt kan skelne mellem mononukleare fagocytter eller færre flowcytometriske markører til makrofagidentifikation. Makrofag heterogenitet er et nyt begreb i medfødt immunologi, hvor makrofager er i stand til at udføre flere funktioner afhængigt af deres oprindelse og væv mikromiljø12,26. Vi udførte multi-parameter flow cytometry på ubehandlede og laserbehandlede museøjne på dag 3 efter laserskade for at identificere mononukleare fagocytter og makrofag heterogenitet. Laserbehandling øgede MHCII-, CD11c-og CD11c+ makrofager med henholdsvis 7,0-25,6, 2,8-7,2 og 3,9-8,2 gange (figur 5A, C). Dendritiske celletal blev også opreguleret 4,5-4,7 gange med laser (Figur 5F). Antallet af mikroglia og monocyt blev ikke påvirket af laserbehandling(figur 5D,E). Der blev ikke påvist signifikante forskelle med eller uden systemisk perfusion før enucleation. Disse resultater viser øgede makrofagpopulationer og dendritiske celler efter laserskade uden ændring af mikroglia eller monocytter. Desuden fremhæver disse data, hvordan multiparameterflowcytometry kan registrere makrophage heterogenitet.
| Antistof eller buffer | Fluorophore | Klon | Mængde pr. prøve (ng) |
| rotte anti-mus Ly6C | FITC | AL-21 | 15 |
| mus anti-mus CD64 | Pe | X54-5/7.1 | 40 |
| rotte anti-mus Tim4 | AlexaFluor 647 | RMT4-54 | 300 |
| hamster anti-mus CD11c | BV 421 | HL3 | 300 |
| rotte anti-mus Ly6G | PE-CF594 | 1A8 | 10 |
| mus anti-mus NK1.1 | PE-CF594 | PK136 | 10 |
| rotte anti-mus Siglec F | PE-CF594 | E50-2440 | 20 |
| rotte anti-mus B220 | PE-CF594 | RA3-6B2 | 20 |
| rotte anti-mus CD8 | PE-CF594 | 53-6.7 | 40 |
| rotte anti-mus CD4 | PE-CF594 | RM4-5 | 20 |
| rotte anti-mus MHC II | AlexaFluor 700 | M5/114.15.2 | 2.5 |
| rotte anti-mus CD11b | APC-Cy7 | M1/70 | 2 |
| rotte anti-mus CD45 | PE-Cy7 | 30-F11 | 6 |
| MACS-buffer |
Tabel 1: Antistoffluorophore og kloner (se trin 4.9). Generelt er en prøve enten et eller to fordøjede øjne. Tilføj flow buffer til et rør først derefter hvert antistof. Fortyndinger kan foretages for at undgå at pipette for lille en volumen, samtidig med at den samlede flowbuffervolumen ændres korrekt. Se Materialeoversigt for produktnummer og firma.
| Laser | PMT-slot | Filter | Spejl | Farver |
| Violet (405nm) | A | 525/50 | 505LP | V500 eller AmCyan |
| B | 450/50 | Pacific Blue, eFluor 450, V450 eller BV421 | ||
| Blå (488nm/FSC) | A | 710/50 | 685LP | PerCP-Cy5.5, PerCP, PI eller 7AAD |
| B | 525/50 | 505LP | FITC, CFSE, GFP eller AlexaFluor 488 | |
| C | 488/10 | Ssc | ||
| Gul-Grøn (561nm) | A | 780/60 | 735LP | PE-Cy7 |
| B | 610/20 | 600LP | PE-CF594, mCherry eller DsRed2 | |
| C | 582/15 | Pe | ||
| Rød (640nm) | A | 780/60 | 735LP | APC-Cy7, APC-H7 eller APC-eFluor 780 |
| B | 730/45 | 690LP | AlexaFluor 700 | |
| C | 670/30 | APC eller AlexaFluor 647 |
Tabel 2: Konfiguration af flowcytometer. Filter og spejl setup for en fire-laser cytometer og de tilgængelige fluorophores, som kan påvises i hver kanal. PMT = photomultiplier tube, FSC = fremad scatter, SSC = side scatter.
| Antistof | Fluorophore | Klon | Beløb pr. SCC (ng) |
| rotte anti-mus CD45 | FITC | 30-F11 | 500 |
| rotte anti-mus CD19 | Pe | 1D3 | 40 |
| rotte anti-mus Tim4 | AlexaFluor 647 | RMT4-54 | 100 |
| hamster anti-mus CD11c | BV421 | HL3 | 200 |
| rotte anti-mus Siglec F | PE-CF594 | E50-2440 | 40 |
| rotte anti-mus CD19 | AlexaFluor 700 | 1D3 | 200 |
| rotte anti-mus CD11b | APC-Cy7 | M1/70 | 200 |
| rotte anti-mus CD45 | PE-Cy7 | 30-F11 | 200 |
| Live / Dead Dye | eFluor 506 | Nielsen | 1 μl |
Tabel 3: Antistof fluorophore og kloner til enkeltfarvede kontrolelementer. Hvert antistof bør føjes til den relevante kompensationsperle som beskrevet i trin 5.3.1 – 5.3.3.
Figur 1: Repræsentativ spænding for den røde laser. (A)Kontrolelementer med én farve til Alexa647. Til venstre vises SCC for Alexa647. Venstre midte viser udslippet af Alexa647 SCC i Alexa700-kanalen. Toppen af Alexa647 SCC er vist i magenta og 0,5 Log mål differentiale vises i cyan. Bemærk, at toppen er til venstre (mindre lys) end den cyan linje. Midterste højre viser udslippet af Alexa647 SCC i APC-Cy7 kanal. Højre illustrerer cellerne i Alexa647 kanal. Bemærk, at alle celler er mindre lyse end SCC (magentalinjen). (B) SCC for Alexa700. Midterste venstre viser SCC for Alexa700. Venstre viser udslippet af Alexa700 SCC i Alexa647-kanalen. Midt til højre demonstrerer udslippet af Alexa700 SCC i APC-Cy7-kanalen. Toppen af Alexa700 SCC er vist i magenta og 0,5 Log mål differentiale vises i cyan. Bemærk, at toppen er til venstre (mindre lys) end den cyan linje. Højre illustrerer cellerne i Alexa700-kanalen. Bemærk, at alle celler er mindre lyse end SCC (magentalinjen). (C)SCC for APC-Cy7. Venstre og midterste venstre viser udslippet af APC-Cy7 SCC i Alexa647 og Alexa700, henholdsvis. Bemærk, at begge toppe er til venstre for den cyan linje. Midterste højre viser AVS-Cy7 SCC. Højre illustrerer cellerne i APC-Cy7-kanalen. Bemærk, at alle celler er mindre lyse end SCC (magentalinjen). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Repræsentativ identifikation af tælleperler, singler og levende celler. (A)Sideopstrejingsområde (SSC-A) vs. forreste punktområde (FSC-A) for alle celler i en konturplot. Greve perler er identificeret ved høj SSC-A, lav FSC-A, og meget stram klyngedannelse af de ensartede perler. (B) PE vs APC-Cy7 plot for ren perle gate. Pilen mellem A og B angiver afbildning af kun greven perle positive begivenheder. Rene tælle perler er afgrænset af høj PE og lav APC-Cy7 fluorescens. (C) FSC-Height (FSC-H) vs FSC-Area (FSC-A) plot af alle celler demonstrerer singlet celler i en positivt korreleret bred linje. Doublets og andre multits viser større FSC-område end FSC-Højde. (D) Live / Dead vs FSC-A for singlet celler. Levende celler defineres som Live / Dead lav og FSC-A positiv. Procenter angiver procent af overordnet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Repræsentativ identifikation af mononukleare fagocytter. Til venstre: CD45 vs CD11b pseudocolor plot af levende celler fra unlasered (A), lasered (B), og fluorescens minus en (FMO) kontrol (C). Venstre: CD45+ celler er defineret i A-B og fraværende i FMO. Bemærk stigningen i CD45+CD11b+ celler i den laserede (B) gruppe. I midten: Pseudofarvet område af afstamning (Lin) markør vs CD11b for CD45+ celler. CD11b+Lin- celler er afgrænset i A-B og er fraværende i FMO for CD11b (nederst). Til højre: CD11b vs CD45 plot af CD11b+Lin- celler. Cd45dim og CD45høje celler er identificeret. Bemærk stigningen i CD45høje celler i den laserede (B) gruppe. Procenter angiver procent af overordnet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Repræsentativ identifikation af mikroglia, dendritiske celler, monocytter og makrofagundersæt. Til venstre: CD64 vs MHCII pseudocolor plot af CD45dim celler definerer microglia som CD64+MHCIIlav. Bemærk den tilsvarende mængde mikroglia i uanføjede (A) og laserede (B) grupper og fraværet af mikroglia i FMO-styringen (C). Midterste venstre: CD64 vs MHCII pseudocolor plot af CD45høje celler definerer MHCII- makrofager som CD64+MHCII-, monocytter som CD64-MHCII-og MHCII+ celler. Bemærk stigningen i MHCII-makrofager i den laserede gruppe (B), fraværet af MHCII + celler i FMO (C, midten), og CD64 FMO (C, venstre) hjalp med at bestemme cutoff for CD64+ og CD64- celler. Midterste højre: CD64 vs CD11c pseudocolor plot af MHCII+ celler. CD11c- makrofager blev defineret som CD64+CD11c-, CD11c+ makrofager blev identificeret som CD64+CD11c+, og dendritiske celler (DCs) blev afgrænset som CD64-CD11c+. Både makrofagundersæt og dendritiske celler blev forøget med laser (B). Bemærk fraværet af CD11c+ celler i FMO (C). Til højre: Ly6C vs Tim4 pseudocolor plot af monocytter. Klassisk Ly6C+ og ikke-klassisk Ly6C- monocytter blev identificeret. Bemærk, at klassiske Ly6C+ monocytter var fraværende i Ly6C FMO (C). Procenter angiver procent af overordnet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Repræsentative data for mononukleare fagocytter mellem unlasered og lasered mus både med og uden systemisk perfusion. MHCII- (A), CD11c- (B) og CD11c+ (C) makrofag blev alle øget med laser. Der blev ikke påvist nogen ændringer mellem lasered og lasered microglia (D) eller monocytter (E). Dendritiske celler (DC) blev også øget med laser (F). Brown Forsythe og Welch ANOVA med Dunnett's T3 multiple sammenligning test blev brugt til at definere statistiske forskelle på grund af ulige varianser mellem grupper. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Multiparameterflowcytometri giver mulighed for kvantitativ analyse af flere celletyper i et komplekst væv. I denne rapport beskriver vi flowcytometrisk detektion af mononukleare fagocytpopulationer, herunder monocytter, dendritiske celler og makrofager, efter laserskade i museøjet. Liyanage et al nylig rapporteret en lignende gating strategi til påvisning af neutrofiler, eosinofiler, lymfocytter, DC'er, makrofager, infiltrere makrofager, og monocytter27. Vores gating strategi primært adskiller sig ved tilføjelsen af CD64. Liyanage et al identificerer DC som CD4-CD8-B220-CD11b+CD11c+ celler, og makrofager som CD4-CD8-B220-CD11b+CD11c-NK1.1-Ly6G- celler. Vi identificerer DC som CD4-CD8-B220-Ly6G-SiglecF-NK1.1-CD11b+CD11c+CD64- celler og makrofager som CD4-CD8-B220-Ly6G-SiglecF-NK1.1-CD11b+CD64+ celler. Brugen af CD64 til at diskriminere DC fra makrofager er veletableret6, og denne strategi giver os mulighed for at identificere makrofag heterogenitet, herunder CD11c + makrofager. Den største begrænsning af denne metode er, at den ikke giver data om vævsarkitektur eller placeringen af specifikke celler i øjet. For at afgøre, om disse celler er i nethinden, choroid, iris, eller en anden okulær struktur, kan vores protokol kombineres med histologiske metoder eller ændres til at omfatte mere omfattende oftalmisk dissektion til individuelt at køre multi-parameter flow cytometry på hver okulær subcompartment.
Vi har optimeret protokollen for fordøjelsen af hele museøjne for at forhindre enhver varians skabt af dissektion. For eksempel, dissektion af bageste øje kopper med fjernelse af hornhinden, iris, og linsen kan skabe variation fra bevaret iris eller hornhinde materiale (under-dissektion) eller øget laser skade på normal bageste øje kop område (over-dissektion). Vores sammenligning mellem kontrol uforstyrrede og laserede øjne registrerer infiltration af mononukleare fagocytter på grund af retinochoridal skade. Til analyse af virkningerne af systemiske sygdomme på øjet, dvs uveitis og diabetes, individuelle okulære subcompartment analyse er afgørende. Fordøjelsesmetoden i afsnit 2 i protokollen er den mest kritiske, mens andre trin i afsnit 3 - 5 er blevet brugt med succes på flere vævstyper24. Vi nåede frem til vores fordøjelsesforhold gennem en iterativ metode, der involverede: (1) test af kemisk fordøjelsesmetode (Collagenase D vs fordøjelsesenzym), (2) bestemmelse af længden af kemisk fordøjelse (30, 60 og 90 minutter) og (3) tilsætning af mekanisk fordøjelse (ingen, en gang, to gange, tre gange). På hvert trin vurderede vi fordøjelsesbetingelsernes succes efter celle levedygtighed og antallet af CD45HiCD64+ (infiltrere makrofager) celler. Vi fandt, at fordøjelsesenzym (se supplerende tabel over materialer) genvundet flere levende celler end Kollagen D og forsøger halvdelen af fordøjelsen enzym koncentration resulterede i færre infiltrerende makrofager. Dernæst fordoblede 60 minutters kemisk fordøjelse med mekanisk fordøjelse næsten de infiltrerende makrofagpopulationer. Tre mekaniske fordøjelser var optimale med 25-30% levende celler af singlets og de mest infiltrerende makrofagpopulationer. Endelig forårsagede hurtigere mekaniske fordøjelsesforhold alvorligt tab af både levende celler og makrofager.
I fremtiden foreslår vi at udvide metoden ved at fjerne hornhinden, iris og linsen efterfulgt af separat fordøje nethinden og den bageste øjenkop (sclera, choroid og retina pigmenteret epitel). Med denne ændring forventer vi at reducere fordøjelsesbetingelserne på grund af henholdsvis proteinholdige og tætte egenskaber ved linsen og hornhinden. Disse reduktioner kan omfatte reduceret fordøjelse enzym koncentration, skifte til Kollagen, nedsat tid for fordøjelsen, eller formindsket mængde af mekanisk fordøjelse. Vi forventer generelt reduceret fordøjelse betingelser for den bageste øje kop, og yderligere mindsket fordøjelsen betingelser for nethinden alene.
Yderligere fremtidige retninger omfatter udvidelse af vores konventionelle multi-parameter flow cytometry panel til en konventionel 6 laser instrument eller spektral flow cytometry. Spektralstrømscytometry giver mulighed for fluorophoredetektion på tværs af hele spektret i stedet for at blive bestemt af de tilgængelige filtre. Spektral flowcytometri resulterer i mere specifik farveregistrering. Spektralstrømscytometri kræver imidlertid, at der følges et helt nyt sæt overvejelser, som ligger uden for dette manuskripts anvendelsesområde. For flere detaljer, se denne seneste JoVE artikel28. De 6 laserinstrumenter omfatter en ultraviolet laser, som tilføjer 6-9 detektorer. Når du føjer markører til et museøjeflow-cytometripanel, anbefaler vi, at du registrerer flere okulære celletyper. For eksempel kan afstamningsporten adskilles for at detektere neutrofiler, eosinofiler, mastceller, NK-celler og lymfocytter uafhængigt. Det anbefales ikke at øge undersæt påvisning af mononukleare fagocytter på grund af det lille antal makrofager i stabil tilstand. Når du tilføjer nye antistoffer, foreslår vi omhyggelig antistoftitrering.
Sammenfattende har vi præsenteret en fleksibel, robust metode til påvisning af mononukleare fagocytpopulationer i museøjet. På grund af de meget overlappende celleoverflademarkører for monocytter, dendritiske celler, makrofager og mikroglia er multiparameterflowcytometri den bedste metode til at detektere disse cellulære populationer. Flowcytometry kan bruges til analyse af celletyper, skæbnekortlægning og/eller cellesortering til transskription eller proteomic evaluering. Dens største begrænsning er mangel på vævsarkitektur, og nøglefund kan bekræftes ved hjælp af traditionel histologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
JAL blev støttet af NIH tilskud K08EY030923; CMC blev støttet af et K01-tilskud (5K01AR060169) fra NIH National Institute of Arthritis and Musculoskeletal Diseases og en Novel Research Grant (637405) fra Lupus Research Alliance.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.6 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| 1.7 ml microcentrifuge tubes | Costar | 3620 | |
| 10 ml pipettes | Fisher Scientific | 431031 | |
| 15 ml conicals | ThermoFisher | 339650 | |
| 1x HBSS, 500 ml | Gibco | 14025-092 | |
| 2.5 ml syringe | Henke Sass Wolf | 7886-1 | |
| 20% paraformaldehyde solution | Electron Microscopy Sciences | 15713-S | |
| 25 ml pipettes | Fisher Scientific | 431032 | |
| 30 G needle | Exel | 26437 | |
| 3ml luer lock syringe | Fisher Scientific | 14955457 | |
| 41 x 41 x 8 mm polystyrene weigh dish | Fisher Scientific | 08-732-112 | |
| 50 ml conicals | Falcon | 352070 | |
| 96-well, U-bottom assay plate without lid | Falcon | 353910 | |
| Amine reactive beads | ThermoFisher | A10628 | |
| Analysis software | FlowJo | v 10 | |
| Anti-rat and anti-hamster Ig kappa bead set | BD Biosciences | 552845 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 664 | |
| Cell counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| Cell counter slides | Invitrogen | C10283 | |
| Compensation beads | ThermoFisher | 01-1111-42 | |
| Count beads | ThermoFisher | 01-1234-42 | |
| Curved forceps | Fisher Scientific | 16-100-123 | |
| Digestion enzyme | Sigma Aldrich | 5401020001 | |
| Dissecting microscope | National Optical and Scientific Instruments, Inc. | DC3-420T | |
| Dissociation tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| DNase | Roche | 10104159001 | |
| Electronic dissociator | Miltenyi Biotec | 130-095-937 | |
| FACS Diva software | BD Biosciences | ||
| Fc block, rat anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | |
| Fine forceps | Integra Miltex | 17035X | |
| Flow buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Flow tubes | Falcon | 352008 | |
| Hamster anti-mouse CD11c BV421 | BD Biosciences | 562782 | |
| Ice bucket | Fisher Scientific | 07-210-123 | |
| Live/Dead dye | ThermoFisher | 65-0866-14 | |
| Lysing solution, 10x solution | BD Biosciences | 555899 | |
| Micro titer tube and rack | Fisher Scientific | 02-681-380 | |
| Mouse anti-mouse CD64 PE | BioLegend | 139304 | |
| Mouse anti-mouse NK1.1 PECF594 | BD Biosciences | 562864 | |
| P1000 pipet tips | Denville Scientific | P2404 | |
| P1000 pipettor | Gilson | FA10006M | |
| P2 pipet tips | eppendorf | 22491806 | |
| P2 pipettor | Gilson | FA10001M | |
| P20 pipettor | Gilson | FA10003M | |
| P200 pipet tips | Denville Scientific | P2401 | |
| P200 pipettor | Gilson | FA10005M | |
| Pipet man | Fisher Scientific | FB14955202 | |
| Rat anti-mouse B220 PECF594 | BD Biosciences | 562313 | |
| Rat anti-mouse CD11b APC-Cy7 | BD Biosciences | 557657 | |
| Rat anti-mouse CD19 AlexaFluor 700 | BD Biosciences | 557958 | |
| Rat anti-mouse CD19 PE | BD Biosciences | 553786 | |
| Rat anti-mouse CD4 PECF594 | BD Biosciences | 562314 | |
| Rat anti-mouse CD45 FITC | ThermoFisher | 11-0451-82 | |
| Rat anti-mouse CD45 PE-Cy7 | BD Biosciences | 552848 | |
| Rat anti-mouse CD8 PECF594 | BD Biosciences | 562315 | |
| Rat anti-mouse Ly6C | BD Biosciences | 561085 | |
| Rat anti-mouse Ly6G PECF594 | BD Biosciences | 562700 | |
| Rat anti-mouse MHC II AlexaFluor 700 | BioLegend | 107622 | |
| Rat anti-mouse Siglec F PECF594 | BD Biosciences | 562757 | |
| Rat anti-mouse Tim4 AlexaFluor647 | BD Biosciences | 564178 | |
| Shaking incubator | Labnet | 311DS | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| Sterile cell strainer, 40 mm nylon mesh | Fisher Scientific | 22363547 | |
| Sterile water, 500 ml | Gibco | A12873-01 | |
| Swinging bucket centrifuge | eppendorf | 5910 R | |
| Trypan blue, 0.4% solution | Gibco | 15250061 |
References
- Chinnery, H. R., McMenamin, P. G., Dando, S. J.
- Droho, S., Cuda, C. M., Perlman, H., Lavine, J. A. Monocyte-Derived Macrophages Are Necessary for Beta-Adrenergic Receptor-Driven Choroidal Neovascularization Inhibition. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (15), 5059-5069 (2019).
- O'Koren, E. G., et al. Microglial Function Is Distinct in Different Anatomical Locations during Retinal Homeostasis and Degeneration. Immunity. 50 (7), 723-727 (2019).
- Kratofil, R. M., Kubes, P., Deniset, J. F. Monocyte Conversion During Inflammation and Injury. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (1), 35-42 (2017).
- Zimmermann, H. W., Trautwein, C., Tacke, F. Functional role of monocytes and macrophages for the inflammatory response in acute liver injury. Frontiers in Physiology. 3, 56 (2012).
- Gautier, E. L., et al. Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages. Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).
- Sutti, S., et al. CX3CR1 Mediates the Development of Monocyte-Derived Dendritic Cells during Hepatic Inflammation. Cells. 8 (9), 1099 (2019).
- Liu, J., et al. Myeloid Cells Expressing VEGF and Arginase-1 Following Uptake of Damaged Retinal Pigment Epithelium Suggests Potential Mechanism That Drives the Onset of Choroidal Angiogenesis in Mice. PLoS One. 8 (8), 72935 (2013).
- Satpathy, A. T., et al. Zbtb46 expression distinguishes classical dendritic cells and their committed progenitors from other immune lineages. The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1135-1152 (2012).
- Krause, T. A., Alex, A. F., Engel, D. R., Kurts, C., Eter, N. VEGF-Production by CCR2-Dependent Macrophages Contributes to Laser-Induced Choroidal Neovascularization. PLoS One. 9 (4), 94313 (2014).
- Lin, W., Liu, T., Wang, B., Bi, H. The role of ocular dendritic cells in uveitis. Immunology Letters. 209, 4-10 (2019).
- Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function. Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).
- O'Koren, E. G., Mathew, R., Saban, D. R. Fate mapping reveals that microglia and recruited monocyte-derived macrophages are definitively distinguishable by phenotype in the retina. Science Reports. 6, 20636 (2016).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 113 (12), 1738-1746 (2016).
- Müller, A., Brandenburg, S., Turkowski, K., Müller, S., Vajkoczy, P. Resident microglia, and not peripheral macrophages, are the main source of brain tumor mononuclear cells. International Journal of Cancer. 137 (2), 278-288 (2014).
- McHarg, S., Clark, S. J., Day, A. J., Bishop, P. N. Age-related macular degeneration and the role of the complement system. Molecular Immunology. 67 (1), 43-50 (2015).
- Nozaki, M., et al. Drusen complement components C3a and C5a promote choroidal neovascularization. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 103 (7), 2328-2333 (2006).
- Tsutsumi, C. The critical role of ocular-infiltrating macrophages in the development of choroidal neovascularization. Journal of Leukocyte Biology. 74 (1), 25-32 (2003).
- Subhi, Y., et al. Association of CD11b +Monocytes and Anti–Vascular Endothelial Growth Factor Injections in Treatment of Neovascular Age-Related Macular Degeneration and Polypoidal Choroidal Vasculopathy. JAMA Ophthalmology. 137 (5), 515-518 (2019).
- Singh, A., et al. Altered Expression of CD46 and CD59 on Leukocytes in Neovascular Age-Related Macular Degeneration. AJOPHT. 154 (1), 193-199 (2012).
- Kwak, N., Okamoto, N., Wood, J. M., Campochiaro, P. A. VEGF is major stimulator in model of choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (10), 3158-3164 (2000).
- Shah, R. S., Soetikno, B. T., Lajko, M., Fawzi, A. A. A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization. Journal of Visualized Experiments. (106), e53502 (2015).
- Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping. Journal of Visualized Experiments. (57), e3814 (2011).
- Makinde, H. M., et al. A Novel Microglia-Specific Transcriptional Signature Correlates with Behavioral Deficits in Neuropsychiatric Lupus. Frontiers in Immunology. 11, 338-419 (2020).
- Sakurai, E., Anand, A., Ambati, B. K., van Rooijen, N., Ambati, J. Macrophage depletion inhibits experimental choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (8), 3578-3585 (2003).
- Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
- Liyanage, S. E., et al. Flow cytometric analysis of inflammatory and resident myeloid populations in mouse ocular inflammatory models. Experimental Eye Research. 151, 160-170 (2016).
- Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry. Journal of Visualized Experiments. (123), e55578 (2017).
