Summary
Questo articolo fornisce protocolli per la progettazione e l'auto-assemblaggio di nanostrutture da oligomeri di acido nucleico peptidico modificati gamma in miscele di solventi organici.
Abstract
Le attuali strategie nella nanotecnologia del DNA e dell'RNA consentono l'auto-assemblaggio di una varietà di nanostrutture di acido nucleico in mezzi acquosi o sostanzialmente idratati. In questo articolo, descriviamo protocolli dettagliati che consentono la costruzione di architetture in nanofibra in miscele di solventi organici attraverso l'auto-assemblaggio di piastrelle di acido nucleico peptidico (γPNA) univocamente adattabili, a singolo filamento e modificate gamma. Ogni piastrella a singolo filamento (SST) è un oligomero γPNA a 12 basi composto da due domini modulari concatenati di 6 basi ciascuno. Ogni dominio può legarsi a un dominio reciprocamente gratuito presente sui filamenti vicini utilizzando la complementarità programmata per formare nanofibre che possono crescere fino a micron in lunghezza. Il motivo SST è composto da 9 oligomeri totali per consentire la formazione di nanofibre a 3 eliche. In contrasto con le analoge nanostrutture del DNA, che formano strutture monodisperse di diametro, questi sistemi γPNA formano nanofibre che si raggruppano lungo le loro larghezze durante l'auto-assemblaggio in miscele di solventi organici. I protocolli di auto-assemblaggio qui descritti includono quindi anche un tensioattiva convenzionale, sodio dodecil solfato (SDS), per ridurre gli effetti di raggruppamento.
Introduction
Costruzione di successo di numerose nanostrutturecomplesse1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 in mezzi acquosi o sostanzialmente idratati realizzati utilizzando naturalmente in opere precedenti sono stati mostrati acidi nucleici presenti come DNA1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 e RNA11,12. Tuttavia, gli acidi nucleici presenti in natura subiscono cambiamenti conformazionali elicoidali duplex o hanno ridotto le condizioni termiche nelle miscele di solventiorganici 13,14.
In precedenza, il nostro laboratorio ha segnalato un metodo per la costruzione di nanofibre a 3 eliche utilizzando imitazioni dell'acido nucleico sintetico modificato in posizione gamma chiamate acidi nucleici gamma-peptidici (γPNA)15 (Figura 1A). La necessità di tale sviluppo e le potenziali applicazioni dell'acido nucleico sintetico imitano la PNA è stata discussanel campo 16,17. Abbiamo dimostrato, attraverso un adattamento della strategia di piastrella mono-filamento (SST) presentata per le nanostrutture di DNA18,19,20, che 9 oligomeri γPNA sequenzialmente distinti possono essere progettati per formare nanofibre a 3 eliche in miscele di solventi organici aprotici polari selezionati come DMSO e DMF. Gli oligomeri γPNA sono stati ordinati commercialmente con modifiche del glicole (R)-dietilenico (mini-PEG) in tre posizioni γ (1, 4 e 8 posizioni di base) lungo ogni oligomero a 12 basi sulla base di metodi pubblicati da Sahu et al. 21 Queste modifiche gamma causano la pre-organizzazione elicoidica associata alla maggiore affinità di legame e stabilità termica di γPNA rispetto alla PNA non modificata.
Questo articolo è un adattamento del nostro lavoro riportato in cui studiamo gli effetti della soluzione solvente e della sostituzione con il DNA sulla formazione di nanostrutture a base di γPNA15. Lo scopo di questo articolo è quello di fornire descrizioni dettagliate del progetto e protocolli dettagliati per metodi adattati ai solventi che sono stati sviluppati per l'auto-assemblaggio e la caratterizzazione della nanofibra γPNA. Così, introduciamo prima la strategia modulare SST, una piattaforma generale per la progettazione di nanostrutture utilizzando l'acido nucleico sintetico che imita la PNA.
Il passo elicoiale per i duplex PNA è stato segnalato per essere di 18 basi per turno rispetto ai duplex del DNA, che subiscono un turno ogni 10,5 basi(Figura 1B). Pertanto, la lunghezza del dominio degli SST γPNA dimostrati è stata impostata su 6 basi per ospitare un terzo di un giro completo o 120 ° di rotazione per consentire l'interazione tra tre eliche triangolamente.e. Inoltre, a differenza dei precedenti motivi SST, ogni SST contiene solo 2 domini, creando efficacemente una struttura a nastro 1-dimensionale che avvolge per formare un fascio a tre eliche (Figura 1C). Ogni oligomero γPNA a 12 basi viene modificato in gamma nelle posizioni 1, 4 e 8 per garantire una distribuzione uniforme dei gruppi mini-PEG attraverso il motivo SST complessivo. Inoltre, all'interno del motivo, ci sono due tipi di oligomeri: fili "contigui" che esistono su una singola elica e fili "crossover" che si estendono sull'elica (Figura 1D). Inoltre, gli oligomeri P8 e P6 sono etichettati rispettivamente con Cy3 fluorescente (stella verde) e biotina (ovalegiallo), (Figura 1D),per consentire il rilevamento della formazione della struttura utilizzando la microscopia a fluorescenza. Complessivamente, il motivo SST è composto da 9 oligomeri totali per consentire la formazione di nanofibre a 3 eliche attraverso la complementarità programmata di ogni singolo dominio al dominio corrispondente su un oligomero vicino (Figura 1E).
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Protocol
1. Progettazione della sequenza γPNA
- Scarica la DNA Design Toolbox22 sviluppata dal Winfree Lab al Caltech23 nella cartella contenente script di programmazione per la progettazione di sequenze.
- All'interno di tale cartella di progettazione della sequenza, aprire un linguaggio di programmazione di quarta generazione compatibile con l'estensione di file ".m", quindi aggiungere la cartella "DNAdesign" scaricata in precedenza al percorso utilizzando il comando seguente:
>> addpath DNAdesign - Successivamente eseguire il seguente script denominato "PNA3nanofiber.m" (vedere la figura complementare 1) utilizzando il seguente comando:
>> PNA3nanofiber - Eseguire questo script per creare variabili denominate "thisSeqs" e "thisScore". La variabile "thisSeqs" contiene le sequenze degli oligomeri progettati e "thisScore" è il punteggio di penalità.
- Eseguire lo script più volte per ottenere il punteggio più minimo. Un campione di 20 esecuzioni di questo tipo è riportato nella tabella 1.
- Confermare manualmente la complementarità Watson-Crick desiderata di ogni dominio delle sequenze generate per il motivo strutturale SST specificato. Le specifiche di sequenza per la struttura in nanofibra a 3 eliche sono mostrate nella tabella 2.
- Verificare quanto segue per le sequenze generate.
- Evitare di utilizzare quattro basi C e G consecutive.
- Selezionare manualmente sequenze specifiche per la funzionalizzazione N-terminale con molecole di colorante fluorescente e biotina per consentire studi di microscopia fluorescente.
- Includere un minimo di 3 mini-modifiche gamma PEG sulla spina dorsale per consentire la conformazione elicoilica pre-organizzata negli oligomeri a singolo filamento come descritto da Sahu et al. 21 della commissione per la
2. Preparazione di trefoli di serie γPNA
- Ottenere filamenti di componenti γPNA di sequenze specificate a 50 nmol scala di sintesi con cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) purificazione da un produttore commerciale.
- Rimospendare ogni filamento in acqua deionizzata a concentrazioni di 300 μM. Conservare i fili rimorsi in congelatore a -20 °C fino a diversi mesi fino a quando necessario per la sperimentazione.
3. Studi della curva di fusione dei sottoinsiemi di oligomeri γPNA
- Ottenere intervalli di temperatura di fusione per diverse combinazioni di sottoinsiemi complementari a 2 oligomeri e 3 oligomeri eseguendo uno studio della curva di fusione in tamponi acquosi come 1x soluzione salina tamponata di fosfato (PBS) o solvente organico polare preferito come dimetilformamide (DMF) o solfossido di dimetile (DMSO) (vedi figura 2).
NOTA: Le curve di fusione termica a >50% del DMF iniziano a perdere la linea di base superiore e mostrano gravi disturbi in parte a causa dell'elevata assorbanza di DMF alla lunghezza d'onda richiesta per gli esperimenti. Questo è un fenomeno noto nella letteratura24. È tuttavia possibile ottenere le curve di fusione a 5 μM per trefoli in queste condizioni di solvente.- Aliquota 16,7 μL dallo stock di 300 μM di ciascun oligomero e fare il volume finale a 1000 μL in 1x PBS o 100% (v/v) DMSO o 100% (v/v) DMF ottenendo effettivamente 5 μM di concentrazione finale per oligomero. Trasferire questa miscela di sottoinsiemi oligomeri in un percorso ottico di 1 cm, cuvetta al quarzo.
- Eseguire esperimenti UV-Vis a temperatura variabile in uno spettrofotometro dotato di un blocco di temperatura programmabile.
- Raccogliere punti dati per le curve di fusione su un intervallo di temperatura di 15\u201290 °C sia per i cicli di raffreddamento (ricottura) che di riscaldamento (fusione) a una velocità di 0,5\u20121 °C/min. Conservare i campioni per 10 minuti a 90 °C prima del raffreddamento e a 15 °C prima del riscaldamento. Determinare la temperatura di fusione (Tm) dal picco della prima derivata della curva di riscaldamento.
- Verificare che gli intervalli di temperatura di fusione per sottoinsiemi a 2 oligomeri siano superiori a 35 °C in tutti i casi di solvente. Inoltre, verificate che i corrispondenti sottoinsiemi a 3 oligomeri che contengono un filamento aggiuntivo al loro sottoinsieme equivalente a 2 oligomeri mostrino un notevole aumento di Tm a causa di una maggiore co-operatività.
NOTA: Ciò verificherebbe che un singolo auto-assemblaggio in vaso di più oligomeri possa ripiegarsi in modo cooperativo nella nanostruttura desiderata con una ragionevole stabilità termica.
4. Protocollo di auto-assemblaggio per più oligomeri γPNA distinti
NOTA: Per ideare un protocollo di rampa termica ad auto-assemblaggio per nanostrutture γPNA, è auspicabile la ricottura a rampa lenta.
- Nel caso di sequenze di oligomeri generate, ricotturare i campioni per 22,5 ore in un raffreddamento a ciclo termico da 90 a 20 °C. Tipicamente, la temperatura di fusione ottenuta per i sottoinsiemi γPNA a 2 oligomeri e 3 oligomeri si trova in intervalli di 40\u201270 °C per diverse condizioni del solvente.
- Programmare il ciclore termico come segue: tenere a 90 °C per 5 min, scendere da 90 a 70 °C ad una velocità costante di 0,1 °C/min, scendere da 70 a 40 °C ad una velocità di 0,1 °C/3 min, scendere da 40 a 20 °C ad una velocità di 0,1 °C/min e tenere a 4 °C (cfr. tabella 3). I campioni possono essere conservati in 4 °C per 12\u201224 h prima della caratterizzazione.
NOTA: Mentre i sottoinsiemi di 2 e 3 oligomeri del nostro sistema di nanofibra possono formarsi in 1x PBS, le nanofibre su scala micron completa si aggregano in 1 pbs. Pertanto, le condizioni del solvente dovrebbero essere ottimizzate in base alla scala e alle dimensioni della struttura in formazione, nonché al tipo e alla densità delle modifiche gamma. - Per nanofibre a 3 eliche lunghe su scala micron, preparare campioni di lotti ricotti in DMSO al 75%: H2O (v/v), 75% DMF: H2O (v/v), 40% 1,4-diossano: H2O (v/v) sulla base di studi di ottimizzazione dei solventi15.
- Preparare i lotti di ricottura come segue (cfr. tabella 4). In primo luogo, preparare 10 sotto stock μL a concentrazioni di 20 μM dalle scorte principali di 300 μM per ogni oligomero aliquotando 0,67 μL dallo stock principale e facendo il volume a 10 μl utilizzando acqua deionizzata.
- Aliquota 1 μL dalle scorte di 20 μM per ogni oligomero e aggiungerla a un tubo PCR da 200 μL. Ciò rappresenta un volume totale di 9 μL per 9 oligomeri.
- Aggiungere 30 μL di DMSO/DMF anidro per le casse 75% DMSO e 75% DMF con ulteriori 1 μL di acqua deionizzata per fare un volume finale di 40 μL con ogni oligomero a concentrazioni finali di 500 nM. Aggiungere 16 μL di 1,4-diossano e rendere il volume con acqua deionizzata a 40 μL per lo stato del 40% di solvente di diossano.
- Caricare i lotti ricottori sul ciclore termico e sul ricottura utilizzando il protocollo menzionato al passaggio 4.2.
5. Imaging della microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF)
- Preparare una camera di umidità da una scatola di punte di pipetta vuota. Riempire la scatola con circa 5 mL di acqua per evitare l'essiccazione dei canali di flusso del campione descritti come segue (vedere figura 3).
- Preparare la camera di flusso con uno scivolo al microscopio, 2 strisce a nastro a doppia lato e coverlip rivestito con nitrocellulosa. Per rivestire il coverslip con nitrocellulosa, immergere il coverslip in un becher contenente lo 0,1% di collodion in acetato di amile e asciugato all'aria.
- Preparare la soluzione di nitrocellulosa effettuando una diluizione di 20 volte dal collodio del 2% disponibile in commercio in acetato di amile con solvente acetato di isoamile.
- Preparare la soluzione di albumina di siero bovino biotinilato (Biotin-BSA) pesando 1 mg di Biotin-BSA e scioglierla in 1 mL di 1x PBS. Flusso 15 μL di 1 mg/mL Biotin-BSA in tampone PBS 1x posizionando il canale di flusso ad angolo. Incubare il canale di flusso per 2-4 minuti a temperatura ambiente in una camera umidificata.
- Preparare il tampone di lavaggio sciogliendo 1 mg di BSA in 1 mL di 1x PBS. Lavare l'eccesso di Biotin-BSA fluendo 15 μL del tampone di lavaggio. Per passivare la superficie, incubare il canale di flusso per 2-4 minuti a temperatura ambiente in una camera umidificata.
- Preparare la soluzione di streptavidina misurando 0,5 mg di streptavidina e 1 mg di BSA e quindi sciogliersi utilizzando 1 mL di 1x PBS. Flusso 15 μL di 0,5 mg/mL streptavidina in 1x PBS contenente 1 mg/mL di BSA. Incubare il canale di flusso per 2-4 minuti a temperatura ambiente in una camera umidificata. Scorrere 15 μL del tampone di lavaggio per lavare via la Streptavidin non vincolata.
- Flusso 15 μL di lotto precedentemente ricotto di oligomeri γPNA a concentrazione di 500 nM per trefolo in condizioni di DMSO al 75%, 75% DMF o 40% 1,4-diossina. Incubare il canale di flusso per 2-4 minuti a temperatura ambiente in una camera umidificata.
- Preparare 1 mM Trolox in condizioni di solvente preferite diluendo 10 volte da uno stock di 10 mM di Trolox in DMSO (misurare 2,5 mg di Trolox e sciogliere in 1 mL di DMSO). Lavare le nanostrutture non vincolate nel canale di flusso con 15 μL di 1 mM Trolox con la stessa composizione del solvente delle nanostrutture.
NOTA: Il contenuto di DMSO >50% nel canale di flusso produrrebbe lievi disturbi del segnale a causa del diverso indice di rifrazione della condizione del solvente durante il TIRF, che è tipicamente calibrato per gli angoli TIRF dell'acqua di rigliona. Questo può essere corretto lavando con 1 mM Trolox realizzato diluire il Trolox 10-fold da 10 mM utilizzando acqua deionizzata. Questa tecnica fornisce immagini più chiare, ma è utile solo per valutare se la formazione si è verificata, tuttavia, perché produce microbolle bifase nel canale di flusso. Di conseguenza, le nanostrutture potrebbero essere visibili all'interfaccia delle due fasi, come mostrato nella figura 4D. - Trasferire il canale di flusso sul porta scorrevole e sull'immagine utilizzando un microscopio a fluorescenza dotato di imaging TIRF utilizzando un obiettivo di immersione dell'olio 60x e una lente d'ingrandimento 1,5x. Eseguire la scansione del canale di flusso con ingrandimento 60x o 90x monitorando il canale Cy3 (vedere la figura 4).
6. Imaging di microscopia elettronica a trasmissione (TEM)
- Pesare 0,5 g di acetato di uranile in 50 mL di acqua distillata per preparare una soluzione acquosa di acetato di uranile acquoso. Filtrare la soluzione di macchia di acetato di uranile acquoso all'1% utilizzando un filtro da 0,2 μm collegato a una siringa.
NOTA: In alternativa, l'acetato di uranile acquoso al 2% potrebbe essere acquistato da un produttore commerciale. - Acquista griglie in rame rivestite a strato di formvar disponibili in commercio con dimensioni a 300 maglie.
NOTA: È importante notare che lo strato di supporto formvar potrebbe essere sciolto via da solventi come DMSO oltre i 2 minuti. Per un'incubazione del campione più lunga, sono disponibili formvar commercialmente disponibili stabilizzati con monossido di silicio sulle griglie di rame che consentono alla rete di essere più idrofila delle griglie rivestite di carbonio e possono resistere a condizioni di campionamento vigorose e fascio di elettroni, come mostrato nella figura 5C. - Pipetta 4 μL di campione sulla griglia per 15 s. Utilizzare un pezzo di carta da filtro per eliminare il campione portando la carta filtrante a contatto con la griglia dal lato.
- Aggiungere immediatamente 4 μL della soluzione di macchia sulla griglia per 5 s.
- Eliminare la macchia come prima e tenere la carta filtrante contro la griglia per 1\u20122 min per assicurarsi che la griglia sia asciutta. I campioni devono essere in genere con immagini entro 1\u20122 h dopo la colorazione. In alternativa, se si garantisce che la griglia sia completamente asciutta, le griglie possono essere conservate in una scatola di stoccaggio della griglia TEM per un massimo di 3 giorni prima dell'imaging.
- Trasferire la griglia su un porta campioni TEM e un'immagine utilizzando un microscopio elettronico a trasmissione azionato a 80 kV con ingrandimento compreso tra 10 K e 150K (vedere figura 5).
7. Morfologie diverse per ibridi γPNA-DNA basati sulla sostituzione selettiva con DNA
- Ottenere oligomeri di DNA di sequenze specificate (cfr. tabella 5) da produttori commerciali di oligonucleotidi sintetizzati su scala di 25 nmol utilizzando la dissalazione standard. Resuspend queste sequenze di DNA usando acqua deionizzata priva di RNasi a concentrazioni di 20 μM.
- Per le sostituzioni contigue del filamento γPNA con DNA, le sequenze D3, D5 e D9 possono sostituire i filamenti p3, p5 e p9. Allo stesso modo, per le sostituzioni di filamenti γPNA crossover con DNA, le sequenze D1, D4 e D7 possono sostituire i filamenti p1, p4 e p7.
- Aliquota 1 μL dalle scorte di 20 μM per ogni oligomero γPNA o DNA e aggiungerla a un tubo PCR da 200 μL come nel passaggio 2.7. Aggiungere 30 μL di DMSO anidro e 1 μL di acqua deionizzata priva di RNasi per rendere il volume finale a 40 μL (cfr. tabella 6).
- Caricare i lotti ricottori sul ciclore termico e sul ricottura utilizzando il protocollo menzionato al passaggio 4.2.
- Caratterizzare le nanostrutture ibride γPNA-DNA utilizzando il protocollo TIRF seguendo i passaggi della sezione 5 o utilizzando il protocollo di imaging TEM menzionato nella sezione 6 (vedere la figura 6).
8. Morfologie diverse per le nanofibre γPNA in concentrazioni variabili di SDS
- Preparare uno stock principale di SDS del 20% (wt/v) misurando 20 mg di SDS e scioglierlo in 100 μL di acqua deionizzata.
- Preparare un sotto stock SDS 6% (wt/v) aliquotando 3 μL dal 20% di stock di SDS e facendo il volume a 10 μL utilizzando acqua deionizzata.
- Ricottura gli oligomeri γPNA in concentrazioni finali di 5,25 mM e 17,5 mM SDS come segue. Aliquota 1 μL dalle scorte di 20 μM per ogni oligomero γPNA e aggiungerla a un tubo PCR da 200 μL come nel passaggio 2.7. Aggiungere 30 μL di DMSO anidro e 1 μL di SDS 6% e 20% per fare il volume finale a 40 μL per raggiungere concentrazioni finali di SDS rispettivamente di 5,25 mM e 17,5 mM (cfr. tabella 7).
- Caricare i lotti ricottori di diverse concentrazioni di SDS sul ciclore termico e sul ricottura utilizzando il protocollo menzionato al passaggio 4.2.
- Caratterizzare le nanostrutture γPNA in presenza di SDS utilizzando il protocollo TIRF seguendo i passaggi della sezione 5 o utilizzando il protocollo di imaging TEM menzionato nella sezione 6 (vedere la figura 7).
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Representative Results
I protocolli discussi nelle sezioni precedenti descrivono la progettazione di un motivo SST adattato dalle nanofibre di DNA per la robusta generazione di strutture di nanofibre auto-assemblate utilizzando oligomeri γPNA multipli e distinti. Questa sezione descrive l'interpretazione dei dati ottenuti dalla ricreazione riuscita dei protocolli descritti.
Seguendo il protocollo descritto nella sezione 5 per l'imaging TIRF di campioni di oligomeri γPNA ricotti in DMSO al 75%: H2O (v/v) fornisce più facilmente prove di architetture ben organizzate sotto osservazioni microscopiche come mostrato nella figura 4A. 75% DMF: La condizione del solvente H2O (v/v) si traduce in nanostrutture a forma di spicule o ad ago(Figura 4B)e, secondo la nostra esperienza, la condizione del 40% 1,4 diossano: la condizione H2O (v/v) mostra una decorazione scarsa delle nanostrutture filamentose se vista utilizzando la microscopia TIRF(Figura 4C). Inoltre, i campioni di nanotubi γPNA formati nel 75% di DMSO: H2O (v/v) dimostrano l'aggregazione di nanofibre ad alto ingrandimento o risoluzioni nanoscopiche durante l'imaging TEM seguendo i passaggi menzionati nella sezione 6 (Figura 5). Le analisi quantitative della larghezza delle nanostrutture hanno mostrato una larghezza mediana di 16,3 nm con valori massimi oltre 80 nm15.
Per ideare uno schema per generare nanostrutture ibride γPNA-DNA in miscele di solventi organici per consentire un'ulteriore funzionalizzazione utilizzando il DNA, è importante considerare la posizione oligomerica nel motivo SST sostituita con oligomeri di DNA isosequenziali. Adattando i passaggi menzionati nella sezione 7 per il caso del costrutto nanotubo qui descritto, gli oligomeri isosequenziali del DNA che sostituiscono gli oligomeri γPNA contigui formano strutture filamentose dritte, mentre la sostituzione degli oligomeri γPNA crossover forma strutture stellate se viste utilizzando l'imaging TIRF e TEM (Figura 6). Le analisi quantitative della larghezza delle nanostrutture che sono state sostituite con oligomeri di DNA contigui hanno mostrato larghezze mediane intorno a 19 nm15.
Infine, dopo aver adattato le fasi della sezione 8, le nanofibre γPNA adottano morfologie più sottili coerenti con un raggruppamento ridotto in presenza di concentrazioni di SDS al di sotto delle sue concentrazioni critiche di micelle (CMC, 8,2 mM). Le nanofibre γPNA adottano anche morfologie altamente in rete ad alte concentrazioni di SDS rispetto alla cmc se viste utilizzando l'imaging TIRF (Figura 7). L'imaging TEM degli oligomeri γPNA autoassemblati in presenza di SDS indica che la condizione SDS di 5,25 mM indica le riduzioni più sostanziali dell'aggregazione strutturale con larghezze che vanno da 8\u201212 nm come mostrato nella (Figura 7C).
Figura 1: Oligomeri di acido nucleico peptidico come elementi costitutivi per nanostrutture complesse.
(A) Strutture chimiche delle unità di DNA (PNA), PNA e γPNA contenenti MP. (La figura è stata ristampata con l'autorizzazione di Ref21. (B) Le eliche PNA-PNA sono meno contorte delle eliche DNA-DNA, con 18 basi per turno invece di 10,5. (C) Questo motivo a tre eliche strutturale a piastrella a tre filamenti (SST) è costituito da 9 oligomeri γPNA distinti lunghi 12 basi, ognuno con due domini a sei basi. (D) All'interno della struttura esistono due tipi di oligomeri: filamenti "contigui" che esistono su un singolo filamento "crossover" a elica e a elica. (E) Questo motivo strutturale lungo 18 basi può polimerizzare per formare filamenti su scala micron. I pannelli B, C ed E sono stati modificati con il permesso del Ref15. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Curve di fusione rappresentative di oligomeri γPNA selezionati in diverse condizioni di solvente.
Sottoinsieme a 2 oligomeri (p4, p5) che mostra domini a 6 basi può legarsi con una ragionevole stabilità termica (curva nera) in 1x PBS. Il sottoinsieme 3- oligomero (p4, p5, p6) mostra una maggiore stabilità termica a causa della cooperatività in 1x PBS (curva blu) e mostra poca o nessuna instabilità rispetto a Tm quando il solvente viene cambiato in solventi organici come DMF (curva punteggiata rossa). La figura è stata modificata con l'autorizzazione delref 15. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Diagramma di flusso per il canale di flusso fluido per l'imaging TIRF del campione.
Flusso di lavoro passo-passo che indica i passaggi coinvolti nella preparazione del campione per l'imaging TIRF di nanofibre γPNA dopo l'assemblaggio del canale di flusso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Imaging al microscopio TIRF di nanofibra γPNA auto-assemblata in diverse condizioni solventi.
Nanofibre γPNA visualizzate utilizzando la microscopia TIRF (barra di scala di 5 μm) durante il monitoraggio del canale Cy3 quando gli oligomeri γPNA sono autoassemblati in (A) 75% DMSO: acqua (v/v), (B) 75% DMF: acqua (v/v) e (C) 40% Dioxane: acqua (v/v) condizioni solventi. (D) Quando le nanofibre γPNA autoassemblate in DMSO al 75%: l'acqua (v/v) legata al canale di flusso viene lavata con 1mM Trolox in acqua, microbolle bifase di forma d'acqua DMSO con nanostrutture che si allineano lungo l'interfaccia della microbolle. La figura è stata modificata con l'autorizzazione delref 15. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Imaging TEM di nanofibre γPNA auto-assemblate nel 75% DMSO: acqua. (v/v) utilizzando griglie mesh formvar support layer copper 300.
(A) Immagini TEM di nanofibre γPNA visualizzate a basso ingrandimento (15x). (B) Le immagini TEM delle nanofibre γPNA visualizzate ad alto ingrandimento (150x) mostrano l'aggregazione di nanotubi lungo la larghezza a risoluzioni nanoscopiche. (C) Le immagini TEM delle nanofibre γPNA visualizzate a basso ingrandimento (10x) utilizzando uno strato di supporto formvar-silicio monossido su una griglia di rame consentono l'imaging in condizioni di campione vigoroso. La figura è stata modificata con l'autorizzazione delref 15. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Morfologie diverse per gli ibridi γPNA-DNA basati sulla sostituzione selettiva con il DNA.
(A) Le immagini TIRF (5 μm scale bar) e (C) TEM (ingrandimento 60x) dell'auto-assemblaggio di ibridi γPNA-DNA al momento della sostituzione degli oligomeri γPNA contigui (p3, p5, p9) con oligomeri di DNA isosequenziali (D3, D5 D9) mostrano nanotubi che adottano una morfologia del filamento dritto. (B) Le immagini TIRF (5 μm scale bar) e(D)TEM (ingrandimento 25x) dell'auto-assemblaggio degli ibridi γPNA-DNA al momento della sostituzione degli oligomeri γPNA crossover (p1, p4, p7) con oligomeri di DNA isosequenziali (D1, D4 D7) mostrano nanofibre che adottano una morfologia stellata. La figura è stata modificata con l'autorizzazione delref 15. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Morfologie diverse per le nanofibre γPNA in concentrazioni variabili di SDS.
Immagini TIRF (5 μm scale bar) di auto-assemblaggio di nanofibre γPNA in presenza di SDS a concentrazioni di (A) 5,25 mM e (B) 17,5 mM. L'auto-assemblaggio in presenza di concentrazioni di SDS inferiori al CMC (8,2 mM) mostra morfologie più sottili dalle immagini TIRF basate sull'intensità della fluorescenza. (C) Questo è verificato dalle immagini TEM (ingrandimento 100x) del sistema in cui la larghezza mediana per le nanofibre si trova nell'intervallo 8\u201212 nm. A concentrazioni significativamente superiori al CMC, i nanotubi γPNA sembrano formare assiemi di ordine superiore attraverso strutture di nanotubi altamente in rete. La figura è stata modificata con l'autorizzazione delref 15. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Output della stringa di script MATLAB "thisSeq" | Punteggio di penalità "thisScore" | ||
| «l'atto di un'azione che non è in materia di protezione dell'ambiente, ma anche di un problema di protezione dell'ambiente. | 0.08 | ||
| 'ccctcccgaccg ggagggttcagg cacttgcctgaa tggcgttgctat acgccattccaa cggtcgttggaa gagatacaagtg tatctcatttac atagcagtaaat ' | 0.0544 | ||
| 'tcgcaggagaca ctgcgaggataa aacggcttatcc ccacttgccccg aagtggacgatt tgtctcaatcgt aaatgtgccgtt acattttaccaa cggggcttggta ' | 0.0688 | ||
| «I dati relativi all'organizzazione del lavoro sono stati oggetto di un'azione comune in questo campo. | 0.0528 | ||
| 'cgggagaaccac ctcccgtttagg cttgaccctaaa gcttacactcgc gtaagccgatga gtggtttcatcg gcaatagtcaag tattgccctgct gcgagtagcagg ' | 0.0656 | ||
| 'aatgagccgtggc ctcattttatct tagggcagataa ctttcgccacaa cgaaagcagtcc gcacggggactg caatacgcccta gtattggaggaa ttgtggttcctc ' | 0.0592 | ||
| 'gatggaagcccccc tccatcgcctgt ccagagacaggc aagtcaagtagg tgacttttattg ggggctcaataa gcaacgctctgg cgttgctcggtg cctactcaccga ' | 0.0688 | ||
| 'tagccccccagt gggctatcgtgt ttcaggacggtgtcg cgcaagagtatt actgggaatact gatttacctgaa taaatcaaggc cgacacgccttt ' | 0.0656 | ||
| 'taggcaacagac tgcctaccactc tttggagagtgg tagcccctgcgg gggctattcatc gtctgtgatgaa ttcccgtccaaa cgggaacctta ccgcagtaaggt ' | 0.0736 | ||
| «Aatgtgtctatc cacattcccttc cgccaagaaggg gtgctgttatgc cagcacgactaa gatagattagtc cctcggttggcg ccgaggtcaaac gcataagtttga » | 0.0768 | ||
| 'ttggcgttatcc cgccaaatgctt ggacgaaagcat accgagtgaaca ctcggtggggtc ggataagacccccc tctacatcgtcc tgtagagtgccc tgttcagggcac ' | 0.0576 | ||
| 'ctgtaaggtctc ttacaggtgctt cacgcaaagcac ttcgggatggag cccgaacaatct gagaccagattg gcggactgcgtg gtccgcctattt ctccataaatag ' | 0.072 | ||
| «actccaatctat tggagttttgtt ctacccaacaaaa cgctcaagtaat tgagcgaacggc atagatgccgtt ctgcgggggtag ccgcaggtcttc attactgaagac » | 0.064 | ||
| 'ggttgttccacg acaacctgaagc ttatgtgcttca ttgccccgagcg gggcaatctttctc cgtggagaaaga ctactgacataa cagtagacgatg cgctcgcatcgt ' | 0.0688 | ||
| «Il problema è che la commissione per l'ambiente, la pesca e lo sviluppo | 0.0688 | ||
| 'gaaggtctaatg accttcatcctg gcagttcaggat ttggtagcggag taccaaaatcg cattagcgattt acgacaaactgc tgtcgtaagtgg ctccgcccactt ' | 0.0576 | ||
| «L'atto di lavoro e l'accesso al lavoro sono stati oggetto di un'azione che non è in atto. | 0.0624 | ||
| 'tggaaccttgta gttccattcgca atcacctgcgaa ccacacttactg gtgtggggggct tacaagagccga ggcgttggtgat aacgccctatct cagtaaagatag ' | 0.0656 | ||
| 'agaggtcgtatt acctctgtgagt cggtttactcac actttccagcaa gaaagtccatcc aatacgggatgg tagcccaaaccg gggctaaggcga ttgctgtcgcct ' | 0.0688 | ||
| 'cggcaaactatg ttgccgatttct acttacagaaat cgtgtcctaaag gacacgggatgg catagtccatcc tgaggcgtaagt gcctcacagcga ctttagtcgctg ' | 0.0704 | ||
Tabella 1: 20 risultati algoritmici di esempio per la potenziale ottimizzazione della progettazione della sequenza γPNA. 20 risultati algoritmici di esempio con output di sequenza nella colonna 1 e il loro punteggio corrispondente nella colonna 2. Le iterazioni ripetute dello script vengono eseguite per ottenere il punteggio più minimo.
| ID sequenza γPNA | Sequenza | Complemento del dominio 1 | Complemento di dominio 2 |
| p1 a) La commissione per l | N-AATAGCGTTCAC-C | p2 dominio 1 | p6-Biotina dominio 1 |
| p2 a) La commissione per l | N-GCTATTGAGTAA-C | p1 dominio 1 | p3 dominio 2 |
| p3 a) La commissione per l | N-GACATCTTACTC-C | p7 dominio 2 | p2 dominio 2 |
| p4 a) La commissione per l | N-CTGGCGTGCGGA-C | p5 dominio 1 | p9 dominio 1 |
| p5 a) La commissione per l | N-CGCCAGCCCTCG-C | p4 dominio 1 | p6-Biotina dominio 2 |
| p6-Biotina | N-Biotina-GTGAACCGAGGG-C | p1 dominio 2 | p5 dominio 2 |
| p7 a) La commissione per l | N-AGTTTTGATGTC-C | p8-Cy3 dominio 1 | p3 dominio 1 |
| p8-Cy3 | N-Cy3-AAAACTACAGAA-C | p7 dominio 1 | p9 dominio 2 |
| p9 a) La commissione per l | N-TCCGCATTCTGT-C | p4 dominio 2 | p8-Cy3 dominio 2 |
Tabella 2: Risultati della progettazione della sequenza γPNA per le nanofibre. Le singole sequenze di oligomeri sono state generate come indicato in questa tabella. Le basi sottolineate indicano le modifiche alla posizione gamma con mini-PEG. La tabella è stata modificata con l'autorizzazione di Ref15.
| Intervallo di temperatura | Velocità rampa |
| 90 °C | Tenere premuto per 3 minuti |
| 90-80 °C | 0,1°C/minuto |
| 80-70 °C | 0,1°C/minuto |
| 70-60 °C | 0,1°C/3 minuti |
| 60-50 °C | 0,1°C/3 minuti |
| 50-40 °C | 0,1°C/3 minuti |
| 40-30 °C | 0,1°C/minuto |
| 30-20 °C | 0,1°C/minuto |
| 4 °C | Tenere premuto a tempo indeterminato |
Tabella 3: Protocollo di rampa di ricottura per ciclore termico. La tabella è stata modificata con l'autorizzazione di Ref15.
| Concentrazione di scorte | 75% DMSO: campione di ricottura acqua (v/v) | 75% DMF: campione di acqua (v/v) ricottura | 40% diossano: campione di ricottura ad acqua (v/v) | Concentrazione finale | |
| Oligomero γPNA (x9) | 20 μM | 9 μL (1 μL x 9) | 9 μL (1 μL x 9) | 9 μL (1 μL x 9) | 500 nM |
| Dmso | - | 30 μL | - | - | 75 % (v/v) |
| Dmf | - | - | 30 μL | - | 75 % (v/v) |
| 1,4-diossano | - | - | - | 16 μL | 40 % (v/v) |
| acqua deionizzata | - | 1 μL | 1 μL | 15 μL | 25 o 60% (v/v) |
| Volume totale | - | 40 μL | 40 μL | 40 μL | - |
Tabella 4: Protocollo per la preparazione di lotti di ricottura di oligomero γPNA in diverse condizioni di solvente.
| ID sequenza DNA | Sequenza |
| D1 | 5'-AATAGCGTTCAC-3' |
| D3 | 5'-GACATCTTACTC-3' |
| D4 | 5'-CTGGCGTGCGGA-3' |
| D5 | 5'-CGCCAGCCCTCG-3' |
| D7 | 5'-AGTTTTGATGTC-3' |
| D9 | 5'-TCCGCATTCTGT-3' |
Tabella 5: Sequenze di DNA isosequenziale come oligomeri sostitutivi di γPNA. La tabella è stata modificata con l'autorizzazione di Ref15.
| Concentrazione di scorte | Sostituzioni del filamento contiguo del DNA | Sostituzioni del filamento DNA Crossover | Concentrazione finale | |
| Oligomero γPNA (x6) | 20 μM | 6 μL (1 μL x 6) | 6 μL (1 μL x 6) | 500 nM |
| Oligomero di DNA (x3) | 20 μM | 3 μL (1 μL x 3) | 3 μL (1 μL x 3) | 500 nM |
| Dmso | - | 30 μL | 30 μL | 75 % (v/v) |
| acqua deionizzata | - | 1 μL | 1 μL | 25 % (v/v) |
| Volume totale | - | 40 μL | 40 μL | - |
Tabella 6: Protocollo per la preparazione di lotti ricotti di nanostrutture ibride γPNA-DNA nel 75% di DMSO: H2O (v/v) mediante sostituzione di oligomeri γPNA contigui o crossover con oligomeri di DNA isosequenziali.
| Concentrazione di scorte | Concentrazioni di SDS inferiori a CMC | Concentrazioni di SDS superiori a CMC | Concentrazione finale | |
| Oligomero γPNA (x9) | 20 μM | 9 μL (1 μL x 9) | 9 μL (1 μL x 9) | 500 nM |
| 6% SDS | 6% (wt/v) | 1 μL | - | 5,25 mM |
| 20% SDS | 20% (wt/v) | - | 1 μL | 17,5 mM |
| Dmso | - | 30 μL | 30 μL | 75 % (v/v) |
| acqua deionizzata | - | - | - | 25 % (v/v) |
| Volume totale | - | 40 μL | 40 μL | - |
Tabella 7: Protocollo per la preparazione di lotti ricotti di nanostrutture γPNA in DMSO al 75%: H2O (v/v) in presenza di concentrazioni di SDS al di sotto e al di sopra del CMC.
Figura complementare 1: Script di programmazione PNA3nanofiber.m per la progettazione di sequenze di oligomeri. Clicca qui per scaricare questa cifra.
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Discussion
Questo articolo si concentra sull'adattamento e il miglioramento dei protocolli di nanotecnologia degli acidi nucleici esistenti verso miscele di solventi organici. I metodi qui descritti si concentrano sulle modifiche e sulla risoluzione dei problemi all'interno di uno spazio sperimentale definito di solventi organici aprotici polari selezionati. Esiste ancora un potenziale inesplorato per altri protocolli consolidati di nanotecnologia dell'acido nucleico da adattare all'interno di questo spazio. Ciò potrebbe migliorare le potenziali applicazioni attraverso l'integrazione in altri campi come la sintesi di polimeri e peptidi che in genere vengono eseguiti in solventiorganici simili 25,26. Inoltre, ci concentriamo qui sui passaggi critici da osservare durante la pratica dei protocolli sopra menzionati.
Durante la preparazione del campione per l'auto-assemblaggio, è importante mantenere le percentuali di volume dell'acqua al 25% (v/v) per le condizioni DMSO e DMF. Di conseguenza, è importante riconoscere che il solvente organico utilizzato per l'auto-assemblaggio dovrebbe essere anche da scorte anidre. Le strutture in nanofibra sono idrofobiche e aggregate in un aumento del contenuto d'acqua.
A differenza degli approcci agli origami di DNA impalcatura che possono creare strutture di lunghezze discrete, l'attuale design del motivo SST per nanofibre γPNA e altri nanotubi DNA SST precedentemente stabiliti non produce strutture di lunghezze discrete. I nanotubi polimerizzano raggiungendo una gamma di lunghezze multi-micron (fino a 11 μm). Per lo stesso motivo, la resa associata alla formazione della struttura non può essere quantificata.
Tuttavia, a causa della spina dorsale peptidica non carica di γPNA, non ci sono dipendenze dal bilanciamento degli ioni in relazione alla formazione della struttura. I tamponi di imaging, quindi, non devono includere formazioni come Mg2+ tipicamente necessarie per la stabilizzazione delle nanostrutture fatte di acidi nucleici presenti in natura.
Infine, l'aggregazione e l'aggregazione della nanostruttura γPNA in diverse condizioni solventi dipendono anche dalle singole concentrazioni di oligomeri introdotte durante l'auto-assemblaggio. Concentrazioni che vanno da 1 μM e superiore ai singoli oligomeri aumentano la propensione all'aggregazione e all'aggregazione e influenzano l'imaging chiaro delle nanostrutture durante l'imaging TIRF o TEM.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalla sovvenzione della National Science Foundation 1739308, dalla sovvenzione NSF CAREER 1944130 e dal numero di sovvenzione FA9550-18-1-0199 dell'Air Force Office of Science Research. Le sequenze γPNA erano un generoso dono del Dr. Tumul Srivastava di Trucode Gene Repair, Inc. Vorremmo ringraziare il Dr. Erik Winfree e il Dr. Rizal Hariadi per le loro utili conversazioni sul codice MATLAB di DNA Design Toolbox. Ringraziamo anche Joseph Suhan, Mara Sullivan e il Center for Biological Imaging per la loro assistenza nella raccolta dei dati TEM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| γPNA strands/oligomers | Trucode Gene Repair Inc. | Section 2.1 | |
| UV-Vis Spectrophotometer | Agilent | Varian Cary 300 | Section 3.1.2 |
| Quartz cuvettes | Starna | 29-Q-10 | Section 3.1.1 |
| Thermal cycler | Bio Rad | C1000 touch | Section 4.1 |
| 0.2 mL PCR tubes | VWR | 53509-304 | Section 4.5 |
| Anhydrous DMF | VWR | EM-DX1727-6 | Section 4.6 |
| Anhydrous DMSO | VWR | EM-MX1457-6 | Section 4.6 |
| Anhydrous 1,4-Dioxane | Fisher Scientific | AC615121000 | Section 4.6 |
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | VWR | 75800-994 | Section 3.1.1 |
| Microscope slides | VWR | 89085-399 | Section 5.2 |
| Glass cover slips | VWR | 48382-126 | Section 5.2 |
| 2% Collodion in Amyl Acetate | Sigma-Aldrich | 9817 | Section 5.2 |
| Isoamyl Acetate | VWR | 200001-180 | Section 5.2 |
| Biotinylated Bovine Serum Albumin (Biotin-BSA) | Sigma-Aldrich | A8549 | Section 5.3 |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | Section 5.4 |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | 189730 | Section 5.5 |
| Trolox | Sigma-Aldrich | 238813 | Section 5.7 |
| Total Internal Reflection Fluorescence microscope | Nikon | Nikon Ti2-E | Section 5.8 |
| Transmission Electron Microscope | Joel | JEM 1011 | Section 6.6 |
| Tweezers | Dumont | 0203-N5AC-PO | Section 6.3 |
| Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | Section 6.1 |
| Formvar, 300 mesh, Copper grids | Ted Pella Inc. | 1701-F | Section 6.2 |
| Formvar-Silicon monoxide Type A, 300 mesh, Copper grids | Ted Pella Inc. | 1829 | Section 6.2 |
| DNA oligomers/strands | IDT | Section 7.1 | |
| Sodium Dodecyl Sulphate (SDS) | VWR | 97064-860 | Section 8.1 |
References
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