Summary
Denne protokol afgrænser trin, der er nødvendige for genlevering gennem fokuseret ultralyd blodhjernebarriere (BBB) åbning, evaluering af den resulterende genekspression og måling af neuromodulationsaktivitet af kemogenetiske receptorer gennem histologiske tests.
Abstract
Akustisk målrettet kemogenetik (ATAC) giver mulighed for ikke-invasiv kontrol af specifikke neurale kredsløb. ATAC opnår en sådan kontrol gennem en kombination af fokuseret ultralyd (FUS) induceret blod-hjerne barriereåbning (FUS-BBBO), genlevering med adeno-associerede virale (AAV) vektorer og aktivering af cellulær signalering med konstruerede, kemogene, proteinreceptorer og deres beslægtede ligander. Med ATAC er det muligt at transducere både store og små hjerneområder med millimeterpræcision ved hjælp af en enkelt ikke-invasiv ultralydsapplikation. Denne transduktion kan senere muliggøre en langsigtet, ikke-invasiv, enhedsfri neuromodulation i frit bevægelige dyr ved hjælp af et lægemiddel. Da FUS-BBBO, AAV'er og kemogenetik er blevet anvendt i flere dyr, bør ATAC også være skalerbar til brug i andre dyrearter. Dette papir udvider en tidligere offentliggjort protokol og skitserer, hvordan man optimerer genleveringen med FUS-BBBO til små hjerneområder med MR-vejledning, men uden behov for en kompliceret MR-kompatibel FUS-enhed. Protokollen beskriver også designet af musemålretnings- og fastholdelseskomponenter, der kan 3D-printes af ethvert laboratorium og let kan ændres til forskellige arter eller brugerdefineret udstyr. For at hjælpe reproducerbarheden beskriver protokollen detaljeret, hvordan mikrobobler, AAV'er og venipunktur blev brugt i ATAC-udvikling. Endelig vises et eksempel på data til vejledning i de indledende undersøgelser af undersøgelser ved hjælp af ATAC.
Introduction
Brug af kredsløbsspecifikke neuromodulationsteknologier, såsom optogenetik1,2 og kemogenetik 3,4,5, har fremmet vores forståelse af psykiatriske tilstande som neuronale kredsløbsforstyrrelser. Neuronale kredsløb er vanskelige at studere og endnu vanskeligere at kontrollere ved behandling af hjernesygdomme, fordi de typisk defineres af specifikke celletyper, hjerneområder, molekylære signalveje og timing af aktivering. Ideelt til både forskning og kliniske anvendelser ville en sådan kontrol udøves ikke-invasivt, men det er udfordrende at opnå både præcis og ikke-invasiv neuromodulation. For eksempel, mens neuroaktive lægemidler kan nå hjernen ikke-invasivt, mangler de rumlig specificitet ved at virke i hele hjernen. På den anden side kan elektrisk dyb hjernestimulering kontrollere specifikke hjerneområder, men har svært ved at kontrollere specifikke celletyper og kræver kirurgi og enhedsplacering6.
Akustisk målrettet kemogenetik7 (ATAC) giver neuromodulation med rumlig, celletype og tidsmæssig specificitet. Det kombinerer tre teknikker: fokuseret ultralydinduceret blod-hjerne-barriereåbning (FUS-BBBO) til rumlig målretning, anvendelse af adeno-associerede virale vektorer (AAV'er) til ikke-invasivt at levere gener under kontrol af celletypespecifikke promotorer og konstruerede kemogenetiske receptorer til selektivt at modulere transfekterede neurale kredsløb via lægemiddeladministration. FUS er en FDA-godkendt teknologi, der udnytter ultralydets evne til at fokusere dybt inde i væv, herunder den menneskelige hjerne, med millimeter rumlig præcision. Ved høj effekt anvendes FUS til ikke-invasiv målrettet ablation, herunder en FDA-godkendt behandling for essentiel tremor8. FUS-BBBO kombinerer ultralyd med lav intensitet med systemisk administrerede mikrobobler, som svinger i blodkar ved ultralydfokus, hvilket resulterer i lokaliseret, midlertidig (6-24 timer) og reversibel åbning af BBB9. Denne åbning muliggør levering af proteiner 9,10, små molekyler 11 og virale vektorer7,12,13,14 til hjernen uden væsentlig vævsskade hos gnavere 10 og ikke-menneskelige primater 15. Kliniske forsøg er i gang for FUS-BBBO16,17, hvilket indikerer mulige terapeutiske anvendelser af denne teknik.
Viral genlevering ved hjælp af AAV udvikler sig også hurtigt til klinisk brug for CNS-lidelser, med nylige FDA- og EU-regulatoriske godkendelser som vigtige milepæle. Endelig anvendes kemogenetiske receptorer18, såsom designerreceptorer, der udelukkende aktiveres af designerlægemidler (DREADD'er), i vid udstrækning af neuroforskere til at tilvejebringe farmakologisk kontrol over neuronal excitation hos transgene eller transfekterede dyr19,20. DREADD'er er G-proteinkoblede receptorer (GPCR'er), der er genetisk manipuleret til at reagere på syntetiske kemogenetiske molekyler snarere end endogene ligander, således at systemisk administration af disse ligander øger eller reducerer excitabiliteten af DREADD-ekspressive neuroner. Når disse tre teknologier kombineres i ATAC, kan de bruges til ikke-invasiv modulering af udvalgte neurale kredsløb med rumlig, celletype og tidsmæssig præcision.
Her udvider og opdaterer vi en tidligere offentliggjort protokol for FUS-BBBO11 ved at inkludere metoder til nøjagtig målretning af hjerneområder med FUS-BBBO i mus ved hjælp af simpelt 3D-printet målretningsudstyr. Vi viser også en anvendelse af FUS-BBBO til ATAC. Vi viser trin, der er nødvendige for levering af AAV'er, der bærer kemogenetiske receptorer, og evaluering af genekspression og neuromodulation ved histologi. Denne teknik er især anvendelig til at målrette mod store eller flere hjerneområder til genekspression eller neuromodulation. For eksempel kan et bredt område af en cortex let transduceres med FUS-BBBO og moduleres ved hjælp af kemogenetik. Genlevering med en alternativ teknik, intrakranielle injektioner, ville imidlertid kræve et stort antal invasive injektioner og kraniotomier. FUS-BBBO og dens anvendelse, ATAC, kan skaleres til dyr af forskellig størrelse, hvor hjerneområder er større og sværere at målrette invasivt.
Protocol
Alle eksperimenter blev udført under en protokol godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee of California Institute of Technology, hvor data oprindeligt blev opnået af J.O.S.
1. Design og 3D-print af dyresele og billedstyringshardware
- Brug filerne fra Szablowski-laboratoriets hjemmeside på: https://www.szablowskilab.org/downloads til 3D-print af komponenterne.
- Sørg for, at trykmaterialet har lav modtagelighed ved MR, men har en MR-synlig støtte. Se detaljerne om materialer, der anvendes i afsnittet materialer og reagenser.
- Redegør for materialenedbrydningen ved flere anvendelser ved at teste materialet gentagne gange og observere de slidsteder, der skal forstærkes. Sørg for, at de trykte vægge er mindst 2 mm tykke.
- Brug 3D-printere med høj præcision til at forbedre målretningspræcisionen.
- Imødegå tyngdekraften og andre kræfter for at undgå afvigelse af plast 3D-printede komponenter ved at understøtte komponenterne langs deres længde og øge tykkelsen af de 3D-printede vægge, hvis der observeres bøjning.
- Redegør for præcision i flere akser, herunder anterior/posterior, medial/lateral, dorsal/ventral samt gab, tonehøjde og hældning.
- Test nøjagtigheden af målretning ved at udføre FUS-BBBO og registrere afvigelsen fra målrettet position.
- Hvis du bruger motoriserede stereotaksiske systemer, skal du evaluere for virkningerne af dynamisk bevægelse på materialets elasticitet ved at optage FUS-BBBO-målretningsproceduren på video og korrigere eventuelle afvigelser ved at fortykke de 3D-printede materialevægge.
2. Beskrivelse af ultralydssystem
- Brug et ultralydssystem med en otte-element ringformet array-transducer (diameter = 25 mm, naturligt brændpunkt = 20 mm; blænde (F) = 0,8)) og par hus til hovedet med afgasset ultralydsgel ved at påføre gel på det barberede musehoved.
BEMÆRK: Centerfrekvensen for en transducer, der blev brugt i en tidligere undersøgelse7, var 1,5 MHz, pulsvarigheden var 10 ms, og pulsgentagelsesfrekvensen var 1 Hz over 120 s. Trykkene blev kalibreret ved hjælp af optisk fiberhydrofon og opretholdt mellem 0,36-0,45 MPa. Antag 18% akustisk dæmpning gennem kraniet21 for 1,5 MHz og parietalbenet. Rækken af betingelser, der er passende for en sikker BBB-åbning og AAV-levering, er beskrevet andetsteds i detaljer 7,14,22.
3. Tilberedning af dyr
- Bedøv en mus ved hjælp af isofluraninhalation ved 2% med luft af medicinsk kvalitet. Kontroller dybden af anæstesi ved en berøringsklemme for at bekræfte manglende respons. Påfør derefter oftalmisk salve for at forhindre hornhindetørring ved hjælp af en steril q-tip til engangsbrug for at forhindre krydskontaminering af salverøret.
BEMÆRK: Typisk procedure for FUS-BBBO kan variere mellem 30 minutter og 2 timer, og anæstesi skal opretholdes hele vejen igennem. - Når musen er bedøvet, vaskes et rent kateter med hepariniseret saltvand (10 E / ml).
BEMÆRK: Et passende kateter til en 25-35 g mus har en 30 G nål og PE10 slange. - Desinficer derefter musehalen med 70% ethanolpude. Placer halevenekateteret i en lateral halevene og fastgør det med en vævslim. Overhold en tilbagestrømning af blod fra halevenen ind i kateteret for at bekræfte dets placering.
- Barber musehovedet og brug derefter hårfjerningscreme, efter at vævslimen er tørret for at reducere muligheden for, at luftbobler fanges under ultralydgel under insonation.
- Placer musen i en 3D-printet MR-vogn, monter fortænderne på en bidestang og hovedet inde i en næsekegle (figur 1a).
- Injicer op til 10 μL lidokain subkutant på stedet, der kommer i kontakt med de afstumpede ørestænger. Fastgør derefter de afstumpede stænger til kraniet og påfør sikre mængder tryk, og pas på ikke at lægge pres på luftrøret, da det forhindrer vejrtrækning. Overhold vejrtrækningen i 30 s for at bekræfte, at dyret trækker vejret frit med en hastighed på 1/s.
- Tilslut målretningsvejledningen til ørebjælker, kontroller vejrtrækning som i trin 3.6 (figur 1b), og fortsæt med at overvåge vejrtrækningen visuelt under hele proceduren hvert minut. En vejrtrækning forhøjet over 1/s er en af indikationerne på tab af anæstesi. Fortsæt med at overvåge tåklemmeresponsen hvert 5. minut, når mus ikke er i MR-scanneren, eller hvis vejrtrækningshastigheden er forhøjet over 1/s.
- Overfør MR-vognen til en MR-holder og derefter inde i boringen af en magnet.
BEMÆRK: Hardwarens design er optimeret til en 72 mm spole inde i en 7T MR. - Anskaf en MR-sekvens for at lokalisere musen i scanneren.
- Vælg sekvensen 3D hurtig lavvinkeloptagelse (FLASH) for at få hele hjernen ved hjælp af følgende parametre i henhold til specifikke instruktioner fra instrumentproducenten. Ekkotid: 3,9 ms, Gentagelsestid: 15 ms, Excitationspulsvinkel: 15°, Matrixstørrelse: 130 x 130 x 114, Opløsning: 350 x 200 x 200 μm pr. voxel, Gennemsnit: 1, Anskaffelsestid: 3 min 42s
- Overfør filer fra MR-systemet til en computer, der styrer FUS-systemet.
- Åbn billedsekvensen i softwaren for at udføre MR-guidet målretning, hvor billedet skal vises som i figur 1c.
4. MR-styret målretning
BEMÆRK: Ved brug af specialdesignede målretningsguider er det ikke nødvendigt at placere ultralydstransducer inden for en MR, og det er heller ikke nødvendigt at skære huden for at udføre målretning ved at nulstille stereotax på bregma- og lambdalinjer. Følg nedenstående trin for at udføre målretningsprocessen.
- Anbring vognen i et stereotaksisk instrument. Fastgør den på plads ved hjælp af en metalblok med dobbeltklæbende tape og ved at trykke vognen mod to støtteposter på det stereotaksiske instrument.
- Overfør MR-billeder til en computer med en kørende FUS-vejledningssoftware ved at vælge filer i datahåndtering, højreklikke for at åbne menupunkter og vælge 'Overfør straks'.
- Åbn FUS-vejledningssoftwaren, og indlæs billedet ved at klikke på 'Åbn sekvens' og indlæse alle filer i billedsekvensen.
- Omformater billedet til tre akser ved at trykke på højreklik og 'Omformat'.
- Lokaliser transduceren til den cirkulære målretningsvejledning (figur 1c) ved at højreklikke.
- I sagittal visning skal du justere den lodrette position af en virtuel transducer for at tage højde for tykkelsen af vandbad og transducerhuset (i dette tilfælde - 8.2 mm opad, figur 1d).
- Peg på det eller de områder, der skal målrettes mod i baneplanlæggeren, og noter koordinaterne i et regneark (i dette tilfælde - mellemhjerne, som i figur 1d).
- Indtast den ønskede målretningsdybde (z-værdi i elektronisk bane (figur 2), og noter koordinater i et regneark.
- Målret mod hvert af punkterne ved at trykke på 'Send bane' og 'Udfør' (figur 2).
BEMÆRK: Dette gøres, når en museholder er placeret inde i motorerne. Imidlertid kan den samme målretning opnås med høj nøjagtighed på et stereotaksisk instrument. - For at korrelere koordinaterne for en MR med den stereotaksiske ramme skal du placere den specialmonterede transducer over en målretningsguide og oversætte, indtil hver af de tre målretningsbolte (figur 3, element A) kan gå gennem både transducerholderen (figur 3, element B) og målretningsguiden (figur 3, element C). Sørg for, at boltene ikke er under spænding eller vipper.
- Transduceren oversættes 10,56 mm fremad i anterior/posterior retning, indtil den er placeret på samme sted, hvor et center af en målretningsguide vises på en MR-scanning.
- Bestem afstanden fra et centrum af den virtuelle transducer (figur 3a, element A) til målområdet (figur 3a, element B), og flyt transduceren til disse koordinater ved hjælp af stereotaksisk ramme.
- Fortsæt til fremstilling af injektionsopløsning.
5. Forberedelse af injektionsopløsning
BEMÆRK: Microbubble-opløsningerne er meget følsomme over for tryk. Derfor kan kraftig blanding eller hurtig injektion gennem tynde nåle kollapse mikroboblerne og reducere effektiviteten af BBB-åbning. Derudover er mikrobobler lettere end vand og kan flyde til toppen af et rør, kateter eller sprøjte (figur 4), f.eks. i en automatisk injektor. Det anbefales kraftigt at resuspendere mikrobobleopløsningen umiddelbart før hver injektion.
- Træk 0,8 ml saltvand op ved hjælp af en sprøjte i 1,5 ml rør.
- Brug en sprøjte til at tilsætte 0,1 ml MR-kontrastmiddel i det samme 1,5 ml rør og blande.
- Bring den ikke-aktiverede mikroboble23,24-opløsning til stuetemperatur.
- Lige før insonationen skal du aktivere mikrobobler i 45 s i en mikrobobleaktiveringsenhed.
- Langsomt (over ~ 3 s) trækker 0,1 ml mikrobobler ved hjælp af en 1 ml tuberkulinsprøjte og 21 G nål fra den midterste dybde af en væske.
- Der tilsættes 0,08 ml mikrobobler i opløsningen af kontrastmiddel og saltvand fremstillet i trin 5.3. Bland ved at banke med hånden i 15 sekunder.
- Da den endelige koncentration af AAV'er er 0,5-2 x 1010 virale partikler pr. gram legemsvægt (VP / g), injiceres lasten til levering (i dette tilfælde AAV9) gennem 30 G nål i halevenekateteret i tilfælde af ATAC - AAV'er, der bærer kemogenetiske receptorer, eller en negativ kontrol, såsom AAV'er, der bærer GFP under samme promotor.
- Bland mikrobobler manuelt i 15 s igen for at undgå flydning (figur 4).
- Umiddelbart derefter suges 200 μL af mikrobobleopløsningen gennem en sprøjte uden en nål påsat. Mangel på en nål reducerer forskydningskræfterne på mikrobobler.
- Vend sprøjten på hovedet og bland ved at trykke stemplet op og ned.
- Sæt 30 G-nålen på, og skub langsomt mikroboblerne ud, mens den stadig er omvendt, indtil der vises dråber for enden af en nål.
6. Insonationsprocedure
- Indstil parametrene for insonation: 10 ms pulsvarighed, 120 gentagelser, hver s og 0,30-0,45 MPa tryk ved kraniet.
- Fjern målretningsguiden, og påfør afgasset ultralydgel på musehovedet, og sørg for ikke at danne bobler.
- Sænk transduceren, og placer den direkte på flad ørestangholder, og indtast koordinaterne i stereotaksiske instrumenter (figur 5).
- Injicer opløsningen af AAV (0,5-2 x 1010 VP/g).
- Bland mikrobobler og MR-kontrastmiddelopløsningen i 15 s og injicer i 80 μL pr. 30 g mus.
- Anvend straks ultralyd i 120 s ved at trykke på 'Send' og 'Udfør'.
- Hvis der målrettes mod mere end ét website, skal du flytte transduceren til det pågældende website og justere dybdemålretningen efter tal i regnearket fra trin 4.7-4.9. Gentag derefter trin 6.5-6.6 for hvert insoneret websted.
7. MR-evaluering af BBB-åbning
BEMÆRK: MR-evalueringen af BBB-åbningen er beskrevet detaljeret andetsteds11. Placeringen af BBB-åbning kan visualiseres som lysere områder hos mus, der modtog en injektion af et T1-vægtet Gd-kontrastmiddel.
- Efter ultralydsapplikationen registreres en MR-sekvens som i trin 3.10.
- Fjern musen fra MR-scanneren, og placer den i et genopretningsbur for at muliggøre genopretning fra anæstesi. Overvåg musene dagligt for tegn på nød, vægttab eller andre humane endepunkter. Kontakt veterinærpersonalet og de institutionelle IACUC-retningslinjer for at fortsætte med enhver behandling, hvis uventede bivirkninger opstår.
8. DREADD-stimulering med en kemogenetisk ligand
- Vælg en kemogenetisk receptor. For DREADD'er skal du vælge hM3Dq-receptoren til neuronal aktivering via Gq-koblede veje19, hM4Di-receptoren til hæmning af neuronal aktivitet gennem Gi/o-koblede veje20 eller KORD-receptoren til aktivering af neuroner via Gs-koblede veje ved hjælp af Salvinorin-B-ligand25.
- Clozapin-n-oxid (CNO) opløses i sterilt saltvand i en koncentration på 1 mg/ml. Det aliquoterede CNO opbevares ved -20 °C.
- Administrer CNO 19 eller en anden kemogenetisk ligand26,27,28 gennem intraperitoneal vej i koncentrationer mellem 0,3 –10 mg/kg.
- Hvis virkningerne af CNO på adfærd skal registreres, skal du begynde at registrere adfærdsaktiviteten inden for 15-45 minutter efter lægemiddeladministrationen for at opnå den maksimale aktivering af DREADD'er19.
- Hvis analyse af neuronal aktivering ønskes, skal du bruge mus til histologisk evaluering efter 60-120 min efter injektion.
- Fortsæt til eutanasi gennem hjerteperfusion (se punkt 9).
9. Histologisk vurdering af genekspression og kemogenetisk aktivering
BEMÆRK: Når det eksperimentelle endepunkt (f.eks. Afslutning af adfærdsundersøgelse, tid, der kræves til genekspression) er opnået, er det afgørende at bekræfte placeringen og tilstedeværelsen af genekspressionen.
- Efter aktivering med en kemogenetisk ligand udføres hjerteperfusion for at bevare væv.
- Bedøv musen med Ketamin (100 mg / kg) / Xylazin (10 mg / kg) blanding i sterilt saltvand gennem en IP-injektion. Bekræft bedøvelsen med en tåklemme og sørg for, at vejrtrækningshastigheden er sænket til ca. 1 / s. Giv termisk støtte gennem varmepuden indtil bekræftelsen af eutanasi.
- Forbered 10% neutral bufret formalin (NBF) og PBS med 10 enheder heparin pr. ml.
BEMÆRK: Opløsningerne skal være ved 4 °C. - Hæld hver buffer i separate 50 ml rør og tilslut, og prim en peristaltisk pumpe forbundet til et 25 G sommerfuglekateter med PBS/heparinopløsning.
- Fastgør lemmerne til en absorberende blå pude med tape og sørg for, at dyret placeres i liggende stilling på puden. Desinficere pelsen for at undgå krydskontaminering af perifere organer, hvis de skal opsamles.
- Åbn peritonealhulen ved et tværgående snit, der udsætter membranen.
- Åbn brystkassen gennem to snit af kirurgisk saks langs den forreste / bageste akse.
- Hjertet blottes, og nålen anbringes i et venstre kammer (højre side af hjertet, set fra liggende side), og i sommerfuglekateteret anbringes i trin 9.1.3.
- Lav et lille snit i højre ventrikel for at tillade blodudstrømning.
- Tænd for den peristaltiske pumpe for at begynde at skylle blodet ud med PBS / heparin.
BEMÆRK: Hvis dette trin ikke udføres tilstrækkeligt, vil blodet størkne under fiksering med formalin og forhindre passende perfusion. - Når alt blod er skyllet ud, og klar PBS begynder at komme ud af højre ventrikel, skal du skifte indgangen til en peristaltisk pumpe til en NBF-opløsning og begynde perfusion for 25 ml pr. Mus.
- Udtræk hjernen, placer i mindst 4 ml NBF og efterfiks i 24 timer.
- Sektion hjernen ved hjælp af koronale sektioner på et vibratomt ved hjælp af 50 μm sektionstykkelse.
- Placer hver sektion i en brønd på en 24 brøndplade, der opbevarer sektionerne i hele hjernen.
- Evaluer ekspressionen af de kemogenetiske receptorer fusioneret med fluorescerende proteiner (f.eks. mCherry eller mCitrin) under et fluorescerende mikroskop for at identificere de sektioner, der viser ekspression for at bekræfte placeringen. Udtrykket er sandsynligvis svagt.
- Udfør immunfarvning mod fluoroforen ved hjælp af følgende protokol:
- Anbring 3 sektioner i 0,5 ml opløsning indeholdende 10% serum af en vært af et sekundært antistof og inkuber i 30 min.
- Overfør sektionerne til en opløsning af et primært antistof ved 1:250 – 1:1.000 fortynding med 1:500 som udgangspunkt.
- Sektionerne med primært antistof inkuberes natten over ved 4 °C i en mikroplade forseglet med en paraffinfilm.
- Vask sektionerne med PBS, 3x i 5 min ad gangen.
- Tilsæt 0,5 ml pr. hul af den sekundære antistofopløsning i 10% serum.
- Inkuber i 4 timer ved stuetemperatur.
- Vask sektionerne med PBS, 3x i 5 min ad gangen.
- Monter på glidere med et vandigt monteringsmedium, der indeholder en nuklear plet (f.eks. DAPI).
- Evaluer lokaliseringen og spredningen ved hjælp af et konfokalmikroskop ved at udføre en flisescanning af en hel sektion.
- Evaluer intensiteten af ekspression ved at måle fluorescens pixelintensitet i målrettede hjerneområder og sammenlign med en intrakranielt injiceret kontrol.
- Alternativt kan du evaluere procent af positive neuroner ved at tælle celler farvet mod kemogenetiske receptorer sammenlignet med DAPI-positive celler eller cellespecifikke markører.
- Evaluer vævsskaden ved at udføre hæmatoxylinfarvning på 50 μm sektion og billeddannelse for tab af celler, ophobning af celleaffald og andre tegn på grov skade.
- For at evaluere specificiteten af cellemålretning skal du udføre dobbelt immunfarvning som beskrevet nedenfor for den kemogenetiske receptor og en cellespecifik markør. Udfør derefter cellepositive tællinger som i trin 9.8.
- Anbring 3 sektioner i 0,5 ml af en opløsning indeholdende 10% serum af en vært af et sekundært antistof og inkuber i 30 min.
- Overfør sektionerne til en opløsning af et primært antistof mod en fluorescerende markør for en kemogenetisk receptor ved 1:250 – 1:1.000 fortynding med 1:500 som udgangspunkt. Tilføj et andet primært antistof fra en anden værtsart, der er målrettet mod en cellespecifik markør af interesse (f.eks. CamkIIa).
- Sektionerne med primært antistof inkuberes natten over ved 4 °C i en mikroplade forseglet med paraffinfilm.
- Vask sektionerne med PBS, 3x i 5 min ad gangen.
- Der tilsættes 0,5 ml sekundær antistofopløsning pr. hul i 10% serum af værtsarterne af begge sekundære antistoffer.
BEMÆRK: Hvert antistof skal have en særskilt fluorofor og skal være reaktivt mod primære antistoffer i trin 9.10.2. - Inkuber i 4 timer ved stuetemperatur.
- Vask sektionerne med PBS, 3x i 5 min ad gangen.
- Monter på dias og fastgør med et vandigt monteringsmedium indeholdende en nuklear plet.
10. Evaluer neuronal aktivering med immunfarvning til c-Fos
- Udfør c-Fos-farvning som i punkt 9.5 i denne protokol ved hjælp af et primært c-Fos-antistof og et sekundært antistof med et fluorescerende mærke, der adskiller sig fra kernepletten.
- Tæl procentdelen af celler, der er positive for både c-Fos og nuklear plet i det område, der er målrettet mod en kemogenetisk receptor.
- Analyser procentdelen af c-Fos-positive kerner i gruppe af mus, der udtrykker kemogenetiske receptorer og behandles med en kemogenetisk ligand eller køretøjskontrol og i gruppe af vildtypemus, der behandles med en kemogenetisk ligand eller køretøjskontrol.
Representative Results
Det første trin i udførelsen af ATAC-protokollen er målretning af FUS-BBBO til de ønskede hjerneområder. For eksempel blev hippocampus målrettet med FUS-BBBO efter den beskrevne protokol, og kontrastmiddel og AAV9-bærende DREADD'er blev injiceret i musene efterfulgt af en FLASH 3D MR-sekvens, der erhverver billeder af musehjernen. En T1-signalforbedring blev opnået i hippocampusområdet (figur 6) og i andre dele af hjernen (figur 7). Efter flere uger blev DREADD'er udtrykt inde i målhjerneområdet. Mens mange DREADD'er er smeltet sammen med en fluorescerende reporter (f.eks. mCherry), viste processen med perfusion og fiksering med formaldehyd sig drastisk at reducere fluorescensen af disse proteiner. Immunfarvning mod mCherry eller DREADD førte til mere pålidelig påvisning af ekspressionen (figur 8) baseret på tidligere erfaringer. I tidligere eksperimenter viste ~ 85% af musene udtryk efter FUS-BBBO7. En simpel test for tilstrækkelige niveauer af udtryk for DREADD'er tester deres funktionalitet på celleniveau. Gøres ved at tilvejebringe en kemogenetisk ligand eller en saltvandskontrol, såsom CNO 19, deschlorclozapin28 eller andre29, og vente 2 timer før en hjerteperfusion og fiksering. Hjernesektionerne blev derefter co-immunfarvet for c-Fos-protein30, hvilket indikerer øget aktivitet af neuroner, og for DREADD. Eksperimentet blev betragtet som vellykket, hvis hjernens sted målrettet mod DREADD'er viste signifikant højere antal neuronale kerner, der er c-Fos-positive i gruppen, der modtog en kemogenetisk ligand sammenlignet med gruppen, der modtog saltvand7 eller sammenlignet med et kontralateralt sted, der ikke blev udsat for FUS-BBBO. Bemærk, at der er et potentiale for nogle af disse ligander til at aktivere neuroner ikke-specifikt uden udtryk for DREADD'er. For eksempel har CNO vist sig at blive metaboliseret til lave niveauer af clozapin hos mus, som krydser BBB og aktiverer DREADD'er med høj styrke27. Det viste sig dog også at binde sig til ikke-specifikke steder. Som i ethvert eksperiment er det afgørende at inkludere alle ordentlige kontroller i kemogenetiske undersøgelser31. En mulig kontrol er administration af den kemogenetiske ligand til vildtypemus uden procedurer for at udelukke virkningerne af lægemidlet alene på det ønskede adfærdsmæssige eller histologiske assay. En anden kontrol kunne være inklusion af fire grupper: DREADD + ligand, DREADD + køretøj, EGFP + ligand, EGFP + køretøj, som vil redegøre for eventuelle potentielle virkninger af både genlevering med FUS-BBBO og den kemogenetiske ligand.
Figur 1: Processen med MR-vejledt målretning af FUS i ATAC. a) Placering af mus med ørestænger, næsekegle og platform, der kan være inde i en MR-scanner. (b) En 3D-printet vejledning (blå), der er synlig i MR, blev fastgjort til enderne af ørestangsrammen og derefter fastgjort på plads med en holder af en overflade MR-spole, der indeholder fire snap-on bolte (halvgennemsigtig blå). (c) Udseende af den 3D-printede guide i sagittal MR (venstre panel) med en bund af den virtuelle repræsentation af en transducer justeret (gul halvcirkel) med bunden af guiden. Højre panel viser udseendet af den 3D-printede vejledning om MR fra koronal visning. Den lyse cirkel var lavet af et polyjetstøttemateriale, der har en stærk MR-kontrast. Korset blev dannet med plastik. En gul cirkel repræsenterer transducerens placering, som var justeret koncentrisk med styret inde i en stereotaksisk ramme. (d) For at målrette hjernestrukturer blev en virtuel transducer flyttet i z-retning over musene for at matche tykkelsen af en ultralydskegle / hus. I dette tilfælde blev transduceren flyttet 8,2 mm over styret for nøjagtig målretning på grund af vandbadets tykkelse. Hjernestrukturer blev valgt ved hjælp af MR-billeddata, og deres MR-koordinater blev derefter skrevet ned og indtastet i stereotaxic-maskinen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Grænseflade af den anvendte software. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Proces til matchning af MR-koordinatrum til stereotaksisk instrument. (a) Tre huller i en transducerholder blev justeret med tre huller i MR-styret, og tre koniske målretningsbolte blev indsat uden at forårsage flex til hele samlingen. (b) Ideelt set ville alle tre bolte sidde midt i hullerne. (c) Hvis der er nogen unøjagtighed i justeringen, ville ikke alle tre bolte passe ind, f.eks. i tilfælde af små, sandsynligvis umærkelige krøjer på 1°, ville kun en bolt passe ind, mens de modsatte bolte ville sidde fast ved MR-styret. Alternativt kunne der være synlig flex af hele samlingen, da bolte blev tvunget igennem. d) Forstørret billede af boltmontering. Boltene skal placeres koncentrisk for den bedste nøjagtighed. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Hurtig omfordeling af mikrobobler inde i sprøjten. (a) Sprøjten blev fotograferet 5 s efter blanding. (b) Et minut senere var der et tydeligt synligt lag, der viste noget af boblekoncentratet nær toppen af 1 ml tuberkulinsprøjte. Dette eksempel anvendte især en opløsning af mikrobobler. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Proces med at placere midten af en transducer over et center af en MR-guide. (a) I de modeller, der er vist i dette papir, er den røde bærer konstrueret til at bevæge sig 10,56 mm fremad fra den position, der er vist i figur 3b, til den position, der er vist her. (b) Den blå MR-guide blev fjernet før sonikering, og en ultralydgel blev påført mellem musen og transduceren (orange) for at sikre ultralydpassage. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: MR-visualisering af BBB-åbningen. a) Aksial visning af BBB-åbningen. Lysere område udpeget med en pilespids viser ekstravasation af et MR T1 kontrastmiddel. b) Koronalt billede af dorsal hippocampus og cortex over hippocampus målrettet med FUS-BBBO (pilespidser). c) Koronalt billede af den centrale hippocampus målrettet med FUS-BBBO (pilespidser). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Eksempel på målretning af 4 hjernesteder ved hjælp af tre-bolt målretningssystemet beskrevet i denne artikel. Områder med pilespidser viste, at BBB åbnede steder med diffusion af et MR-kontrastmiddel. De fire steder blev målrettet efter hinanden med ~ 150 s mellem hver BBB-åbning, fra bunden til toppen. Billedet blev taget inden for 2 minutter efter den sidste BBB-åbning. Vægtbjælken er 2 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: Registrering af DREADD-udtryk. (a) Immunfarvning for fluoroforen fastgjort til DREADD'er, i dette tilfælde var mCherry en pålidelig metode til påvisning i nogle undersøgelser. b) I et andet repræsentativt afsnit med DREADD'er rettet mod hippocampus under de samme betingelser som i (a) producerede fluorescensen af mCherry i sig selv stærk baggrund og relativt svagt signal. c) Som negativ kontrol blev der anvendt en mus, der fik systemisk injektion af AAV, men ikke fik FUS-BBBO. Intet signifikant udtryk kan findes ved mCherry immunfarvning. Skalabjælker er 500 mm. (Data i a, c tilpasset fra7 med tilladelser, Copyright 2020 Nature-Springer). Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
ATAC kræver en vellykket implementering af flere teknikker til vellykket neuromodulation af specifikke neurale kredsløb, herunder nøjagtig MR-guidet målretning, FUS-BBBO og histologisk evaluering af genekspression. 3D-printbare komponenter blev udviklet for at forenkle målretning af små hjernestrukturer med billeddannelsesstyret FUS-BBBO.
MR-guidet fokuseret ultralyd (MRIgFUS) administration udgør en række udfordringer. For det første har typisk MR-spole begrænset plads, der er designet til kun at rumme en prøve og ikke ultralydhardwaren. De større boringer af MR'er øger omkostningerne ved udstyr og reducerer billedkvaliteten, da signalet er relateret til fyldningsfaktoren for en spole32. Derfor vil enhver FUS-hardware, der placeres oven på et dyrebillede i MR, kompromittere billedkvaliteten. For det andet er det vanskeligt og dyrt at designe MR-kompatible enheder. MR-kompatible materialer skal være diamagnetiske, have lav tilbøjelighed til at skabe hvirvelstrømme under radiofrekvensbestråling og have lav magnetisk modtagelighed i høje magnetfelter. I ethvert ledende materiale vil skabelsen af hvirvelstrømme eller dets magnetiske modtagelighed også påvirke billedkvaliteten negativt. Endelig har de tilgængelige MR-kompatible materialer lavere Youngs moduli og holdbarhed end de metaller, der typisk anvendes til fremstilling af præcise målretningsmaskiner, f.eks. stereotaksiske rammer. Motorerne, der bruges til positionsjusteringer, skal være MR-kompatible og placeres uden for MR-boringen på grund af deres størrelse. Disse motorer skal tilsluttes i en afstand til transduceren inde i en MR-boring ved hjælp af MR-kompatible materialer. Problemer med plastisk vridning, mangel på tilstrækkelig plads inde i boringen til at implementere komponenter i robust størrelse og utilstrækkelig plads til at ændre målretningspositioner på tværs af hele hjernen har påvirket målretningsnøjagtigheden i tidligere arbejde.
For at løse disse problemer blev det besluttet at udføre billeddannelse i MR- og FUS-BBBO-administration uden for scanneren. For at muliggøre MR-vejledning blev mus placeret inde i en 3D-printet fastholdelse, der havde en MR-synlig målretningsguide, der kunne bruges til at lokalisere musehjernestrukturerne både i MR og i stereotax-koordinatrummet. Da både musekraniet og målretningsguiden er fastgjort til ørestangholdere (figur 1a,b), kan en målretningsguide bruges til at korrelere rumlige koordinater inden for MR-billedet og nulstille de stereotaksiske instrumenter. Fastholdelsen har ikke bevægelige dele og indeholder ikke en transducer, hvilket gjorde det muligt for os at gøre den både robust og tilstrækkelig lille til at passe ind i en MR og fjernede signalinterferens fra transducerens elektronik. Pladsen inde i målretningsguiden er blevet udhulet, da den 3D-printede understøttelse af nogle materialer er synlig i MR (figur 1c). Huller i samlingen blev indført for at muliggøre stereotaxkalibrering (figur 3). Ultralydstransduceren blev fastgjort til en elektrodeholder af en stereotax, og målretning blev udført som beskrevet i afsnit 4 (figur 1d). Transduceren skal understøttes langs dens længde af ørestænger, hvilket forhindrer enhver afvigelse fra planplanet. Målretningen i dorso-ventral retning kan opnås ved hjælp af faseforskydninger i et ringformet array.
Den praktiske målretningspræcision bestemmes af ultralydsfokusering og kraniedæmpning. FUS-BBBO-proceduren er detaljeret beskrevet for rotter 11 og er implementeret i en række andre modelorganismer23,33,34 og hos mennesker 16,17. Forholdet mellem ultralydsfokusstørrelse omvendt proportional med frekvens, hvor højere frekvenser kan resultere i mere præcis levering. Imidlertid øges dæmpningen af kraniet med frekvenser35, hvilket kan føre til kranieopvarmning og beskadigelse af de kortikale områder. Den nøjagtige målretningsstrategi afhænger af hjernens websted. De steder, hvor et halvt maksimalt tryk i fuld bredde passer ind i hjernevævet, giver mulighed for forudsigelig og sikker BBB-åbning i mange hjernestrukturer såsom striatum, mellemhjerne og hippocampus. Regioner nær bunden af hjernen udgør en særlig udfordring hos mus. Musens hjerne måler ca. 8-10 mm i dorso-ventral retning, hvilket kan sammenlignes med den fulde bredde halv maksimale størrelse af mange kommercielt tilgængelige transducere. Derfor kan målretning i bunden af kraniet føre til ultralydsrefleksion fra knogler og luft, der er til stede i øregangene, munden eller luftrøret, hvilket kan føre til uforudsigelige mønstre af høje og lave tryk36. Nogle af disse tryk kan krydse en inertial kavitationstærskel, som har vist sig at forårsage blødning og vævsskade37. For at målrette regioner, der er placeret nær bunden af kraniet, kan det være at foretrække at bruge intersektionel ATAC7, hvor intersektionel genetik38 bruges til at begrænse genekspression til et mindre område end det, der er målrettet med FUS-stråle. I det offentliggjorte eksempel på intersektionel ATAC er et transgent dyr, der udtrykker et genredigeringsenzym (Cre38) i dopaminerge celler, blevet målrettet med ultralyd i underafsnittet af regionen, der indeholder dopaminerge celler. Endelig kan de kortikale regioner målrettes med FUS, men diffraktion og refleksion af ultralyd kan forekomme, hvilket fører til ujævne trykprofiler. Denne protokol dækker ikke målretning mod kortikale regioner, da den vil være stærkt afhængig af de anvendte arter. Imidlertid er der observeret en vis målretning af cortex over hippocampus 7 (f.eks. Figur 7), hvilket indikerer, at det i det mindste hos mus er muligt.
Valget af en kemogenetisk aktivator og dosering afhænger af de specifikke eksperimentelle behov. En række undersøgelser, herunder en af forfatternes undersøgelser7, viste ingen signifikant ikke-specifik respons39,40, mens højere doser (f.eks. 10 mg / kg) kan give bivirkninger, i det mindste i nogle tilfælde41. Men som med alle adfærdseksperimenter er korrekt kontrol31 afgørende på grund af potentiel off-målrettet aktivitet af CNO og dets metabolitter42. Sådanne kontroller kan omfatte administration af CNO og saltvandskontrol til dyr, der udtrykker DREADD'er, og administration af CNO til vildtypedyr eller i nogle specifikke tilfælde en sammenligning af ipsi- og kontralaterale steder i hjernen, der henholdsvis udtrykker kemogenetiske receptorer og ikke udtrykker deme. Derudover afslørede nyere forskning en række nye DREADD-agonister med forbedret specificitet28,29,43. Andre kemogenetiske receptorer 5,25,44 kan også anvendes sammen med ATAC-proceduren.
Histologisk vurdering af genekspression er nødvendig post mortem for hvert dyr. En lille brøkdel af dyrene viser dårlig genekspression efter FUS-BBBO7. Derudover er det nødvendigt at vise den rumlige nøjagtighed og specificitet af genekspression, da fejlmålretning er mulig. Bemærk, at nogle AAV'er kan vise retrograd eller anterograd sporingsevne45 og kan forårsage transfektion langt fra det sted, der er målrettet mod ultralyd på trods af nøjagtig ultralydmålretning. Hvis den udtrykte kemogenetiske receptor er smeltet sammen med eller co-udtrykker en fluorofor, kan billeddannelse af fluoroforen i vævssektioner være tilstrækkelig til at evaluere lokalisering og ekspressionsintensitet. Imidlertid er mange fluorescerende proteiner beskadiget af vævsfikseringsprocessen, og immunfarvning for mCherry-protein, der ofte bruges med DREADD'er, gav bedre signal i tidligere undersøgelser7. Endelig kan det på grund af tætheden af neuroner i visse dele af hjernen (f.eks. granulært cellelag i hippocampus) være gavnligt at anvende nuclear-lokaliserede fluoroforer udtrykt under IRES, i modsætning til fusioner, til at udføre celletællinger, da kerner let kan segmenteres og modfarves med nukleare pletter, såsom DAPI eller TO-PRO-3. At evaluere neuromodulation ved c-Fos-farvning, udføre nuklear modfarvning og tælle c-Fos-positive kerner snarere end noget fluorescenssignal er bydende nødvendigt. I nogle tilfælde kan cellulært affald vise fluorescens og forvirre målingerne af positive celler.
Begrænsninger af lægemiddel- og genafgivelse med FUS-BBBO inkluderer lavere opløsning end levering med invasive intrakranielle injektioner og behovet for større mængder injicerede lægemidler eller virale vektorer. Derudover, mens en direkte injektion i hjernen resulterer i eksklusiv levering til et injiceret sted, bruger FUS-BBBO en intravenøs vej, hvilket resulterer i mulig levering til perifert væv. Begrænsninger ved brug af kemogenetik til neuromodulation omfatter en langsom tidsplan, som kan være utilstrækkelig til nogle adfærdsmæssige protokoller, der kræver hurtige ændringer i intensiteten af neuromodulation.
Disclosures
Ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af Brain and Behavior Foundation, NARSAD Young Investigator Award. Flere 3D-printede komponenter blev oprindeligt designet af Fabien Rabusseau (Image Guided Therapy, Frankrig). Forfatteren takker John Heath (Caltech) og Margaret Swift (Caltech) for teknisk hjælp med at forberede manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 21-gauge needles (BD) | Fisher Scientific | 14826C | |
| 25-gauge butterfly catheter | Harvard Bioscience | 725966 | |
| 30-gauge needles (BD) | Fisher Scientific | 14826F | |
| Absorbent blue pad | Office Depot | 902406 | |
| Anti-c-Fos antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-253-G | |
| Anti-mCherry antibody | Thermofisher | PA534974 | |
| Bruker Biospec 70/30 | Bruker | custom | includes the RF coils |
| Clozapine-n-oxide | Tocris | 4936 | |
| Custom designed 3D printed mouse harnesses and MRIgFUS targeting components | ImageGuidedTherapy, Szablowski lab | custom | download from szablowskilab.org/downloads |
| Custom MRIgFUS machine | ImageGuidedTherapy | N/A | |
| Definity microbubbles | Lantheus | DE4 | |
| Degassed aquasonic/ultrasound gel | Fisher Scientific | 5067714 | |
| Depilation crème | Nair | n/a | |
| Eight-element annular array transducer | Imasonic Inc. | custom | |
| Ethanol Pads/Alcohol Swabs (70%) (BD) | Office Depot | 599893 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149-25KU | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Ketamine | Patterson Veterinary | 07-890-8598 | |
| Neutral buffered formalin (10%) | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | |
| Optical fiber hydrophone | Precision Acoustics | ||
| PE10 tubing | Fisher Scientific | NC1513314 | |
| Peristaltic pump | |||
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 524650-1EA | |
| Prohance contrast agent | Bracco | 0270-1111-04 | |
| Saline | Fisher Scientific | NC9054335 | |
| Secondary antibody, Donkey-anti goat | ThermoFisher | A-11055 | |
| Secondary antibody, Donkey-anti rabbit | ThermoFisher | 84546 | |
| Surgical scissors (straight) | Fisher Scientific | 17467480 | |
| ThermoGuide Software | ImageGuidedTherapy | ||
| Tissue glue (Gluture) | Fisher Scientific | NC9855218 | |
| Tuberculin Syringe (1 mL) (BD) | Fisher Scientific | 14823434 | |
| VeroClear 3D printable material | Stratasys | RGD810 | |
| Vialmix microbubble activation device | Lantheus | VMIX | |
| Vibrating microtome | Compresstome | VF-300 | |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | X1251-1G |
References
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
- Zhang, F., Wang, L. -P., Boyden, E. S., Deisseroth, K. Channelrhodopsin-2 and optical control of excitable cells. Nature Methods. 3, 785-792 (2006).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 5163-5168 (2007).
- Lerchner, W., et al. Reversible silencing of neuronal excitability in behaving mice by a genetically targeted, ivermectin-gated Cl- channel. Neuron. 54, 35-49 (2007).
- Magnus, C. J., et al. Chemical and genetic engineering of selective ion channel-ligand interactions. Science. 333, 1292-1296 (2011).
- Deeb, W., et al. Proceedings of the fourth annual deep brain stimulation think tank: a review of emerging issues and technologies. Frontiers in Integrative Neuroscience. 10, 38 (2016).
- Szablowski, J. O., Lee-Gosselin, A., Lue, B., Malounda, D., Shapiro, M. G. Acoustically targeted chemogenetics for the non-invasive control of neural circuits. Nature Biomedical Engineering. 2, 475-484 (2018).
- Elias, W. J., et al. A pilot study of focused ultrasound thalamotomy for essential tremor. New England Journal of Medicine. 369, 640-648 (2013).
- Burgess, A., Hynynen, K. Noninvasive and targeted drug delivery to the brain using focused ultrasound. ACS Chemical Neuroscience. 4, 519-526 (2013).
- Kinoshita, M., McDannold, N., Jolesz, F. A., Hynynen, K. Noninvasive localized delivery of Herceptin to the mouse brain by MRI-guided focused ultrasound-induced blood-brain barrier disruption. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 103, 11719-11723 (2006).
- Samiotaki, G., Acosta, C., Wang, S., Konofagou, E. E. Enhanced delivery and bioactivity of the neurturin neurotrophic factor through focused ultrasound-mediated blood-brain barrier opening in vivo. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 35, 611-622 (2015).
- O'Reilly, M. A., Waspe, A. C., Chopra, R., Hynynen, K. MRI-guided disruption of the blood-brain barrier using transcranial focused ultrasound in a rat model. Journal of Visualized Experiments. (61), e3555 (2012).
- Thévenot, E., et al. Targeted delivery of self-complementary adeno-associated virus serotype 9 to the brain, using magnetic resonance imaging-guided focused ultrasound. Human gene Therapy. 23, 1144-1155 (2012).
- Hsu, P. -H., et al. Noninvasive and targeted gene delivery into the brain using microbubble-facilitated focused ultrasound. PloS One. 8, 58682 (2013).
- Wang, S., Olumolade, O. O., Sun, T., Samiotaki, G., Konofagou, E. E. Noninvasive, neuron-specific gene therapy can be facilitated by focused ultrasound and recombinant adeno-associated virus. Gene Therapy. 22, 104 (2015).
- Downs, M. E., et al. Long-Term Safety of Repeated Blood-Brain Barrier Opening via Focused Ultrasound with Microbubbles in Non-Human Primates Performing a Cognitive Task. PLoS One. 10, 0125911 (2015).
- Lipsman, N., et al. Blood-brain barrier opening in Alzheimer's disease using MR-guided focused ultrasound. Nature Communications. 9, 2336 (2018).
- Carpentier, A., et al. Clinical trial of blood-brain barrier disruption by pulsed ultrasound. Science Translational Medicine. 8, 343 (2016).
- Sternson, S. M., Roth, B. L. Chemogenetic Tools to Interrogate Brain Functions. Annual Reviews Neurosciences. 37, 387-407 (2014).
- Alexander, G. M., et al. Remote control of neuronal activity in transgenic mice expressing evolved G protein-coupled receptors. Neuron. 63, 27-39 (2009).
- Zhu, H., et al. Chemogenetic inactivation of ventral hippocampal glutamatergic neurons disrupts consolidation of contextual fear memory. Neuropsychopharmacology. 39, 1880-1892 (2014).
- Choi, J. J., Pernot, M., Small, S. A., Konofagou, E. E. Noninvasive, transcranial and localized opening of the blood-brain barrier using focused ultrasound in mice. Ultrasound in Medicine & Biology. 33, 95-104 (2007).
- Thévenot, E., et al. Targeted delivery of self-complementary adeno-associated virus serotype 9 to the brain, using magnetic resonance imaging-guided focused ultrasound. Human Gene Therapy. 23, 1144-1155 (2012).
- Hynynen, K., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F. A. Noninvasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits. Radiology. 220, 640-646 (2001).
- Yang, F. -Y., Fu, W. -M., Chen, W. -S., Yeh, W. -L., Lin, W. -L. Quantitative evaluation of the use of microbubbles with transcranial focused ultrasound on blood-brain-barrier disruption. Ultrasonics Sonochemistry. 15, 636-643 (2008).
- Vardy, E., et al. A New DREADD Facilitates the Multiplexed Chemogenetic Interrogation of Behavior. Neuron. 86, 936-946 (2015).
- Thompson, K. J., et al. DREADD Agonist 21 Is an Effective Agonist for Muscarinic-Based DREADDs in Vitro and in Vivo. ACS Pharmacology and Translational Sciences. 1, 61-72 (2018).
- Gomez, J. L., et al. Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine. Science. 357, 503-507 (2017).
- Nagai, Y., et al. Deschloroclozapine: a potent and selective chemogenetic actuator enables rapid neuronal and behavioral modulations in mice and monkeys. bioRxiv. , 854513 (2019).
- Thompson, K. J., et al. DREADD Agonist 21 Is an Effective Agonist for Muscarinic-Based DREADDs in Vitro and in Vivo. ACS Pharmacology and Translational Science. 1, 61-72 (2018).
- Bullitt, E. Expression of c-fos-like protein as a marker for neuronal activity following noxious stimulation in the rat. Journal of Comparative Neurology. 296, 517-530 (1990).
- Mahler, S. V., Aston-Jones, G. CNO Evil? Considerations for the use of DREADDs in behavioral neuroscience. Neuropsychopharmacology. 43, 934 (2018).
- Gruber, B., Froeling, M., Leiner, T., Klomp, D. W. J. RF coils: A practical guide for nonphysicists. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 48, 590-604 (2018).
- Treat, L. H., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Hynynen, K. Transcranial MRI-guided focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening in rats. IEEE. 2, 998-1000 (2004).
- Choi, J. J., Pernot, M., Small, S. A., Konofagou, E. E. Feasibility of transcranial, localized drug-delivery in the brain of Alzheimer's-model mice using focused ultrasound. IEEE. 2, 988-991 (2005).
- Cobbold, R. S. Foundations of Biomedical ultrasound. , Oxford university press. (2006).
- Younan, Y., et al. Influence of the pressure field distribution in transcranial ultrasonic neurostimulation. Medical Physics. 40, 082902 (2013).
- McDannold, N., Vykhodtseva, N., Hynynen, K. Targeted disruption of the blood-brain barrier with focused ultrasound: association with cavitation activity. Physics in Medicine and Biology. 51, 793-807 (2006).
- Branda, C. S., Dymecki, S. M. Talking about a Revolution: The Impact of Site-Specific Recombinases on Genetic Analyses in Mice. Developmental Cell. 6, 7-28 (2004).
- Jendryka, M., et al. Pharmacokinetic and pharmacodynamic actions of clozapine-N-oxide, clozapine, and compound 21 in DREADD-based chemogenetics in mice. Scientific Reports. 9, 4522 (2019).
- Manvich, D. F., et al. The DREADD agonist clozapine N-oxide (CNO) is reverse-metabolized to clozapine and produces clozapine-like interoceptive stimulus effects in rats and mice. Scientific Reports. 8, 3840 (2018).
- Martinez, V. K., et al. Off-Target Effects of Clozapine-N-Oxide on the Chemosensory Reflex Are Masked by High Stress Levels. Frontiers in Physiology. 10, 521 (2019).
- Gomez, J. L., et al. Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine. Science. 357, 503-507 (2017).
- Bonaventura, J., et al. High-potency ligands for DREADD imaging and activation in rodents and monkeys. Nature Communications. 10, 1-12 (2019).
- Roth, B. L.
- Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of Transduction Efficiency, Tropism and Axonal Transport of AAV Serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the Mouse Brain. PLoS One. 8, 76310 (2013).
