Summary
פרוטוקול זה מתאר את השלבים הדרושים להעברת הגן באמצעות פתיחה ממוקדת של מחסום דם במוח (BBB), הערכה של ביטוי הגנים המתקבל ומדידת פעילות נוירומודולציה של קולטנים כימוגנטיים באמצעות בדיקות היסטולוגיות.
Abstract
כימוגנטיקה ממוקדת אקוסטית (ATAC) מאפשרת בקרה לא פולשנית של מעגלים עצביים ספציפיים. ATAC משיג שליטה כזו באמצעות שילוב של אולטרסאונד ממוקד (FUS) המושרה על ידי פתיחת מחסום דם-מוח (FUS-BBBO), העברת גנים עם וקטורים נגיפיים הקשורים לאדנו (AAV), והפעלה של איתות תאי עם קולטני חלבונים מהונדסים וכימוגנטיים והליגנדים הקוגנטיים שלהם. עם ATAC, ניתן להמיר אזורי מוח גדולים וקטנים בדיוק מילימטרי באמצעות יישום אולטרסאונד יחיד לא פולשני. התמרה זו יכולה מאוחר יותר לאפשר נוירומודולציה ארוכת טווח, לא פולשנית ונטולת מכשירים בבעלי חיים הנעים בחופשיות באמצעות תרופה. מאחר ש-FUS-BBBO, AAVs וכימוגנטיקה שימשו בבעלי חיים רבים, ATAC צריך להיות ניתן להרחבה גם לשימוש במינים אחרים של בעלי חיים. מאמר זה מרחיב פרוטוקול שפורסם בעבר ומתאר כיצד למטב את העברת הגנים עם FUS-BBBO לאזורי מוח קטנים עם הנחיית MRI, אך ללא צורך במכשיר FUS מסובך תואם MRI. הפרוטוקול, גם, מתאר את העיצוב של מיקוד עכבר ורכיבי ריסון שניתן להדפיס בתלת-ממד על ידי כל מעבדה וניתן לשנות אותם בקלות עבור מינים שונים או ציוד מותאם אישית. כדי לסייע ביכולת השחזור, הפרוטוקול מתאר בפירוט כיצד נעשה שימוש במיקרו-בועות, AAV וניפונקטורה בפיתוח ATAC. לבסוף, נתונים לדוגמה מוצגים כדי להנחות את החקירות הראשוניות של מחקרים באמצעות ATAC.
Introduction
השימוש בטכנולוגיות נוירומודולציה ספציפיות למעגלים, כגון אופטוגנטיקה1,2 וכימוגנטיקה 3,4,5, קידם את הבנתנו את המצבים הפסיכיאטריים כהפרעות במעגלים עצביים. מעגלים עצביים קשים למחקר וקשים עוד יותר לשליטה בטיפול בהפרעות מוחיות מכיוון שהם מוגדרים בדרך כלל על ידי סוגי תאים ספציפיים, אזורי מוח, מסלולי איתות מולקולריים ותזמון ההפעלה. באופן אידיאלי הן ליישומים מחקריים והן ליישומים קליניים, שליטה כזו תופעל באופן לא פולשני, אך השגת נוירומודולציה מדויקת ולא פולשנית היא מאתגרת. לדוגמה, בעוד תרופות נוירואקטיביות יכולות להגיע למוח באופן לא פולשני, הן חסרות ספציפיות מרחבית על ידי פעולה ברחבי המוח. מצד שני, גירוי חשמלי עמוק במוח יכול לשלוט באזורים מסוימים במוח, אך מתקשה לשלוט בסוגי תאים ספציפיים ודורש ניתוח ומיקום מכשיר6.
Acoustically Targeted Chemogenetics7 (ATAC) מספק נוירומודולציה עם ספציפיות מרחבית, סוג התא וטמפורלי. הוא משלב שלוש טכניקות: אולטרסאונד ממוקד המושרה על ידי פתיחת מחסום דם-מוח (FUS-BBBO) למיקוד מרחבי, שימוש בווקטורים נגיפיים הקשורים לאדנו (AAVs) כדי להעביר גנים באופן לא פולשני תחת שליטה של מקדמים ספציפיים לסוג התא, וקולטנים כימוגנטיים מהונדסים כדי לווסת מעגלים עצביים נגועים באופן סלקטיבי באמצעות מתן תרופות. FUS היא טכנולוגיה שאושרה על ידי ה- FDA המנצלת את יכולתו של האולטרסאונד להתמקד עמוק בתוך רקמות, כולל המוח האנושי, בדיוק מרחבי מילימטרי. בעוצמה גבוהה, FUS משמש לאבלציה ממוקדת לא פולשנית, כולל טיפול שאושר על ידי ה- FDA לרעד חיוני8. FUS-BBBO משלב אולטרסאונד בעוצמה נמוכה עם מיקרו-בועות מערכתיות, המתנדנדות בכלי הדם במוקד האולטרסאונד, וכתוצאה מכך פתיחה מקומית, זמנית (6-24 שעות) והפיכה של BBB9. פתח זה מאפשר העברה של חלבונים9,10, מולקולות קטנות 11 ווקטורים נגיפיים7,12,13,14 למוח ללא נזק משמעותי לרקמות במכרסמים 10 ובפרימטים לא אנושיים 15. ניסויים קליניים נמשכים עבור FUS-BBBO16,17, המצביעים על יישומים טיפוליים אפשריים של טכניקה זו.
העברת גנים נגיפיים באמצעות AAV מתקדמת במהירות גם לשימוש קליני עבור הפרעות במערכת העצבים המרכזית, עם אישורים רגולטוריים אחרונים של ה- FDA והאיחוד האירופי כאבני דרך עיקריות. לבסוף, קולטנים כימוגנטיים18, כגון קולטני מעצבים המופעלים באופן בלעדי על ידי תרופות מעצבים (DREADDs), נמצאים בשימוש נרחב על ידי מדעני מוח כדי לספק שליטה פרמקולוגית על עירור עצבי בבעלי חיים טרנסגניים או נגועים 19,20. DREADDs הם קולטנים מצומדים לחלבון G (GPCRs) שהונדסו גנטית להגיב למולקולות כימוגנטיות סינתטיות ולא לליגנדות אנדוגניות, כך שמתן מערכתי של ליגנדות אלה מגביר או מפחית את ההתרגשות של נוירונים המבטאים DREADD. כאשר שלוש טכנולוגיות אלה משולבות לתוך ATAC, הן יכולות לשמש לאפנון לא פולשני של מעגלים עצביים נבחרים עם דיוק מרחבי, סוג תא וטמפורלי.
כאן, אנו מרחיבים ומעדכנים פרוטוקול שפורסם בעבר עבור FUS-BBBO11 על ידי הכללת מתודולוגיה למיקוד מדויק של אזורי מוח עם FUS-BBBO בעכברים באמצעות ציוד מיקוד פשוט המודפס בתלת-ממד. אנו מציגים גם יישום של FUS-BBBO ל- ATAC. אנו מראים את הצעדים הדרושים לאספקת AAVs הנושאים קולטנים כימוגנטיים, והערכה של ביטוי גנים ונוירומודולציה על ידי היסטולוגיה. שיטה זו ישימה במיוחד עבור מיקוד אזורי מוח גדולים או מרובים עבור ביטוי גנים או נוירומודולציה. לדוגמה, אזור רחב של קליפת המוח יכול להיות מומר בקלות עם FUS-BBBO ומווסת באמצעות כימוגנטיקה. עם זאת, העברת גנים בטכניקה חלופית, זריקות תוך גולגולתיות, תדרוש מספר רב של זריקות פולשניות וקרניוטומיות. FUS-BBBO והיישום שלו, ATAC, ניתנים להרחבה לבעלי חיים בגדלים שונים, שבהם אזורי המוח גדולים יותר וקשה יותר לתקוף אותם באופן פולשני.
Protocol
כל הניסויים נערכו תחת פרוטוקול שאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המכון הטכנולוגי של קליפורניה, שם הנתונים הושגו במקור על ידי J.O.S.
1. תכנון והדפסה תלת-ממדית של רתמת בעלי חיים וחומרת הנחיית תמונה
- השתמש בקבצים מאתר מעבדת שבלובסקי בכתובת: https://www.szablowskilab.org/downloads להדפסה תלת ממדית של הרכיבים.
- ודא שלחומר ההדפסה יש רגישות נמוכה ב- MRI אך יש לו תמיכה נראית לעין MRI. ראה פירוט החומרים המשמשים בסעיף חומרים וריאגנטים.
- קחו בחשבון את התפרקות החומר עם שימושים מרובים על ידי בדיקת החומר שוב ושוב והתבוננות באתרי השחיקה שיש לחזק. ודא שהקירות המודפסים הם בעובי של 2 מ"מ לפחות.
- השתמש במדפסות תלת-ממד בדיוק גבוה כדי לשפר את דיוק הפילוח.
- נגד כוח הכבידה וכוחות אחרים כדי למנוע סטייה של רכיבים מודפסים בתלת-ממד מפלסטיק על ידי תמיכה ברכיבים לאורכם והגדלת עובי הקירות המודפסים בתלת-ממד אם נצפה כיפוף כלשהו.
- קחו בחשבון דיוק במספר צירים, כולל קדמי/אחורי, מדיאלי/לטרלי, גבי/גחוני, כמו גם פיהוק, גובה והטייה.
- בדוק את דיוק המיקוד על ידי ביצוע FUS-BBBO והקלטת הסטייה ממיקום היעד.
- אם אתה משתמש במערכות סטריאוטקסיות ממונעות, הערך את ההשפעות של תנועה דינמית על גמישות החומר על ידי הקלטת הליך מיקוד FUS-BBBO בווידאו, ותקן כל סטייה על ידי עיבוי קירות החומר המודפסים בתלת-ממד.
2. תיאור מערכת אולטרסאונד
- השתמש במערכת אולטרסאונד עם מתמר מערך טבעתי בן שמונה אלמנטים (קוטר = 25 מ"מ, נקודת מוקד טבעית = 20 מ"מ; צמצם (F) = 0.8)) וזוג דיור לראש עם ג'ל אולטרסאונד degassed על ידי מריחת ג'ל על ראש העכבר המגולח.
הערה: התדר המרכזי של מתמר ששימש במחקר קודם7 היה 1.5 MHz, משך הפולס היה 10ms, ותדירות חזרת הדופק הייתה 1 הרץ מעל 120 שניות. הלחצים כוילו באמצעות הידרופון סיב אופטי ונשמרו בין 0.36-0.45 מגפ"ס. נניח הנחתה אקוסטית של 18% דרך הגולגולת21 עבור 1.5 מגה הרץ והעצם הקודקודית. מגוון התנאים המתאימים לפתיחה בטוחה של BBB ולמסירת AAV תוארו במקום אחר בפירוט 7,14,22.
3. הכנת בעלי חיים
- יש להרדים עכבר אחד באמצעות שאיפת איזופלורן בשיעור של 2% עם אוויר ברמה רפואית. בדוק את עומק ההרדמה על ידי צביטת מגע כדי לאשר חוסר תגובה. לאחר מכן, החל משחה אופתלמית כדי למנוע התייבשות הקרנית באמצעות q-tip סטרילי חד פעמי כדי למנוע זיהום צולב של צינור המשחה.
הערה: הליך טיפוסי של FUS-BBBO יכול לנוע בין 30 דקות לשעתיים, ויש לשמור על הרדמה לאורך כל הדרך. - לאחר שהעכבר מורדם, יש לשטוף קטטר נקי במי מלח הפריניזציה (10 U/ml).
הערה: צנתר מתאים לעכבר של 25-35 גרם כולל מחט של 30 גרם וצינורית PE10. - לאחר מכן יש לחטא את זנב העכבר עם כרית אתנול 70%. מניחים את צנתר וריד הזנב בווריד זנב רוחבי ומאבטחים אותו באמצעות דבק רקמות. שימו לב לזרימה חוזרת של דם מווריד הזנב לתוך הצנתר כדי לאשר את מיקומו.
- יש לגלח את ראש העכבר ולאחר מכן להשתמש בקרם דפילציה לאחר שדבק הרקמה התייבש על מנת להפחית את האפשרות של בועות אוויר להילכד תחת ג'ל קולי במהלך התזה.
- הניחו את העכבר בעגלת MRI מודפסת בתלת-ממד, הרכיבו את השיניים הקדמיות על מוט נשיכה ואת הראש בתוך חרוט אף (איור 1a).
- יש להזריק עד 10 μL לידוקאין תת עורית באתר במגע עם פסי האוזן הקהים. לאחר מכן, הצמידו את הסורגים הקהים לגולגולת והפעילו כמויות בטוחות של לחץ, תוך הקפדה לא להפעיל לחץ על קנה הנשימה מכיוון שהוא מפריע לנשימה. שימו לב לנשימה במשך 30 שניות כדי לוודא שהחיה נושמת בחופשיות בקצב של 1/s.
- חברו את מדריך המיקוד למוטות אוזניים, בדקו נשימה כמו בשלב 3.6 (איור 1b), והמשיכו לעקוב אחר הנשימה באופן חזותי לאורך כל ההליך בכל דקה. קצב נשימה גבוה מעל 1/s הוא אחד הסימנים לאובדן הרדמה. המשך לעקוב אחר תגובת צביטת הבוהן כל 5 דקות כאשר עכברים אינם נמצאים בסורק MRI או אם קצב הנשימה גבוה מעל 1/s.
- העבירו את עגלת ה-MRI למחזיק MRI ולאחר מכן לתוך בור של מגנט.
הערה: תכנון החומרה ממוטב עבור סליל 72 מ"מ בתוך MRI 7T. - רכוש רצף MRI כדי למקם את העכבר בסורק.
- בחר את רצף הצילום המהיר בזווית נמוכה (FLASH) כדי לרכוש את כל המוח, באמצעות הפרמטרים הבאים, בהתאם להוראות ספציפיות של יצרן המכשיר. זמן הדהוד: 3.9 מטר/שניה, זמן חזרה: 15 מטר/שניה, זווית דופק עירור: 15°, גודל מטריצה: 130 x 130 x 114, רזולוציה: 350 x 200 x 200 מיקרומטר לווקסל, ממוצעים: 1, זמן רכישה: 3 דקות 42 שניות
- העברת קבצים ממערכת MRI למחשב השולט במערכת FUS.
- פתחו את רצף ההדמיה בתוכנה כדי לבצע מיקוד מונחה MRI, שבו התמונה אמורה להופיע כמו באיור 1c.
4. מיקוד מונחה MRI
הערה: עם השימוש במדריכי מיקוד מותאמים אישית, אין צורך למקם מתמר אולטרסאונד בתוך MRI, וגם אין צורך לחתוך את העור כדי לבצע מיקוד על ידי אפס סטריאוטקס על קווי ברגמה ולמבדה. בצע את השלבים הבאים כדי לבצע את תהליך הפילוח.
- מקם את הכרכרה בתוך מכשיר סטריאוטקסי. אבטחו אותו במקומו באמצעות בלוק מתכת עם סרט דו-צדדי ועל ידי לחיצה על הכרכרה כנגד שני עמודי תמיכה של הכלי הסטריאוטקסי.
- העבר תמונות MRI למחשב עם תוכנת הנחיית FUS פועלת על ידי בחירת קבצים במנהל הנתונים, לחיצה ימנית כדי להציג אפשרויות תפריט ובחירה באפשרות 'העבר באופן מיידי'.
- פתח את תוכנת ההנחיה FUS וטען תמונה על ידי לחיצה על 'פתח רצף' וטעינת כל הקבצים של רצף ההדמיה.
- עצבו מחדש את התמונה לשלושה צירים על ידי לחיצה ימנית ו'עיצוב מחדש'.
- מקם את המתמר לקו העזר למיקוד המעגלי (איור 1c) על-ידי לחיצה באמצעות לחצן העכבר הימני.
- במבט קשת, התאימו את המיקום האנכי של מתמר וירטואלי כדי להתחשב בעובי אמבט המים ובית המתמר (במקרה זה – 8.2 מ"מ כלפי מעלה, איור 1d).
- כוונו את האזורים שיש להתמקד בהם במתכנן המסלול ורשמו את הקואורדינטות בגיליון אלקטרוני (במקרה זה – המוח האמצעי, כמו באיור 1d).
- חייג בעומק הרצוי של מיקוד (ערך z במסלול אלקטרוני (איור 2) ושים לב לקואורדינטות בגיליון אלקטרוני.
- מקדו כל אחת מהנקודות על-ידי לחיצה על 'שלח מסלול' ו'ביצוע' (איור 2).
הערה: הדבר נעשה כאשר מנשא עכבר ממוקם בתוך המנועים. עם זאת, אותו מיקוד ניתן להשיג עם דיוק גבוה על מכשיר סטריאוטקסי. - כדי להתאים את הקואורדינטות של MRI עם המסגרת הסטריאוטקסית, מקמו את המתמר המותאם אישית מעל מדריך מיקוד ותרגמו עד שכל אחד משלושת ברגי המטרה (איור 3, אלמנט A) יוכל לעבור גם דרך מחזיק המתמר (איור 3, אלמנט B) וגם דרך מדריך המטרה (איור 3, אלמנט C). ודא שהברגים אינם במתח או הטיה.
- מתרגם את המתמר 10.56 מ"מ קדימה בכיוון קדמי/אחורי עד שהוא ממוקם באותו מקום שבו מופיע מרכז של מדריך מיקוד ב- MRI.
- קבעו את המרחק ממרכז המתמר הווירטואלי (איור 3a, אלמנט A) לאזור היעד (איור 3a, אלמנט B), והזיזו את המתמר לקואורדינטות אלה באמצעות מסגרת סטריאוטקסית.
- המשך להכנת פתרון הזרקה.
5. הכנת תמיסת הזרקה
הערה: תמיסות המיקרו-בועות רגישות מאוד ללחץ. כתוצאה מכך, ערבוב נמרץ או הזרקה מהירה דרך מחטים דקות יכולים למוטט את המיקרו-בועות ולהפחית את יעילות פתיחת BBB. נוסף על כך, מיקרו-בועות קלות יותר ממים ויכולות לצוף לחלק העליון של צינור, קטטר או מזרק (איור 4), למשל במזרק אוטומטי. מומלץ מאוד להשהות מחדש את תמיסת המיקרו-בועות מיד לפני כל הזרקה.
- למשוך 0.8 מ"ל מלוחים באמצעות מזרק לתוך צינור 1.5 מ"ל.
- באמצעות מזרק, להוסיף 0.1 מ"ל של חומר ניגוד MRI לתוך אותו צינור 1.5 מ"ל ולערבב.
- הביאו את תמיסת המיקרו-בועות23,24 הלא מופעלת לטמפרטורת החדר.
- ממש לפני התהודה, הפעל מיקרו-בועות למשך 45 שניות במכשיר הפעלת מיקרו-בועות.
- לאט (מעל ~ 3 שניות) למשוך 0.1 מ"ל של microbubbles באמצעות מזרק שחפת 1 מ"ל ומחט 21 גרם מן העומק האמצעי של נוזל.
- הוסף 0.08 מ"ל של microbubbles לתוך פתרון של חומר ניגוד מלוחים מוכן בשלב 5.3. מערבבים על ידי הקשה ביד במשך 15 שניות.
- כאשר הריכוז הסופי של AAVs הוא 0.5-2 x 10 10 חלקיקים נגיפיים לכל גרם של משקל גוף (VP/g), יש להזריק את המטען למסירה (במקרה זה AAV9) דרך מחט30 G לתוך צנתר ורידי הזנב, במקרה של ATAC – AAVs הנושאים קולטנים כימוגנטיים, או בקרה שלילית, כגון AAVs הנושאים GFP תחת אותו מקדם.
- ערבבו שוב מיקרו-בועות ביד במשך 15 שניות כדי למנוע ציפה (איור 4).
- מיד לאחר מכן, לשאוף 200 μL של פתרון microbubble דרך מזרק ללא מחט מחוברת. היעדר מחט יפחית את כוחות הגזירה על מיקרו-בועות.
- הופכים את המזרק ומערבבים על ידי לחיצה על הבוכנה למעלה ולמטה.
- חברו את המחט 30 גרם, ובעודכם הפוכים, דחפו באיטיות את המיקרו-בועות החוצה עד שיופיעו טיפות בקצה המחט.
6. הליך תהודה
- הגדר את הפרמטרים לתהודה: משך פעימה של 10 אלפיות השנייה, 120 חזרות, כל שנייה ולחץ של 0.30-0.45 מגפ"ס בגולגולת.
- הסר את מדריך המיקוד ומרח ג'ל אולטרסאונד נטול גזים על ראש העכבר, תוך הקפדה שלא ליצור בועות.
- הנמיכו את המתמר והניחו אותו ישירות על משטח מחזיק מוטות האוזן, וחייגו את הקואורדינטות למכשירים הסטריאוטקסיים (איור 5).
- הזריקו את התמיסה של AAV (0.5-2 x 1010 VP/g).
- מערבבים מיקרו-בועות ואת תמיסת חומר הניגוד MRI במשך 15 שניות ומזריקים פנימה 80 μL לכל 30 גרם עכבר.
- החל מיד אולטרסאונד במשך 120 שניות על ידי לחיצה על 'שלח' ו 'ביצוע'.
- אם הוגדר יעד ליותר מאתר אחד, העבר את המתמר לאתר זה והתאם את פילוח העומק בהתאם למספרים בגיליון האלקטרוני משלבים 4.7-4.9. לאחר מכן חזור על שלבים 6.5-6.6 עבור כל אתר מסונן.
7. הערכת MRI של פתיחת BBB
הערה: הערכת MRI של פתח BBB תוארה בפירוט במקום אחר11. ניתן לדמיין את המיקום של פתח BBB כאזורים בהירים יותר בעכברים שקיבלו זריקה של חומר ניגוד Gd משוקלל T1.
- לאחר יישום האולטרסאונד, הקלט רצף MRI כמו בשלב 3.10.
- הוציאו את העכבר מסורק ה-MRI והכניסו אותו לכלוב התאוששות כדי לאפשר התאוששות מהרדמה. עקבו אחר העכברים מדי יום לאיתור סימני מצוקה, ירידה במשקל או נקודות קצה אנושיות אחרות. התייעץ עם הצוות הווטרינרי ועם הנחיות IACUC המוסדיות כדי להמשיך בכל טיפול במקרה של תופעות לוואי בלתי צפויות.
8. גירוי DREADD עם ליגנד כימוגנטי
- בחר קולטן כימוגנטי. עבור DREADDs, בחר את קולטן hM3Dq להפעלה עצבית באמצעות מסלולים מצומדים Gq19, קולטן hM4Di לעיכוב פעילות עצבית באמצעות מסלולים מצומדים Gi/o20, או קולטן KORD להפעלת נוירונים באמצעות מסלולים מצומדים Gs באמצעות ליגנד Salvinorin-B25.
- להמיס clozapine-n-oxide (CNO) במי מלח סטריליים בריכוז של 1 מ"ג/מ"ל. אחסן את CNO aliquoted ב -20 ° C.
- מתן CNO19, או ליגנד כימוגנטי אחר26,27,28, דרך מסלול intraperitoneal בריכוז בין 0.3 – 10 מ"ג / ק"ג.
- אם רוצים לרשום השפעות של CNO על ההתנהגות, התחל לתעד את הפעילות ההתנהגותית תוך 15-45 דקות לאחר מתן התרופה כדי להשיג את ההפעלה המרבית של DREADDs19.
- אם רוצים ניתוח של הפעלה עצבית, השתמשו בעכברים להערכה היסטולוגית לאחר 60-120 דקות לאחר ההזרקה.
- המשך להמתת חסד באמצעות זילוח לב (ראה סעיף 9).
9. הערכה היסטולוגית של ביטוי גנים והפעלה כימוגנטית
הערה: ברגע שמושגת נקודת הסיום של הניסוי (למשל, סיום המחקר ההתנהגותי, הזמן הדרוש לביטוי גנים), קריטי לאשר את המיקום והנוכחות של ביטוי הגנים.
- לאחר ההפעלה עם ליגנד כימוגנטי, לבצע זילוח לב כדי לשמר רקמות.
- מרדימים את העכבר עם קטמין (100 מ"ג/ק"ג) / קסילזין (10 מ"ג/ק"ג) תערובת במי מלח סטריליים באמצעות הזרקת IP. אשרו את ההרדמה עם צביטת בוהן וודאו שקצב הנשימה הופחת לכ-1/שנייה. לספק תמיכה תרמית דרך כרית החימום עד אישור המתת חסד.
- הכינו 10% פורמלין חוצץ נייטרלי (NBF) ו-PBS עם 10 יחידות הפרין למ"ל.
הערה: הפתרונות צריכים להיות בטמפרטורה של 4°C. - יוצקים כל חיץ לצינורות נפרדים של 50 מ"ל ומתחברים, ומפעילים משאבה פריסטלטית המחוברת לצנתר פרפר 25 גרם עם תמיסת PBS/הפרין.
- חברו את הגפיים לפד כחול סופג בעזרת נייר דבק וודאו שהחיה מונחת במצב שכיבה על הפד. לחטא את הפרווה כדי למנוע זיהום צולב של איברים היקפיים במקרה שהם צריכים להיאסף.
- פתח את חלל הצפק על ידי חתך רוחבי, חושף את הסרעפת.
- פתח את כלוב הצלעות דרך שני חתכים של מספריים כירורגיים לאורך הציר הקדמי / האחורי.
- יש לחשוף את הלב ולהניח את המחט בחדר שמאל (צד ימין של הלב כפי שנראה כעמוד השדרה) ולהניח בצנתר הפרפר בשלב 9.1.3.
- בצע חתך קטן בחדר הימני כדי לאפשר זרימת דם.
- הפעל את המשאבה הפריסטלטית כדי להתחיל לשטוף את הדם עם PBS/הפרין.
הערה: אם שלב זה אינו מבוצע כראוי, הדם יקריש במהלך הקיבוע עם פורמלין וימנע זילוח מתאים. - לאחר שכל הדם נשטף החוצה ו- PBS צלול מתחיל לצאת מהחדר הימני, העבר את הכניסה של משאבה פריסטלטית לתמיסת NBF והתחל זילוח עבור 25 מ"ל לעכבר.
- לחלץ את המוח, לשים לפחות 4 מ"ל של NBF ולאחר תיקון במשך 24 שעות.
- חתכו את המוח באמצעות מקטעים קורונליים על ויברטומה באמצעות עובי חתך של 50 מיקרומטר.
- מניחים כל חלק בבאר של צלחת 24 באר המאחסנת את החלקים ברחבי המוח.
- להעריך את הביטוי של קולטנים כימוגנטיים מאוחים חלבונים פלואורסצנטיים (למשל, mCherry או mCitrine), תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לזהות את החלקים המראים ביטוי כדי לאשר את המיקום. סביר להניח שהביטוי יהיה עמום.
- בצע immunostaining נגד fluorophore באמצעות הפרוטוקול הבא:
- מניחים 3 חלקים בתמיסה של 0.5 מ"ל המכילה 10% סרום של שלל נוגדן משני ודגרים במשך 30 דקות.
- מעבירים את המקטעים לתמיסה של נוגדן ראשוני בדילול 1:250 – 1:1,000, תוך שימוש בקנ"מ 1:500 כנקודת התחלה.
- לדגור על החלקים עם נוגדן ראשוני למשך הלילה ב 4 ° C ב microplate אטום עם סרט פרפין.
- שטפו את החלקים עם PBS, 3x למשך 5 דקות בכל פעם.
- הוסף 0.5 מ"ל לכל באר של תמיסת נוגדנים משנית בסרום 10%.
- יש לדגור במשך 4 שעות בטמפרטורת החדר.
- שטפו את החלקים עם PBS, 3x למשך 5 דקות בכל פעם.
- הרכבה על מגלשות עם אמצעי הרכבה מימי המכיל כתם גרעיני (לדוגמה, DAPI).
- הערך את הלוקליזציה וההתפשטות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי על ידי ביצוע סריקת אריחים של קטע שלם.
- הערך את עוצמת הביטוי על-ידי מדידת עוצמת הפיקסלים הפלואורסצנטיים באזורי מוח ממוקדים והשווה מול בקרה המוזרקת תוך גולגולתית.
- לחלופין, הערך את אחוז תאי העצב החיוביים על ידי ספירת תאים המוכתמים כנגד קולטנים כימוגנטיים, בהשוואה לתאים חיוביים ל- DAPI, או סמנים ספציפיים לתא.
- להעריך את הנזק לרקמות על ידי ביצוע צביעת hematoxylin על חתך 50 מיקרומטר והדמיה עבור אובדן תאים, הצטברות של פסולת התא, וסימנים אחרים של נזק גס.
- כדי להעריך את הספציפיות של מיקוד התא, בצע אימונוסטיין כפול כמתואר להלן עבור הקולטן הכימוגנטי וסמן ספציפי לתא. לאחר מכן, בצע ספירה חיובית של תאים כמו בשלב 9.8.
- מניחים 3 חלקים ב 0.5 מ"ל של תמיסה המכילה 10% סרום של שורה של נוגדן משני ולדגור במשך 30 דקות.
- מעבירים את המקטעים לתמיסה של נוגדן ראשוני כנגד סמן פלואורסצנטי של קולטנים כימוגנטיים בדילול של 1:250 – 1:1,000, תוך שימוש בקנ"מ 1:500 כנקודת התחלה. הוסף נוגדן ראשוני שני מזן מארח אחר הממוקד נגד סמן ספציפי לתא (למשל, CamkIIa).
- יש לדגור על החלקים עם נוגדן ראשוני למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C במיקרו-צלחת אטומה בסרט פרפין.
- שטפו את החלקים עם PBS, 3x למשך 5 דקות בכל פעם.
- הוסף 0.5 מ"ל לכל באר של תמיסת נוגדנים משנית בסרום 10% של המין המארח של שני הנוגדנים המשניים.
הערה: לכל נוגדן צריך להיות פלואורופור ייחודי ועליו להיות תגובתי כנגד נוגדנים ראשוניים בשלב 9.10.2. - יש לדגור במשך 4 שעות בטמפרטורת החדר.
- שטפו את החלקים עם PBS, 3x למשך 5 דקות בכל פעם.
- הרכבה על שקופיות ולתקן עם אמצעי הרכבה מימי המכיל כתם גרעיני.
10. להעריך הפעלה עצבית עם immunostaining עבור c-Fos
- בצע צביעת c-Fos כמו בנקודה 9.5 של פרוטוקול זה באמצעות נוגדן c-Fos ראשוני ונוגדן משני עם תג פלואורסצנטי שונה מהכתם הגרעיני.
- ספור את אחוז התאים החיוביים הן עבור c-Fos והן עבור כתם גרעיני באזור הממוקד על ידי קולטן כימוגנטי.
- לנתח את אחוז הגרעינים החיוביים של c-Fos בקבוצת עכברים המבטאים קולטנים כימוגנטיים ומטופלים בליגנד כימוגנטי או בבקרת רכב ובקבוצת עכברי בר המטופלים בליגנד כימוגנטי או בבקרת רכב.
Representative Results
השלב הראשון בביצוע פרוטוקול ATAC הוא מיקוד של FUS-BBBO לאזורי המוח הרצויים. לדוגמה, בעקבות הפרוטוקול המתואר, ההיפוקמפוס הותקף באמצעות FUS-BBBO, וחומר ניגוד ו-AAV9 הנושאים DREADD הוזרקו לעכברים, ולאחר מכן רצף MRI תלת-ממדי FLASH הרוכש תמונות של מוח העכבר. שיפור אות T1 הושג באזור ההיפוקמפוס (איור 6) ובחלקים אחרים של המוח (איור 7). לאחר מספר שבועות, DREADDs באו לידי ביטוי בתוך אזור מוח המטרה. בעוד DREADDs רבים מאוחים לכתב פלואורסצנטי (למשל mCherry), תהליך הזילוח והקיבוע עם פורמלדהיד נמצא כמפחית באופן דרסטי את הפלואורסצנטיות של חלבונים אלה. צביעה חיסונית נגד mCherry או DREADD הובילה לזיהוי אמין יותר של הביטוי (איור 8) בהתבסס על ניסיון קודם. בניסויים קודמים, ~85% מהעכברים הראו ביטוי לאחר FUS-BBBO7. בדיקה פשוטה לרמות ביטוי מספיקות של DREADDs היא בדיקת הפונקציונליות שלהם ברמה התאית. זה יכול להיעשות, למשל, על ידי מתן ליגנד כימוגנטי או בקרת מלוחים, כגון CNO19, deschloroclozapine 28, או אחרים29, ומחכה 2 שעות לפני זילוח לב וקיבוע. לאחר מכן חלקי המוח עברו חיסון, עבור חלבון c-Fos30, המצביע על פעילות מוגברת של נוירונים, ועבור DREADD. הניסוי נחשב למוצלח, אם האתר במוח שהותקף ב-DREADDs הראה מספר גבוה משמעותית של גרעינים עצביים שהם חיוביים ל-c-Fos בקבוצה שקיבלה ליגנד כימוגנטי בהשוואה לקבוצה שקיבלה מלוחים7 או בהשוואה לאתר נגדי שלא היה נתון ל-FUS-BBBO. יש לציין כי קיים פוטנציאל עבור חלק מהליגנדות הללו להפעיל תאי עצב באופן לא ספציפי ללא ביטוי של DREADDs. לדוגמה, CNO הוכח כמטבוליזם לרמות נמוכות של קלוזאפין בעכברים, אשר חוצה את מחסום הדם-מוח ומפעיל DREADDs בעוצמה גבוהה27. עם זאת, הוכח גם שהוא נקשר למיקומים לא ספציפיים. כמו בכל ניסוי, חיוני לכלול את כל הבקרות המתאימות במחקרים כימוגנטיים31. בקרה אפשרית אחת היא מתן הליגנד הכימוגנטי לעכברי בר, ללא פרוצדורות, כדי לשלול את השפעות התרופה בלבד על הבדיקה ההתנהגותית או ההיסטולוגית הרצויה. בקרה נוספת יכולה להיות הכללה של ארבע קבוצות: DREADD + ליגנד, DREADD + רכב, EGFP + ליגנד, EGFP + רכב, אשר יסביר את כל ההשפעות האפשריות של העברת גנים עם FUS-BBBO, ואת ליגנד כימוגנטי.
איור 1: התהליך של מיקוד מונחה MRI של FUS ב-ATAC. (א) מיקום עכבר עם מוטות אוזניים, חרוט אף ופלטפורמה שניתן להכניס בתוך סורק MRI. (ב) מדריך מודפס בתלת-ממד (כחול) הנראה ב-MRI חובר לקצוות מסגרת מוט האוזן ולאחר מכן אובטח במקומו באמצעות מחזיק סליל MRI משטח המכיל ארבעה ברגי הצמדה (כחול שקוף למחצה). (ג) הופעת המדריך המודפס בתלת-ממד ב-MRI קשת (פאנל שמאלי), כאשר תחתית הייצוג הווירטואלי של מתמר מיושרת (חצי עיגול צהוב) עם תחתית המדריך. הפאנל הימני מציג את המראה של המדריך המודפס בתלת-ממד על MRI ממבט קורונלי. העיגול הבהיר היה עשוי מחומר תמיכה פוליג'ט בעל ניגודיות MRI חזקה. הצלב נוצר מפלסטיק. עיגול צהוב מייצג את מיקום המתמר שהיה מיושר באופן קונצנטרי עם המדריך בתוך מסגרת סטריאוטקסית. (d) כדי להתמקד במבני מוח, מתמר וירטואלי הוזז בכיוון z מעל העכברים כדי להתאים לעובי של חרוט / בית אולטרסאונד. במקרה זה, בגלל עובי אמבט המים, המתמר הועבר 8.2 מ"מ מעל המדריך למיקוד מדויק. מבני המוח נבחרו באמצעות נתוני דימות MRI, וקואורדינטות ה-MRI שלהם נכתבו והוזנו למכונה הסטריאוטקסית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ממשק התוכנה שבה נעשה שימוש. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תהליך התאמת מרחב קואורדינטות MRI למכשיר סטריאוטקסי. (א) שלושה חורים בתוך מחזיק מתמר יושרו עם שלושה חורים בתוך מדריך ה-MRI, ושלושה ברגי מיקוד חרוטיים הוכנסו מבלי לגרום לכיפוף המכלול כולו. (ב) באופן אידיאלי, כל שלושת הברגים ישבו במרכז החורים. (ג) אם יש אי דיוק כלשהו ביישור, לא כל שלושת הברגים ייכנסו פנימה, למשל, במקרה של פיהוק קטן, ככל הנראה בלתי מורגש, של 1°, רק בורג אחד יתאים בעוד שהברגים הנגדיים יהיו תקועים במדריך MRI. לחלופין, יכולה להיות גמישות נראית לעין של המכלול כולו כאשר ברגים נדחקו פנימה. (ד) תצוגה מוגדלת של התאמת ברגים. יש למקם את הברגים באופן מרוכז לקבלת הדיוק הטוב ביותר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: חלוקה מחדש מהירה של מיקרו-בועות בתוך המזרק. (א) מזרק צולם 5 שניות לאחר הערבוב. (ב) דקה לאחר מכן, הייתה שכבה גלויה בבירור שהראתה חלק מהבועות מתרכזות ליד החלק העליון של מזרק שחפת 1 מ"ל. דוגמה זו, בפרט, השתמשה פתרון של microbubbles. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: תהליך של מיקום מרכז מתמר מעל מרכז של מדריך MRI. (א) במודלים המוצגים במאמר זה, המוביל האדום תוכנן לנוע 10.56 מ"מ קדימה מהמיקום המוצג באיור 3b, למצב המוצג כאן. (ב) מדריך ה-MRI הכחול הוסר לפני הסוניקציה, וג'ל אולטרסאונד הוחל בין העכבר למתמר (כתום) כדי להבטיח מעבר אולטרסאונד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: הדמיית MRI של פתח BBB. (א) מבט צירי על פתח BBB. אזור בהיר יותר המסומן עם ראש חץ מראה אקסטרווזיה של חומר ניגוד MRI T1 . (b) מבט קורונלי על ההיפוקמפוס הגבי וקליפת המוח שמעל ההיפוקמפוס הממוקדת באמצעות FUS-BBBO (ראשי חץ). (c) מבט קורונלי על ההיפוקמפוס המרכזי הממוקד באמצעות FUS-BBBO (ראשי חץ). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: דוגמה למיקוד של 4 אתרי מוח באמצעות מערכת מיקוד תלת-ברגית המתוארת במאמר זה. אזורים עם ראשי חץ הראו BBB נפתח אתרים עם דיפוזיה של חומר ניגוד MRI. ארבעת האתרים היו ממוקדים ברצף, עם ~ 150 שניות בין כל פתח BBB, מלמטה למעלה. התמונה צולמה תוך 2 דקות לאחר הפתיחה האחרונה של BBB. סרגל קנה המידה הוא 2 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: זיהוי ביטוי DREADD. (א) Immunostaining עבור fluorophore מחובר DREADDs, במקרה זה mCherry היה שיטה אמינה של גילוי בכמה מחקרים. (b) בחלק מייצג אחר עם DREADDs המכוונים להיפוקמפוס תוך שימוש באותם תנאים כמו ב-(a), הפלואורסצנטיות של mCherry לבדה יצרה רקע חזק ואות חלש יחסית. (ג) כבקרה שלילית, נעשה שימוש בעכבר שקיבל הזרקה מערכתית של AAV, אך לא עבר FUS-BBBO. לא ניתן למצוא ביטוי משמעותי על ידי mCherry immunostaining. פסי קנה מידה הם 500 מ"מ. (נתונים ב-a, c הותאמומ-7 עם הרשאות, Copyright 2020 Nature-Springer). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
ATAC דורש יישום מוצלח של מספר טכניקות לנוירומודולציה מוצלחת של מעגלים עצביים ספציפיים, כולל מיקוד מונחה MRI מדויק, FUS-BBBO, והערכה היסטולוגית של ביטוי גנים. רכיבים הניתנים להדפסה בתלת-ממד פותחו כדי לפשט את המיקוד של מבני מוח קטנים באמצעות FUS-BBBO מונחה הדמיה.
מתן אולטרסאונד ממוקד מונחה MRI (MRIgFUS) מציב מספר אתגרים. ראשית, לסליל MRI טיפוסי יש שטח מוגבל שנועד להכיל רק דגימה ולא את חומרת האולטרסאונד. המשעממים הגדולים יותר של MRI מגדילים את עלות הציוד ומפחיתים את איכות התמונה, שכן האות קשור לגורם המילוי של סליל32. כתוצאה מכך, כל חומרת FUS המונחת על גבי תמונה של בעל חיים ב-MRI תפגע באיכות ההדמיה. שנית, תכנון מכשירים תואמי MRI הוא קשה ויקר. חומרים תואמי MRI צריכים להיות דיאמגנטיים, בעלי נטייה נמוכה ליצירת זרמי ערבולת במהלך הקרנת גלי רדיו, ובעלי רגישות מגנטית נמוכה בשדות מגנטיים גבוהים. בכל חומר מוליך, יצירת זרמי מערבולת או רגישותו המגנטית ישפיעו לרעה גם על איכות ההדמיה. לבסוף, החומרים הזמינים תואמי MRI הם בעלי מודולי ועמידות נמוכים יותר של יאנג מאשר המתכות המשמשות בדרך כלל לייצור מכונות מיקוד מדויקות, כגון מסגרות סטריאוטקסיות. המנועים המשמשים לכוונון מיקום צריכים להיות תואמי MRI וממוקמים מחוץ למשעמם ה- MRI בשל גודלם. מנועים אלה צריכים להיות מחוברים במרחק למתמר בתוך משעמם MRI באמצעות חומרים תואמי MRI. בעיות של עיוות פלסטיק, היעדר מספיק מקום בתוך הבור כדי ליישם רכיבים בגודל חזק, וחוסר מקום מספיק לשינוי מיקומי מיקוד ברחבי המוח כולו השפיעו על דיוק המיקוד בעבודות קודמות.
כדי לפתור בעיות אלה, הוחלט לבצע הדמיה ב- MRI וניהול FUS-BBBO מחוץ לסורק. כדי לאפשר הנחיית MRI, עכברים הוכנסו לתוך ריסון מודפס בתלת-ממד עם מדריך מיקוד גלוי MRI שניתן להשתמש בו כדי למקם את מבני המוח של העכבר הן ב-MRI והן במרחב הקואורדינטות הסטריאוטקסיות. מאחר שגם גולגולת העכבר וגם מדריך המיקוד מחוברים היטב למחזיקי מוטות האוזן (איור 1a,b), ניתן להשתמש במדריך מיקוד כדי לתאם קואורדינטות מרחביות בתוך תמונת MRI ולאפס את המכשירים הסטריאוטקסיים. לרסן אין חלקים נעים והוא אינו מכיל מתמר, מה שאפשר לנו להפוך אותו גם חזק וגם קטן מספיק כדי להיכנס לתוך MRI והסיר הפרעות אות מהאלקטרוניקה של המתמר. החלל בתוך מדריך המיקוד היה חלול כאשר התמיכה המודפסת בתלת-ממד עבור חומרים מסוימים נראית ב-MRI (איור 1c). חורים במכלול הוכנסו כדי לאפשר כיול סטריאוטקסי (איור 3). מתמר האולטרסאונד הוצמד לאלקטרודה בעלת סטריאוטקס, והמיקוד בוצע כמתואר בסעיף 4 (איור 1d). המתמר צריך להיות נתמך לאורכו על ידי בית של מוטות אוזניים, מניעת כל סטייה ממישור הרמה. ניתן להשיג את המיקוד בכיוון הגב-גחוני באמצעות שינויי פאזה במערך טבעתי.
דיוק המיקוד המעשי נקבע על ידי מיקוד אולטרסאונד והנחתת גולגולת. נוהל FUS-BBBO תואר בפירוט עבור חולדות 11 ויושם במספר יצורי מודל אחרים23,33,34 ובבני אדם 16,17. הקשר בין גודל מיקוד האולטרסאונד ביחס הפוך לתדר, כאשר תדרים גבוהים יותר יכולים לגרום למסירה מדויקת יותר. עם זאת, הנחתת הגולגולת עולה עם תדירויות35 מה שעלול להוביל לחימום הגולגולת ולפגיעה באזורים בקליפת המוח. אסטרטגיית המיקוד המדויקת תהיה תלויה באתר המוח. האתרים שבהם לחץ מקסימלי ברוחב מלא של חצי רוחב נכנס לתוך רקמת המוח מאפשרים פתיחה צפויה ובטוחה של BBB במבני מוח רבים כגון הסטריאטום, המוח התיכון וההיפוקמפוס. אזורים הסמוכים לבסיס המוח מהווים אתגר ספציפי בעכברים. מוח העכבר מודד כ-8-10 מ"מ בכיוון הגחון-דורסו, הדומה לחצי הרוחב המלא של הגודל המרבי של מתמרים רבים הזמינים מסחרית. כתוצאה מכך, מיקוד בתחתית הגולגולת יכול להוביל להחזר אולטרסאונד מהעצמות והאוויר הנמצאים בתעלות האוזן, בפה או בקנה הנשימה, אשר יכול להוביל לדפוסים בלתי צפויים של לחצים גבוהים ונמוכים36. חלק מהלחצים הללו יכולים לחצות סף קוויטציה אינרציאלי שהוכח כגורם לדימום ולנזק לרקמות37. כדי להתמקד באזורים הממוקמים בסמוך לבסיס הגולגולת, ייתכן שעדיף להשתמש ב-ATAC7 מצטלב, שבו גנטיקה מצטלבת38 משמשת להגבלת ביטוי גנים לאזור קטן יותר מזה הממוקד בקרן FUS. בדוגמה שפורסמה של ATAC מצטלב, חיה טרנסגנית המבטאת אנזים לעריכת גנים (Cre38) בתאים דופמינרגיים הותקפה באמצעות אולטרסאונד בתת-האזור המכיל תאים דופמינרגיים. לבסוף, אזורי קליפת המוח יכולים להיות ממוקדים עם FUS, אבל עקיפה והשתקפות של אולטרסאונד עלול להתרחש המוביל פרופילי לחץ אחידים. פרוטוקול זה אינו מכסה את המיקוד של אזורים בקליפת המוח מכיוון שהוא יהיה תלוי מאוד במינים המשומשים; אולם נצפתה התמקדות מסוימת בקליפת המוח שמעל היפוקמפוס 7 (למשל, איור 7), מה שמצביע על כך שלפחות בעכברים זה אפשרי.
הבחירה של מפעיל כימוגנטי ומינון יהיה תלוי בצרכים הניסוייים הספציפיים. מספר מחקרים, כולל אחד המחקרים של המחברים7, לא הראו תגובה לא ספציפית משמעותית39,40, בעוד מינונים גבוהים יותר (למשל, 10 מ"ג / ק"ג) יכולים לגרום לתופעות לוואי, לפחות במקרים מסוימים41. עם זאת, כמו בכל הניסויים ההתנהגותיים, בקרות נאותות31 חיוניות בשל פעילות פוטנציאלית מחוץ למיקוד של CNO והמטבוליטים שלו42. בקרות כאלה יכולות לכלול מתן בקרות CNO ומלוחים לבעלי חיים המבטאים DREADDs ומתן CNO לחיות בר או במקרים מסוימים השוואה בין אתרים איפסי וקונטרלטרליים במוח שעושים ואינם מבטאים קולטנים כימוגנטיים בהתאמה. בנוסף, מחקר שנערך לאחרונה גילה מספר אגוניסטים חדשים של DREADD עם ספציפיות משופרת28,29,43. קולטנים כימוגנטיים אחרים 5,25,44 יכולים לשמש גם בשילוב עם הליך ATAC.
הערכה היסטולוגית של ביטוי גנים היא הכרחית לאחר המוות עבור כל בעל חיים. חלק קטן מבעלי החיים מראים ביטוי גנים גרוע בעקבות FUS-BBBO7. בנוסף, יש צורך להראות את הדיוק המרחבי ואת הספציפיות של ביטוי גנים מאז מיקוד שגוי אפשרי. יש לציין כי חלק מה- AAV עשויים להראות יכולת מעקב מדרדר או אנטרוגרדי45 ויכולים לגרום לטרנספקציה הרחק מהאתר הממוקד באולטרסאונד למרות מיקוד אולטרסאונד מדויק. אם הקולטן הכימוגנטי המובע מאוחה או מבטא יחד פלואורופור, הדמיה של הפלואורופור במקטעי רקמה עשויה להספיק כדי להעריך לוקליזציה ועוצמת ביטוי. עם זאת, חלבונים פלואורסצנטיים רבים ניזוקים מתהליך קיבוע הרקמות, וצביעת מערכת החיסון עבור חלבון mCherry המשמש לעתים קרובות עם DREADDs הניבה אות טוב יותר במחקרים קודמים7. לבסוף, בשל צפיפות תאי העצב באזורים מסוימים במוח (למשל, שכבת תאים גרגירית בהיפוקמפוס), שימוש בפלואורופורים מקומיים גרעיניים המבוטאים תחת IRES, בניגוד לאיחוי, לביצוע ספירת תאים עשוי להועיל, שכן ניתן לפלח גרעינים בקלות ולהכתים אותם בכתמים גרעיניים, כגון DAPI או TO-PRO-3. כדי להעריך נוירומודולציה על ידי צביעת c-Fos, ביצוע צביעת נגד גרעינית וספירת גרעינים חיוביים c-Fos, ולא כל אות פלואורסצנטי, הוא הכרחי. במקרים מסוימים, פסולת תאית יכולה להראות פלואורסצנטיות ולבלבל את המדידות של תאים חיוביים.
מגבלות העברת התרופה והגנים עם FUS-BBBO כוללות רזולוציה נמוכה יותר מאשר העברה בזריקות תוך גולגולתיות פולשניות והצורך בכמויות גדולות יותר של תרופות מוזרקות או וקטורים נגיפיים. בנוסף, בעוד שהזרקה ישירה למוח מביאה לאספקה בלעדית לאתר המוזרק, FUS-BBBO משתמש בנתיב תוך ורידי וכתוצאה מכך העברה אפשרית לרקמות היקפיות. מגבלות השימוש בכימוגנטיקה לנוירומודולציה כוללות ציר זמן איטי, אשר עשוי להיות לא מספיק לפרוטוקולים התנהגותיים מסוימים הדורשים שינויים מהירים בעוצמת הנוירומודולציה.
Disclosures
אין ניגוד עניינים.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי קרן המוח וההתנהגות, פרס החוקר הצעיר של NARSAD. מספר רכיבים מודפסים בתלת-ממד תוכננו במקור על ידי פביאן רבוסו (Image Guided Therapy, צרפת). המחבר מודה לג'ון הית' (קלטק) ולמרגרט סוויפט (קלטק) על העזרה הטכנית בהכנת כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 21-gauge needles (BD) | Fisher Scientific | 14826C | |
| 25-gauge butterfly catheter | Harvard Bioscience | 725966 | |
| 30-gauge needles (BD) | Fisher Scientific | 14826F | |
| Absorbent blue pad | Office Depot | 902406 | |
| Anti-c-Fos antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-253-G | |
| Anti-mCherry antibody | Thermofisher | PA534974 | |
| Bruker Biospec 70/30 | Bruker | custom | includes the RF coils |
| Clozapine-n-oxide | Tocris | 4936 | |
| Custom designed 3D printed mouse harnesses and MRIgFUS targeting components | ImageGuidedTherapy, Szablowski lab | custom | download from szablowskilab.org/downloads |
| Custom MRIgFUS machine | ImageGuidedTherapy | N/A | |
| Definity microbubbles | Lantheus | DE4 | |
| Degassed aquasonic/ultrasound gel | Fisher Scientific | 5067714 | |
| Depilation crème | Nair | n/a | |
| Eight-element annular array transducer | Imasonic Inc. | custom | |
| Ethanol Pads/Alcohol Swabs (70%) (BD) | Office Depot | 599893 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149-25KU | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Ketamine | Patterson Veterinary | 07-890-8598 | |
| Neutral buffered formalin (10%) | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | |
| Optical fiber hydrophone | Precision Acoustics | ||
| PE10 tubing | Fisher Scientific | NC1513314 | |
| Peristaltic pump | |||
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 524650-1EA | |
| Prohance contrast agent | Bracco | 0270-1111-04 | |
| Saline | Fisher Scientific | NC9054335 | |
| Secondary antibody, Donkey-anti goat | ThermoFisher | A-11055 | |
| Secondary antibody, Donkey-anti rabbit | ThermoFisher | 84546 | |
| Surgical scissors (straight) | Fisher Scientific | 17467480 | |
| ThermoGuide Software | ImageGuidedTherapy | ||
| Tissue glue (Gluture) | Fisher Scientific | NC9855218 | |
| Tuberculin Syringe (1 mL) (BD) | Fisher Scientific | 14823434 | |
| VeroClear 3D printable material | Stratasys | RGD810 | |
| Vialmix microbubble activation device | Lantheus | VMIX | |
| Vibrating microtome | Compresstome | VF-300 | |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | X1251-1G |
References
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
- Zhang, F., Wang, L. -P., Boyden, E. S., Deisseroth, K. Channelrhodopsin-2 and optical control of excitable cells. Nature Methods. 3, 785-792 (2006).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 5163-5168 (2007).
- Lerchner, W., et al. Reversible silencing of neuronal excitability in behaving mice by a genetically targeted, ivermectin-gated Cl- channel. Neuron. 54, 35-49 (2007).
- Magnus, C. J., et al. Chemical and genetic engineering of selective ion channel-ligand interactions. Science. 333, 1292-1296 (2011).
- Deeb, W., et al. Proceedings of the fourth annual deep brain stimulation think tank: a review of emerging issues and technologies. Frontiers in Integrative Neuroscience. 10, 38 (2016).
- Szablowski, J. O., Lee-Gosselin, A., Lue, B., Malounda, D., Shapiro, M. G. Acoustically targeted chemogenetics for the non-invasive control of neural circuits. Nature Biomedical Engineering. 2, 475-484 (2018).
- Elias, W. J., et al. A pilot study of focused ultrasound thalamotomy for essential tremor. New England Journal of Medicine. 369, 640-648 (2013).
- Burgess, A., Hynynen, K. Noninvasive and targeted drug delivery to the brain using focused ultrasound. ACS Chemical Neuroscience. 4, 519-526 (2013).
- Kinoshita, M., McDannold, N., Jolesz, F. A., Hynynen, K. Noninvasive localized delivery of Herceptin to the mouse brain by MRI-guided focused ultrasound-induced blood-brain barrier disruption. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 103, 11719-11723 (2006).
- Samiotaki, G., Acosta, C., Wang, S., Konofagou, E. E. Enhanced delivery and bioactivity of the neurturin neurotrophic factor through focused ultrasound-mediated blood-brain barrier opening in vivo. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 35, 611-622 (2015).
- O'Reilly, M. A., Waspe, A. C., Chopra, R., Hynynen, K. MRI-guided disruption of the blood-brain barrier using transcranial focused ultrasound in a rat model. Journal of Visualized Experiments. (61), e3555 (2012).
- Thévenot, E., et al. Targeted delivery of self-complementary adeno-associated virus serotype 9 to the brain, using magnetic resonance imaging-guided focused ultrasound. Human gene Therapy. 23, 1144-1155 (2012).
- Hsu, P. -H., et al. Noninvasive and targeted gene delivery into the brain using microbubble-facilitated focused ultrasound. PloS One. 8, 58682 (2013).
- Wang, S., Olumolade, O. O., Sun, T., Samiotaki, G., Konofagou, E. E. Noninvasive, neuron-specific gene therapy can be facilitated by focused ultrasound and recombinant adeno-associated virus. Gene Therapy. 22, 104 (2015).
- Downs, M. E., et al. Long-Term Safety of Repeated Blood-Brain Barrier Opening via Focused Ultrasound with Microbubbles in Non-Human Primates Performing a Cognitive Task. PLoS One. 10, 0125911 (2015).
- Lipsman, N., et al. Blood-brain barrier opening in Alzheimer's disease using MR-guided focused ultrasound. Nature Communications. 9, 2336 (2018).
- Carpentier, A., et al. Clinical trial of blood-brain barrier disruption by pulsed ultrasound. Science Translational Medicine. 8, 343 (2016).
- Sternson, S. M., Roth, B. L. Chemogenetic Tools to Interrogate Brain Functions. Annual Reviews Neurosciences. 37, 387-407 (2014).
- Alexander, G. M., et al. Remote control of neuronal activity in transgenic mice expressing evolved G protein-coupled receptors. Neuron. 63, 27-39 (2009).
- Zhu, H., et al. Chemogenetic inactivation of ventral hippocampal glutamatergic neurons disrupts consolidation of contextual fear memory. Neuropsychopharmacology. 39, 1880-1892 (2014).
- Choi, J. J., Pernot, M., Small, S. A., Konofagou, E. E. Noninvasive, transcranial and localized opening of the blood-brain barrier using focused ultrasound in mice. Ultrasound in Medicine & Biology. 33, 95-104 (2007).
- Thévenot, E., et al. Targeted delivery of self-complementary adeno-associated virus serotype 9 to the brain, using magnetic resonance imaging-guided focused ultrasound. Human Gene Therapy. 23, 1144-1155 (2012).
- Hynynen, K., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F. A. Noninvasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits. Radiology. 220, 640-646 (2001).
- Yang, F. -Y., Fu, W. -M., Chen, W. -S., Yeh, W. -L., Lin, W. -L. Quantitative evaluation of the use of microbubbles with transcranial focused ultrasound on blood-brain-barrier disruption. Ultrasonics Sonochemistry. 15, 636-643 (2008).
- Vardy, E., et al. A New DREADD Facilitates the Multiplexed Chemogenetic Interrogation of Behavior. Neuron. 86, 936-946 (2015).
- Thompson, K. J., et al. DREADD Agonist 21 Is an Effective Agonist for Muscarinic-Based DREADDs in Vitro and in Vivo. ACS Pharmacology and Translational Sciences. 1, 61-72 (2018).
- Gomez, J. L., et al. Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine. Science. 357, 503-507 (2017).
- Nagai, Y., et al. Deschloroclozapine: a potent and selective chemogenetic actuator enables rapid neuronal and behavioral modulations in mice and monkeys. bioRxiv. , 854513 (2019).
- Thompson, K. J., et al. DREADD Agonist 21 Is an Effective Agonist for Muscarinic-Based DREADDs in Vitro and in Vivo. ACS Pharmacology and Translational Science. 1, 61-72 (2018).
- Bullitt, E. Expression of c-fos-like protein as a marker for neuronal activity following noxious stimulation in the rat. Journal of Comparative Neurology. 296, 517-530 (1990).
- Mahler, S. V., Aston-Jones, G. CNO Evil? Considerations for the use of DREADDs in behavioral neuroscience. Neuropsychopharmacology. 43, 934 (2018).
- Gruber, B., Froeling, M., Leiner, T., Klomp, D. W. J. RF coils: A practical guide for nonphysicists. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 48, 590-604 (2018).
- Treat, L. H., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Hynynen, K. Transcranial MRI-guided focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening in rats. IEEE. 2, 998-1000 (2004).
- Choi, J. J., Pernot, M., Small, S. A., Konofagou, E. E. Feasibility of transcranial, localized drug-delivery in the brain of Alzheimer's-model mice using focused ultrasound. IEEE. 2, 988-991 (2005).
- Cobbold, R. S. Foundations of Biomedical ultrasound. , Oxford university press. (2006).
- Younan, Y., et al. Influence of the pressure field distribution in transcranial ultrasonic neurostimulation. Medical Physics. 40, 082902 (2013).
- McDannold, N., Vykhodtseva, N., Hynynen, K. Targeted disruption of the blood-brain barrier with focused ultrasound: association with cavitation activity. Physics in Medicine and Biology. 51, 793-807 (2006).
- Branda, C. S., Dymecki, S. M. Talking about a Revolution: The Impact of Site-Specific Recombinases on Genetic Analyses in Mice. Developmental Cell. 6, 7-28 (2004).
- Jendryka, M., et al. Pharmacokinetic and pharmacodynamic actions of clozapine-N-oxide, clozapine, and compound 21 in DREADD-based chemogenetics in mice. Scientific Reports. 9, 4522 (2019).
- Manvich, D. F., et al. The DREADD agonist clozapine N-oxide (CNO) is reverse-metabolized to clozapine and produces clozapine-like interoceptive stimulus effects in rats and mice. Scientific Reports. 8, 3840 (2018).
- Martinez, V. K., et al. Off-Target Effects of Clozapine-N-Oxide on the Chemosensory Reflex Are Masked by High Stress Levels. Frontiers in Physiology. 10, 521 (2019).
- Gomez, J. L., et al. Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine. Science. 357, 503-507 (2017).
- Bonaventura, J., et al. High-potency ligands for DREADD imaging and activation in rodents and monkeys. Nature Communications. 10, 1-12 (2019).
- Roth, B. L.
- Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of Transduction Efficiency, Tropism and Axonal Transport of AAV Serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the Mouse Brain. PLoS One. 8, 76310 (2013).
